CN115896064A - 一种耐高温Bst DNA聚合酶及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种耐高温Bst DNA聚合酶及其制备方法与应用。本发明通过对天然Bst DNA聚合酶基因进行了随机突变，并进行高热稳定性的筛选，最终成功筛选得到一种耐高温Bst DNA聚合酶Bst‑M2，其氨基酸序列如序列表中序列6所示。通过实验证明，Bst‑M2与天然Bst和商业Bst DNA聚合酶的核酸聚合酶活性一致，但热稳定性大幅提升，在90℃加热处理后依然可保持酶活性，可将样本热裂解与核酸扩增反应在一管内完成，实现高度集成的一步法LAMP反应，从而大幅降低核酸污染风险和工作量，尤其适用于复杂结构模板的核酸检测和核酸即时检测，解决了目前核酸POCT中易出现核酸污染导致假阳性的技术短板。

Description

一种耐高温Bst DNA聚合酶及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种耐高温Bst DNA聚合酶及其制备方法与应用。

背景技术

近年随着非洲猪瘟疫情的发展，核酸检测技术已变得非常普及。而且核酸检测还被广泛应用于其他多种病原检测、遗传疾病诊断、法医鉴定以及食品致病菌的筛查。核酸检测技术基于应用场景主要分为两个方向，一种是偏重于实验室确诊检测的PCR技术，一种是适用于现场快速检测的等温扩增技术。PCR技术敏感、准确，因此被广泛用于医院、疫控和第三方检测机构的核酸检测。但由于PCR所需仪器设备昂贵，难以便携，而且对于检测人员和检测环境要求较高，使其不适用于现场快速检测、临床床边检测以及硬件条件欠佳环境的检测。目前对于核酸即时检测(POCT)的需求越来越大，流行疫病筛查、环境病原监测、食品致病菌鉴定等领域都需要实现现场、快速、高灵敏的核酸检测技术。等温扩增技术由于不需要大型仪器设备和专业实验室，而且检测时间仅为PCR技术的1/3-1/5，已被广泛应用于核酸POCT领域。

等温扩增技术根据核酸扩增原理不同，包括：基于核酸序列的扩增(nucleic acidsequence-based amplification，NASBA)、链置换扩增(strand displacementamplification，SDA)、环介导等温扩增(loop-mediated amplification，LAMP)、滚环扩增(rolling circle amplification，RCA)、信号介导的RNA技术扩增(signal mediatedamplification of RNA technology，SMART)、解旋酶-依赖性扩增(helicase-dependentamplification，HDA)、重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification，RPA)、切口核酸内切酶信号扩增(nicking endonuclease signal amplification，NESA)和切口核酸内切酶辅助纳米粒子激活(nicking endonuclease assisted nanoparticleactivation，NENNA)。尽管多个等温扩增技术被证明可用于核酸检测，但应用最广泛的依然是LAMP和RPA技术，而LAMP技术由于低廉的成本和高效的扩增效率，占据了核酸POCT超90％的市场。

尽管LAMP技术已被广泛应用于核酸POCT领域，但该技术依然存在一定的技术短板。核酸检测包括样本处理和核酸扩增两个关键环节，而核酸POCT由于环境条件限制，无法利用核酸提取仪进行样本核酸的提取，所以一般采用加热裂解病毒或细菌，使其核酸释放出来，进一步作为模板进行核酸扩增检测。这种两步法操作具有2个缺陷：1、由于开展POCT的环境不具备负压条件，热裂解后打开管盖转移模板的过程，释放的核酸分子容易形成气溶胶，从而造成核酸检测的假阳性结果；2、两步操作增大了工作量和污染的风险。因此，若能实现将热裂解与核酸扩增在一个反应管中不开盖完成，则能完美解决以上两个问题。然而，目前LAMP反应所需的Bst酶最适反应温度是60-65度，超过70度会迅速失活，使得该目标无法达成。因此，若能大幅提升Bst酶的热稳定性，将能够实现本目标。

Bst酶是来自嗜热脂肪地芽孢杆菌(以前称为嗜热脂肪芽孢杆菌)的耐热DNA聚合酶，它是负责DNA复制和修复的细胞机制的重要组成部分。根据氨基酸序列比较和蛋白晶体结构分析将DNA聚合酶超家族划分为A、B、C、D、X、Y和RT七个家族。Bst酶属于DNA聚合酶A家族，它同时具备5’-3’核酸外切酶活性、DNA聚合酶活性和链置换活性。由于外切酶活性会影响DNA聚合酶的效力，因此用于LAMP反应的Bst都是去除了其N端约300个氨基酸外切酶区域的Bst截短大片段，从而只保留了DNA聚合酶活性。为了提升LAMP反应的扩增效率，多个研究机构尝试对Bst酶进行改造。尽管对于Bst DNA聚合酶的改造取得了不错的成绩，然而目前依然没有研究实现大幅提升Bst DNA聚合酶的耐热性能，当前基于LAMP技术的核酸POCT领域依然对于更高耐受温度的Bst DNA聚合酶存在需求。

发明内容

本发明的目的是提供一种耐高温的Bst DNA聚合酶及其制备方法与应用。

为了实现上述目的，本发明首先提供了一种蛋白质，所述蛋白质为将Bst DNA聚合酶氨基酸序列的第13位的甲硫氨酸突变为亮氨酸，且将第94位的苯丙氨酸突变为亮氨酸，且将第118位的甲硫氨酸突变为亮氨酸，且将第158位的丙氨酸突变为脯氨酸，且将第283位的甘氨酸突变为天冬氨酸，且将第446位的脯氨酸突变为丝氨酸，且将第461位的谷氨酰胺突变为赖氨酸，且保持所述Bst DNA聚合酶其它氨基酸序列不变后得到的蛋白质。所述BstDNA聚合酶氨基酸序列如序列表中序列2所示。

上述蛋白质可为如下(a1)-(a3)中任一所述的蛋白质：

(a1)由序列表中序列6所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(a2)将(a1)所示的氨基酸序列经过除第13位、第94位、第118位、第158位、第283位、第446位和第461位氨基酸残基以外的一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；

(a3)将(a1)或(a2)所示的氨基酸序列的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

上述(a2)中，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，或不超过9个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，或不超过8个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，或不超过7个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，或不超过6个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，或不超过5个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，或不超过4个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，或不超过3个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，或不超过2个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，或不超过1个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述(a3)中，所述标签是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。

上述(a2)或(a3)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述任一所述蛋白质中，所述蛋白质的热稳定性高于所述Bst DNA聚合酶(序列2)。具体体现为经90℃热处理5min后依然具有良好的DNA聚合酶活性。

为了实现上述目的，本发明又提供了编码上述蛋白质的核酸分子。

本发明提供的编码上述蛋白质的核酸分子为如下(b1)-(b3)中任一所述的DNA分子：

(b1)核苷酸序列是序列表中序列5所示的DNA分子；

(b2)与(b1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性且编码上述蛋白质的DNA分子；

(b3)在严格条件下与(b1)或(b2)限定的核苷酸序列杂交且编码上述蛋白质的DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA。所述核酸分子可为编码所述蛋白质的基因及其调控序列形成的核酸分子。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码上述蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有编码上述蛋白质的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码上述蛋白质且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

上述(b2)中，所述同一性是指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列6所示氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，具有80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述75％或75％以上同一性可为至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。

上述(b3)中，所述严格条件可为在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min；或在0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min。

为了实现上述目的，本发明还提供了下述(c1)-(c3)中任一所述的生物材料：

(c1)含有上述核酸分子的表达盒；

(c2)含有上述核酸分子的重组载体；

(c3)含有上述核酸分子的重组菌。

上述(c1)中，所述表达盒是指能够在宿主细胞中表达上述蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动上述蛋白质编码基因序列转录的启动子，还可包括终止上述蛋白质编码基因序列转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。

上述(c2)中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述重组载体具体为将pET26b载体的NcoI和XhoI酶切位点间的DNA分子替换为编码上述蛋白质的核酸分子后得到的载体。

上述(c3)中，所述重组菌可为含有上述核酸分子的真菌或细菌。

进一步的，所述细菌可为大肠杆菌。所述重组菌是将编码上述蛋白质的核酸分子导入大肠杆菌后得到的菌。

更进一步的，所述重组菌是将上述重组载体导入大肠杆菌后得到的菌。

所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)。

为了实现上述目的，本发明还提供了制备上述蛋白质的方法。

本发明提供的制备上述蛋白质的方法包括如下步骤：使上述核酸分子在宿主菌中进行表达，得到上述蛋白质。

进一步的，所述方法包括如下步骤：将上述重组菌进行发酵培养，得到所述蛋白质。

更进一步的，所述发酵培养的方法可按照如下步骤进行：将上述重组菌接种至培养基中培养至OD_600nm＝0.7-0.8后加入IPTG进行诱导培养，得到发酵液，所述发酵液中含有上述蛋白质。

具体的，所述种子培养基可为含氨苄青霉素的LB液体培养基。

所述IPTG在发酵培养体系中的终浓度可为1mM。

所述诱导培养的条件可为37℃、200转/分(旋转半径为13mm)振摇诱导5小时。

为了实现上述目的，本发明还提供了一种试剂盒。

本发明提供的试剂盒包括上述蛋白质。

进一步的，所述试剂盒还包括除DNA聚合酶以外的其它用于进行LAMP反应的其它试剂，如反应缓冲液、dNTPs、水、荧光染料以及LAMP引物中的一种或多种。

为了实现上述目的，本发明还提供了下述(d1)-(d4)中任一所述的应用：

(d1)上述蛋白质在作为Bst DNA聚合酶中的应用；

(d2)上述核酸分子或上述生物材料在制备Bst DNA聚合酶中的应用；

(d3)上述蛋白质或上述核酸分子或上述生物材料或上述方法或上述试剂盒在进行LAMP反应中的应用；

(d4)上述蛋白质或上述核酸分子或上述生物材料或上述方法或上述试剂盒在核酸检测中的应用。

为了实现上述目的，本发明最后提供了(e1)或(e2)所述的方法：

(e1)一种进行LAMP反应的方法，包括以上述蛋白质作为Bst DNA聚合酶进行LAMP反应(如荧光LAMP反应或显色LAMP反应)的步骤；

(e2)一种核酸检测的方法，包括以上述蛋白质作为Bst DNA聚合酶进行LAMP反应(如荧光LAMP反应或显色LAMP反应)的步骤。

进一步的，所述方法中，样本热裂解与核酸扩增在一个反应管中完成。

再进一步的，所述方法还包括将含有上述蛋白质的LAMP检测体系先在90℃热裂解5分钟再进行LAMP反应的步骤。

更进一步的，上述蛋白质在所述LAMP检测体系中的浓度可为1μg/25μL。

上述任一所述应用或方法中，所述LAMP反应或核酸检测中的样本可为细菌样本(如大肠杆菌样本)或病毒样本(如乙肝病毒样本或非洲猪瘟病毒样本)。

本发明通过对Bst DNA聚合酶基因进行了随机突变，并进行高热稳定性Bst DNA聚合酶的筛选，最终成功筛选到一株酶活性与天然Bst DNA聚合酶和商业Bst DNA聚合酶一致，但热稳定大幅提升的Bst DNA聚合酶突变株，通过对Bst DNA聚合酶突变株进行测序，得到Bst DNA聚合酶突变体Bst-M2。相比天然Bst DNA聚合酶和商业Bst DNA聚合酶，Bst-M2具有更好的热稳定性，经90℃热处理后依然具有良好的DNA聚合酶活性，其可以用于常规的LAMP反应，同时还可以将样本热裂解和核酸扩增集成到一个反应管，实现高度集成的一步法LAMP反应，从而大幅降低核酸污染风险和工作量，尤其适用于复杂结构模板的核酸检测和核酸即时检测(POCT)，解决了目前核酸POCT中易出现核酸污染导致假阳性的技术短板。本发明通过优化改造Bst DNA聚合酶有效提升了Bst DNA聚合酶的热稳定性及Bst DNA聚合酶产品的性能。

附图说明

图1为琼脂糖电泳检测天然Bst DNA聚合酶和不同Bst DNA聚合酶突变体的LAMP扩增产物。

图2为荧光LAMP验证商业Bst DNA聚合酶、天然Bst DNA聚合酶和3个Bst DNA聚合酶突变体经不同温度预处理后的扩增效率差异。

图3为荧光LAMP验证商业Bst DNA聚合酶、天然Bst DNA聚合酶和3个Bst DNA聚合酶突变体的核酸检测灵敏度差异。

图4为显色LAMP验证商业Bst DNA聚合酶和Bst DNA聚合酶突变体Bst-M2的性能。

图5为荧光LAMP检测商业Bst DNA聚合酶和Bst DNA聚合酶突变体Bst-M2针对细菌的检测效率。

图6为荧光LAMP检测商业Bst DNA聚合酶和Bst DNA聚合酶突变体Bst-M2针对病毒的检测效率。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、Bst DNA聚合酶突变体基因的筛选和获得

一、Bst DNA聚合酶突变体表达菌株的制备

1、交由南京金斯瑞公司合成去除外切酶区域的天然Bst DNA聚合酶大片段的编码基因，该基因优化为大肠杆菌适应密码子，并在基因两端添加NcoI和XhoI限制性内切酶位点。合成的天然Bst DNA聚合酶大片段的编码基因序列如序列表中序列1所示，其编码的蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示。

2、采用错倾PCR技术在合成的天然Bst DNA聚合酶大片段的编码基因中引入随机突变，得到Bst随机突变基因文库。具体通过GeneMorph II随机突变试剂盒(安捷伦，货号为200550)完成，操作步骤参照试剂盒说明书。

3、将Bst酶随机突变基因文库克隆至pET26b载体(Novagen，货号为TB071)的NcoI和XhoI酶切位点间，得到克隆入Bst随机突变基因的pET26b重组质粒。

4、将克隆入Bst随机突变基因的pET26b重组质粒转化BL21(DE3)大肠杆菌感受态(全式金，货号为CD601-02)，涂布含50μg/mL氨苄青霉素(Merck，货号为69-52-3)和3.0g/L的乳糖(Merck，货号为63-42-3)的LB平板。30℃培养72小时。LB平板中的乳糖会诱导pET26b重组质粒表达Bst酶突变蛋白(重组蛋白)，表达的重组蛋白首先通过载体的pelB信号肽分泌到大肠杆菌的周质空间，随着诱导时间延长，周质空间中的重组蛋白会出现在菌落周围。

二、耐高温Bst酶的一次筛选

通过检测菌落周围的Bst酶活性，筛选目标突变Bst酶表达菌株。具体步骤如下：

1、Bst DNA聚合酶活性测定：Bst DNA聚合酶以DNA为模板合成DNA，本测定方案以活化的小牛胸腺DNA(MCE，货号为91080-16-9)为模板，反应体系中加入α-[³²P]标记的dATP(上海恒远生物，货号为PN102)，在DNA合成过程中，α-[³²P]标记的dATP会掺入新合成的DNA，通过检测DNA的放射性，从而可以判断Bst DNA聚合酶的活性。

2、配制反应体系：20mM Tris pH 9.0，10mM KCl，10mM(NH₄)₂SO₄，2mM MgCl₂，100μg/mL小牛胸腺DNA、0.2mM dNTP和0.5μCiα-[³²P]dATP。

3、剪取与细菌培养平板尺寸一致的DE81滤纸(Whatman，货号为3658-917)，浸泡在步骤2配制反应液中1小时。

4、取出浸泡的滤纸平铺在培养有转化重组质粒的大肠杆菌培养皿上，标记好滤纸与培养皿的对应位置，静置5分钟。

5、轻轻取下滤纸，平铺在已预热至90℃的玻璃平皿中，平皿用封口膜封住以保持滤纸水分，静置5分钟。热稳定性差的突变Bst酶将因高温失去酶活，只有热稳定性良好的突变Bst酶的酶活得以保留，继续检测其Bst DNA聚合酶活性，即可筛选到耐高温的突变Bst酶。

6、将平皿放置65℃水浴，反应1小时。

7、打开装有滤纸的平皿，放置55℃烘箱至彻底干燥。

8、将烘干的滤纸用2×SSC缓冲液(Merck，货号为S6630)冲洗两遍，晾干。

9、将晾干的滤纸与柯达X-OMATBT胶片重叠，用压片暗盒进行压片过夜，用显影定影试剂盒(钰博生物，货号为YB0020)处理X光片。

10、根据X光片的发光点找到对应菌落，挑取菌落接种到装有含50μg/mL氨苄青霉素(Merck，货号为69-52-3)液体LB培养基的96孔培养板，37℃培养至菌液浓度OD_600nm＝0.7-0.8。

11、加入终浓度为0.5mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG，Merck，货号为16758)，30℃，200转/分(旋转半径为13mm)，诱导24小时。

12、将96孔培养板5000g离心10分钟，收集菌液上清，进一步筛选鉴定。

结果显示：重组质粒转化BL21(DE3)大肠杆菌后，每块培养皿平均约生长500个菌落，总共转化了6000块培养皿，大约生成300万个单菌落，通过本轮筛选，总共获得67个耐高温Bst酶突变菌株。

三、耐高温Bst酶的二次筛选确认

1、采用荧光LAMP对筛选获得的67个耐高温Bst酶突变菌株表达的Bst DNA聚合酶突变体的酶活性和热稳定性进行鉴定。以非洲猪瘟核酸质控品(伟业计量，批号为BDS-IQC-1085)模板，采用荧光LAMP反应验证是否能够出现扩增曲线，非洲猪瘟特异引物选自《非洲猪瘟病毒等温扩增快速检测方法》地方标准(标准化：DB21/T3256—2020)，引物序列见表1，同时将天然Bst酶作为阳性对照。具体反应体系和反应条件见表2和表3。

表1、LAMP引物序列

引物名称	序列(5′-3′)
		ASFVF3	ATAGGTAATGCGATCGGATACA
ASFVB3	CCAACAATAACCGCCACGC
		ASFVFIP	TAACGCCACTATGCAGCCCACGGAAGAGCTGAATCTCTATCCT
ASFVBIP	CAACATGTGCGAACTTGTGCCACATACCTGGAACGTCTCC
		ASFVLF	TCGCCACGCAAAGATAAGC
ASFVLR	AGCCTCGGTGTTGATGCGGATT

表2、荧光LAMP反应体系

组分	体积(μL)
		10×buffer(NEB，货号为M0538)	2.5
<![CDATA[MgSO<sub>4</sub>(100mM)]]>	1.5
		dNTP(10mM)	3.5
天然或突变Bst酶	5
		外引物F3/B3(5μM)	1
内引物FIP/BIP(40μM)	1
		环引物LF/LB(10μM)	1
DNA模板	5
		荧光染料(NEB，货号为B1700S)	0.5
纯水	4
		总体积	25

表3、荧光LAMP扩增条件

温度(℃)	时间	荧光采集
			65℃	25分钟	每20秒采集1次荧光，共采集75次

选取荧光PCR结果能够形成扩增S曲线，而且LAMP Ct值偏低且峰高较高的突变Bst作为候选变异株。结果显示：经荧光LAMP鉴定，天然Bst酶能形成扩增S曲线，说明Bst表达制备流程无误。67个突变Bst中的8个突变Bst能够形成扩增S曲线，提示它们可能发生了LAMP反应。

由于LAMP反应会形成特殊的阶梯状DNA条带，为确认是否发生LAMP反应，进一步对天然Bst酶对照组和8个可形成扩增S曲线的突变Bst组扩增产物进行琼脂糖电泳。电泳结果如图1所示，其中，M为分子量标准，泳道1是天然Bst对照，2-9为8个突变体扩增产物，天然Bst形成了阶梯状DNA条带，而突变Bst组中有3个也出现明显的阶梯状DNA条带，提示这三个突变体可以进行LAMP反应。分别将其命名为Bst-M1、Bst-M2、Bst-M3。

进一步对3个Bst突变体进行基因测序分析，通过与天然Bst基因序列进行比对，发现3个Bst突变体均存在多个点突变。去除无义突变后，导致Bst-M1突变体的氨基酸突变位点分别是A15S、F47L、F94L、A158P、G413V、A489G；导致Bst-M2突变体的氨基酸突变位点分别是M13L、F94L、M118L、A158P、G283D、P446S、Q461K；导致Bst-M3突变体的氨基酸突变位点分别是E23K、G36C、V93G、A158P、V296M、P446S、S501C。

Bst-M1突变体基因序列如序列表中序列3所示，其编码的Bst-M1突变体的氨基酸序列如序列表中序列4所示；Bst-M2突变体基因序列如序列表中序列5所示，其编码的Bst-M2突变体的氨基酸序列如序列表中序列6；Bst-M3突变体基因序列如序列表中序列7所示，其编码的Bst-M3突变体的氨基酸序列如序列表中序列8所示。

实施例2、Bst DNA聚合酶突变体的制备与纯化

一、蛋白表达

1、分别将包含有天然Bst DNA聚合酶和3个Bst DNA聚合酶突变体Bst-M1、Bst-M2、Bst-M3的重组质粒pET26b-Bst、pET26b-Bst-M1、pET26b-Bst-M2、pET26b-Bst-M3转化BL21(DE3)感受态细胞，涂布含50μg/mL氨苄青霉素的LB平板。37℃培养15小时。

重组质粒pET26b-Bst为将pET26b载体的NcoI和XhoI酶切位点间的DNA分子替换为序列表中序列1所示的DNA分子，且保持pET26b载体其它序列不变后得到的质粒。

重组质粒pET26b-Bst-M1为将pET26b载体的NcoI和XhoI酶切位点间的DNA分子替换为序列表中序列3所示的DNA分子，且保持pET26b载体其它序列不变后得到的质粒。

重组质粒pET26b-Bst-M2为将pET26b载体的NcoI和XhoI酶切位点间的DNA分子替换为序列表中序列5所示的DNA分子，且保持pET26b载体其它序列不变后得到的质粒。

重组质粒pET26b-Bst-M3为将pET26b载体的NcoI和XhoI酶切位点间的DNA分子替换为序列表中序列7所示的DNA分子，且保持pET26b载体其它序列不变后得到的质粒。

2、挑取单菌落接种含50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃、100转/分(旋转半径为13mm)振摇培养至菌液OD_600nm＝0.7-0.8，加入终浓度1mM IPTG，37℃、200转/分(旋转半径为13mm)振摇诱导5小时。

3、将培养体系5000g离心10min，收集菌体沉淀(诱导后菌体)。用30mM Tris HClpH8.0、20％蔗糖、1mM EDTA(按每克菌体80mL计)悬浮后冰浴，轻轻振荡10分钟。

4、8000g离心10min，收集菌体，去除上清，沉淀菌体用5mM MgSO₄重悬，冰浴，轻轻振荡10分钟。

5、12000g离心15分钟，取上清即为细菌周质空间中表达的蛋白溶液(重组Bst DNA聚合酶蛋白溶液)。

二、蛋白纯化

分别将步骤一制备的各蛋白溶液进行纯化，最终获得4种Bst DNA聚合酶重组蛋白，分别是天然Bst DNA聚合酶和3个Bst DNA聚合酶突变体Bst-M1、Bst-M2、Bst-M3。具体纯化步骤如下：将制备的细菌周质空间蛋白溶液用结合缓冲液(20mM Tris，500mM NaCl，20mM咪唑，pH8.0)稀释5倍，然后用0.22μm滤径的针头滤器(Corning，货号为CLS431229)过滤；选用亲和层析柱HisTrap FF(GELife，货号为17-5286-01)进行纯化，将样品以0.3mL/分钟的速度加入层析柱中，用洗涤缓冲液(20mM Tris，500mM NaCl，60mM咪唑，pH8.0)清洗杂蛋白；用洗脱缓冲液(20mM Tris，500mM NaCl，200mM咪唑，pH8.0)将目标蛋白洗脱下来；收集目标洗脱峰，将收集的洗脱峰液再过HiLoad Superdex 200分子筛层析柱(GELife，货号为17-1071-01)，用不含甘油酶储存缓冲液(10mM Tris，50mM KCl，0.1mM EDTA，0.1％ TritonX-100，1mM DTT，pH7.5)以0.4mL/分钟的速度分离目的蛋白，收集目标洗脱峰，用0.22μm滤径的针头滤器(Corning，货号为CLS431229)过滤纯化的重组Bst DNA聚合酶蛋白溶液。纯化后的Bst DNA聚合酶蛋白溶液通过BCA法(ThermoFisher，货号为A53225)进行蛋白定量，加入等体积灭菌甘油混合，-20℃保存。

实施例3、Bst DNA聚合酶突变体的鉴定

一、不同处理温度的酶活鉴定

以非洲猪瘟核酸质控品(伟业计量，批号为BDS-IQC-1085)为模板，采用荧光LAMP反应验证实施例2中制备的天然Bst DNA聚合酶(下文简称为天然Bst酶)和3个Bst DNA聚合酶突变体Bst-M1、Bst-M2、Bst-M3(下文分别简称为Bst-M1酶、Bst-M2酶、Bst-M3酶)在不同温度下的稳定性。每种Bst根据处理方式不同设置4组，分别是未做加热处理的对照组，以及分别在70℃、80℃和90℃热处理5分钟的测试组。非洲猪瘟特异引物序列见表1，同时将商业Bst DNA聚合酶(NEB，货号为M0538，下文简称为商业Bst酶)作为对照。具体反应体系见表2，区别仅在于将重组Bst酶加入量修改为1μg/反应。将配制的反应体系首先分别放置3种不同温度温浴5分钟，然后放入荧光PCR启动LAMP反应，反应条件见表3。

结果如图2所示，其中，深蓝色曲线为Bst-M1，红色曲线为Bst-M2，绿色曲线为Bst-M3，紫色曲线为商业Bst酶，浅蓝色曲线为天然Bst酶。从图中可以看到，商业Bst酶、天然Bst酶和3个Bst酶突变体在未进行热处理的情况下，都能够形成明显的S型扩增曲线，而且Ct值和峰高接近。Bst-M2酶和Bst-M3酶的Ct值最小，商业Bst酶和天然Bst酶相近，Bst-M1酶的Ct值最大。

当进行70℃热处理后，5组Bst依然能够实现LAMP扩增，但是商业Bst酶、天然Bst酶和Bst-M1酶的Ct值明显变大，而且天然Bst酶峰高开始变矮。提示这三种Bst酶活性受到影响，出现部分酶活损失。而Bst-M2酶和Bst-M3酶的Ct值未发生明显变化，提示其具备更好的热稳定性。

当进行80℃热处理后，5组Bst酶依然能够实现LAMP扩增，但是商业Bst酶和天然Bst酶的Ct值进一步变大，而且两者峰高明显变矮。提示这两种Bst酶活性受到严重影响，出现大部分酶活损失。而且，Bst-M1酶和Bst-M3酶的Ct值也进一步变大，峰高开始变矮，提示这两个Bst酶突变体的酶活也受到了明显影响，而Bst-M2酶依然能够实现良好的LAMP反应，Ct值略有降低(32至37)，峰高未出现变化。

当进行90℃热处理后，5组Bst酶只有3个Bst酶突变体能够实现LAMP扩增，商业Bst酶和天然Bst酶已无Ct值，提示这两种Bst酶已完全失活。另外，尽管Bst-M1酶和Bst-M3酶有扩增，但Ct值已明显延后，峰高也明显变矮，提示这两个Bst酶突变体的酶活也大幅损失。而Bst-M2酶依然能够实现良好的LAMP反应，Ct值仅从37降低至45，峰高未出现变化。

因此，可以得出结论，相比商业Bst酶、天然Bst酶和另外两个Bst酶突变体，Bst-M2表现出了良好的热稳定性，在90℃处理5分钟后，依然保留了绝大部分酶活性。

二、Bst-M2突变体检测灵敏度鉴定

为确认Bst-M2酶能否用于高灵敏的核酸检测，以非洲猪瘟核酸质控品(伟业计量，批号为BDS-IQC-1085)为模板，用纯水将其进行10倍梯度稀释，得到浓度分别为10⁶拷贝/mL、10⁵拷贝/mL、10⁴拷贝/mL、10³拷贝/mL、10²拷贝/mL的模板。然后分别用商业Bst酶(NEB，货号为M0538)和Bst-M2酶建立荧光LAMP反应体系。具体反应体系见表2，只是将重组Bst-M2酶加入量修改为1μg/反应。

结果如图3所示，商业Bst酶和Bst-M2酶的最低检出限均达到10³拷贝/mL，两者检测灵敏度无差异，证明Bst-M2酶可用于基于LAMP技术的高灵敏度核酸检测。

三、LAMP显色法鉴定酶活鉴定

由于LAMP反应时，Bst DNA聚合酶发挥聚合作用，改变体系中质子数量进而改变PH值，通过添加PH指示剂，即可实现通过观察反应液颜色变化而鉴定核酸扩增结果，目前已有显色法LAMP核酸检测试剂上市。为了确认筛选获得的Bst-M2酶可用于显色法LAMP反应，采用两种不同显色剂(红绿和红黄)的Low-buffer(魔力维克，货号为MV3121和MV3122)对Bst-M2酶进行了鉴定，同时将商业Bst酶(NEB，货号为M0538)作为对照。以非洲猪瘟核酸质控品(伟业计量，批号为BDS-IQC-1085)为模板，非洲猪瘟特异引物序列见表1，反应体系见表4。配制反应体系后，65℃反应30分钟，观察管中反应液颜色变化。

表4、荧光LAMP反应体系

组分	体积(μL)
		2×Low-buffer(货号为MV3121或MV3122)	12.5
商业Bst或突变Bst-M2酶(1mg/mL)	1
		外引物F3/B3(5μM)	1
内引物FIP/BIP(40μM)	1
		环引物LF/LB(10μM)	1
DNA模板	5
		纯水	3.5
总体积	25

结果如图4所示，商业Bst酶和Bst-M2酶实现扩增后，均出现了预期颜色变化，两者无差异，证明Bst-M2酶可用于显色法LAMP反应。

实施例4、Bst-M2 DNA聚合酶的应用

为了进一步确认筛选获得的Bst-M2酶能否实现将样本热裂解和核酸扩增两个反应在一个反应管内完成。分别选择细菌(大肠杆菌)和病毒(乙肝病毒)作为待检样本，比较两步法(热裂解和核酸扩增分开)和一步法(热裂解和核酸扩增合并)的检测灵敏度差异。将大肠杆菌标准物质(伟业计量，货号为BNCC353719)和乙肝病毒标准物质(伟业计量，货号为GBW(E)090139)用0.9％生理盐水进行10倍梯度稀释，稀释倍数分别为10、100、1000、10000、100000、1000000倍，平均分成3组，第一组进行90℃热裂解5分钟，然后作为LAMP反应的模板(两步法)；第二组直接作为LAMP反应的模板，只是在LAMP反应前将配制的LAMP检测体系先90℃热裂解5分钟(一步法)；第三组是未进行热裂解处理的一步法对照。LAMP反应所需引物序列见表5，反应体系见表6，反应条件见表7。

表5、LAMP引物序列

表6、荧光LAMP反应体系

组分	体积(μL)
		10×buffer(NEB，货号为M0538)	2.5
<![CDATA[MgSO<sub>4</sub>(100mM)]]>	1.5
		dNTP(10mM)	3.5
Bst-M2酶	1
		外引物F3/B3(5μM)	1
内引物FIP/BIP(40μM)	1
		环引物LF/LB(10μM)	1
细菌或病毒模板	5
		荧光染料(NEB，货号为B1700S)	0.5
纯水	8
		总体积	25

表7、荧光LAMP扩增条件

温度(℃)	时间	荧光采集
			65℃	25分钟	每20秒采集1次荧光，共采集75次

结果如图5和图6所示，基于Bst-M2酶建立的一步法和两步法LAMP，针对细菌和病毒样本具有一致的最低检出限，两者检测灵敏度无差异，而未进行热处理的一步法检测效率明显下降，提示热处理可使一步法反应管内样本有效裂解释放核酸。结果证明Bst-M2酶可用于建立一步法LAMP技术。

上述结果表明，本发明筛选获得的DNA聚合酶突变体Bst-M2比天然Bst酶和商业Bst酶具有更好的热稳定性，经90℃热处理后依然具有良好的DNA聚合酶活性，其可以用于常规的LAMP反应，同时还可以将样本热裂解和核酸扩增集成到一个反应管，实现高度集成的一步法LAMP反应，从而大幅降低核酸污染风险和工作量，尤其适用于核酸POCT检测，解决了目前核酸POCT中易出现核酸污染导致假阳性的技术短板。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请预包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (10)

1.一种蛋白质，所述蛋白质为将Bst DNA聚合酶氨基酸序列的第13位的甲硫氨酸突变为亮氨酸，且将第94位的苯丙氨酸突变为亮氨酸，且将第118位的甲硫氨酸突变为亮氨酸，且将第158位的丙氨酸突变为脯氨酸，且将第283位的甘氨酸突变为天冬氨酸，且将第446位的脯氨酸突变为丝氨酸，且将第461位的谷氨酰胺突变为赖氨酸，且保持所述Bst DNA聚合酶其它氨基酸序列不变后得到的蛋白质。

2.根据权利要求1所述的蛋白质，其特征在于：所述蛋白质为如下(a1)-(a3)中任一所述的蛋白质：

(a1)由序列表中序列6所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(a2)将(a1)所示的氨基酸序列经过除第13位、第94位、第118位、第158位、第283位、第446位和第461位氨基酸残基以外的一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；

(a3)将(a1)或(a2)所示的氨基酸序列的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

3.编码权利要求1或2所述蛋白质的核酸分子。

4.根据权利要求3所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子为如下(b1)-(b3)中任一所述的DNA分子：

(b1)核苷酸序列是序列表中序列5所示的DNA分子；

(b2)与(b1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性且编码权利要求1或2所述蛋白质的DNA分子；

(b3)在严格条件下与(b1)或(b2)限定的核苷酸序列杂交且编码权利要求1或2所述蛋白质的DNA分子。

5.下述(c1)-(c3)中任一所述的生物材料：

(c1)含有权利要求3或4所述核酸分子的表达盒；

(c2)含有权利要求3或4所述核酸分子的重组载体；

(c3)含有权利要求3或4所述核酸分子的重组菌。

6.根据权利要求5所述的生物材料，其特征在于：所述重组载体为将pET26b载体的NcoI和XhoI酶切位点间的DNA分子替换为编码权利要求1或2所述蛋白质的核酸分子后得到的载体。

7.制备权利要求1或2所述蛋白质的方法，包括如下步骤：使权利要求3或4所述的核酸分子在宿主菌中进行表达，得到权利要求1或2所述的蛋白质。

8.试剂盒，其包括权利要求1或2所述的蛋白质。

9.下述(d1)-(d4)中任一所述的应用：

(d1)权利要求1或2所述的蛋白质在作为Bst DNA聚合酶中的应用；

(d2)权利要求3或4所述的核酸分子或权利要求5或6所述的生物材料在制备Bst DNA聚合酶中的应用；

(d3)权利要求1或2所述的蛋白质或权利要求3或4所述的核酸分子或权利要求5或6所述的生物材料或权利要求7所述的方法或权利要求8所述的试剂盒在进行LAMP反应中的应用；

(d4)权利要求1或2所述的蛋白质或权利要求3或4所述的核酸分子或权利要求5或6所述的生物材料或权利要求7所述的方法或权利要求8所述的试剂盒在核酸检测中的应用。

10.下述(e1)或(e2)所述的方法：

(e1)一种进行LAMP反应的方法，包括以权利要求1或2所述的蛋白质作为Bst DNA聚合酶进行LAMP反应的步骤；

(e2)一种核酸检测的方法，包括以权利要求1或2所述的蛋白质作为Bst DNA聚合酶进行LAMP反应的步骤。

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