CN113444729A - 一种幽门螺杆菌特异结合核酸适体及其应用 - Google Patents

一种幽门螺杆菌特异结合核酸适体及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113444729A
CN113444729A CN202110849349.2A CN202110849349A CN113444729A CN 113444729 A CN113444729 A CN 113444729A CN 202110849349 A CN202110849349 A CN 202110849349A CN 113444729 A CN113444729 A CN 113444729A
Authority
CN
China
Prior art keywords
helicobacter pylori
aptamer
specific binding
solution
nucleic acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202110849349.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113444729B (zh
Inventor
林俊生
郭方可
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Huaqiao University
Original Assignee
Huaqiao University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Huaqiao University filed Critical Huaqiao University
Priority to CN202110849349.2A priority Critical patent/CN113444729B/zh
Publication of CN113444729A publication Critical patent/CN113444729A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113444729B publication Critical patent/CN113444729B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种幽门螺杆菌特异结合核酸适体及其应用，其核苷酸序列如SEQ ID NO.01所示。本发明的核酸适配体能够与幽门螺旋杆菌特异性结合，所构建幽门螺旋杆检测装置具有很好的特异性和灵敏性。

Description

一种幽门螺杆菌特异结合核酸适体及其应用
技术领域
本发明属于幽门螺杆菌检测技术领域，具体涉及一种幽门螺杆菌特异结合核酸适体及其应用。
背景技术
幽门螺旋杆菌是一种革兰阴性致病菌，寄生于人体胃组织中，是慢性胃炎、消化性溃疡、胃黏膜淋巴组织相关性淋巴瘤以及胃癌相关的最重要病原体。1994年世界卫生组织将其列为I类致癌因子，幽门螺旋杆菌感染诱发的相关疾病，对人类的生产生活造成了严重影响，甚至直接威胁着大众的生命健康。目前临床针对幽门螺旋杆菌的检测方法根据对受检者的创伤性，主要分为侵入性与非侵入性两大类，临床常用的检测方法尿素呼气试验UBT(碳13、碳14呼气试验)较为精准，然而碳14系放射性同位素，且需要借助昂贵的仪器以及相关专业人士操作，无法满足简单、快速、便携的大众需求。因此，临床亟需寻找一种经济、便携、准确的检测幽门螺旋杆菌的实验方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种幽门螺杆菌特异结合核酸适体。
本发明的另一目的在于提供上述幽门螺杆菌特异结合核酸适体的应用。
本发明的技术方案如下：
一种幽门螺杆菌特异结合核酸适体，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO.01所示。
本发明的另一技术方案如下：
上述幽门螺杆菌特异结合核酸适体在制备幽门螺杆菌检测装置中的应用。
在本发明的一个优选实施方案中，所述幽门螺杆菌特异结合核酸适体为传感元件。
进一步优选的，将所述传感元件所获得的信号经恒温扩增和侧流传递。
更进一步优选的，所用扩增技术为重组酶介导等温核酸扩增技术。
再进一步优选的，所述扩增技术结合层析式双抗体夹心快速检测核酸试纸条。
本发明的再一技术方案如下：
一种幽门螺杆菌检测装置，其特征在于：采用权利要求1所述的幽门螺杆菌特异结合核酸适体作为传感元件。
在本发明的一个优选实施方案中，所述传感元件所获得的信号经恒温扩增和侧流传递进行处理。
进一步优选的，所用扩增技术为重组酶介导等温核酸扩增技术。
更进一步优选的，所述扩增技术结合层析式双抗体夹心快速检测核酸试纸条。
本发明的有益效果是：本发明的核酸适配体能够与幽门螺旋杆菌特异性结合，所构建幽门螺旋杆检测装置具有很好的特异性和灵敏性。
附图说明
图1为本发明实施例1中优化幽门螺旋杆菌靶标溶液浓度qPCR曲线图。其中，Hp投入量为5×106个时qPCR结果的扩增曲线与阳性对照结果的扩增曲线最为接近，因此在该反应体系中5×106个Hp的投入量对qPCR进程的影响最小，为最佳投入量。
图2为本发明实施例1中幽门螺旋杆菌适配体第10轮筛选qPCR曲线图。其中，C表示阴性对照，E：Elusion组，即模版为洗涤后的幽门螺旋杆菌与次级文库中DNA的结合物；W1：Wash 1组，即模版为幽门螺旋杆菌与次级文库中DNA的结合物第一次洗涤的上清液；W2：Wash 2组，即模版为幽门螺旋杆菌与次级文库中DNA的结合物第二次洗涤的上清液。
图3为本发明实施例1中第10轮筛选点杂交表征结果图。其中，对照组一抗为生物素修饰的上游引物；实验组一抗为生物素修饰的第十轮次级文库，实验组中第十轮次级文库与Hp表征结果为黑色实心信号，为阳性结果；其余组均无为黑色实心信号，为阴性结果，因此第十轮次级文库已经包含了足量的能与Hp结合的DNA。
图4为本发明实施例2中阳性克隆在8％尿素变性胶电泳中结果图。其中，M：maker；1-20：菌落PCR后样品，其中2、5、6、7、8、9、10、11、15、17、20泳道均在244bp左右有条带为阳性克隆，其余为非阳性克隆。
图5为本发明实施例2中第10轮次级文库Eastern blotting实验结果图。其中，图中有方框标记的2、7、8、9、11、15、17、20号为阳性结果，5、10号为阴性结果。2、5、7、8、9、10、11、15、17、20号结果分别对应第十轮次级文库转染后的挑取的2、5、7、8、9、10、11、15、17、20号大肠杆菌菌液，分别将转染进的第十轮次级文库提取、单链分离、纯化后依次作为Eastern blotting实验的一抗。
图6为本发明实施例2中的SEQ ID NO.01序列的二级结构示意图。其中，该序列在未结合幽门螺旋杆菌的情况下含有明显的茎环结构。
图7为本发明实施例3中点杂交验证适配体Apt-15与幽门螺旋杆菌之间的特异性结合结果图。其中，实验组与对照组有明显不同，证明适配体Apt-15与幽门螺旋杆菌特异性结合。其中Apt-15组一抗为生物素修饰的Apt15；上游引物互补链组一抗为生物素修饰的上游互补链引物；下游互补链引物组一抗为生物素修饰的下游互补链引物；阴性对照1组一抗为生物素修饰的阴性适配体；阴性对照2组一抗为生物素修饰的阴性引物；阴性对照3组一抗为BB缓冲液。
图8为本发明实施例3中荧光显微镜验证适配体Apt-15与幽门螺旋杆菌之间的特异性结合结果图。其中，(a)组荧光检测结果有荧光，对照组均无，证明适配体Apt-15与幽门螺旋杆菌特异性结合。
图9为本发明实施例3中QCM-D实验在线监测适配体Apt-15与幽门螺旋杆菌之间的特异性结合结果图。其中，(A)为对照组拟合曲线，(B)为试验组拟合曲线。(B)组频率比(A)组频率幅度多下降了16Hz左右，证明适配体Apt-15与幽门螺旋杆菌之间为特异性结合。
图10为本发明实施例3中Eastern blotting实验验证适配体Apt-15与幽门螺旋杆菌的特异性结合结果图。其中，实验组结果中有明显阳性反应条带，对照组均无，证明适配体Apt-15与幽门螺旋杆菌为特异性结合。其中实验组一抗为Apt-15-Bio；阴性对照1组一抗为BB缓冲液；阴性对照2组一抗为Apt-yx-Bio。
图11为本发明实施例4中q-PCR法分析适配体Apt-15与幽门螺旋杆菌亲和力结果图。其中，图中结果标明适配体Apt-15的浓度越大与幽门螺旋杆菌的结合能力越强。
图12为本发明实施例4中q-PCR法测定适配体Apt-15与幽门螺旋杆菌之间的解离常数结果图。其中，适配体Apt-15与幽门螺旋杆菌结合的解离常数Kd值为(9.817±1.839)nM，在纳摩尔级别，亲和力良好。
图13为本发明实施例5中LFD-RAA装置原理示意图。
图14为本发明实施例5中LFD-RAA快速检测梯度浓度幽门螺旋杆菌检测结果图。
其中，10个幽门螺旋杆菌检测未出现阳性结果，102个组的检测限条带明显比103个组颜色淡。Hp个数10、102、103、104、105、106个依次对应的浓度为50、5×102、5×103、5×104、5×105、5×106个/mL。
图15为本发明实施例5中梯度浓度幽门螺旋杆菌体外检测回归曲线、矫正曲线和检测限结果图。其中，检测限为80个/mL，105个组检测结果接近平台值，10-105个呈线性关系。Hp个数10、102、103、104、105、106个依次对应的浓度为50、5×102、5×103、5×104、5×105、5×106个/mL。
图16为本发明实施例5中LFD-RAA装置的3D打印模型图
图17为本发明实施例5中LFD-RAA装置的3D打印信息图。
图18为本发明实施例6中传感器检测临床幽门螺旋杆菌患者的粪便样本结果图。其中，临床确诊幽门螺旋杆菌携带者的粪便中，利用该传感器检测出幽门螺旋杆菌阳性，不含幽门螺旋杆菌的对照组检测结果为阴性。
具体实施方式
以下通过具体实施方式对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
实施例1幽门螺旋杆菌核酸适配体的筛选
一、文库与靶标幽门螺旋杆菌表面孵育联接
1)设计单链寡核苷酸库文库：5’-tccagcactccacgcataac(SEQ ID NO.02)(Nn)gttatgcgtgcgacggtgaa(SEQ ID NO.03)-3’。其中N为随机碱基，n＝20-60，优选n＝40。由上海生工公司合成，产品为装在离心管的干燥粉剂。按照行业内技术人员所熟知的PCR技术设计引物。Nn之前的序列为上游引物，Nn之后的序列为上游引物结合区。把含文库的离心管在室温下离心10min，14000xg，再按终浓度2μM加入BB(50mmol/L Tris-HCl，pH7.4，5mmol/LKCl，100mmol/L NaCl，1mmol/LMgCl2·H2O)，溶液摇匀溶解，离心10min，置4℃冰箱备用；
2)文库退火：将随机文库于PCR仪上退火，退火条件为95℃8-12min，优选为10min；随后室温放置冷却30min。
3)脱脂奶粉封闭靶标非特异性位点：将新鲜的幽门螺旋杆菌与5％脱脂奶粉室温孵育30min，孵育结束后，离心5min，8000xg洗涤，再用结合缓冲液(binding buffer，BB)缓冲液重悬后洗涤2次(该封闭过程仅用于前三轮筛选)。
4)挑选候选适配体序列：将退火后的文库与封闭后的靶标于恒温摇床培养箱25℃孵育1h，220rpm。将文库中的序列与靶标结合后的聚合物离心5min，8000xg洗涤弃去未结合的序列，再用BB缓冲液重悬后洗涤2次，加入100μL 1×PCR buffer将上述洗涤后的聚合物沉淀重悬，待用。
二、实时荧光定量PCR(real-time quantitative polymerase chain reaction，qPCR)监控筛选过程：
30μL qPCRmix体系(每管已按30μL的体系分装)中加入2μL重悬及洗涤上清样本混匀，qPCR监测，其程序为预变性：95℃3min；26个循环：95℃30S，60℃30S，72℃30S；延伸：72℃30S。(具体结果如图1和图2所示)
qPCRmix体系成分表1：
表1
Figure BDA0003182248560000051
备注：F1为上游引物：5’-tccagcactccacgcataac-3’(SEQ ID NO.02)；R2为下游引物：5’-ttcaccgtcgcacgcataac-3’(SEQ ID NO.03)。
三、候选序列的扩增：
1)PCR：取1mL PCR mix将100μL文库-菌液混合液加入充分混匀，分装至8连排PCR管中，经表2.12的程序进行PCR克隆；
PCRmix体系成分表2：
表2
Figure BDA0003182248560000052
Figure BDA0003182248560000061
备注：F1-FAM为荧光修饰的上游引物：5’-FAM-tccagcactccacgcataac-3’(SEQ IDNO.04)；
R2-ployA：5’-aaaaaaaaaaaaaaaaaaaa(SEQ ID NO.06)-Spacer18-ttcaccgtcgcacgcataac(SEQ ID NO.05)-3’。
四、ssDNA的制备和回收
1)将上述PCR扩增产物(约1.1mL)用正丁醇浓缩；
2)将1)中浓缩产物用8％尿素变性胶分离，切胶回收目的片段(本实验使用长短链引物进行PCR，故目的条带与其部分互补链长度不同，碱基数相差20bp)；
3)将回收样本置于BB溶液中4℃透析过夜，即为次级文库，用于下一轮的筛选，如此反复。
五、终轮筛选点杂交验证
(1)剪取2块1.2cm×0.6cm大小的NC膜(0.22μM)，并在右上角裁掉一个角以标记膜的正反面，将其分成4个区域，在每个区域中央用2B铅笔轻轻标记。
(2)在每张NC膜上按照标记的位点一次滴加5μL的BSA溶液、幽门螺旋杆菌、幽门螺旋杆菌、幽门螺旋杆菌，室温放置。待上述液体完全被膜吸收至没有液体印迹，再在同一位置依次滴加5μL的BSA溶液、幽门螺旋杆菌、幽门螺旋杆菌、幽门螺旋杆菌。室温放置至液体印迹完全消失。
(3)取出24孔板，将上述处理后的NC膜放置于24孔板中，每个膜分别加入300μL5％的脱脂奶粉封闭，将其放置于摇床上，转速为60rpm，室温封闭1h。
(4)对照组一抗制备：取30μL 1mM的生物素修饰的上游引物互补链加至270μL的BB缓冲液中，充分涡旋混匀。实验组一抗制备：取30μL 1mM的生物素修饰的上游引物互补链和30μL第十轮次级文库加至240μL的BB缓冲液中，充分涡旋混匀。将上述对照组一抗以及实验组一抗分别放置于金属浴中，95℃变性10min。加热结束后从金属浴中取出，室温放置20min，自然冷却至室温待用。
(5)封闭结束取出NC膜，分别放入500μL TBST洗脱液中，洗涤掉与膜结合的多余的脱脂奶粉，室温放置摇床上100rpm转速，洗涤10min。洗涤三次。
(6)洗涤结束，将上述NC膜分别加入300μL对照组一抗，和实验组一抗中，放置于恒温培养振荡器中，37℃下转速为60rpm，室温孵育1h。
(7)孵育结束取出NC膜，分别放入500μL TBST洗脱液中，洗涤与膜结合的多余的一抗，室温放置摇床上，100rpm转速，洗涤10min。洗涤三次。
(8)二抗制备：从-20℃冰箱中取出辣根过氧化物酶标记链霉亲和素(HRP-SA)1μL加入至1mL BB缓冲液中，充分涡旋混匀，待用。
(9)洗涤结束后，将上述NC膜分别加入300μL二抗中，放置于恒温培养振荡器中，25℃下转速为60rpm，孵育1h。
(10)孵育结束，取出NC膜，分别放入500μL TBST洗脱液中，洗涤掉与膜结合的多余的二抗，室温放置摇床上，转速为100rpm，洗涤10min。洗涤三次。
(11)显影液制备：分别取等量的显影液A液和B液混合均匀，在分别量取两液体时应注意更换枪头，避免相互污染造成显影液失效，CAP软件发光拍摄。
结果如图3所示，对照组一抗为生物素修饰的上游引物；实验组一抗为生物素修饰的第十轮次级文库，实验组中第十轮次级文库与Hp表征结果为黑色实心信号，为阳性结果；其余组均无为黑色实心信号，为阴性结果，因此第十轮次级文库已经包含了足量的能与Hp结合的DNA序列。
实施例2幽门螺旋杆菌核酸适配体的克隆、测序及序列分析
一、待测序PCR产物的制备：
经10轮筛选得到ssDNA文库用普通上下游引物进行PCR扩增，随后琼脂糖电泳在紫外灯下切下含有目的条带DNA的琼脂糖凝胶，用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒回收目的产物。
二、连接及连接产物的转染：
1)在200μL离心管中加入1μL pEASY-Blunt Zero载体(已含有连接酶)、3μLPCR产物(扩增时将Pfu酶改为taq酶)及1μL无菌水；
2)轻轻混合，25℃反应10min；
3)加连接产物(5μL)加入50μLTransl-T1感受态细胞中(在感受态细胞刚刚解冻时加入连接产物)，轻弹混匀，冰浴30min；
4)42℃热激90S，立即置于冰上2min；
5)加入800μL的经37℃预热的LB培养基(不含抗性)，37℃，200RPM振荡培养60min；1500xg离心1min，弃掉部分上清，保留150μL，轻弹悬浮菌体，将150μL菌液涂板(含100μg/mL氨苄青霉素)，37℃培养过夜。
三、阳性克隆检测及测序：
1)挑选白色菌落接种至含氨苄青霉素的液体培养基(3.5mL/管)中，200rpm、37℃培养6小时左右；
2)取2μL混合液于20μLPCR体系，用M13Forward Primer和M13Reverse Primer鉴定阳性克隆；
3)测序：挑取阳性转化子进行下述Eastern blotting实验。
四、第十轮次级文库Eastern blotting实验
将转化将转染进入大肠杆菌的来自第十轮次级文库的DNA提取出来，首先将筛选出的11组菌液PCR产物作为模版，利用本文筛选时选用的随机文库的上下游引物对其进行不对称PCR克隆，在PCR时引物将会寻找到导入大肠杆菌的DNA片段，进行克隆。再将得到的克隆产物进行电泳，分离出大小为80bp的筛选得到的目的适配体，将其纯化便可以用于验证其是否能与靶标幽门螺旋杆菌结合。
结果如图5所示，图中2、5、7、8、9、10、11、15、17、20号结果分别对应第十轮次级文库转染后的挑取的2、5、7、8、9、10、11、15、17、20号大肠杆菌菌液，分别将转染进的第十轮次级文库提取、单链分离、纯化后依次作为Eastern blotting实验的一抗。图中有方框标记的2、7、8、9、11、15、17、20号为阳性结果，5、10号为阴性结果。将阳性结果组对应的菌液送专业公司进行测序。
五、序列分析及模拟二级结构：
适配体Apt-15，序列如下(5’-3’)：
tccagcactccacgcataaccccaccgtcgaagtgcgtccccccctactgttgcctccctgttatgcgtgcgacggtgaa(SEQ ID NO.01)
对适配体Apt-15核酸序列利用Mfold(http：//www.unafold.org/mfold/applications/dna-folding-form.php)进行二级结构预测(参数为Na+浓度为153.2mM，Mg2+浓度为0.5mM，温度为25℃，其他参数默认)，结果如图6所示，该序列在未结合幽门螺旋杆菌的情况下含有明显的茎环结构。
实施例3幽门螺旋杆菌核酸适配体的特异性评价
1、点杂交表征
(1)剪取5块1.2cm×0.6cm大小的NC膜(0.22μM)，并在右上角裁掉一个角以标记膜的正反面。
(2)将剪取的NC膜平均分成4个区域，在每个区域中央用2B铅笔轻轻的画上标记点。
(3)靶标及对照溶液配制：分别取1OD幽门螺旋杆菌和大肠杆菌放置于离心机中9000rpm离心5min，弃去上清，加入500μLBB缓冲液重悬，充分混匀后放置于离心机中9000rpm离心5min，弃去上清，加入500μLBB缓冲液重悬再重复离心洗涤一次(湘仪H1650-W)。
(4)在每张NC膜上按照标记的位点一次滴加5μL的BSA溶液、大肠杆菌、幽门螺旋杆菌、幽门螺旋杆菌，室温放置。待上述液体完全被膜吸收至没有液体印迹，再在同一位置依次滴加5μL的BSA溶液、大肠杆菌、幽门螺旋杆菌、幽门螺旋杆菌。室温放置至液体印迹完全消失。
(5)取出24孔板，将上述处理后的NC膜放置于24孔板中，每个膜分别加入300μL5％的脱脂奶粉封闭。
(6)将上述24孔板放置于摇床上，转速为60rpm，室温封闭1h。
(7)对照组一抗制备：取30μL 1mM的生物素修饰的上游引物互补链加至270μL的BB缓冲液中，充分涡旋混匀；取30μL1mM的生物素修饰的红霉素适配体加至270μL的BB缓冲液中，充分涡旋混匀。实验组一抗制备：取30μL1mM的生物素修饰的Apt-15加至270μL的BB缓冲液中，充分涡旋混匀。将上述对照组一抗以及实验组一抗分别放置于金属浴中，95℃变性10min。加热结束后从金属浴中取出，室温放置20min，自然冷却至室温，待用。
(8)封闭结束，取出NC膜，分别放入500μL TBST洗脱液中，洗涤为与膜结合的多余的脱脂奶粉，室温放置摇床上，转速为100rpm，洗涤10min。洗涤三次。
(9)洗涤结束，将上述NC膜分别加入300μL对照组一抗，和实验组一抗中，放置于恒温培养振荡器中，37℃下转速为60rpm，室温孵育1h。
(10)孵育结束，取出NC膜，分别放入500μL TBST洗脱液中，洗涤为与膜结合的多余的一抗，室温放置摇床上，转速为100rpm，洗涤10min。洗涤三次。
(11)二抗制备：从-20℃冰箱中取出HRP-SA 2μL加入至2mLBB缓冲液中，充分涡旋混匀，待用。
(12)洗涤结束后，将上述NC膜分别加入300μL二抗中，放置于恒温培养振荡器中，25℃下转速为60rpm，孵育1h。
(13)孵育结束，取出NC膜，分别放入500μL TBST洗脱液中，洗涤为与膜结合的多余的二抗，室温放置摇床上，转速为100rpm，洗涤10min。洗涤三次。
(14)显影液制备(现用现配)：分别取等量的显影液A液和B液混合均匀，在分别量取两液体时应注意更换枪头，避免相互污染造成显影液失效。打开CAP软件，发光拍摄。
结果如图7所示，图中实验组与对照组有明显不同，证明适配体Apt-15与幽门螺旋杆菌特异性结合。其中Apt-15组一抗为生物素修饰的Apt15；上游引物互补链组一抗为生物素修饰的上游互补链引物；下游互补链引物组一抗为生物素修饰的下游互补链引物；阴性对照1组一抗为生物素修饰的阴性适配体；阴性对照2组一抗为生物素修饰的阴性引物；阴性对照3组一抗为BB缓冲液。
2、荧光显微镜实验
(1)将带有荧光修饰的适配体FAM-Apt-15 12000rpm离心10分钟(湘仪H1650-W)，加入1400mL BB缓冲液溶解(配成1μM)，再经过12000rpm离心10分钟使其充分混合均匀。
(2)取上述1μM荧光修饰的适配体FAM-Apt-15以及同浓度FAM荧光基团修饰的核苷酸链，95℃变性10分钟，室温冷却20分钟。待用。
(3)取幽门螺旋杆菌5×106个，9000rpm离心4分钟(湘仪H1650-W)，弃去上清冻存液，用BB缓冲液重悬，再重复上述步骤，清洗涤2次。待用。
(4)取大肠杆菌5×106个，9000rpm离心4分钟(湘仪H1650-W)，弃去上清甘油冻存液，用BB缓冲液重悬，再重复上述步骤，清洗涤2次。待用。
(5)将上述已经变性处理后的ssDNA适配体分别与上述BB缓冲液洗涤处理后的螺旋杆菌菌液以及大肠杆菌菌液，摇床25℃，220rpm，孵育1h。
(6)孵育结束后，分别将上述四种混合液9000rpm离心4分钟(湘仪H1650-W)。弃去上清，用BB缓冲液重悬，再重复上述步骤，清洗涤2次。最后一次洗涤后，加入BB缓冲液重悬，充分混合均匀。
(7)分别吸取适量上述混合液体，依次滴在洁净的载玻片中央，室温晾干后封上盖玻片，置于激光共聚焦显微镜下观察，实验组设置如表3所示。
实验组设置表3
表3
Figure BDA0003182248560000101
Figure BDA0003182248560000111
结果如图8所示，(a)组荧光检测结果有荧光，对照组均无，证明适配体Apt-15与幽门螺旋杆菌特异性结合。
3、QCM表征
本实验原理为金芯片表面通过金硫键与巯基化链霉亲和素(Sulfhydrylatedstreptavidin，GSA)偶联，GSA被固定在金芯片上，通入生物素修饰的适配体时，GSA与生物素发生偶联，使得生物素修饰的适配体被连接到金芯片上。再通入靶标溶液，靶标与适配结合被留在金芯片上。这些质量的变化最终将以频率变化的方式呈现，具体方法操作如下。
(1)取两片金芯片放置于芯片架上，将芯片架放置于紫外通风仪(待确定名字)下紫外照射10min后通风10min。
(2)将芯片架放置于一个干净的5mL烧杯中，向烧杯中依次加入10mL ddH2O，2mL氨水溶液，2mL过氧化氢，上下提拉芯片架，使配制的清洗溶液充分混匀。
(3)将烧杯放置于75℃的水浴锅中，加热10min。
(4)加热结束倒掉一半水溶液，补加同体积的室温无菌水，上下提拉芯片后，再倒掉一半水溶液，补加同体积的室温无菌水。反复多次该循环(为避免温度骤降金芯片碎裂)直至烧杯中液体温度降至室温。用无菌水清洗后，使用氮气将金芯片吹干。
(5)将金芯片以及垫片安装至流动池中，将装置固定好，以此将进样管连接到进样口，出样管连接到出样口，打开仪器和连接的电脑，打开Qsoft软件将温度设置为25℃，在Tools中选择四孔，点击Acquisition检测实验芯片放置的流动池频率是否正常，若正常则继续使用。
(6)打开蠕动泵，流速控制在30μL/min左右，通入空气以直至基线平稳。
(7)基线调平之后，进样管放在装有BB缓冲液的离心管中，再次调节平衡。
(8)GSA(50ng/μL)溶液配制：取30μLGSA(5mg/μL)加至2970μL BB缓冲液，分别取出两管500μL溶液待用；MCH(0.5mM)溶液配制：取0.5μL MCH(98％)加至7.5mL缓冲液中，分别取出两管500μL溶液待用；Apt-15(0.5M)溶液配制：取50μL Apt-15-Bio(10M)加至950μL BB缓冲液中充分涡旋混匀，用离心管封口夹夹好放置95℃金属浴中10min变性后室温放置自然冷却30min。
(9)频率曲线平衡后，将两只进样管分别放在装有500mL GSA(50ng/μL)溶液的离心管中，蠕动泵流速为30μL/min。
(10)将两只进样管分别放在装有MCH(0.5mM)溶液的离心管中，蠕动泵流速为30μL/min，对金芯片上未与GSA结合的位点进行封闭，直至频率曲线趋于平衡。
(11)将两只进样管分别放在装有BB缓冲液的离心管中，蠕动泵流速为30μL/min，对金芯片冲洗，直至频率曲线趋于平衡。
(12)靶标溶液配制：取个数为5×106的幽门螺旋杆菌放置于离心机中9000rpm离心5min，弃去上清，加入500μL BB缓冲液重悬，充分混匀后放置于离心机中9000rpm离心5min，弃去上清，加入500μL BB缓冲液重悬再重复离心洗涤一次(湘仪H1650-W)。
(13)将两只进样管分别放在装有500mL靶标溶液和500mL BB溶液的离心管中，蠕动泵流速为30μL/min。
(14)将两只进样管分别放在装有BB缓冲液的离心管中，蠕动泵流速为30μL/min，对金芯片冲洗，直至频率曲线趋于平衡。
结果如图9所示，图中(A)为对照组拟合曲线，(B)为试验组拟合曲线。(B)组频率比(A)组频率幅度多下降了16Hz左右，证明适配体Apt-15与幽门螺旋杆菌之间为特异性结合。
4、Eastern blotting法表征
(1)按照3.3.4.2中Eastern blotting的表征方法，取1OD幽门螺旋杆菌经洗涤和变形处理后用于SDS-PAGE凝胶电泳。
(2)将电泳后SDS-PAGE凝胶中蛋白转膜至处理后的PVDF膜上，用5％脱脂奶粉于摇床上(60rpm)室温封闭30min。
(3)将PVDF膜转移至TBST洗涤液中摇床(100rpm)室温洗涤10min。重复洗涤三次。
(4)将蛋白部分的膜分成三份分别孵育对应的一抗：试验组的一抗为Apt-15-Bio(1μM)，阴性对照1组一抗为BB缓冲液，阴性对照2组一抗为Apt-yx-Bio(1μM)，分别放置于25℃恒温振荡培养箱中孵育1h。
(5)将三组PVDF膜依次转移至TBST洗涤液中摇床(100rpm)室温洗涤10min。重复洗涤三次。
(6)二抗的制备：按照1∶1000的比例稀释HRP-SA，将洗涤好的PVDF膜二抗孵育，放置于25℃恒温振荡培养箱中转速60rpm，孵育1h。
(7)孵育结束，将PVDF膜转移至TBST洗涤液中摇床(100rpm)室温洗涤10min。重复洗涤三次。
(8)显影液的制备A液和B液的比例为1∶1，即分别取1mL显影液的A液和B液，混合于5mL的用锡纸包裹的离心管中，加显影液于化学发光图像分析系统显影，并记录结果。
结果如图10所示，图中实验组结果中有明显阳性反应条带，对照组均无，证明适配体Apt-15与幽门螺旋杆菌为特异性结合。其中实验组一抗为Apt-15-Bio；阴性对照1组一抗为BB缓冲液；阴性对照2组一抗为Apt-yx-Bio。
实施例4幽门螺旋杆菌核酸适配体的解离常数(Kd)测定
适配体亲和力(Dissociation constant，Kd)是指靶标与适配体的结合能力，通常用亲和力常数进行测定。靶标与适配体的亲和力越高，亲和力常数越小，结合能力越强；反之亲和力越低，亲和常数越大，结合能力越弱。具体实验方法操作如下。
(1)将适配体Apt-15于离心机中12000rpm离心10分钟，加入1300mL BB缓冲液溶解(配成1μM)，再经过12000rpm离心10分钟使其充分混合均匀(湘仪H1650-W)。
(2)将上述适配体溶液依次稀释到12.5nM、25nM、50nM、100nM、200nM、400nM，对照组适配体含量为0nM，各设置三个平行组继续进行实验。
(3)取上述各浓度适配体Apt-15，95℃变性10分钟，室温冷却20min待用。
(4)取幽门螺旋杆菌5×106个，9000rpm离心4分钟(湘仪H1650-W)，弃去上清冻存液，用BB缓冲液重悬，再重复上述步骤，清洗涤2次，分装成7管，每管5×106个菌。待用。
(5)将上述已经变性处理后的ssDNA适配体与上述BB缓冲液洗涤处理后的螺旋杆菌菌液，摇床25℃，220rpm，孵育1h。
(6)孵育结束后，将上述混合液9000rpm离心4分钟(湘仪H1650-W)。弃去上清，用BB缓冲液重悬，再重复上述步骤，清洗涤2次。最后一次洗涤后，加入PCR buffer重悬Apt-15-幽门螺旋杆菌复合物，各取3μL加入30μL q-PCRmix中作为模版，按照表4的配方，表5的条件进行q-PCR扩增。
表4 Apt-15-幽门螺旋杆菌复合物q-PCRmix配方
Figure BDA0003182248560000131
Figure BDA0003182248560000141
表5 Apt-15-幽门螺旋杆菌复合物q-PCRmix条件
Figure BDA0003182248560000142
(7)记录不同浓度适配体PCR扩增曲线Ct值(图11)，利用Origin 8.0软件拟合曲线，将1/Ct×103得到的值代人公式求得解离常数值。Y＝BmaxX/(Kd+X)，其中：X为FAM-Apt-15适配体浓度，Y为对应的荧光值，Bmax为体系中最大荧光值。
经过Origin 8.0软件分析拟合曲线(图12)，适配体Apt-15与幽门螺旋杆菌结合的解离常数Kd值为(9.817±1.839)nM，在纳摩尔级别，表明适配体Apt-15与幽门螺旋杆菌的亲和力良好，适配体Apt-15与幽门螺旋杆菌结合能力较强。
实施例5幽门螺旋杆菌检测传感器构建及检测限测定
一、幽门螺旋杆菌检测传感器构建
将适配体Apt-15结合恒温核酸扩增技术以及层析式双抗体夹心快速检测核酸试纸条，通过3D打印建立了一种能用于体外快速检测幽门螺旋杆菌的装置。原理如图13所示。试纸条依侧流顺序样品垫、结合垫、层析膜和吸水垫组成，层析膜上的纳米颗粒池、检测线(T)和指控线(C)分别由过量的链霉亲和素包被的红色纳米颗粒、FAM抗体和生物素组成。RAA扩增的双链DNA的两端分别含有生物素(Biotin)和6羟基荧光素(6-FAM)。当RAA扩增产物从样品垫向上侧流时，双链DNA上修饰的生物素会与试纸条上的链霉亲和素包被的红色纳米颗粒结合(生物素与链霉亲和素结合)，由于双链DNA的另一端修饰有荧光素，在已与链霉亲和素包被的红色纳米颗粒结合的样品经过检测线时，会被检测线处的FAM抗体拦截下来(FAM与FAM抗体结合)，此时检测线处显示出红色。当过量的链霉亲和素包被的红色纳米颗粒(未与双链DNA结合)经过质控线时会与质控线处的生物素结合。被拦截下的红色纳米颗粒会显示出红色。为便于检测操作，利用Siemens NX为传感器设计外壳的3D模型(如图16和17所示)。其中，该装置包括一本体，所述的本体上设有试纸条放置槽以及内置一个与试纸条放置槽相连通的重组酶介导链替换核酸扩增技术(RAA)反应槽；还包括试纸条，所述的试纸条为层析式双抗体夹心快速检测核酸试纸条，试纸上具有如SEQ ID NO.01所示的核苷酸序列作为传感元件。经加样孔加入RAA反应体系和模板。装置双耳环朝上，室温下完成信号经RAA的扩增；再将装置单耳环朝上，RAA扩增产物因重力作用流至试纸条的样品垫，因毛细管作用而向上侧流、层析。
二、幽门螺旋杆菌检测传感器检测限测定
(1)取两管-80℃冻存的幽门螺旋杆菌，室温解冻后，9000rpm离心4min(湘仪H1650-W)，弃去上清冻存液，用BB缓冲液重悬，再重复上述步骤，清洗涤2次，待用。
(2)将上述幽门螺旋杆菌混悬液依次稀释10倍、100倍、500倍分别测吸光度，每个待测样品测量三次，求其平均值，利用不同浓度的菌液吸光度，计算待用幽门螺旋杆菌混悬液吸光度平均值。
(3)根据吸光度计算并制备个数梯度的菌液，Hp菌液梯度：0、10、102、103、104、105、106个菌，体积为200μL，对应浓度为：0、50、5×102、5×103、5×104、5×105、5×106个/mL。
(4)取适配体Apt-15(0.5M)，95℃变性10min，室温冷却20min。
(5)上述梯度浓度的螺旋杆菌菌液放置于离心机中9000rpm离心4min(湘仪H1650-W)，离心后弃去上清立即用200μL上述已经变性处理后的适配体重悬，充分混合均匀后放置于摇床25℃，220rpm，孵育1h。
(6)孵育结束后，将上述混合液12000rpm离心10min(湘仪H1650-W)。弃去上清，用BB缓冲液重悬，再重复上述步骤，清洗涤2次。
(7)将上述靶标与适配体的结合作为信号，也作为重组酶介导链替换核酸扩增(RAA，也称重组酶聚合酶扩增，RPA)的模版，分别进行RAA信号放大，反应体系如表5.4所示，将上述体系充分混匀，放置于30℃金属浴中，恒温反应15min。
(8)分别取8μL RAA反应产物滴加在一次性核酸检测试纸条的样品垫上，按照RAA体系加样但以不加入模版反应后的产物作为阴性对照。
(9)分别将试纸条的样品垫向下插入含有100μL缓冲液的离心管中，15至30分钟内记录判读区结果。
(10)根据试纸条的检测结果判断该装置检测幽门螺旋杆菌的检测限：利用相机(Nikon N1406，Japan)拍摄保存试纸条的检测结果，利用ImageJ软件(1.53，NIH，USA)分别计算试纸条上检测线的红色条带深浅程度，并利用GraphPad Prism软件(7.00，USA)根据所得的标准化数据来计算线性回归曲线，根据线性回归的标准误差得出标准偏差(Std.Deviation of intercept)，然后通过检测限计算公式3.3×Std.Deviation ofintercept/slope得出传感器检测限，slope为线性回归曲线的斜率。线性回归上的所有标准化的数据与标准化的平台数据导入到GraphPad Prism的Sigmoidal 4PL模型中绘制拟合曲线。
将利用ImageJ软件测量图14的试纸条上检测线的红色条带深浅程度的数据导入GraphPad Prism软件标准化处理，将标准化后的平台数据与幽门螺旋杆菌数量(10、102、103、104、105、106个)导入Sigmoidal 4PL模型得出拟合曲线图15。从回归曲线中可以看到检测结果中的线性范围为10-105个之间，将该部分数据(10、102、103、104、105个)计算线性回归方程为Y＝24.24×X-21.76，R2为0.9574，通过公式(3.3×SD of intercept/slope)得出检测限为16个幽门螺旋杆菌，由于梯度个数幽门螺旋杆菌的溶液体积均是200μL，因此该装置快速检测幽门螺旋杆菌的检测限为80个/mL。
实施例6利用适配体检测样本中的幽门螺旋杆菌
(1)取新鲜携带幽门螺旋杆菌患者的粪便样品收集在干净的50mL离心管内。将上述容器放置冰盒中带回实验室待用。
(2)取约100μL样本与1.5mL离心管中，加500μL BB缓冲液混匀，9000rpm，离心4min(湘仪H1650-W)，分别留取上清液和沉淀物。
(3)加200μL 0.5μM的Apt-15适配体于上述样品沉淀中，充分混匀。
(4)将上述混合物220r/min，25℃，孵育1h。
(5)孵育结束后2000rpm，离心10min(湘仪H1650-W)，分别留取上清液和沉淀物。
(6)加200μL BB缓冲液混匀，12000rpm，离心10min(湘仪H1650-W)，弃去上清液(重复洗涤2次)。
(7)加20μL RAA缓冲液与上述沉淀混匀，取1、2、4、8μL作为模版加入RAA体系中，30℃反应15min。
(8)取8μL上述反应产物进行试纸条检测。
(9)如获阳性结果，再弃上清。
结果如图18所示，临床确诊幽门螺旋杆菌携带者的粪便中，利用该传感器检测出幽门螺旋杆菌阳性，不含幽门螺旋杆菌的对照组检测结果为阴性。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。
序列表
<110> 华侨大学
<120> 一种幽门螺杆菌特异结合核酸适体及其应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tccagcactc cacgcataac cccaccgtcg aagtgcgtcc ccccctactg ttgcctccct 60
gttatgcgtg cgacggtgaa 80
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tccagcactc cacgcataac 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ttcaccgtcg cacgcataac 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tccagcactc cacgcataac 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ttcaccgtcg cacgcataac 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 20

Claims (10)

1.一种幽门螺杆菌特异结合核酸适体，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO.01所示。
2.权利要求1所述的幽门螺杆菌特异结合核酸适体在制备幽门螺杆菌检测装置中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述幽门螺杆菌特异结合核酸适体为传感元件。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：将所述传感元件所获得的信号经恒温扩增和侧流传递。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于：所用扩增技术为重组酶介导等温核酸扩增技术。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于：所述扩增技术结合层析式双抗体夹心快速检测核酸试纸条。
7.一种幽门螺杆菌检测装置，其特征在于：采用权利要求1所述的幽门螺杆菌特异结合核酸适体作为传感元件。
8.如权利要求7所述的一种幽门螺杆菌检测装置，其特征在于：所述传感元件所获得的信号经恒温扩增和侧流传递进行处理。
9.如权利要求8所述的一种幽门螺杆菌检测装置，其特征在于：所用扩增技术为重组酶介导等温核酸扩增技术。
10.如权利要求9所述的一种幽门螺杆菌检测装置，其特征在于：所述扩增技术结合层析式双抗体夹心快速检测核酸试纸条。
CN202110849349.2A 2021-07-27 2021-07-27 一种幽门螺杆菌特异结合核酸适体及其应用 Active CN113444729B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110849349.2A CN113444729B (zh) 2021-07-27 2021-07-27 一种幽门螺杆菌特异结合核酸适体及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110849349.2A CN113444729B (zh) 2021-07-27 2021-07-27 一种幽门螺杆菌特异结合核酸适体及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113444729A true CN113444729A (zh) 2021-09-28
CN113444729B CN113444729B (zh) 2024-02-27

Family

ID=77817404

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110849349.2A Active CN113444729B (zh) 2021-07-27 2021-07-27 一种幽门螺杆菌特异结合核酸适体及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113444729B (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113913431A (zh) * 2021-09-09 2022-01-11 湖南工业大学 一种辛硫磷核酸适配体、核酸适配体衍生物及其应用
CN115386581A (zh) * 2021-11-17 2022-11-25 安徽省昂普拓迈生物科技有限责任公司 一种特异性结合ox40蛋白的核酸适配体及其应用
CN117844941A (zh) * 2024-01-10 2024-04-09 长江师范学院 基于间接竞争和重组酶聚合酶等温扩增反应的牛早孕检测方法及应用
CN118147283A (zh) * 2024-02-04 2024-06-07 长江师范学院 一种基于适配体夹心-RPA反应的bPAG检测方法及其应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106047882A (zh) * 2016-06-01 2016-10-26 湖南大学 一组特异性结合结核分枝杆菌的核酸适配体及其应用
CN109628457A (zh) * 2019-02-03 2019-04-16 淮海工学院 单链dna核酸适配体及其筛选方法与用途
CN110669766A (zh) * 2019-09-29 2020-01-10 皖南医学院第二附属医院 粘附素核酸适配体及其筛选方法和应用
CN112094847A (zh) * 2020-09-28 2020-12-18 江苏海洋大学 幽门螺旋杆菌检测用核酸适配体与筛选检测方法及用途
CN112195220A (zh) * 2020-10-13 2021-01-08 济南国益生物科技有限公司 一种用于核酸快速检测的侧流层析-重组酶恒温扩增方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106047882A (zh) * 2016-06-01 2016-10-26 湖南大学 一组特异性结合结核分枝杆菌的核酸适配体及其应用
CN109628457A (zh) * 2019-02-03 2019-04-16 淮海工学院 单链dna核酸适配体及其筛选方法与用途
CN110669766A (zh) * 2019-09-29 2020-01-10 皖南医学院第二附属医院 粘附素核酸适配体及其筛选方法和应用
CN112094847A (zh) * 2020-09-28 2020-12-18 江苏海洋大学 幽门螺旋杆菌检测用核酸适配体与筛选检测方法及用途
CN112195220A (zh) * 2020-10-13 2021-01-08 济南国益生物科技有限公司 一种用于核酸快速检测的侧流层析-重组酶恒温扩增方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
华影等: "特异性结合幽门螺杆菌黏附蛋白A(HpaA)核酸适配子的筛选及鉴定" *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113913431A (zh) * 2021-09-09 2022-01-11 湖南工业大学 一种辛硫磷核酸适配体、核酸适配体衍生物及其应用
CN113913431B (zh) * 2021-09-09 2023-10-24 湖南工业大学 一种辛硫磷核酸适配体、核酸适配体衍生物及其应用
CN115386581A (zh) * 2021-11-17 2022-11-25 安徽省昂普拓迈生物科技有限责任公司 一种特异性结合ox40蛋白的核酸适配体及其应用
CN117844941A (zh) * 2024-01-10 2024-04-09 长江师范学院 基于间接竞争和重组酶聚合酶等温扩增反应的牛早孕检测方法及应用
CN118147283A (zh) * 2024-02-04 2024-06-07 长江师范学院 一种基于适配体夹心-RPA反应的bPAG检测方法及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN113444729B (zh) 2024-02-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN113444729A (zh) 一种幽门螺杆菌特异结合核酸适体及其应用
CN104328218A (zh) 同步检测五种猪病毒的液相基因芯片的核酸及其检测方法
CN114134253A (zh) 鉴别非洲猪瘟野毒株和基因缺失株的荧光定量检测引物及试剂盒
CN117701556A (zh) Car基因组病毒载体拷贝数检测试剂盒及其应用
CN115073613A (zh) 一种融合蛋白GLuc-p30及其制备方法和应用
CN104911269B (zh) 鉴别气溶胶中布鲁氏菌a19疫苗株的引物、探针及试剂盒
CN113046455A (zh) 一种基于lfd-rma法检测幽门螺杆菌的引物探针组
CN116814857A (zh) 猫细小病毒及其试剂盒和荧光重组酶聚合酶扩增的方法
CN116949197A (zh) 四种常见隐孢子虫raa检测方法的建立
CN111172301A (zh) 一种艰难梭菌毒素b的pcr荧光检测试剂盒及其应用
CN111018983B (zh) 一种抗人心肌肌钙蛋白i的抗体及其应用
CN113073100B (zh) 奈替米星核酸适配体及筛选和在奈替米星检测上的应用
CN115109782A (zh) 重组人源cxcl16蛋白的表达及复性方法
CN111718397B (zh) 基于鼠源天然单链抗体库筛选识别CIM-ScFv抗体的多肽序列及其应用
CN114480659A (zh) 一种基于多重扩增测序测定微小残留病变水平的方法
CN113943822A (zh) 一种基于lamp-lfd的幽门螺杆菌poct检测试剂盒及方法
CN111996268A (zh) 溶藻弧菌双重TaqMan探针实时荧光定量PCR检测试剂盒及其制备方法
CN111172319A (zh) 一种检测猪流行性腹泻病毒的引物对及其试剂盒和应用
CN117924439B (zh) 重组CagA蛋白及其制备方法和应用
CN111018978B (zh) 一种抗人心肌肌钙蛋白i的抗体及其应用
CN101851679A (zh) 一种快速检测牛粪便样品中布鲁菌的pcr试剂盒
KR102480124B1 (ko) 생식능 강화 소 African Humped Cattle (AFH) 품종 특이적 단일염기다형성 및 그의 용도
CN113215112B (zh) 分离的致病性黄颡鱼杯状病毒及其特异性序列及应用
CN114891861B (zh) 一种检测抗体中cho细胞残留dna的raa试剂盒及其检测方法
CN110615845B (zh) 一种兼有IgG结合活性及生物素结合活性的双功能蛋白及其免疫PCR试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant