CN116622744A - 重组末端脱氧核苷酸转移酶的制备方法和应用 - Google Patents

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CN116622744A CN202211402035.9A CN202211402035A CN116622744A CN 116622744 A CN116622744 A CN 116622744A CN 202211402035 A CN202211402035 A CN 202211402035A CN 116622744 A CN116622744 A CN 116622744A
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Abstract

本申请公开了一种重组末端脱氧核苷酸转移酶的制备方法和应用。本申请中，开发了基于基因工程技术的末端脱氧核苷酸转移酶制备方法，将经同义密码子偏好性优化的编码末端脱氧核苷酸转移酶的多核苷酸导入载体，成功构建原核表达质粒，提高了目的蛋白的表达量；本申请中涉及末端脱氧核苷酸转移酶的纯化方法，该方法对产品损失小，所得目的蛋白纯度高，纯化后的目的蛋白活性高达64U/μL。

Description

重组末端脱氧核苷酸转移酶的制备方法和应用
技术领域
本发明涉及基因工程领域，特别涉及重组末端脱氧核苷酸转移酶的制备方法和应用。
背景技术
末端转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase，TdT)是一种非模板依赖的DNA聚合酶，可以催化在寡核苷酸、单链或双链DNA的3’羟基端加上dNTP。其分子量为58.3kDa，不具有5`或3`的外切酶活性。在反应液中加入Co2+使扩增效率提高。70℃加热10分钟或加入适量EDTA均可使其失活，金属离子螯合剂，较高浓度的铵根离子、氯离子、碘离子和磷酸根均对TdT有抑制作用。
在正常情况下，TdT仅存在于胸腺和骨髓中，在胸腺细胞中浓度最高。根据这一观察，有人假设TdT在免疫分化中发挥作用，至少在T细胞系列中如此。同时TdT存在于淋巴细胞白血病细胞中。TdT不仅在免疫系统中具有重要作用,而且对某些淋巴瘤的诊断也具有重要应用。TdT在淋巴母细胞淋巴瘤/白血病中阳性，是诊断淋巴母细胞淋巴瘤/白血病的重要依据之一。TdT在许多肿瘤、非肿瘤疾病中的表达均有指导意义，正确和充分认识TdT的表达谱,可使TdT阳性的肿瘤诊断更加精准。
TdT酶蛋白的常见应用有Tunel及RACETunel(terminal deoxynucleotidytransferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling，原位末端转移酶标记技术)其原理为细胞在凋亡时，会激活一些DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体的基因组DNA，此时DNA的3-OH即会暴露出来，在TdT的催化下其会加上标记有FTIC标记的dUTP(fluoresceindUTP),从而可以通过荧光显微镜或流式细胞仪进行检测。5’RACE原理为(rapid-amplification of cDNA ends)在使用基因特异性引物(GSP)与mRNA结合，并且逆转录生成特定的单链cDNA后，就需要使用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)添加相同的字符串cDNA的3端的核苷酸，称为均聚物尾巴。其中TdT的非模板依赖性至关重要，可以催化在单链DNA的3羟基端加上dNTP，两种不同的DNA分子加上不同的但可以互补的即A和T、C和G的尾巴后，经过退火或复性，两种尾巴便可以借助互补作用连接在一起)。在cDNA文库建立时，这种加尾方法是使cDNA插人载体中的常用方法之一。
现有技术中关于TdT已有许多文献报告，大部分都集中在对TdT表达量高低及相应病理情况的研究。较少文献研究TdT的制备方法，当前还没有简单、高效的制备方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种重组末端脱氧核苷酸转移酶制备方法。
本发明的另一目的在于提供一种编码末端脱氧核苷酸转移酶的多核苷酸序列。
本发明的另一目的在于提供与编码末端脱氧核苷酸转移酶的多核苷酸序列适配的载体。
本发明的另一目的在于提供含有编码末端脱氧核苷酸转移酶的多核苷酸序列的试剂盒。
为解决上述技术问题，本发明第一方面，提供了一种编码末端脱氧核苷酸转移酶的多核苷酸，所述多核苷酸经密码子优化，且所述多核苷酸选自以下任一种：
(i)具有如SEQ ID NO.1所示序列的多核苷酸；
(ii)具有与如SEQ ID NO.1所示序列的同源性大于95％的多核苷酸；和
(iii)具有与(i)或(ii)中所述的多核苷酸序列互补的多核苷酸。
本发明第二方面，提供了一种表达载体，所述表达载体包括本发明第一方面提供的多核苷酸。
在一些优选的方案中，所述表达载体为大肠杆菌表达载体，更优选为pET-28a(+)。
本发明第三方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包括本发明第二方面提供的表达载体；或者
所述宿主细胞的基因组中整合有如本发明第一方面提供的多核苷酸。
在一些优选的方案中，所述宿主细胞为大肠杆菌(Escherichia coli)。
在一些优选的方案中，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)菌株。
本发明第四方面提供了一种制备末端脱氧核苷酸转移酶的方法，所述方法包括步骤：培养本发明第三方面所述的宿主细胞，以表达出目的蛋白；和
分离所述目的蛋白，即得所述末端脱氧核苷酸转移酶；
其中，所述目的蛋白具有如牛源末端氧核苷酸转移酶。
在一些优选的方案中，所述宿主细胞通过含有本发明第一方面所述多核苷酸的质粒转化大肠杆菌获得。
在一些优选的方案中，用SB、TB或SOC培养基培养所述的宿主细胞。
在一些优选的方案中，在振荡的环境中培养所述的宿主细胞。
在一些优选的方案中，在温度为16至19℃下培养所述宿主细胞。
在一些优选的方案中，培养所述的宿主细胞时，所用培养基中含有卡那霉素抗性基因。
在一些优选的方案中，培养所述的宿主细胞时，使用IPTG进行诱导，以表达出目的蛋白。
在一些优选的方案中，培养所述的宿主细胞时，培养至OD600在0.6至0.8，后使用IPTG进行诱导，以表达出目的蛋白。
在一些优选的方案中，所述分离所述目的蛋白的步骤包括：
将经破碎的目的蛋白上清液与流动相同时通过层析柱进行洗脱，收集洗脱液。
在一些优选的方案中，所述层析柱为Ni-柱亲和层析柱(Ni-NTA)。
在一些优选的方案中，所述流动相包括BufferA和/或BufferB；
其中，BufferA包括三羟甲基氨基甲烷(Tris)和NaCl；
BufferB包括三羟甲基氨基甲烷(Tris)、甘油(Glycerol)和咪唑(Imidazole)。
在一些优选的方案中，BufferA中三羟甲基氨基甲烷(Tris)和NaCl的体积比为1:1。
在一些优选的方案中，BufferB中，三羟甲基氨基甲烷(Tris)、甘油(Glycerol)和咪唑(Imidazole)的体积比为1:1:10。
在一些优选的方案中，所述洗脱的程序包括第一阶段、第二阶段；
所述第一阶段中，使用的流动相为BufferA；
所述第二阶段中，使用的流动相为BufferA和BufferB的混合物，其中，BufferA的体积百分含量从100％逐渐降低至40％，BufferB的体积百分含量从0％逐渐增加至60％。
在一些优选的方案中，所述洗脱的程序还包括第三阶段，
所述第三阶段中，使用的流动相为BufferB。
在一些优选的方案中，所述流动相的流速为1.5-3ml/min。
本发明第五方面提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括：如本发明第一方面提供的的多核苷酸；或者
如本发明第二方面提供的表达载体；或者
如本发明第三方面所述的宿主细胞；或者
或者根据本发明第四方面所述的方法制备的末端脱氧核苷酸转移酶。
本发明相对于现有技术而言，至少具有下述优点：
(1)本发明开发了基于基因工程技术的末端脱氧核苷酸转移酶制备方法，将经同义密码子偏好性优化的编码末端脱氧核苷酸转移酶的多核苷酸导入载体，成功构建原核表达质粒，提高了目的蛋白的表达量；
(2)本发明开发了末端脱氧核苷酸转移酶的纯化方法，该方法对产品损失小，所得目的蛋白纯度高，纯化后的目的蛋白活性高达64U/μL。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定。
图1是根据本发明实施例中制备的末端脱氧核苷酸转移酶的SDS-PAGE鉴定结果图；
图2是根据本发明实施例中制备的末端脱氧核苷酸转移酶的SDS-PAGE鉴定结果图；
图3是根据本发明实施例中纯化后的末端脱氧核苷酸转移酶电泳图；
图4是根据本发明实施例中末端脱氧核苷酸转移酶标准品和待测样品电泳图。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，开发了基于原核表达系统的末端脱氧核苷酸转移酶表达体系，并进一步通过同义密码子偏好性优化，得到了能够在大肠杆菌表达系统中大量表达目的蛋白的编码末端脱氧核苷酸转移酶的多核苷酸序列，所表达的目的蛋白活性高，稳定性好。
发明人进一步开发了末端脱氧核苷酸转移酶纯化方法，在高校表达出高活性酶后，使用该分离纯化方法进行纯化，所得的末端脱氧核苷酸转移酶纯度极高。
获取目的基因/获取目的蛋白有关的核酸序列
本发明中目的蛋白或其元件的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据已公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的基因。用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。
在本发明的一个实施方式中，通过NCBI数据库对目的蛋白的氨基酸序列进行分析，获得目的基因序列信息。
同义密码子偏好性优化
为克服在大肠杆菌中表达异源蛋白时产量降低的潜在问题，本发明涉及经同义密码子偏好性优化的多核苷酸序列。对获取的目的基因序列进行同义密码子偏好性优化，经同义密码子偏好性优化的目的基因序列(SEQ ID NO:1-5)可表达与目的蛋白相同的氨基酸序列(但部分序列虽经同义密码子偏好性优化，所得产物仍然是包涵体)。
本发明中，SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3表达的目的蛋白维持了较高的活性，其中SEQ ID NO:1所示的序列在大肠杆菌表达体系中可溶性表达量最高。而SEQ ID NO:2没有可溶性表达。
本发明还涉及与SEQ ID NO:1-5所示序列的同源性大于95％的多核苷酸；和与SEQID NO:1-5所示序列互补的多核苷酸。
目的基因的载体
本发明还涉及包含本发明的多核苷酸的载体。本发明中“载体”表示线性或环状DNA分子，其包含编码目的蛋白的片段，所述目的蛋白可操作地连接到提供其转录的其它片段。这样的附加片段可以包括启动子和终止子序列，并且可以任选地包括一个或多个复制起点，一个或多个可选择标记，增强子，多腺苷酸化信号，载体等。载体片段可以衍生自宿主生物体，另一生物体，质粒或病毒DNA，或可以是合成的。载体可以是合成的或方便地进行重组DNA操作的任何表达载体，载体的选择通常取决于载体要导入的宿主细胞。因此，载体可以是自主复制载体，即载体，其作为染色体外实体存在，染色体外实体的复制与染色体复制无关，例如质粒。或者，载体可以是当引入宿主细胞时整合到宿主细胞基因组中并与其整合的染色体一起复制的载体。在一个实施方案中，本发明的载体是表达载体。本发明的一个实施例中选择pET-28a(+)作为载体，以获取更高效的表达效率。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明蛋白的编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。示例性地，使用DNA内切酶将载体DNA分子切割成可与外源基因连接的线性分子，然后将经密码子优化的目的基因片段连接于载体，可选用单酶切位点的黏端连接、双酶切片段的定向克隆、不同限制酶切位点的黏端连接、平端连接、人工接头连接或同寡核苷酸末端连接实现外源DNA片段的插入。
含有目的基因的载体转化宿主细胞
本发明还涉及用本发明的载体或融合蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞。含有经密码子优化的目的基因的载体可以通过已知的方法插入、转染或乙其他方式转化到宿主细胞中，从而获得含有本发明经密码子优化的目的基因并能够表达目的蛋白的转化体。本发明中“宿主细胞”是引入了外源多核苷酸和/或载体的细胞。宿主细胞可以是真核宿主细胞或原核宿主细胞，宿主细胞优选是细菌，并且优选是大肠杆菌，更优选是大肠杆菌ROSETTA(DE3)菌种(Escherichia coli Rosetta(DE3)strain)。
制备目的蛋白的方法
本发明还涉及制备目的蛋白的方法，可利用本发明的多核苷酸序列表达或生产重组蛋白。一般来说有以下步骤：
(1)用本发明的编码本发明蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；
(2)在合适的培养基中培养的宿主细胞；
(3)从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
其中，步骤(1)含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞可通过本领域技术人员熟知的常规技术进行，当宿主是大肠杆菌时，可选用热击法和电转化法等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基，优选为SB、TB或SOC培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。为促进目的蛋白的表达并提升可溶蛋白的表达量，本发明的一个优选的实施方式，使用TB培养基培养的宿主细胞，且所用培养基中含有卡那霉素抗性基因。
为进一步促进目的蛋白的可溶性表达，在本发明的一个优选的实施方式中，培养宿主细胞至OD600在0.6-0.8之间后，采用IPTG进行诱导，并在17至19℃下继续培养约8至12小时。
在上面的方法中的蛋白质可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化蛋白。因此本发明中，在成功培养得到目的蛋白后，还涉及对其进行分离和纯化的步骤，例如步骤(3)中，从培养基中分离和纯化蛋白质以获得高纯度的目的蛋白。虽纯化目的蛋白的方法可是本领域技术人员熟知的常规手段，包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。但由于末端脱氧核苷酸转移酶的分离纯化难度较高，因此一些常规方法获得的纯化的蛋白一方面活性降低，另一方面纯度仍然不够。本发明的优选的实施方式中提供了分离所述目的蛋白的方法，所述分离所述目的蛋白的步骤包括：将经破碎的目的蛋白上清液与流动相同时通过层析柱进行洗脱，收集洗脱液；流动相包括BufferA和/或BufferB；其中，BufferA包括三羟甲基氨基甲烷(Tris)和NaCl；BufferB包括三羟甲基氨基甲烷(Tris)、甘油(Glycerol)和咪唑(Imidazole)。
作为流动相中各组分之间配比的优选方案，例如BufferA中三羟甲基氨基甲烷(Tris)和NaCl的体积比为1:1；BufferB中，三羟甲基氨基甲烷(Tris)、甘油(Glycerol)和咪唑(Imidazole)的体积比为1:1:10。
优选地，洗脱步骤中，所述洗脱的程序包括第一阶段、第二阶段；所述第一阶段中，使用的流动相为BufferA；所述第二阶段中，使用的流动相为BufferA和BufferB的混合物，其中，BufferA的体积百分含量从100％逐渐降低至40％，BufferB的体积百分含量从0％逐渐增加至60％。
更优选地，所述洗脱的程序还包括第三阶段，所述第三阶段中，使用的流动相为BufferB。
在本发明中，使用针对本文中的某些实施例提供的任何示例性或示例性措辞(例如，“”)只是为了更好地呈现本发明，而不限制以其它方式要求权利的本发明的范围。本文中的任何措辞都不应被解释为表示本发明实施中不可缺少的权利要求中未描述的要素。
如果引用文献中的术语的定义或使用与本文中描述的术语的定义不一致或不一致，则使用本文中描述的术语的定义，而不使用引用文献中的术语的定义。
本文中使用的各种术语如下所示。如果权利要求中使用的术语未在下文中定义，则应给出本领域技术人员给出的该术语的最广泛定义，以反映在申请时印刷的出版物或所发布的专利中。
如本文中所用的，术语“分离的”是指与核酸或多肽在其天然来源中存在的至少一种其它组分(例如核酸或多肽)分离的核酸或多肽。在一个实施方案中，发现核酸或多肽仅存在(如果有的话)通常存在于其溶液中的溶剂，缓冲液，离子或其它组分。术语“分离的”和“纯化的”不包括存在于其天然来源中的核酸或多肽。
如本文中所用的，术语“多核苷酸”和“多核苷酸序列”可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的蛋白质片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码多肽的功能。
如本文中所用的，术语“密码子优化”是指根据实际做蛋白表达或生产的生物(包括大肠杆菌、酵母、哺乳动物血细胞、植物细胞、昆虫细胞等)表现出的密码子利用差异，避免使用低利用率或稀有的密码子，来提高基因合成效率的方式。
如本文中所用的，术语“同源性”和“同一性”可互换使用，是指两个或更多个多核苷酸或多肽之间相同(即相同)核苷酸或氨基酸的百分比。可以通过以下方法测量两个或多个多核苷酸或多肽之间的序列同一性。排列多核苷酸或多肽的核苷酸或氨基酸序列，对排列的多核苷酸或多肽中含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置的数量进行评分，并将其与排列的多核苷酸或多肽中含有不同核苷酸或氨基酸残基的位置的数量进行比较。多核苷酸可以在一个位置上不同，例如，根据包含不同的核苷酸(即，替换或变异)或核苷酸的缺失(即，在多核苷酸中插入或缺失一个或两个核苷酸)。多肽可以例如通过含有氨基酸(即，取代或变异)或氨基酸的缺失(即，插入一个或两个多肽中的氨基酸或氨基酸的缺失)在一个位置上不同。可以通过将含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置的数量除以多核苷酸或多肽中氨基酸残基的总数来计算序列同一性。例如，百分比同一性可通过将含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置的数量除以多核苷酸或多肽中核苷酸或氨基酸残基的总数，然后乘以100来计算。
如本文中所用的，术语“序列互补”和“反向序列互补”可互换使用，指的是与原多核苷酸序列的方向相反，且与原多核苷酸序列互补的序列。例如，如果原始多核苷酸序列是ACTGAAC，则其反向互补序列是GTTCAT。
如本文中所用的，术语“表达”包括涉及宿主细胞中多肽产生的任何步骤，包括但不限于转录，翻译，翻译后修饰和分泌。表达后可收获，即回收宿主细胞或表达产物。
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
除非另有指明，本文所用的技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义，需要注意的是，本文所用的术语仅为了描述具体实施方式，而非意图限制本申请的示例性实施方式。
实施例1、构建末端脱氧核苷酸转移酶氨基酸质粒并转染宿主细胞
(1)获取牛源末端脱氧核苷酸转移酶氨基酸序列、人源末端脱氧核苷酸转移酶氨基酸序列，对前述氨基酸序列进行分析获取基因序列，对基因序列进行同义密码子偏好性优化，得到经同义密码子偏好性优化的基因序列SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。经大肠杆菌同义密码子偏好性优化后，分别连接载体为pET-28a(+)合成重组表达质粒。
(2)重组质粒导入宿主大肠杆菌
取1μL步骤(1)中制备的表达质粒，在冰浴条件下，加入到30μL大肠杆菌感受态BL21(DE3)中，冰浴放置30min，42℃水浴45s，立刻冰上放置2min，加入400μL不含抗生素的SOC培养基，37℃、230rpm振荡培养45min。取100μL菌液均匀涂布到含100μg/mL卡那抗性的LB平板上，37℃培养箱培养过夜。
SEQ ID NO:1
ATGGACCCGCTGTGTACTGCATCTTCTGGTCCTCGTAAAAAACGTCCGCGTCAGGTGGGTGCGTCTATGGCAAGCCCACCGCACGACATTAAATTCCAGAACCTGGTCCTGTTCATTCTGGAAAAGAAGATGGGTACTACTCGTCGCAACTTCCTGATGGAGCTGGCGCGTCGCAAAGGTTTTCGTGTTGAAAACGAACTGTCTGATAGCGTTACCCATATCGTTGCGGAAAATAATTCCGGTAGCGAAGTTCTGGAATGGCTGCAGGTGCAGAACATTCGTGCTAGCTCCCAGCTGGAGCTGCTGGATGTTAGCTGGCTGATCGAGAGCATGGGTGCAGGTAAACCAGTGGAAATTACCGGCAAACACCAGCTGGTTGTTCGCACCGATTATTCCGCGACCCCGAACCCTGGCTTCCAGAAAACCCCGCCGCTGGCTGTAAAAAAAATCTCTCAGTACGCTTGTCAGCGTAAAACCACTCTGAACAACTACAACCACATCTTCACCGACGCTTTCGAAATTCTGGCCGAAAACAGCGAATTTAAAGAAAATGAAGTTTCTTACGTCACTTTCATGCGTGCGGCTTCTGTTCTGAAAAGCCTGCCGTTCACCATTATCTCTATGAAGGACACTGAAGGTATCCCTTGCCTGGGTGATAAAGTTAAATGCATTATCGAAGAAATCATTGAGGACGGTGAATCCTCTGAAGTGAAAGCCGTTCTGAACGACGAACGTTACCAGTCTTTCAAACTGTTTACGAGCGTGTTCGGTGTGGGCCTGAAAACCAGCGAAAAATGGTTCCGCATGGGTTTCCGCTCTCTGAGCAATATTATGTCTGACAAAACCCTGAAATTCACCAAAATGCAGAAAGCTGGTTTCCTGTATTACGACGATCTGGTTTCTTGTGTTACGCGTGCGGAAGCCGAAGCAGTAGGTGTCCTGGTTATAGAAGCAGTCTGGGCGTTCCTGCCTGACGCCTTCGTAACCATGACTGGTGGTATCCGTCGTGGTAAATAAATCGGCCACGATGTCGACTTCCTGATTACTTCTCCAGGTTCTGCAGAGGATGAAGAGCAGCTGCTGCCAAAAGTAATCAACCTGTGGGAAATAATAGGTCTGCTGCTGTATTACGATCTGGTGGAATCCACTTTTGAAAAATTCAAACTGCCGTCTCGCCAGGTTGACACTCTGGATCATTTCCAAAAATGCTTTCTGATCCTGAAACTGCATCACCAGCGTGTCGATAGCTCTAAATCTAACCAGCAGGAGGGTAAGACTTGGAAAGCAATCCGTGTAGATCTGGTGATGTGCCCGTACGAAAACCGTGCCTTTGCGCTGCTGGGTTGGACCGGTTCTCGTCAGTTCGAACGTGATATCCGCCGTTACGCTACCCACGAACGTAAGATGATGCTGGATAACCATGCGCTGTACGACAAAACTAAACGTGTTTTCCTGAAAGCAGAGTCCGAGGAGGAAATCTTCGCACACCTGGGCCTGGATTACATCGAACCGTGGGAACGCAACGCG
SEQ ID NO:2
ATGGATCCACCTCGTGCATCTCATCTGTCTCCGCGCAAAAAACGTCCGCGCCAGACTGGTGCACTGATGGCATCTTCCCCGCAGGACATTAAATTCCAGGACCTGGTAGTTTTCATCCTGGAAAAAAAGATGGGCACTACCCGTCGTGCATTTCTGATGGAACTGGCTCGCCGTAAGGGTTTCCGTGTTGAGAATGAACTGAGCGACTCTGTTACCCATATCGTTGCGGAAAACAATTCCGGCTCCGACGTCCTGGAATGGCTGCAAGCACAGAAAGTGCAGGTTAGCTCTCAGCCGGAACTGCTGGACGTATCCTGGCTGATCGAATGTATCCGTGCTGGCAAACCGGTCGAAATGACCGGTAAACACCAGCTGGTTGTTCGTCGTGACTACTCCGATTCCACCAATCCAGGTCCTCCGAAAACCCCGCCGATTGCGGTACAGAAAATCAGCCAGTACGCTTGTCAGCGTCGCACCACTCTGAACAACTGCAACCAGATCTTCACCGACGCGTTCGATATTCTGGCGGAAAACTGTGAATTCCGCGAAAACGAAGATTCCTGCGTTACCTTCATGCGTGCTGCTTCCGTCCTGAAAAGCCTGCCGTTCACCATCATCTCTATGAAGGACACTGAAGGCATCCCATGCCTGGGTTCTAAAGTTAAAGGCATTATCGAAGAAATCATTGAAGATGGCGAATCTTCTGAAGTTAAAGCGGTCCTGAATGACGAACGTTATCAGAGCTTCAAACTGTTCACCAGCGTGTTCGGTGTTGGCCTGAAAACCTCTGAAAAATGGTTCCGTATGGGCTTCCGTACCCTGAGCAAGGTTCGCTCCGACAAAAGCCTGAAATTCACCCGTATGCAGAAGGCGGGTTTCCTGTACTACGAAGACCTGGTTTCTTGCGTGACCCGTGCGGAAGCGGAAGCTGTTTCTGTACTGGTTAAAGAAGCTGTATGGGCGTTCCTGCCTGACGCTTTCGTCACCATGACCGGTGGTTTCCGTCGCGGCAAAAAAATGGGTCACGACGTTGACTTCCTGATCACGAGCCCGGGCTCCACCGAAGATGAGGAACAGCTGCTGCAGAAAGTTATGAACCTGTGGGAAAAGAAAGGTCTGCTGCTGTACTACGACCTGGTTGAATCCACCTTTGAAAAGCTGCGCCTGCCGTCCCGTAAAGTGGATGCGCTGGACCACTTCCAGAAGTGTTTCCTGATCTTCAAACTGCCGCGTCAGCGCGTTGATTCCGACCAATCTTCTTGGCAGGAGGGCAAGACCTGGAAGGCAATTCGTGTGGATCTGGTCCTGTGCCCGTACGAACGTCGTGCTTTTGCGCTGCTGGGCTGGACTGGTTCTCGTCAGTTTGAACGCGACCTGCGTCGTTACGCGACTCATGAGCGCAAAATGATTCTGGATAACCACGCCCTGTACGACAAAACCAAGCGTATTTTCCTGAAAGCCGAAAGCGAGGAAGAAATTTTCGCGCACCTGGGCCTGGATTACATCGAGCCGTGGGAACGTAACGCC
实施例2、目的基因的表达
挑取步骤实施例1中制备的单克隆，无菌操作分别接种于含100μg/mL卡那抗性的SB、TB、SOC培养基中，37℃220rpm振荡培养至OD600在0.6-0.8之间，IPTG进行诱导，放置于18℃振荡培养过夜。取等量三种不同培养基的菌液超声破碎进行SDS-PAGE鉴定，鉴定结果见图1和图2。图1结果显示牛源的TdT在18℃条件下，在TB、SB、SOC培养基中可溶性蛋白表达。图2结果显示人源的TdT即便在N端融合表达促溶标签SUMO，在18℃条件下，在TB、LB、SB、SOC培养基中蛋白依然是包涵体表达。
实施例3、表达体系的优化
选取牛源的TdT基因序列，进行大肠杆菌同义密码子偏好性优化，得到若干组优化后的密码子序列，部分优化后的密码子序列举例如SEQ ID NO:3-5。将优化后的密码子按照实施例1相同的方式构建质粒并转染宿主细胞，并按照与实施例2相同的方式表达目的基因，并计算表达量记录至表1。
表1
名称 序列 上清表达量
密码子Ⅰ SEQ ID NO:1 40％
密码子Ⅲ SEQ ID NO:3 包涵体表达
密码子Ⅳ SEQ ID NO:4 包涵体表达
密码子Ⅴ SEQ ID NO:5 上清表达量35％
SEQ ID NO:3
ATGGCACAACAGAGGCAACACCAGAGATTGCCTATGGACCCATTGTGTACCGCATCTTCTGGTCCTAGAAAAAAAAGACCGAGACAGGTTGGCGCATCAATGGCATCTCCACCCCATGACATTAAGTTCCAAAACTTGGTATTATTCATTTTGGAGAAAAAGATGGGTACCACTAGAAGAAATTTTTTAATGGAATTGGCGAGAAGAAAGGGTTTTAGAGTTGAGAATGAGTTGAGTGATTCAGTCACACATATTGTTGCTGAGAATAATTCTGGTTCAGAAGTACTGGAGTGGCTGCAGGTCCAAAATATTAGGGCTAGTTCCCAATTAGAGTTGTTGGACGTCAGCTGGCTGATTGAATCAATGGGAGCTGGCAAGCCTGTCGAAATAACTGGCAAGCATCAACTGGTTGTTAGAACTGATTATTCTGCGACCCCCAACCCAGGATTTCAAAAGACTCCACCATTGGCCGTGAAGAAAATTAGCCAATATGCGTGTCAAAGAAAAACAACTCTAAATAATTACAATCACATCTTTACTGACGCATTCGAGATACTTGCTGAAAATTCTGAATTTAAAGAAAATGAAGTTTCATATGTCACTTTTATGAGGGCAGCGTCAGTTTTGAAGTCATTGCCATTTACAATCATATCAATGAAAGATACAGAAGGTATTCCATGTTTAGGTGATAAGGTTAAATGCATAATTGAAGAGATTATTGAAGACGGAGAGAGCAGTGAGGTTAAAGCAGTATTAAATGACGAGAGGTACCAGTCATTCAAATTATTCACATCAGTGTTCGGAGTTGGTTTGAAAACATCTGAGAAGTGGTTCAGAATGGGATTCCGTTCCCTAAGTAAGATTATGTCTGATAAAACCTTAAAGTTCACTAAAATGCAAAAGGCCGGATTTTTATACTACGAAGATTTGGTGTCCTGTGTGACAAGGGCTGAAGCTGAAGCAGTGGGTGTTCTAGTAAAGGAAGCGGTTTGGGCCTTCCTACCTGATGCGTTTGTCACTATGACCGGAGGTTTTAGAAGAGGTAAAAAAATTGGGCATGATGTCGATTTTTTGATAACTAGCCCAGGCTCCGCCGAAGACGAAGAGCAATTATTGCCTAAGGTCATTAATCTATGGGAAAAGAAGGGACTGCTTTTGTATTATGATCTAGTCGAATCTACTTTCGAAAAGTTCAAGCTTCCAAGTAGACAAGTTGATACCTTAGATCATTTCCAGAAATGTTTCTTAATTTTGAAATTACATCATCAAAGAGTAGATAGTAGTAAATCCAACCAACAGGAAGGTAAGACGTGGAAGGCCATTAGGGTTGATCTTGTAATGTGTCCTTACGAAAATAGAGCTTTCGCTTTACTAGGGTGGACTGGTTCTAGACAGTTCGAAAGAGATATAAGGAGATATGCAACCCATGAGAGAAAAATGATGTTGGACAACCATGCTTTGTACGATAAGACTAAGAGGGTGTTTTTAAAGGCTGAAAGTGAAGAAGAAATTTTCGCCCATCTAGGTTTGGACTACATTGAGCCCTGGGAAAGAAATGCT
SEQ ID NO:4
ATGGCTCAACAGCGTCAGCATCAAAGATTACCGATGGACCCGTTATGTACGGCTTCTTCTGGTCCTCGAAAAAAGCGCCCAAGACAAGTAGGAGCTTCGATGGCCAGTCCTCCTCACGATATAAAATTTCAAAATCTTGTTCTTTTTATCCTGGAGAAAAAGATGGGAACAACGAGACGCAACTTTTTAATGGAGCTTGCCAGAAGAAAAGGTTTCAGAGTTGAAAATGAACTGAGCGATTCTGTTACTCACATAGTTGCAGAAAATAATAGCGGCTCAGAAGTTCTTGAATGGTTGCAGGTGCAGAATATTCGTGCCTCCAGCCAACTTGAACTTCTTGATGTTAGCTGGCTGATTGAAAGCATGGGCGCCGGCAAACCTGTGGAAATTACGGGAAAACACCAGTTGGTTGTTCGTACAGATTACTCCGCGACCCCGAACCCGGGATTTCAAAAAACCCCGCCATTAGCAGTGAAAAAAATTTCTCAGTACGCATGTCAACGGAAGACTACCCTTAATAATTATAACCATATATTTACAGATGCATTCGAAATCTTGGCGGAAAATAGCGAGTTTAAGGAAAACGAAGTGAGCTATGTTACGTTTATGCGTGCCGCTTCAGTTTTAAAAAGCTTGCCGTTTACTATCATTTCAATGAAAGACACAGAAGGCATACCGTGTCTTGGTGATAAGGTAAAGTGCATTATTGAAGAAATCATCGAAGATGGGGAATCATCTGAAGTCAAAGCGGTTCTGAACGACGAGCGTTATCAAAGCTTCAAGCTTTTTACAAGCGTATTCGGTGTGGGGCTGAAAACAAGCGAGAAATGGTTTCGAATGGGCTTCAGAAGTTTGAGTAAAATCATGAGCGATAAAACCCTGAAATTTACGAAAATGCAGAAGGCCGGCTTTCTGTATTATGAAGACTTGGTCTCATGTGTTACGAGAGCAGAAGCTGAAGCCGTTGGCGTCTTGGTGAAAGAAGCAGTCTGGGCATTCTTACCGGATGCCTTTGTTACTATGACAGGAGGATTCCGGAGAGGTAAAAAGATTGGCCATGATGTAGATTTTCTGATTACAAGCCCTGGGTCAGCAGAAGATGAAGAACAACTGTTGCCGAAAGTGATAAATCTTTGGGAAAAAAAGGGTTTGTTGTTATATTACGATTTAGTAGAAAGCACTTTCGAAAAATTTAAGTTGCCGAGTCGTCAAGTGGATACGCTTGATCATTTTCAGAAATGCTTTTTAATTTTGAAACTGCATCATCAACGCGTAGATTCATCGAAATCCAATCAACAAGAAGGCAAAACATGGAAAGCGATTCGAGTGGATCTCGTCATGTGTCCGTATGAAAACAGAGCTTTCGCGCTCCTTGGATGGACGGGATCTCGTCAGTTCGAGCGGGACATTAGACGCTACGCAACGCATGAACGCAAAATGATGTTAGACAACCATGCACTGTATGATAAAACTAAAAGAGTGTTCCTTAAAGCGGAATCTGAAGAAGAAATCTTTGCCCATTTGGGGCTTGACTACATTGAACCGTGGGAGCGTAACGCC
SEQ ID NO:5
ATGGCACAGCAGCGTCAGCATCAACGTTTACCGATGGACCCCTTATGTACCGCATCAAGCGGTCCGCGTAAAAAACGCCCTCGTCAGGTTGGCGCTTCTATGGCGAGCCCTCCACACGACATTAAATTCCAAAATTTGGTGCTCTTTATTCTGGAAAAAAAAATGGGTACTACCCGTCGCAACTTCCTGATGGAACTGGCCCGTCGCAAAGGGTTCCGCGTAGAGAACGAATTATCAGATAGCGTGACCCATATTGTGGCGGAAAACAATAGTGGTTCTGAAGTTCTGGAATGGCTGCAAGTGCAGAACATTCGTGCGTCGTCTCAGCTCGAACTCCTTGATGTTAGCTGGCTGATCGAGAGCATGGGCGCGGGTAAACCTGTAGAAATTACAGGCAAACATCAACTCGTGGTTCGCACCGACTACAGCGCAACCCCGAATCCGGGATTCCAGAAAACGCCGCCGTTAGCTGTGAAAAAAATTTCACAATACGCGTGCCAACGCAAAACCACTCTGAACAACTATAATCACATTTTTACCGATGCTTTCGAAATTCTGGCGGAGAACAGCGAATTTAAAGAGAATGAAGTGAGCTATGTGACCTTCATGCGCGCAGCCTCCGTGCTTAAAAGCCTGCCGTTCACCATCATTAGCATGAAAGATACCGAAGGCATTCCGTGCCTGGGTGATAAGGTAAAATGCATTATCGAAGAGATCATTGAAGACGGTGAAAGCAGCGAAGTCAAAGCAGTGTTAAATGATGAGCGCTACCAATCCTTTAAACTTTTTACCTCGGTGTTTGGCGTGGGCCTTAAAACATCAGAAAAATGGTTTCGTATGGGCTTTCGCTCCCTTAGCAAAATTATGAGCGATAAGACTTTAAAATTCACGAAAATGCAAAAGGCTGGCTTTCTGTACTATGAAGACTTAGTGTCTTGCGTTACGCGTGCCGAAGCCGAAGCCGTAGGAGTTTTGGTAAAGGAAGCGGTCTGGGCGTTTCTCCCGGACGCTTTTGTGACTATGACTGGCGGCTTTCGCCGTGGTAAAAAAATTGGCCACGATGTGGATTTTCTTATTACCTCACCGGGTAGCGCCGAAGATGAAGAGCAATTGCTTCCTAAAGTGATCAACCTGTGGGAAAAAAAAGGCCTGCTGTTATATTATGACTTGGTGGAATCGACTTTCGAAAAGTTTAAACTGCCGTCCCGCCAGGTGGATACTCTGGATCATTTCCAAAAATGTTTTCTCATTCTGAAACTGCATCATCAGCGTGTAGATAGTTCCAAATCAAATCAGCAGGAAGGTAAAACCTGGAAGGCCATCCGCGTTGATCTGGTGATGTGCCCGTACGAAAACCGTGCATTTGCGTTATTGGGCTGGACCGGAAGTCGTCAGTTCGAACGTGATATCCGCCGCTATGCAACCCACGAACGCAAAATGATGCTTGACAATCACGCGTTATATGATAAGACCAAACGCGTGTTCCTGAAAGCCGAATCGGAAGAAGAAATTTTCGCGCATCTGGGCCTTGATTATATTGAACCTTGGGAACGCAATGCC
实施例4、表达产物的纯化
选取优化密码子Ⅰ(SEQ ID NO:1)和优化密码子Ⅴ(SEQ ID NO:5)重组菌株发酵所得纯化样品，并选取TB培养基，放置于18℃诱导表达培养，收集并称取菌体4g，分别加入20ml Lysis Buffer在冰上重悬。超声破碎破碎细胞：10#探头，功率10％，超5.5S，停9.9S，超声破碎30min。20000rpm，4℃离心30min，取上清，0.22μm膜过滤，用1ml Ni-NTA纯化。15mL粗品，上样流速为0.5ml/min，上完样使用20ml Lysis Buffer冲洗UV和电导至基线。洗脱程序包括：Step 1:0％B,8CV，2ml/min；Step 2:0—60％B，20CV，2ml/min；Step 3:100％B,10CV，2ml/min。典型的收养后电泳结果如图3所示(密码子Ⅰ，58.3kda)。洗脱液组成见下表1.
表1
试剂 BufferA BufferB Lysis Buffer
Tris 50mM 50mM 50mM
NaCl 50mM 50mM 300mM
Glycerol - - -
Imidazole - 500mM -
pH 7.0 7.0 7.0
从电泳结果与纯化结果可以看出，纯化所得后面一个主峰为目的蛋白峰，穿透中有微量的蛋白穿出，纯化所的目的蛋白纯度较高。
取密码子Ⅰ重组菌株发酵获得的纯化样品共16ml，分别装入10KD的透析袋中分别放入1000ml的透析液中过夜透析第二天早上收集透析后样品，混匀，体积为15ml。用BCA法测浓度，结果为0.442mg/ml，产量为6.63mg，1.66mg/g菌，R2＝0.998。
取密码子Ⅴ重组菌株发酵获得的纯化样品共14ml，分别装入10KD的透析袋中分别放入1000ml的透析液中过夜透析第二天早上收集透析后样品，混匀，体积为11ml。用BCA法测浓度，结果为0.406mg/ml，产量为4.46mg，1.12mg/g菌，R2＝0.996。
实施例5、目的蛋白活性
(1)测活试剂
TdT酶稀释液：50mM KPO4(pH7.3)、100mM氯化钠、1.43mM 2-巯基乙醇、0.1％TritonX-100和50％甘油
Terminal Transferase(20U/μL)、10X TdT Buffer、25mM CoCl2均购自NEB(货号：M0315L)
底物：T4LSub-PF(生工合成)
dATP(promega)
(2)实验步骤
分别取优化密码子Ⅰ和优化密码子Ⅴ重组菌株发酵所得的纯化样品及阳性酶(市售获得TDT酶，购自NEB公司，货号：M0315S)的稀释：先将阳性酶稀释为4U/μL，再按1/2、1/4、1/8、1/16、1/32稀释；样品稀释为原液、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32；按照下表2配制扩增体系，NTC组用灭菌水代替TdT酶。将反应体系按37℃、30min；70℃、15min反应后，反应产物进行15％page胶电泳。
表2
试剂 体积
10X TdT Buffer 5.0μL
CoCl2(2.5mM) 5.0μL
T4LSub-PF(5pmol) 1.0μL
dNTP(10mM) 0.5μL
TdT 0.5μL
ddH2O 38.0μL
末端转移酶阳性酶标准品及待测样品跑胶结果表明：密码子I重组菌株制得的样品活性约为阳性酶的16倍,活性为4*16＝64U/μL。密码子V重组菌株制得的样品活性约为阳性酶的2倍,则活性为4*2＝8U/μL。
典型的跑胶结果见下图4(密码子I重组菌株制得的样品活性)，图4中，1-7为阳性酶的7个梯度；8为NTC；9-14为样品TDT的6个梯度。
本领域的普通技术人员可以理解，上述各实施方式是实现本发明的具体实施例，而在实际应用中，可以在形式上和细节上对其作各种改变，而不偏离本发明的精神和范围。

Claims (10)

1.一种编码末端脱氧核苷酸转移酶的分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸经密码子优化，且所述多核苷酸选自以下任一种：
(i)具有如SEQ ID NO.1所示序列的多核苷酸；
(ii)具有与如SEQ ID NO.1所示序列的同源性大于95％的多核苷酸；和
(iii)具有与(i)或(ii)中所述的多核苷酸序列互补的多核苷酸。
2.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包括如权利要求1所述的多核苷酸。
3.根据权利要求2所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为大肠杆菌表达载体，优选为pET-28a(+)。
4.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括如权利要求2或3中任一项所述的表达载体；或者
所述宿主细胞的基因组中整合有如权利要求1所述的多核苷酸。
5.一种制备末端脱氧核苷酸转移酶的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
使含有如权利要求1所述的多核苷酸载体转化宿主细胞；
培养所述宿主细胞，以表达所述末端脱氧核苷酸转移酶；
和，分离所述目的蛋白，即得所述末端脱氧核苷酸转移酶。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，用SB、TB或SOC培养基培养所述的宿主细胞；
和/或，培养所述宿主细胞时，所用培养基中含有卡那霉素抗性基因；
和/或，培养所述宿主细胞时，通过IPTG诱导以表达出目的蛋白；
和/或，培养所述宿主细胞时，在温度为16至19℃下培养所述宿主细胞；
和/或，培养所述的宿主细胞时，培养至OD600在0.6至0.8，后使用IPTG进行诱导，以表达出目的蛋白。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述分离所述目的蛋白的步骤包括：
将经破碎的目的蛋白上清液与流动相同时通过层析柱进行洗脱，收集洗脱液；
所述流动相包括BufferA和/或BufferB；
其中，BufferA包括三羟甲基氨基甲烷(Tris)和NaCl；
BufferB包括三羟甲基氨基甲烷(Tris)、甘油(Glycerol)和咪唑(Imidazole)。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，BufferA中三羟甲基氨基甲烷(Tris)和NaCl的体积比为1:1；
和/或，BufferB中，三羟甲基氨基甲烷(Tris)、甘油(Glycerol)和咪唑(Imidazole)的体积比为1:1:10。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述洗脱的程序包括第一阶段、第二阶段；
所述第一阶段中，使用的流动相为BufferA；
所述第二阶段中，使用的流动相为BufferA和BufferB的混合物，其中，BufferA的体积百分含量从100％逐渐降低至40％，BufferB的体积百分含量从0％逐渐增加至60％。
10.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：如权利要求1所述的多核苷酸；或者
如权利要求2或3中任一项所述的表达载体；或者
如权利要求4所述的宿主细胞；或者
根据权利要求5至9中任一项所述的方法所制备的末端脱氧核苷酸转移酶。
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