CN110669766A - 粘附素核酸适配体及其筛选方法和应用 - Google Patents

粘附素核酸适配体及其筛选方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种黏附素适配体及筛选该黏附素适配体的方法，本发明以幽门螺杆菌基因组DNA为模板，扩增得到其黏附素基因，将得到的基因与表达载体连接获得筛选靶标，再将筛选靶标与随机单链ssDNA文库孵育，SELEX筛选，PCR扩增文库，然后经多轮筛选得到黏附素核酸适配体。本发明还公开了该黏附素适配体在制备幽门螺杆菌的检测试剂盒以及制备幽门螺杆菌免疫药物中的应用。本发明的黏附素核酸适配体具有较高的亲和力与特异性，分子量小、渗透性强，相对现有技术能够更直观的反应机体感染Hp的状况。

Description

粘附素核酸适配体及其筛选方法和应用
技术领域
本发明涉及核酸适配体及其筛选和应用，尤其涉及一种可用于检测幽门螺杆菌的核酸适配体及其筛选方法和应用。
背景技术
核酸适配体是采用指数富集的配基系统进化技术(Systematic Evolution ofLigands by Exponential Enrichment，SELEX)从随机单链寡核苷酸库中筛选出的能与靶物质高特异性、高亲和力的配体。利用SELEX筛选的核酸适配体具有亲和力高、性能稳定、分子量低、免疫原性低、易于修饰改造且无毒副作用等优点。
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，H.pylori，Hp)感染与胃癌的高发密切相关，全球Hp感染率约为50％，亚洲地区感染率高达70％，我国的平均感染率约为59％。Hp感染人体的机制主要是其菌体通过黏附作用与胃黏膜上皮细胞结合定植于胃黏膜层。黏附过程中Hp能够激活胃黏膜上皮细胞内多种信号通路并分泌多种致病相关因子，继而引发细胞增生、凋亡、过度炎症反应等病理表现，进而促使Hp向黏膜内深层定植。由此可见，Hp与胃粘膜上皮细胞的黏附是其侵袭机体致病过程的关键环节。
Hp进行黏附的物质基础为黏附素，黏附素的种类较多且在黏附过程中占主导地位。目前发现有多种Hp黏附素蛋白(如Hpa A、Bab A、Sab A、Alp A/B、Oip A、Hop Z)能通过与胃黏膜上皮细胞的紧密结合而发挥其定植作用。其中Hpa A在Hp在定植、致病各阶段中均发挥及其重要的作用，且有望成为幽门螺杆菌检测、预防的靶标。因而筛选黏附素相应的配基，通过配基阻断粘附素的黏附作用对清除Hp有积极的意义。因此，利用SELEX的特性针对Hpa A筛选出相应的配基对胃黏膜内Hp诊疗有非常重要的意义。
目前临床针对Hp的感染的检测主要以C14呼气试验和快速尿酶试验为主要手段，其原理主要基于Hp尿素酶催化尿素分解。但是C14呼气试验因为有一定的放射性，或多或少的对婴儿和未成年的健康造成损伤；且近期内服用过抗生素及空腹程度也会对呼气试验结果的判读造成影响。而快速脲酶实验往往会因为取材中Hp数量的关系以及近期服用抗生素造成一定程度的假阴性。目前临床实验室中常用的外周血中Hp抗体的检测更为广泛，但是其对患者病程的判断仍然存在不足。而且目前培养技术仍未能标准化、商品化，亟待一种能够对以上方法进行补充的检测手段。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明提供一种特异性靶向粘附素Hpa A的适配体，还提供了上述黏附素适配体的筛选方法，其基于SELEX技术，针对黏附素Hpa A筛选相应的配基并验证其余之结合的特性，为进一步探索该方法进行胃黏膜内Hp诊疗的可行性奠定了基础。
为了实现上述目的，本发明采用了下述技术方案：
一种黏附素核酸适配体，所述核酸适配体的核苷酸序列含有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；或含有以下任意一种核苷酸序列：与SEQ ID NO.1限定的核苷酸序列同源性在60％以上、与SEQ ID NO.1限定的核苷酸序列进行杂交的序列、SEQ ID NO.1限定的核苷酸序列转录的RNA序列。
进一步地，所述核酸适配体的核苷酸序列被甲基化、巯基化、磷酸化、氨基化或同位素化。
进一步地，所述核酸适配体的核苷酸序列上连接有荧光物质、治疗性物质、放射性物质、生物素、地高辛、纳米发光材料或酶标记。
一种上述的核酸适配体的的筛选方法，包括以下步骤：
(1)以幽门螺杆菌基因组DNA为模板，PCR扩增得到幽门螺杆菌黏附素(Hpa A)基因；
(2)将得到的基因与表达载体Pet28a质粒经酶切后连接，连接产物转入大肠杆菌E.coli BL21菌株并诱导表达，裂解细菌，纯化，获得的重组粘附素Hpa A即为筛选靶标；
(3)将步骤(2)得到的黏附素Hpa A与ssDNA文库进行孵育，收集与筛选靶标结合的ssDNA；
(4)将得到的ssDNA进行PCR扩增，得到dsDNA；
(5)得到的dsDNA与pUC19质粒经酶切后连接，并转入大肠杆菌E.coli DH5α菌株；
(6)选取阳性克隆测序，并验证阳性克隆扩增得到的ssDNA与Hpa A的结合力，得到核酸适配体。
进一步地，步骤(1)中Hpa A引物序列为：
F:5’-CGGATCCTGCAGCCCGCATATTATTG-3’；
R:5’-CAAGCTTTCGGTTTCTTTTGCCTTTT-3’。
进一步地，步骤(3)中，ssDNA文库包括序列：
5’-CGGATCCATCCAGAGTGACGCAGCA-N45-TGGACACGGTGGCTTAGT-3’；
引物P1：5’-CGGATCCATCCAGAGTGACGCAGCA-3’；
引物P2：5’-GAAGCTTACTAAGCCACCGTGTCCA-3’。
进一步地，步骤(3)中，将纯化的粘附素Hpa A包被于聚苯乙烯微孔中，然后将合成的ssDNA文库溶于筛选缓冲液投入其中，洗下结合的ssDNA作为下一轮的模板；第五轮后以空白孔为负向筛选介质。
本发明还提供了上述的黏附素核酸适配体或其衍生物在制备检测幽门螺杆菌的试剂盒、分子探针或靶向介质中的应用。
一种幽门螺杆菌检测试剂，含有权利要求上述的黏附素核酸适配体。
本发明还提供了上述的黏附素核酸适配体或其衍生物在制备抗幽门螺杆菌疫苗中的用途。所述黏附素适配体的衍生物可以是上述的和配体的核苷酸序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架。
与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：
本发明得到的具有较高亲和力的核酸适配体具有较强的区分Hp的能力；在胃黏膜冰冻切片中验证其与Hp的结合时，结合荧光标记，能够更灵敏的检测出菌体，相对于C14呼气试验和快速脲酶实验，其更能够直观的反应机体感染Hp的状况，特异性结合Hp菌体表面的Hpa A适配体的筛选能够应用于胃粘膜组织Hp感染的检测。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。在所有附图中，类似的元件或部分一般由类似的附图标记标识。附图中，各元件或部分并不一定按照实际的比例绘制。
图1为PCR扩增Hpa A基因琼脂糖凝胶电泳图；
图2为重组pET28a/Hpa A质粒酶切后琼脂糖凝胶电泳图；
图3为重组pET28a/Hpa A质粒测序结果的比对图；
图4为Hpa A蛋白在大肠杆菌DE3中的诱导表达的SDS-PAGE凝胶电泳图；
图5为重组Hpa A蛋白的纯化后的SDS-PAGE凝胶电泳图；
图6为纯化的重组蛋白Hpa A的HPLC图；
图7为不同轮数文库的相对结合力的比较结果图；
图8为限制性内切酶酶切鉴定分析适配体单克隆图；
图9为不同单克隆适配体对5种菌株检测性能的比较结果图；
图10为适配体HA6全长序列及核心序列结合力的检测结果图；
图11为激光共聚焦验证适配体与H.pylori的结合结果图；
图12为流式细胞检测适配体HA6阻断Hp与GES-1的结合结果图。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。
需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。以下实施例中的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。实施例中中所用材料如无特殊说明，均为常规生化试剂商店购买得到。
实施例1、适配体的筛选
1、实验材料
菌株来源：Hp ATCC26695菌株来自江苏大学。
ssDNA文库：
5’-CGGATCCATCCAGAGTGACGCAGCA-N45-TGGACACGGTGGCTTAGT-3’
和引物P1：5’-CGGATCCATCCAGAGTGACGCAGCA-3’
引物P2：5’-GAAGCTTACTAAGCCACCGTGTCCA-3’；均由上海生物工程公司提供。
哥伦比亚培养基购自青岛海博生物技术公司。
胎牛血清购自Gibco公司。
限制性内切酶BamH I、Hind III及T4连接酶购自Fermentas公司。
DNA marker、蛋白marker购自北京兰博利德生物公司。
微需氧产气袋购自三菱公司。
PCR mix反应液购自Thermo公司。
卡那霉素、庆大霉素购自Sigma公司。
鳜鱼精DNA购自Sigma公司。
2、Hp培养及pET28a/Hpa A重组质粒构建
2.1 Hp培养
称取哥伦比亚培养基44克溶于900ml纯水，121℃高压灭菌15分钟冷却至45℃加入50ml无菌脱纤维羊血、50ml胎牛血清及20mg庆大霉素，混匀后倾倒入无菌平皿备用。将幽门螺杆菌菌株密集划线涂布于平板上，置于微需氧罐中加适量灭菌水和微需氧产气袋密闭后置于37℃培养箱。待菌株培养合格后，刮取Hp菌膜，用细菌基因提取试剂盒提取Hp基因组DNA并鉴定。
2.2 pET28a/Hpa A重组质粒构建
引物设计及合成：
设计Hpa A(Gene ID:898975)引物，序列如下：
F:5’-CGGATCCTGCAGCCCGCATATTATTG-3’(BamH I，25μmol/L)；
R:5’-CAAGCTTTCGGTTTCTTTTGCCTTTT-3’(Hind III，25μmol/L)；
基因扩增：以提取的基因组DNA为模板，PCR扩增，反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环，72℃延伸5min，电泳鉴定产物。本发明的实施例从ATCC26695提取基因组，通过引物成功克隆出不含27aa的信号肽的Hpa A基因长度699bp，共长713bp，如图1所示。
pET28a/Hpa A重组质粒构建：使用PCR产物回收试剂盒回收扩增获得的Hpa A基因。分别将PCR扩增片段和质粒pET28a用BamH I和Hind III限制性内切酶在37℃下酶切2h，使用DNA回收试剂盒分别回收2种酶切产物。将回收的片段酶切产物和质粒酶切产物按照摩尔数9:1混合于T4连接酶反应体系中，16℃下反应4h。取10ul反应体系与50ul E.coli DE3感受态混匀后置于冰浴30分钟，置于42℃水浴90s，然后置于冰浴15min。将上述混合试剂加至500ul LB培养基，37℃静置1h，然后取200ul涂布于抗性LB琼脂平板(卡那霉素终浓度：50ug/mL)，37℃培养过夜。挑取单克隆LB液体培养基(含卡那霉素终浓度：50ug/mL)增菌提取质粒，使用BamH I和Hind III酶切鉴定，酶切小片段约在700左右，如图2所示。对鉴定为阳性克隆的质粒测序，经比对序列100％一致，无移码突变，质粒命名为pET28a/Hpa A，如图3所示。
3、重组Hpa A蛋白的诱导表达、纯化及鉴定
将转化pET28a/Hpa A重组质粒的E.coli BL21于含卡那霉素的LB液体培养基中培养至OD 600nm约为0.8，37℃加入1mmol IPTG诱导4小时后，离心收集细菌。SDS-PAGE电泳，在分子量约30kD附近有丰度较高的蛋白表达，如图4所示。图4中为SDS-PAGE凝胶电泳分析重组Hpa A蛋白在大肠杆菌DE3中的诱导表达：M：蛋白marker，1、2、3、4泳道分别为IPTG诱导1h、2h、3h、4h时大肠杆菌DE3菌体裂解物，5泳道为未转化重组质粒的细菌裂解；箭头所示为重组Hpa A蛋白条带。
向收集的细菌加入10mg/mL溶菌酶溶液，4℃过夜。高压均质仪处理后，4℃下10000g离心30min，取上清液用Ni-NAT柱子亲和纯化，分别用5倍柱体积20mmol、40mmol咪唑洗涤3次，200mmol咪唑洗脱。将洗脱下来的目的蛋白冷冻干燥后进行SDS-PAGE电泳鉴定及HPLC鉴定，如图5和图6所示。图5中，M：蛋白marker，1泳道为纯化的重组蛋白Hpa A。经Ni-NAT纯化洗脱后的重组Hpa A分子量约28kD，经灰度扫描分析和HPLC鉴定其纯度约为98％；将条带切胶送交公司行肽指纹图谱分析鉴定，检测结果为helicobacter pyloriATCC26695来源的Hpa A蛋白，如表1所示。
表1肽指纹图谱分析重组蛋白与HpaA氨基酸序列一致性
Figure BDA0002220456190000061
4、SELEX筛选
筛选缓冲液：20mM HEPES，PH＝7.4，120mM NaCl，5mM KCl，1mM CaCl2，1mM MgCl2·6H2O。
初始ssDNA文库，包括文库序列：
5’-CGGATCCATCCAGAGTGACGCAGCA-N45-TGGACACGGTGGCTTAGT-3’(BamH I)(88nt)；
引物P1：5’-CGGATCCATCCAGAGTGACGCAGCA-3’(BamH I)；
引物P2：5’-GAAGCTTACTAAGCCACCGTGTCCA-3’(Hind III)；
利用微孔板法进行SELEX筛选。溶解初始ssDNA文库。用pH 9.6碳酸盐缓冲液溶解10ng纯化的HpaA蛋白，包被于聚苯乙烯微孔，鳜鱼精DNA37℃封闭1小时。取2nmol初始ssDNA文库，95℃加热5min后迅速置于冰水中5min，加入微孔中37℃孵育1小时，弃去上清液，用筛选缓冲液洗涤微孔3次，每次5min。微孔中加入100ul H2O，95℃加热5min。
将结合的ssDNA洗脱液用PCR扩增，作为下一轮筛选的文库。PCR扩增反应条件：95℃预变性5min，95℃30s，60℃30s，72℃20s，共12个循环，72℃延伸5min。
在第5轮加入鳜鱼精DNA封闭的微孔反向筛选，收集上清中ssDNA行PCR扩增，作为下一轮正向筛选的文库，扩增条件：95℃预变性5min，95℃30s，60℃30s，72℃20s，共10个循环，72℃延伸5min。
经由10轮的正向筛选和5轮的负向筛选后，分别对收获的10轮文库的相对结合力进行检测，数据显示第1轮到第5轮的相对结合力呈上升趋势，第5轮后负向筛选的加入使得相对结合力暂时下降，但随着筛选轮数的增加结合力其相对结合力仍呈增高趋势，且高于前5轮，如图7所示。图7中，ns表示两组间差异无统计学意义；**差异具有显著的统计学意义。
5、适配体结合特性的鉴定
将最后一轮获得的ssDNA行PCR扩增为dsDNA，与pUC19质粒分别经双酶切(BamH I和Hind III)酶切后，按照试剂盒说明回收酶切片段。将PCR酶切片段与质粒酶切产物按照物质的量5:1混合，然后在T4连接酶反应体系中16℃连接4小时，后转化入E.coli DH5α大肠杆菌中，于氨苄青霉素抗性LB固体培养基上37℃过夜培养。挑取单克隆菌落增菌培养并提取质粒，将提取的质粒使用双酶切(BamH I和Hind III)鉴定。将酶切阳性的质粒使用Bio-P1扩增，得到的ssDNA与Hpa A结合，并验证其相对结合力。
在将第10轮适配体扩增为双链并克隆进pUC19质粒中，挑选的43个克隆经酶切鉴定其中有40个阳性克隆，如图8所示。
将相对结合力较高的6个单克隆适配体与多种菌体结合，验证其结合特异性。将特异性较高的2个单克隆适配体(记为HA3和HA6适配体)进行亲和力的测定，结果如图9所示。
随后对两个适配体的亲和力进行检测，HA3和HA6适配体的KD值分别为：8.531±1.59nM和6.520±1.489nM，如图10所示。图10中，图(A)为适配体HA6全长序列结合力的检测；图(B)为适配体HA6核心序列结合力的检测。
实施例2、适配体检测效能验证
将酶切阳性后最终筛选获得的2个适配体的质粒测序，并合成FAM标记的核心区序列，用两适配体在胃黏膜组织切片中检测HP。将取出的新鲜胃粘膜做冰冻切片，固定在多聚赖氨酸处理的载玻片上，将合成的FAM标记的适配体以10μmol浓度投入并覆盖检测区，避光孵育20分钟，筛选缓冲液洗涤玻片5次，甩干后用荧光显微镜检测。
最后得到的适配体的一级序列为：
CGTTACGATCGGATCCAATGCATTTGCGCATATCGTAACCGATAG，即SEQ ID NO.1。
在荧光显微镜下观察荧光，有荧光记为阳性：(+)；无荧光记为阴性：(-)，如图11所示。图11中，图(A)为FAM标记的适配体HA6与H.pylori的结合；(B)为罗丹明染料与H.pylori的着色；(C)为将(A)(B)两图合并后的图。
并将所检测结果与患者的C14呼气试验及快速脲酶实验比对。与患者的快速脲酶实验(RUT法)比对发现，其符合率较高，且两种方法无统计学差异，如表2所示。
表2两种方法对166份胃粘膜标本中幽门螺杆菌的检出率的比较
Figure BDA0002220456190000081
实施例3流式细胞检测HA6阻断HP与GES-1细胞结合
使用罗丹明B将HP染色，加入不同剂量梯度的适配体HA6，孵育后与GES-1细胞结合，并通过流式细胞仪检测GES-1细胞上附着Hp的比例，如图12所示。
现有研究对原核表达的粘附素行结构分析，其与天然的粘附素结构一致，因此针对其三维构象筛选配基切实可行。本发明基于对胃粘膜中Hp的检测，选择了丰度较高的HpaA。本发明对该蛋白260位氨基酸功能区进行分析，其1-27位氨基酸为信号肽，134-139位氨基酸为结合的功能区，随后对编码28-259位氨基酸的基因进行扩增、克隆。
纯化的过程中，使用Ni-NAT亲和层析柱进行纯化，并使用HPLC鉴定纯度，其纯度约98％，满足筛选的要求。经过10轮的正向筛选和5轮的负向筛选后，将最后一轮适配体文库克隆，对选取的阳性克隆PCR扩增得32种适配体相对结合力进行检测，选取6个相对结合力较高的适配体行检测特异性检测。经检测后发现有两种适配体具有较强的区分Hp的能力，随后对适配体全长和核心序列(45nt)结合力进行比较，其结合力差异无统计学意义。遂在胃黏膜冰冻切片中验证其与Hp的结合，适配体凭借其分子量小、渗透性强，结合荧光标记，能够更灵敏的检测出菌体。
本发明利用核酸适配体的体外筛选技术SELEX技术，筛选了Hpa A的相应的配基，并使用该配基对胃粘膜中Hp进行了检测。本发明的Hp黏附素Hpa A核酸适配体的筛选方法相对于C14呼气试验和快速脲酶实验，能够更加直观的反应机体感染Hp的状况。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。
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<213> 人工序列
<400> 1
cgttacgatc ggatccaatg catttgcgca tatcgtaacc gatag 45

Claims (10)

1.一种黏附素核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体的核苷酸序列含有SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列；或含有以下任意一种核苷酸序列：与SEQ ID NO.1限定的核苷酸序列同源性在60％以上、与SEQ ID NO.1限定的核苷酸序列进行杂交的序列、SEQ ID NO.1限定的核苷酸序列转录的RNA序列。
2.根据权利要求1所述的黏附素核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体的核苷酸序列被甲基化、巯基化、磷酸化、氨基化或同位素化。
3.根据权利要求1或2所述的黏附素核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体的核苷酸序列上连接有荧光物质、治疗性物质、放射性物质、生物素、地高辛、纳米发光材料或酶标记。
4.一种权利要求1所述的核酸适配体的的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)以幽门螺杆菌基因组DNA为模板，PCR扩增得到幽门螺杆菌黏附素(Hpa A)基因；
(2)将得到的基因与表达载体Pet28a质粒经酶切后连接，连接产物转入大肠杆菌E.coli BL21菌株并诱导表达，裂解细菌，纯化，获得的重组粘附素Hpa A即为筛选靶标；
(3)将步骤(2)得到的黏附素Hpa A与ssDNA文库进行孵育，收集与筛选靶标结合的ssDNA；
(4)将得到的ssDNA进行PCR扩增，得到dsDNA；
(5)得到的dsDNA与pUC19质粒经酶切后连接，并转入大肠杆菌E.coli DH5α菌株；
(6)选取阳性克隆测序，并验证阳性克隆扩增得到的ssDNA与Hpa A的结合力，得到核酸适配体。
5.如权利要求4所述的筛选方法，其特征在于，步骤(1)中Hpa A引物序列为：
F:5’-CGGATCCTGCAGCCCGCATATTATTG-3’；
R:5’-CAAGCTTTCGGTTTCTTTTGCCTTTT-3’。
6.如权利要求4所述的筛选方法，其特征在于，步骤(3)中，ssDNA文库包括序列：
5’-CGGATCCATCCAGAGTGACGCAGCA-N45-TGGACACGGTGGCTTAGT-3’；
引物P1：5’-CGGATCCATCCAGAGTGACGCAGCA-3’；
引物P2：5’-GAAGCTTACTAAGCCACCGTGTCCA-3’。
7.如权利要求4所述的筛选方法，其特征在于，步骤(3)中，将纯化的粘附素Hpa A包被于聚苯乙烯微孔中，然后将合成的ssDNA文库溶于筛选缓冲液投入其中，洗下结合的ssDNA作为下一轮的模板；第五轮后以空白孔为负向筛选介质。
8.权利要求1-3任意一项所述的黏附素核酸适配体或其衍生物在制备检测幽门螺杆菌的试剂盒、分子探针或靶向介质中的应用。
9.一种幽门螺杆菌检测试剂，其特征在于，含有权利要求1-3任意一项所述的黏附素核酸适配体。
10.权利要求1-3任意一项所述的黏附素核酸适配体或其衍生物在制备抗幽门螺杆菌疫苗中的用途。
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