KR101794502B1 - 아스트로바이러스 표준양성대조군 유전자 및 이로부터 전사되는 rna 전사체 - Google Patents

아스트로바이러스 표준양성대조군 유전자 및 이로부터 전사되는 rna 전사체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 아스트로바이러스 표준양성대조군 유전자, 이를 포함하는 재조합 벡터, 상기 유전자로부터 전사되는 RNA 전사체; 및 상기 RNA 전사체를 포함하는 검출용 키트에 관한 것이다. 본 발명에 따른 아스트로바이러스 표준양성대조군 유전자 및 이로부터 전사되는 RNA 전사체는 환경시료에서 검출되는 아스트로바이러스 PCR 산물과 크기(size)가 달라 환경시료의 교차오염에 의한 거짓양성(false positive) 및 거짓음성(false-negative) 발생을 방지함을 확인하였다. 따라서, 아스트로바이러스 검출에 정확하고 신속하게 이용될 수 있다.

Description

아스트로바이러스 표준양성대조군 유전자 및 이로부터 전사되는 RNA 전사체{Astrovirus standardized positive control gene and RNA transcripts transcripted therefrom}
본 발명은 아스트로바이러스 표준양성대조군 유전자, 이를 포함하는 재조합 벡터, 상기 유전자로부터 전사되는 RNA 전사체; 및 상기 RNA 전사체를 포함하는 검출용 키트에 관한 것이다.
아스트로바이러스(Astrovirus)는 아스트로비리대(astroviridae)과(科)에속하며 외막이 없는 바이러스로 RNA 유전자는 단일가닥의 양성(+) 극성을 지닌 다. 아스트로바이러스의 유전자는 약 6.8 Kb의 크기로 3` 말단에 폴리 (A)를 포함하고 있으며 3개의 ORF(open reaning frame)를 암호화하고 있다. 5` 말단에는 ORFs 1A와 ORFs 1B, 두 개의 ORFs가 있는데 각 바이러스 단백질 분해효소와 RNA-의존성 RNA 중합효소(RNA-dependent RNA polymerase, RdRp)를 암호화하고 있다. 3`말단에 위치한 ORFs 2는 구조단백질의 유전자를 암호화하고 있으며, 이는 성숙한 바이러스의 구조단백질 전구체이다. ORFs 1A와 1B는 약 70개정도의 뉴클리오티드(nucleotide)가 겹쳐져 있으며, 이는 아스트로바이러스 혈청형에서 매우 높은 유사성을 보이며 7개의 부분으로 이루어진 프레임-쉬프팅 신호(frame-shifting signal)를 포함하고 있고 프레임-쉬프팅(frame-shifting)에 필수적인 줄기-고리(stem-loop) 구조를 형성한다. 아스트로바이러스에 감염된 세포는 전체유전자와 ORF2 하부 게놈(subgenomic) RNA를 생산하여 많은 수의 구조단백질을 만들어 내는데 이용된다. 아스트로바이러스는 ORF2의 염기를 토대로 유전자형을 분리할 수 있으며 8개의 유전자형으로 나눠지고 그 중 1형의 혈청형이 우리나라를 포함하여 전 세계적으로 주로 유행한다.
아스트로바이러스는 주로 면역력이 약한 어린이나 노인 등에게 장염을 유발한다. 일단 감염되면 3~4일의 잠복기를 거쳐 몸이 떨리고 설사와 두통, 구토, 복통, 발열 등을 동반하는 증상이 나타난다. 우리나라에서는 가을부터 겨울에 걸쳐 매년 바이러스에 의한 영유아성 장염이 유행하며, 어린이 설사의 질환의 2~8%는 아스트로바이러스에 의한 것으로 분석되고 있다.
아스트로바이러스는 세포배양이 어려운 노로바이러스나 다른 칼리시바이러스와는 다르게 세포배양하여 증식할 수 있다. 상기 세포배양을 이용하여 1984년에 아스트로바이러스는 5개의 혈청형으로 분류되었고, 1980년대 후반 효소면역측정법(Enzyme immunoassay, EIA)의 발전으로 아스트로바이러스 항원성이 확인되었으며, 1991년에 아스트로바이러스의 유전자 분석과 클로닝으로 발전으로 의학적인 중요성이 확립되었다.
아스트로바이러스를 검출하는 방법에는 효소면역측정법(EIA), 유전자 검출법(RT-PCR) 등이 알려져 있으며, 식품과 물에서는 대부분 종래의 RT-PCR을 사용하고 있다. 종래의 RT-PCR 이용 시 유전자 증폭과정 중의 문제점 확인과 신뢰성 검증을 위해 PCR 양성 대조군이 필요하나, 안정적인 공급의 한계가 있고 양성대조군의 교차오염(cross contamination)의 우려도 높아 거짓양성(false positive)이나, 또는 부적절한 PCR조건에서 초래되는 거짓음성(false-negative)의 우려가 있다. 따라서, 표준양성대조군을 확보함으로써 검사방법의 신뢰성을 확보하고, 아스트로바이러스가 의심되는 지역에 대하여 신속한 조사와 대응 방안을 마련할 필요가 있다.
이에 본 발명자는 아스트로바이러스 표준양성대조군을 개발하기 위한 연구를 지속한 결과, 아스트로바이러스의 ORF2 유전자를 증폭하는 양방향 프라이머 사이에 장관 아데노바이러스(enteric adenovirus) 41형 유전자를 삽입하여 합성한 아스트로바이러스 표준양성대조군 유전자와 이로부터 전사되는 RNA 전사체를 이용 시, 아스트로바이러스의 검출을 정확하고 신속하게 수행할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 아스트로바이러스의 유전자를 증폭하는 정방향 프라이머; 장관 아데노바이러스(enteric adenovirus) 41형 유전자; 및 아스트로바이러스의 유전자를 증폭하는 역방향 프라이머;로 이루어진, 아스트로바이러스 표준양성대조군(Positive control) 유전자를 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은, 아스트로바이러스 표준양성대조군 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은, 아스트로바이러스 표준양성대조군 유전자로부터 전사되는 아스트로바이러스 표준양성대조군 RNA 전사체를 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은 아스트로바이러스 표준양성대조군 RNA 전사체를 포함하는, 아스트로바이러스 검출용 키트를 제공하는 것이다.
상기와 같은 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 아스트로바이러스의 유전자를 증폭하는 정방향 프라이머; 장관 아데노바이러스(enteric adenovirus) 41형 유전자; 및 아스트로바이러스의 유전자를 증폭하는 역방향 프라이머;로 이루어진, 아스트로바이러스 표준양성대조군(Positive control) 유전자를 제공한다.
또한 본 발명은, 아스트로바이러스 표준양성대조군 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
또한 본 발명은, 아스트로바이러스 표준양성대조군 유전자로부터 전사되는 아스트로바이러스 표준양성대조군 RNA 전사체를 제공한다.
또한 본 발명은, 아스트로바이러스 표준양성대조군 RNA 전사체를 포함하는 아스트로바이러스 검출용 키트를 제공한다.
본 발명에 따른 아스트로바이러스 표준양성대조군 유전자 및 이로부터 전사되는 RNA 전사체는 환경시료에서 검출되는 아스트로바이러스 PCR 산물과 크기(size)가 달라 환경시료의 교차오염에 의한 거짓양성(false positive) 및 거짓음성(false-negative) 발생을 방지함을 확인하였다. 따라서, 아스트로바이러스 검출에 정확하고 신속하게 이용될 수 있다.
도 1은 아스트로바이러스의 ORF 2 유전자를 증폭하는 정방향 프라이머; 장관 아데노바이러스(enteric adenovirus) 41형 유전자; 및 아스트로바이러스의 ORF 2유전자를 증폭하는 역방향 프라이머;를 벡터에 삽입하는 과정을 설명하는 개열지도이다.
도 2는 아스트로바이러스 플라스미드의 콜로니를 PCR하여 확인한 결과를 나타낸 도이다(레인 1은 PCR 크기 표지 마커, 레인 2 및 레인 3은 아스트로바이러스 플라스미드의 콜로니를 PCR, 레인 4는 음성대조군임).
도 3은 아스트로바이러스 시료에 아스트로바이러스 표준양성대조군을 이용하여 RT-PCR을 수행한 결과를 전기 영동을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다(레인 1: PCR 사이즈 표지 마커, 레인 2: 아스트로바이러스 실제 시료 PCR 산물, 레인 3: 음성대조군, 레인 4: 아스트로바이러스 표준양성대조군 PCR 산물).
본 발명은 아스트로바이러스의 ORF 2 유전자를 증폭하는 정방향 프라이머; 장관 아데노바이러스 41형 유전자; 및 아스트로바이러스의 ORF 2 유전자를 증폭하는 역방향 프라이머;로 이루어진, 아스트로바이러스 표준양성대조군 유전자를 제공한다.
본 발명에 있어서, "표준양성대조군"은 분자생물학적 방법을 이용하여 시료 중 아스트로바이러스를 검출하는데 있어서 표준화를 위해 사용되는 양성대조군을 의미한다.
일반적으로, 객관적이고 신뢰할 수 있는 아스트로바이러스 검출방법에는 양성대조군을 사용하게 된다. 그러나, 상기 양성대조군은 동물세포에 배양하여 회수한 바이러스를 사용해야 하는 어려움이 있어, 지속적인 공급에 문제가 있다. 현재 아스트로바이러스를 검출하는 데에 필수적인 표준양성대조군이 전무하여, 표준화된 양성대조군의 개발이 시급하다.
본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 수 있다. 상기 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 아스트로바이러스 표준양성대조군 유전자는 당해 유전자의 염기 서열을 참조하여 핵산 합성기 등을 이용하여 인공적으로 합성하거나, 아스트로바이러스 표준양성대조군 유전자 게놈 DNA를 주형으로 목적한 아스트로바이러스 표준양성대조군 유전자의 양 말단에 상보적인 서열을 가지는 올리고 뉴클레오타이드를 프라이머로 이용하여 PCR을 실시함으로써 제조할 수 있다. 한편, 코돈의 축퇴성으로 인하여 본 발명의 아스트로바이러스 표준양성대조군 유전자는 다양한 염기 서열로 존재할 수 있으며, 이들은 모두 본 발명의 범주에 포함된다. 또한, 상기 아스트로바이러스 표준양성대조군 유전자의 변이체가 본 발명의 범주에 포함된다. 구체적으로, 아스트로바이러스 표준양성대조군 유전자의 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
상기 아스트로바이러스 표준양성대조군 유전자는 당 분야의 공지 방법, 예를 들어 벡터 형태의 네이키드 DNA로 세포내로 전달하거나(Wolff et al. Science,1990: Wolffet al. J Cell Sci. 103:1249-59, 1992), 리포좀(Liposome), 양이온성 고분자(Cationic polymer)등을 이용하여 세포 내로 전달할 수 있다.
상기 아스트로바이러스의 유전자는 ORF 2 부위일 수 있고, 상기 정방향 프라이머는 서열번호 1로, 역방향 프라이머는 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어질 수 있다. 또한, 상기 장관 아데노바이러스 41형 유전자는 서열번호 3으로, 아스트로바이러스 표준양성대조군 유전자는 서열번호 4로 표시되는 염기서열로 이루어질 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서는, 아스트로바이러스의 ORF 2 유전자를 증폭하는 정방향 프라이머; 장관 아데노바이러스 41형 유전자; 및 아스트로바이러스의 ORF 2 유전자를 증폭하는 역방향 프라이머;의 유전자 서열을 합성하여 pGEM T-easy 벡터에 클로닝하였다. 그 후, 재조합 벡터로부터 T7 RNA 중합효소를 이용하여 시험관내(in vitro) 전사하여, 아스트로바이러스 표준양성대조군 RNA 전사체를 제작하였다.
또한 본 발명은, 아스트로바이러스 표준양성대조군 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명에서 용어, "벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 발현 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다.
본 발명의 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널, 인핸서 같은 발현 조절 요소 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 신호 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한, 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택성 마커를 포함하고, 복제 가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함한다. 벡터는 자가 복제하거나 숙주 DNA에 통합될 수 있다.
또한 본 발명은, 아스트로바이러스 표준양성대조군 유전자로부터 전사되는 아스트로바이러스 표준양성대조군 RNA 전사체를 제공한다.
상기 RNA 전사체는 도 1의 개열 지도를 갖는 재조합 벡터로부터 T7 RNA 중합효소를 이용하여 시험관내(in vitro) 전사될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 RNA 전사체는 시료로부터 아스트로바이러스를 검출 시, 아스트로바이러스의 검출 여부를 확인하기 위한 표준양성대조군으로서 사용될 수 있다. 즉, 본 발명의 표준양성대조군 RNA 전사체는 시료와 함께 역전사 중합반응 및 PCR 반응을 수행함으로써 시료에서 아스트로바이러스의 검출이 제대로 이루어지고 있는지를 확인할 수 있는 표준양성대조군으로서 사용된다.
또한 본 발명은, 아스트로바이러스 표준양성대조군 RNA 전사체를 포함하는 아스트로바이러스 검출용 키트를 제공한다.
상기 진단용 키트는 필요에 따라서 반응액이 포함되도록 제작될 수도 있으며, 이는 공지기술을 적용하면 용이하게 실시할 수 있는 것이다. 본 발명의 키트는 아스트로바이러스 진단에 필요한 시약을 추가로 포함할 수 있으며, 상기 시약은 예를 들면, 이에 제한되지 않고, 완충액 등일 수 있다. 또한, 상기 키트는 안내서를 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 아스트로바이러스의 캡시드 ORF 2 유전자의 검출 확인
1-1. 아스트로바이러스의 RNA 분리
아스트로바이러스의 염기서열 확보를 위해, 아스트로바이러스 RNA 분리를 하기와 같이 수행하였다.
보다 구체적으로, 아스트로바이러스 RNA를 분리하기 위해 바이러스 RNA 키트(QIAamp® Viral RNA Mini; QIAGEN, Germany)를 이용하였다. 시료는 임상시료를 사용하였다. 14,000 rpm에서 3분간 원심분리 한 상기 임상 시료 140 μl 및 AVL 완충액(carrier RNA 포함) 560μl를 1.5 ml 튜브에 넣고 15초 동안 펄스-볼텍스(pulse-vortex)한 후 실온에서 10분 동안 정치하고 가볍게 스핀다운(spin-down)하였다. 상기 튜브에 에탄올(96~100%) 1,120 μl을 넣고 15초 동안 혼합한 후 다시 스핀다운하였다. 상기 혼합된 시료 중 630 μl을 스핀칼럼(QIAamp Mini spin column)(2 ml 튜브 포함)에 넣고 6,000 x g에서 1분간 원심분리하여 RNA 흡착하였다. 첫번째 세척을 위해, 여과된 액과 튜브를 버리고 상기 스핀칼럼을 새로운 2 ml 튜브에 옮긴 후, AW1 세척완충액 500 μl를 넣고 6,000 x g에서 3분간 원심분리하였다. 두번째 세척을 위해, 상기 1번째 세척된 스핀칼럼을 새로운 2 ml 튜브에 옮긴 후, AW2 세척완충액 500 μl를 넣고 최대속도로 1분간 원심분리하였다. 상기 두번째 세척된 스핀칼럼을 1.5 ml 튜브에 장착하여, AVE 용출완충액 60 μl를 칼럼에 주입하고 1분간 방치한 후, 6,000 x g에서 1분간 원심분리하여 아스트로바이러스의 RNA를 분리하였다. 즉시 사용하지 않을 시 상기 분리된 RNA는 -70℃에 보관하여 사용하였다.
1-2. 역전사 중합효소 연쇄반응(RT- PCR ) 및 semi-nested PCR 수행
상기 실시예 1-1에서 분리한 아스트로바이러스 RNA에서, 아스트로바이러스의 ORF2 부위를 증폭하기 위하여, 1-step RT-PCR 및 semi-nested PCR을 수행하였다.
보다 구체적으로, 1-step RT-PCR 을 수행하기 위해, PCR 튜브에 25 μl의 1-step PCR Reddy mix(Verso 1-step RT-PCR Reddy mix kit; Thermo scientific)에 상기 실시예 1-1에서 분리한 5 μl의 아스트로바이러스 RNA, 하기 표 1에 기재된 20 pmol 농도의 정방향 및 역방향 프라이머 각 2 μl, 역전사 효소 1 μl 및 증류수 15 μl를 넣어 최종 부피를 50 μl로 맞추고, 하기 표 2에 기재된 조건으로 1-step RT-PCR을 수행하였다.
또한, semi-nested PCR을 수행하기 위해, 상기 RT-PCR 반응으로 수득한 주형 cDNA 5μl, 하기 표 1에 기재된 20 pmol 농도의 정방향 및 역방향 프라이머 각 2μl 및 dNTPs 4 μl, 10X 완충용액 5 μl, Taq DNA polymerase 1 μl, 증류수 31μl를 넣어 최종 부피를 50 μl로 맞추고, 하기 표 2의 조건으로 semi-nested PCR을 수행하였다.
증폭부위 프라이머 프라이머 염기서열(5`->3`) 서열번호 방향
ORF 2 Mon 269(F)a CAACTCAGGAAACAGGGTGT 서열번호 1 정방향
Mon 270(R)a TCAGATGCATTGTCATTGGT 서열번호 2 역방향
반응 종류 조 건 반응 반복수
cDNA 합성
초기 변성		 48℃ 40min
94℃ 3 min 		1 주기
변성
결합
확장 		94℃ 30sec 35 주기
52℃ 30sec
72℃ 1min 30sec
최종신장 68℃ 5min 1 주기
보관 4℃ ∞
1-3. 전기영동 분석
상기 실시예 1-2에서 증폭시킨 아스트로바이러스의 ORF 2 유전자를 확인하기 위해, 전기영동 및 염기서열 분석을 하기와 같이 수행하였다.
보다 구체적으로, 전기영동을 수행하기 위해, Loading STAR (DyneBioinc,korea)와 상기 실시예 1-2에서 증폭시킨 PCR 산물을 1:5 부피 비율로 혼합하여 0.5 x TAE 완충액에 2% 아가로즈 겔을 사용하여 로딩(loading)하고, 밴드를 확인하였다. 그 결과, 아스트로바이러스의 ORF 2 부위 유전자의 PCR 산물이 449 bp인 것을 확인하였다.
1-4. 염기서열 분석
유전자 염기서열을 분석하여 아스트로바이러스 유전자를 최종 판정하기 위해, 상기 1-3에서 전기영동을 수행하여 확인한 아스트로바이러스의 ORF 2 부위의 PCR 산물을 이용하여 염기서열을 분석하였다.
보다 구체적으로, 아스트로바이러스의 ORF 2 부위의 PCR 산물을 PCR purification kit(Bioneer, Korea)를 이용하여 정제하였다. 상기 정제된 샘플을 검출 프라이머를 이용하여 염기서열을 분석하였다. DNA 염기서열 분석기(3500xL Genetic Analyzer, ABI)를 사용하여 분석하였고, DNA 시퀀싱에 의해 결정된 염기서열은 아스트로바이러스 유전자 데이터베이스(NCBI GeneBank)와 비교하여, 아스트로바이러스임을 최종 확인하였다.
상기 최종 확인된 아스트로바이러스 ORF 2 부위에 대하여, 상기 실시예 1-3의 전기영동을 수행한 결과는, 하기 실시예 4의 환경 시료에 대한 아스트로바이러스 표준양성대조군 RNA 전사체의 검출 효율; 및 전기영동 수행 후의 사이즈 크기 비교를 위해 사용되었다.
실시예 2. 외부 유전자인 장관 아데노바이러스 41형(Enteric Adeno 41) 유전자 확보 및 아스트로바이러스 표준양성대조군 유전자 합성
외부 유전자인 장관 아데노바이러스 41형 유전자 확보하고, 이를 아스트로바이러스 표준양성대조군 유전자 합성을 위해 사용한 뒤, 이를 이용하여 클로닝, 형질전환 및 플라스미드를 정제하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
보다 구체적으로, 아스트로바이러스 표준양성대조군 유전자를 제작하기 위하여, 외부 유전자인 장관아데노바이러스 41의 유전자를 검색하여(NCBI Genbank no. DQ315364) 서열번호 3으로 표시되는 염기서열을 확보하였다.
또한, 아스트로바이러스 표준양성대조군 유전자를 제작하기 위하여, 유전자 합성 업체(바이오니아)에 의뢰하여, 아스트로바이러스의 ORF 2 유전자를 증폭하는 정방향 프라이머(서열번호 1); 장관 아데노바이러스 41형 유전자(서열번호 3); 및 아스트로바이러스의 ORF 2 유전자를 증폭하는 역방향 프라이머(서열번호2)를 합성하였다. 상기 합성된 유전자를 pGEM T-easy 플라스미드 벡터에 클로닝하였으며, 상기 벡터 개열 지도를 도 1에 나타내었다.
그 후, 형질전환하기 위해, 합성된 플라스미드 1 μl 및 E. coli 세포인 DH5α를 1.5 ml 튜브에 50 μl를 넣고 합성된 플라스미드 1 μl를 얼음에 20분간 넣어 형질전환을 유도하였다. 20분 후 42℃ 항온수조에서 60~90초간 열 충격(heat-shock)처리를 한 후, 얼음에 3분간 방치하였다. 암피실린(ampicillin)에 저항성이 있는 형질전환을 선별하기 위하여, 암피실린이 들어있는 LB 배지(broth) 10 ml를 추가하고 피펫팅(pipeting)하여 잘 섞어준 후 37℃ 진탕 배양기(shaking incubator)에서 16시간 동안 배양하였다.
다음으로, 플라스미드를 정제하기 위해, Plasmid miniprep kit(Solgent, Korea)를 이용하였다. 상기 배양액을 1.5 ml 튜브에 옮긴 후, 13,000 rpm에서 1분간 원심분리하고 튜브안의 상층액을 버렸다. 튜브안의 펠릿(pellet)을 재현탁(resuspension)하기 위하여 남아있는 펠릿에 RNase가 처리된 SP1 완충액 250 μl를 넣고 볼텍싱(vortexing)하였다. 상기 혼합된 시료의 세포 용해(lysis)를 위하여 SP2 완충액 250 μl를 넣고 뒤집기(inverting)를 4~6회 실시한 후 실온에서 2분 방치하였다. 상기 방치된 시료의 중화(neutralization)를 위하여 SGP3 완충액 350 μl를 넣고 뒤집기를 4~6회 실시한 후 10,000 rpm에서 10분간 원심분리 하였다. 상기 원심분리된 시료의 튜브에 존재하는 잔여물(residue)들을 최대한 배제하여 용해물(lysate)만 조심스럽게 옮겨 수집 튜브(collection tube)가 결합된 칼럼(column)에 넣고 10,000 rpm에서 30초간 다시 원심 분리하였다. 칼럼을 통과한 잔여물들은 버리고 수집 튜브를 다시 칼럼과 결합시켰다. 상기 칼럼에 100% 에탄올이 첨가된 세척완충액(wash 완충액) 750 μl를 넣고 12,000 rpm에서 30초간 원심 분리하였다. 칼럼에 통과한 잔여물을 버리고 수집 튜브를 다시 칼럼과 결합시켜 상기와 같은 방법으로 한번 더 세척하였다. 세척된 칼럼의 건조를 위하여 12,000 rpm에서 3분간 원심분리하고 새로운 1.5ml 튜브에 칼럼을 옮기고, 용리(elution)를 위하여 용리 완충액(elution 완충액) 30 μl를 넣고 2분간 상온에 방치하고 12,000 rpm에서 2분간 원심 분리하였다. 상기 정제한 플라스미드를 2% 아가로즈 겔에서 전기 영동하여 확인하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, DH5α에서 추출하여 정제한 플라스미드를 확인하였다.
상기 플라스미드의 제한효소 처리를 위하여, 제한효소인 ECoRI 1 μl (10u)(TaKaRa Biotechnology), 10 x 완충액 1 μl, 플라스미드 DNA 5 μl, 증류수 3 μl을 튜브에 넣었다. 상기 튜브를 37℃ 배양기에서 1시간 반 동안 반응(cutting) 시켰다. 반응이 끝나면 2% 아가로즈 겔에서 전기영동 하여 삽입 DNA를 확인하였다.
실시예 3. RNA 전사체 제작
아스트로바이러스 표준양성대조군 유전자로부터 전사되는 RNA 전사체를 제작하기 위해, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
보다 구체적으로, 제한효소를 처리하여 시험관내 RNA 전사체를 제작하기 위한 선형(linear)의 DNA로 만들기 위하여, SpeI(10u)(TaKaRa Biotechnology) 1 μl, 10 x 완충액 1 μl, 플라스미드 DNA 5 μl, 증류수 3 μl를 1.5 ml 튜브에 넣고 37℃ 배양기에서 1시간 반 동안 반응시켰다. 반응이 끝나면 2% 아가로즈 겔에서 전기영동하여 DNA를 확인하였다.
다음으로, T7 RNA 중합효소를 이용한 시험관내 전사(In Vitro transcription) 반응으로 대량의 ssRNA를 합성하기 위해, T7 프로모터 서열을 가지는 상기 제한효소가 처리된 플라스미드 DNA를 주형으로 이용하여 T7 전사(transcription)를 수행하였다. 보다 구체적으로, 프로메가(Promega, USA)의 RiboMAX Large Scale RNA Production Systems-T7 kit를 이용하였다. 총 부피를 100 μl이 되도록 하여 T7 5×완충액 20 μl와 rNTPs(25 mM의 ATP, CTP, GTP, UTP) 30 μl, 선형 DNA 주형 (7.48 μg) 20 μl, 증류수 30 μl를 넣고 37℃ 배양기에서 4시간 동안 반응시켰다. 상기 반응액에 RQ1 RNAase-Free DNAase (Promega) 10 μl를 넣고 37℃ 배양기에서 15분 동안 반응시켰다.
또한, RNA를 정화하기 위하여, 1.5 ml 튜브에 상기 T7 전사 반응이 끝난 전사체(transcript) 100 μl 및 25:24:1 = 페놀:클로로포름(Chloroform):이소아밀(isoamyl) (sigma) 100 μl를 혼합한 다음, 14,000 rpm에서 2분간 원심분리하였다. 원심분리된 튜브에서 상등액만 취하여 1.5 ml 튜브에 넣고, 24:1 = 클로로포름:이소아밀(sigma)을 상등액과 동일한 양을 넣고 혼합하고 14000rpm으로 2분간 원심분리하였다. 원심분리된 튜브에서 상등액만 취하고, 3M 소듐 아세테이트(Sodium acetate)(Promega)를 상등액 양의 0.1%의 양을 첨가하고 이소프로판올(isopropanol)을 상등액과 동량을 넣은 후 얼음에서 2~5분간 반응시켰다. 상기 반응액을 14000rpm으로 10분간 원심분리한 후, 상등액을 버리고 차가운 70% 에탄올 1 ml을 넣은 후 뒤집기하고, 다시 14000rpm으로 10분간 원심분리한 후 상등액을 제거하고 20분간 실온에서 건조시켰다. 상기 건조된 시료의 용리(elution)를 위하여 증류수 30 μl을 넣고 2분간 상온에 방치한 후, RNA를 수득하여 -80℃에 보관하였다.
실시예 4. 환경 시료에 대한 제작된 아스트로바이러스 표준양성대조군 유전자의 검출 효율 확인
상기 실시예 3에서 제작한 RNA 전사체 아스트로바이러스의 ORF 2 유전자 부위에 대한 검출 효율; 및 상기 실시예 1-3의 전기영동 수행한 밴드와 사이즈 크기를 비교하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
보다 구체적으로, 1-step RT-PCR을 수행하기 위해, PCR 튜브에 25 μl의 1-step PCR Reddy mix(Verso 1-step RT-PCR Reddy mix kit; Thermo scientific)에 5 μl의 상기 실시예 2에서 수득한 아스트로바이러스 표준양성대조군 RNA 전사체, 상기 표 1에 기재된 20 pmol 농도의 정방향 및 역방향 프라이머 각 2 μl, 역전사 효소 1 μl 및 증류수 15 μl를 넣어 최종 부피를 50 μl로 맞추고, 상기 표 2에 기재된 조건으로 1-step RT-PCR 을 수행하였다.
또한, 상기 PCR 산물을 확인하기 위해 전기영동을 수행하였다. 보다 구체적으로, Loading STAR (DyneBioinc,korea)와 PCR 산물을 1:5 부피 비율로 혼합하여 0.5 x TAE 버퍼에 2% 아가로즈 겔을 사용하여 로딩(loading)하고, 밴드를 확인하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 아스트로바이러스 실제 시료(레인 2)에서는 449bp의 크기가 나타났으나, 아스트로바이러스 표준양성대조군 RNA 전사체는 234 bp임을 확인하여, 상기 실제 시료와 아스트로바이러스 표준양성대조군 RNA 전사체는 동일한 증폭조건에서 약 215bp의 차이가 있음을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 아스트로바이러스 표준양성대조군 유전자 및 이로부터 전사되는 RNA 전사체를 이용 시, 실제 시료와 크기 차이가 있어. 환경시료의 교차오염에 의한 거짓양성(false positive) 및 거짓음성(false-negative) 발생을 방지하여, 유용하고 편리하게 사용할 수 있음을 확인하였다.
<110> KOREA FOOD & DRUG ADMINISTRATION <120> Astrovirus standardized positive control gene and RNA transcripts transcripted therefrom <130> 1-2 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for ORF 2 <400> 1 caactcagga aacagggtgt 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for ORF 2 <400> 2 tcagatgcat tgtcattggt 20 <210> 3 <211> 185 <212> DNA <213> Enteric Adeno 41 gene <400> 3 atggccaccc cctcgatgat gccgcaatgg tcttacatgc acatcgccgg gcaggacgcc 60 tcggagtatc tgagcccggg cctggtgcaa tttgcccgcg ccaccgatac gtacttcagc 120 ctggggaaca agttcagaaa tcccactgtg gctccgacag acaggtcaca gcgactgacg 180 ctgcg 185 <210> 4 <211> 225 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Standardized Positive Control for Astrovirus <400> 4 caactcagga aacagggtgt atggccaccc cctcgatgat gccgcaatgg tcttacatgc 60 acatcgccgg gcaggacgcc tcggagtatc tgagcccggg cctggtgcaa tttgcccgcg 120 ccaccgatac gtacttcagc ctggggaaca agttcagaaa tcccactgtg gctccgacag 180 acaggtcaca gcgactgacg ctgcgaccaa tgacaatgca tctga 225

Claims (11)

  1. 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 아스트로바이러스 표준양성대조군(Positive control) 유전자이며,
    상기 아스트로바이러스 표준양성대조군은 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 아스트로바이러스의 ORF(open reading frame) 2 유전자를 증폭하는 정방향 프라이머; 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 장관 아데노바이러스(enteric adenovirus) 41형 유전자; 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 아스트로바이러스의 ORF 2 유전자를 증폭하는 역방향 프라이머;로 이루어지고,
    서열번호 1 및 2 로 표시되는 프라이머를 이용한 RT-PCR 에 의하여 아스트로바이러스 전사체와 구별 가능한 234bp 크기의 전사체로 전사되는 것을 특징으로 하는, 아스트로바이러스 표준양성대조군 유전자.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제1항의 아스트로바이러스 표준양성대조군 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 재조합 벡터는 도 1의 개열지도를 갖는 것을 특징으로 하는 재조합벡터.
    [도 1]

    Figure 112014127309607-pat00001

  9. 제1항의 아스트로바이러스 표준양성대조군 유전자로부터 전사되며, 서열번호 1 및 2 로 표시되는 프라이머를 이용한 RT-PCR 에 의하여 아스트로바이러스 전사체와 구별 가능한 234bp 크기로 전사되는, 아스트로바이러스 표준양성대조군 RNA 전사체(transcript).
  10. 제9항에 있어서,
    상기 아스트로바이러스 표준양성대조군 RNA 전사체는 도 1의 개열지도를 갖는 재조합 벡터로부터 T7 RNA 중합효소를 이용하여 시험관내(in vitro) 전사되는 것을 특징으로 하는 아스트로바이러스 표준양성대조군 RNA 전사체.
    [도 1]
    Figure 112014127309607-pat00002
  11. 제9항의 아스트로바이러스 표준양성대조군 RNA 전사체를 포함하는, 아스트로바이러스 검출용 키트.
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GenBank Accession # : AB330122 (2008. 06. 14.)
Virology J. 2011, 8:260
환경매개 수인성 장바이러스 분석 기법 개발 [국립환경과학원: NIER-SP2012-105] (2012. 12)

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