CN108866242A - 用于鉴别不同血清型传染性支气管炎病毒活疫苗的半套式rt-pcr分型引物及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及鸡传染性支气管炎病毒活疫苗的RT‑PCR分型检测引物及试剂盒。本发明所述的分型检测引物由序列如SEQ ID NO.1－2所示的通用引物和序列如SEQ ID NO.3－6所示的血清型特异性引物组成。本发明还公开了包含上述分型检测引物的试剂盒。利用本发明的引物和试剂盒，采用半套式RT‑PCR方法鉴别M型、4/91型、LDT3‑A型和QX型血清型传染性支气管炎病毒活疫苗，与常规PCR方法相比，具有更强的特异性和敏感性；还具有快速、高效、低成本的特点，可在5～6h内完成样品的检测，克服了传统血清中和试验的方法耗时较长的缺点，且该方法适合大批量样品的检测与分析。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及鸡传染性支气管炎病毒活疫苗的RT-PCR分型检测。
背景技术
传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus，IBV)属于冠状病毒科(Coronaviridae)，冠状病毒属(Coronavirus)，是有囊膜的单股正链RNA病毒，其基因组长度约为27.6kb。IBV基因组编码4种关键结构蛋白:纤突蛋白(S)、膜蛋白(M)、核衣壳蛋白(N)和小膜蛋白(E)。
S蛋白是IBV的主要结构蛋白，位于病毒的最外面，是构成病毒粒子最表层纤突的主要成分。S蛋白具有许多重要的生物学功能，与病毒吸附宿主细胞和组织嗜性相关。S蛋白翻译后经过宿主细胞蛋白酶的裂解产生N端的S1蛋白和C端的S2蛋白，两者之间由二硫键连接，S1在外形成一个泡状结构，S2通过一个小的疏水跨膜片段嵌入病毒囊膜中，形成S1的柄，将S1蛋白锚定在囊膜上。
IBV基因组的遗传变异是一个非常普遍的现象，大量研究发现IBV基因组RNA的点突变、碱基插入/缺失和不同毒株间的基因重组均可造成IBV的变异。由于病毒变异造成了不同IBV毒株之间巨大的抗原性差异，形成了众多的血清型，不同血清型的IBV毒株之间交叉保护性较低甚至完全没有交叉保护，给疾病的免疫预防带来很大的困难。研究表明，大多数IBV的血清型相关抗原决定簇位于S1蛋白的N端，其中存在3个高度变异的区域(HVR)：N端第37～81氨基酸处，内含两个亲水区；第117～160氨基酸处，为一疏水区；第269～298氨基酸处，为一强亲水区。
根据国内最新的流行病学监测结果，QX型是目前国内流行的最主要的优势血清型，但也同时流行其他多个血清型。为了控制IBV的感染，目前国内在生产中应用的IBV疫苗株也包括多个血清型，其中最为常用的有4个血清型，分别为：Massachusetts型(简称M型，也被称为Mass型或马萨诸塞型，代表疫苗毒株为H120、H52和Ma5)、4/91型(也称793/B型，代表疫苗株为4/91)、LDT3-A型(代表疫苗株为LDT3-A)和QX型(代表疫苗株为QXL87)。经典的鉴定不同血清型毒株的方法为血清中和试验，该技术虽已属常规技术，但需要使用不同血清型特异的阳性血清，目前通过商业化的途径尚不能获得针对上述4种血清型疫苗株的全部特异性血清。且该方法检测周期往往要几周以上，存在检测周期长、工作量大的局限性。
RT-PCR技术是一种快速、敏感、特异的分子生物学检测方法，目前已经在各种病毒检测和分型中得到了广泛应用。IBV不同血清型毒株间S1基因高变区同源性较低，而相同血清型毒株间一般存在较为保守的特征性序列，因此可以通过设计血清型特异性引物进行RT-PCR扩增，从而达到区分不同血清型毒株的目的。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供用于区分M型、4/91型、LDT3-A型和QX型传染性支气管炎病毒疫苗株的半套式RT-PCR特异性引物对。
本发明的第二个目的在于提供区分M型、4/91型、LDT3-A型和QX型传染性支气管炎病毒疫苗株的半套式RT-PCR试剂盒。
已公开报道的血清型鉴别PCR方法仅能对部分血清型IBV弱毒疫苗株进行区分(如区分M型和4/91型)，而LDT3-A株和QXL87株是最近注册的新的血清型的疫苗株，也是目前中国特有的疫苗株，尚未有任何RT-PCR方法可实现同时对M型、4/91型、LDT3-A型和QX型等4种血清型IBV疫苗株进行的区分。本发明通过对不同血清型IBV疫苗株S1基因序列进行比对，寻找各血清型之间在S1基因高变区侧翼的保守序列和高变区内血清型特异性差异序列，首先针对高变区侧翼的保守序列设计出一对通用引物，可以特异性扩增所有4个血清型疫苗株S1基因特异性片段，用于套式PCR首轮扩增包含高变区的特异性片段，然后根据高变区内的差异序列设计血清型特异性PCR引物，与通用引物组合进行套式PCR扩增，即可达到特异性区分不同血清型疫苗毒株的目的,各引物在S1基因的结合位置和扩增产物示意图如图1所示。
本发明公开了用于鉴别不同血清型传染性支气管炎病毒活疫苗的半套式RT-PCR分型引物，由序列如SEQ ID NO.1－2所示的通用引物和序列如SEQ ID NO.3－6所示的血清型特异性引物组成；所述不同血清型是M型、4/91型、LDT3-A型和QX型。
本发明还公开了一种用于鉴别M型、4/91型、LDT3-A型和QX型血清型传染性支气管炎病毒活疫苗的半套式RT-PCR试剂盒，该试剂盒含有上述的用于鉴别不同血清型传染性支气管炎病毒活疫苗的半套式RT-PCR分型引物。引物序列如表1所示。
表1优选的PCR引物序列
试剂盒中除引物外还包括以下组分：
(1)RNA提取试剂：Trizol试剂；
(2)反转录试剂：无核酸酶灭菌超纯水，随机引物(0.2μg/μL)，5×反转录缓冲液，dNTPs(10mmol/L)，RNase抑制剂(20U/μL)，M-MLV反转录酶(200U/μL)；
(3)PCR反应试剂：10×PCR反应缓冲液，dNTP混合物(2.5mmol/L)、Taq DNA聚合酶(5U/μL)；
(4)阳性对照样品：包括M型、4/91型、LDT3-A型和QX型毒株核酸样品，具体分别为M型、4/91型、LDT3-A型和QX型疫苗毒株感染的鸡胚尿囊液抽提RNA的反转录产物cDNA；
(5)阴性对照样品：正常SPF鸡胚尿囊液抽提RNA的反转录产物cDNA。
本发明进一步提供了采用半套式RT-PCR鉴别4种血清型IBV活疫苗的方法，，具体步骤为：
(1)提取样本总RNA并进行反转录(RT)合成cDNA。
(2)首先利用通用引物对IB-VacUni-F3+IB-VacUni-R进行第一轮PCR扩增，对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，利用紫外凝胶成像仪检测目的条带，如果扩增出452bp(M型)或458bp(4/91型、LDT3-A型或QX型)大小目的条带则证明为IBV检测阳性，否则为阴性。其中，PCR扩增可采用下列反应程序:起始变性94℃5min,30个循环(94℃30s,60℃30s,72℃40s)，最后经过72℃5min延伸。
(3)然后以第一轮IBV检测阳性的PCR产物为模板，利用引物对组合Vac-Mass-F+IB-VacUni-R、Vac-4/91-F+IB-VacUni-R、Vac-LDT3A-F+IB-VacUni-R和Vac-QX-F+IB-VacUni-R分别进行半套式PCR，对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，利用紫外凝胶成像仪检测目的条带，如果Vac-Mass-F+IB-VacUni-R引物对扩增出194bp大小特异性条带，则说明样品中含有M型疫苗株，如果Vac-4/91-F+IB-VacUni-R引物对扩增出197bp大小特异性条带，则说明样品中含有4/91型毒株，如果Vac-LDT3A-F+IB-VacUni-R引物对扩增出200bp大小特异性条带，则说明样品中含有LDT3-A型疫苗株，如果Vac-QX-F+IB-VacUni-R引物对扩增出200bp大小特异性条带，则说明样品中含有QX型疫苗株。其中，PCR扩增可采用下列反应程序:起始变性94℃5min,30个循环(94℃30s,60℃30s,72℃30s)，最后经过72℃5min延伸。
本发明提供了上述特异性引物对在制备鉴别传染性支气管炎病毒血清型试剂盒中的应用。
本发明提供了上述特异性引物对在制备鉴别M型、4/91型、LDT3-A型和QX型等4种血清型IBV疫苗毒株的半套式RT-PCR试剂盒中的应用。
含有SEQ ID NO.1-6所示特异性引物的检测试剂属于本发明的保护范围。
含有SEQ ID NO.1-6所示特异性引物的试剂盒属于本发明的保护范围。
本发明的优点在于：(1)扩增的目的片段位于IBV的Sl基因的高变区，不同血清型毒株在该区域存在较大的序列差异，具体表现为高频率的碱基变异、插入或缺失，作为PCR检测的目标区域具有良好的区分度；(2)本发明采用半套式RT-PCR方法，首先针对高变区侧翼的保守序列设计一对引物能扩增所有4种血清型S1基因特异性片段，然后针对扩增片段内部不同血清型间差异最显著的区域分别设计血清型特异性引物，与通用引物配对组成4种不同的引物对组合，以第一轮的PCR产物为模板分别特异性扩增M型、4/91型、LDT3-A型和QX型等4种血清型IBV疫苗毒株，与常规PCR方法相比，具有更强的特异性和敏感性；(3)本发明方法不仅适用于养禽生产中进行疫苗的评价，也适用于兽药监管部门对兽药企业生产的IBV活疫苗是否非法添加兽药国家标准以外的其它毒株进行监督检查，具有快速、高效、低成本的特点，可在5～6h内完成样品的检测，克服了传统血清中和试验的方法耗时较长的缺点，且该方法适合大批量样品的检测与分析。
附图说明
图1为PCR引物在S1基因的结合位点示意图。
图2为半套式RT-PCR第一轮引物对筛选与退火温度优化试验结果。图中，M为DL1000DNA marker；第1～第12泳道为引物IB-VacUni-F3和引物IB-VacUni-R配对对QX型QXL87毒株扩增结果，对应的退火温度梯度依次为70.0℃、69.4℃、68.4℃、66.5℃、64.3℃、61.4℃、58.0℃、55.2℃、53.0℃、51.3℃、50.4℃、50.0℃；第13～第24泳道为引物IB-VacUni-F2和引物IB-VacUni-R配对对QX型QXL87毒株扩增结果，对应的退火温度梯度依次为70.0℃、69.4℃、68.4℃、66.5℃、64.3℃、61.4℃、58.0℃、55.2℃、53.0℃、51.3℃、50.4℃、50.0℃。
图3为半套式RT-PCR第一轮引物对筛选与退火温度优化试验结果。图中，M为DL1000DNA marker；第1～第12泳道为引物IB-VacUni-F1和引物IB-VacUni-R配对对QX型QXL87毒株扩增结果，对应的退火温度梯度依次为70.0℃、69.4℃、68.4℃、66.5℃、64.3℃、61.4℃、58.0℃、55.2℃、53.0℃、51.3℃、50.4℃、50.0℃；第13～第24泳道为引物IB-VacUni-F3和引物IB-VacUni-R配对对LDT3-A型LDT3-A毒株扩增结果，对应的退火温度梯度依次为70.0℃、69.4℃、68.4℃、66.5℃、64.3℃、61.4℃、58.0℃、55.2℃、53.0℃、51.3℃、50.4℃、50.0℃。
图4为半套式RT-PCR第一轮引物对筛选与退火温度优化试验结果。图中，M为DL1000DNA marker；第1～第12泳道为引物IB-VacUni-F2和引物IB-VacUni-R配对对LDT3-A型LDT3-A毒株扩增结果，对应的退火温度梯度依次为70.0℃、69.4℃、68.4℃、66.5℃、64.3℃、61.4℃、58.0℃、55.2℃、53.0℃、51.3℃、50.4℃、50.0℃；第13～第24泳道为引物IB-VacUni-F1和引物IB-VacUni-R配对对LDT3-A型LDT3-A毒株扩增结果，对应的退火温度梯度依次为70.0℃、69.4℃、68.4℃、66.5℃、64.3℃、61.4℃、58.0℃、55.2℃、53.0℃、51.3℃、50.4℃、50.0℃。
图5为半套式RT-PCR第一轮引物对筛选与退火温度优化试验结果。图中，M为DL1000DNA marker；第1～第12泳道为引物IB-VacUni-F3和引物IB-VacUni-R配对对4/91型4/91毒株扩增结果，对应的退火温度梯度依次为70.0℃、69.4℃、68.4℃、66.5℃、64.3℃、61.4℃、58.0℃、55.2℃、53.0℃、51.3℃、50.4℃、50.0℃；第13～第24泳道为引物IB-VacUni-F2和引物IB-VacUni-R配对对4/91型4/91毒株扩增结果，对应的退火温度梯度依次为70.0℃、69.4℃、68.4℃、66.5℃、64.3℃、61.4℃、58.0℃、55.2℃、53.0℃、51.3℃、50.4℃、50.0℃。
图6为半套式RT-PCR第一轮引物对筛选与退火温度优化试验结果。图中，M为DL1000DNA marker；第1～第12泳道为引物IB-VacUni-F1和引物IB-VacUni-R配对对4/91型4/91毒株扩增结果，对应的退火温度梯度依次为70.0℃、69.4℃、68.4℃、66.5℃、64.3℃、61.4℃、58.0℃、55.2℃、53.0℃、51.3℃、50.4℃、50.0℃；第13～第24泳道为引物IB-VacUni-F3和引物IB-VacUni-R配对对M型H120毒株扩增结果，对应的退火温度梯度依次为70.0℃、69.4℃、68.4℃、66.5℃、64.3℃、61.4℃、58.0℃、55.2℃、53.0℃、51.3℃、50.4℃、50.0℃。
图7为半套式RT-PCR第一轮引物对筛选与退火温度优化试验结果。图中，M为DL1000DNA marker；第1～第12泳道为引物IB-VacUni-F2和引物IB-VacUni-R配对对M型H120毒株扩增结果，对应的退火温度梯度依次为70.0℃、69.4℃、68.4℃、66.5℃、64.3℃、61.4℃、58.0℃、55.2℃、53.0℃、51.3℃、50.4℃、50.0℃；第13～第24泳道为引物IB-VacUni-F1和引物IB-VacUni-R配对对M型H120毒株扩增结果，对应的退火温度梯度依次为70.0℃、69.4℃、68.4℃、66.5℃、64.3℃、61.4℃、58.0℃、55.2℃、53.0℃、51.3℃、50.4℃、50.0℃。
图8为半套式RT-PCR第二轮扩增与退火温度优化试验结果，引物组合为Vac-Mass-F和引物IB-VacUni-R，扩增毒株为M型H120毒株；图中，M为DL1000DNA marker；第1～第12泳道对应的退火温度梯度依次为60.0℃、59.7℃、59.2℃、58.2℃、57.1℃、55.7℃、54.0℃、52.6℃、51.5℃、50.6℃、50.2℃、50.0℃。
图9为半套式RT-PCR第二轮扩增与退火温度优化试验结果，引物组合为Vac-4/91-F和引物IB-VacUni-R，扩增毒株为4/91型4/91毒株；图中，M为DL1000DNA marker；第1～第12泳道对应的退火温度梯度依次为60.0℃、59.7℃、59.2℃、58.2℃、57.1℃、55.7℃、54.0℃、52.6℃、51.5℃、50.6℃、50.2℃、50.0℃。
图10为半套式RT-PCR第二轮扩增与退火温度优化试验结果，引物组合为Vac-LDT3A-F和引物IB-VacUni-R，扩增毒株为LDT3-A型LDT3-A毒株；图中，M为DL1000DNAmarker；第1～第12泳道对应的退火温度梯度依次为60.0℃、59.7℃、59.2℃、58.2℃、57.1℃、55.7℃、54.0℃、52.6℃、51.5℃、50.6℃、50.2℃、50.0℃。
图11为半套式RT-PCR第二轮扩增与退火温度优化试验结果，引物组合为Vac-QX-F和引物IB-VacUni-R，扩增毒株为QX型QXL87毒株；图中，M为DL1000DNA marker；第1～第12泳道对应的退火温度梯度依次为60.0℃、59.7℃、59.2℃、58.2℃、57.1℃、55.7℃、54.0℃、52.6℃、51.5℃、50.6℃、50.2℃、50.0℃。
图12为试剂盒对M型(H52株、H120株、Ma5株)、4/91型(4/91株)、LDT3-A型(LDT3-A株)和QX型(QXL87株)的第一轮PCR扩增结果；图中，M为DL1000DNA marker，1为H52株，2为H120株，3为Ma5株，4为4/91株，5为LDT3-A株，6为QXL87株，7为阴性对照。
图13为试剂盒对M型(H52株、H120株、Ma5株)、4/91型(4/91株)、LDT3-A型(LDT3-A株)和QX型(QXL87株)的第二轮PCR扩增结果，引物组合为引物Vac-Mass-F和引物IB-VacUni-R；图中，M为DL1000DNA marker，1为H52株，2为H120株，3为Ma5株，4为4/91株，5为LDT3-A株，6为QXL87株，7为阴性对照。
图14为试剂盒对M型(H52株、H120株、Ma5株)、4/91型(4/91株)、LDT3-A型(LDT3-A株)和QX型(QXL87株)的第二轮PCR扩增结果，引物组合为引物Vac-4/91-F和引物IB-VacUni-R；图中，M为DL1000DNA marker，1为H52株，2为H120株，3为Ma5株，4为4/91株，5为LDT3-A株，6为QXL87株，7为阴性对照。
图15为试剂盒对M型(H52株、H120株、Ma5株)、4/91型(4/91株)、LDT3-A型(LDT3-A株)和QX型(QXL87株)的第二轮PCR扩增结果，引物组合为引物Vac-LDT3A-F和引物IB-VacUni-R；图中，M为DL1000DNA marker，1为H52株，2为H120株，3为Ma5株，4为4/91株，5为LDT3-A株，6为QXL87株，7为阴性对照。
图16为试剂盒对M型(H52株、H120株、Ma5株)、4/91型(4/91株)、LDT3-A型(LDT3-A株)和QX型(QXL87株)的第二轮PCR扩增结果，引物组合为引物Vac-QX-F和引物IB-VacUni-R；图中，M为DL1000DNA marker，1为H52株，2为H120株，3为Ma5株，4为4/91株，5为LDT3-A株，6为QXL87株，7为阴性对照。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
下列实施例中常规的实验方法，参见Sambrook等编写的分子克隆。仪器的使用参照仪器操作说明。Centrifuge 5424R冷冻离心机、Centrifuge 5425离心机和Eppendorf2单道移液器(0.1～2.5μL、0.5～10μL、10～100μL、20～200μL)，为德国Eppendorf公司产品；Vortex Genie2涡旋振荡器，为美国Scientific Industries公司产品；GeneTouchPCR基因扩增仪为杭州博日科技有限公司产品；HE 120多功能水平电泳槽和Tanon 4100全自动数码凝胶成像分析系统，为上海天能科技有限公司产品；DK-600型电热恒温水槽，为上海精宏实验设备有限公司产品。Trizol RNA提取试剂，购自Invitrogen公司。M-MLV反转录酶(2000U/μL)、RNA酶抑制剂(50U/μL)、Taq DNA聚合酶(5U/μL)，dNTP混合物(2.5mmol/L和10mmol/L)、随机引物(0.1μg/μL)和无核酸酶超纯水，均购自北京全式金生物技术有限公司。DL1000DNA marker购自宝生物工程(大连)有限公司。
本发明实施例中选用的传染性支气管炎病毒疫苗株和商品疫苗如下:H52株、H120株、Ma5株、4/91株和LDT3-A株为将对应商品疫苗接种10日龄SPF鸡胚所获得的含毒鸡胚尿囊液；QXL87株(QX型)由扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室保藏和提供(陈启稳.QX型鸡传染性支气管炎弱毒疫苗的研制.扬州大学硕士学位论文，2014.)；鸡传染性支气管炎活疫苗(H52株)为乾元浩生物股份有限公司南京生物药厂产品、鸡传染性支气管炎活疫苗(H120株)为青岛易邦生物工程有限公司产品、鸡传染性支气管炎活疫苗(Ma5株)为英特威美国分公司产品、鸡传染性支气管炎活疫苗(4/91株)为MSD公司产品、鸡传染性支气管炎活疫苗(LDT3-A株)为哈尔滨维科生物技术开发公司产品、鸡新城疫-传染性支气管炎二联活疫苗(LaSota株+QXL87株)为青岛易邦生物工程有限公司产品。
实施例1鉴别M型、4/91型、LDT3-A型和QX型传染性支气管炎病毒疫苗株半套式RT-PCR方法第一轮PCR引物(通用引物)设计。
参照GenBank登录的M型IBV疫苗H52株、H120株和Ma5株IBV S1基因序列(GenBank登录号分别为：KF188436、AF352315、AY561713)、4/91株S1基因序列(GenBank登录号为KF377577)、LDT3-A株S1基因序列(GenBank登录号为KR608272)和QXL87株S1基因序列(GenBank登录号为MH743141)的高变区设计并筛选特异性通用引物，对M型、4/91型、LDT3-A型和QX型疫苗株S1基因序列均能有效扩增。经过反复比对和筛选，最终获得3条备选上游引物和1条下游引物(表2)。
表2半套式RT-PCR第一轮通用引物设计
继续对3种引物组合进行配对实验，分别以4种血清型疫苗株H120株、4/91株、LDT3-A株和QXL87株作为检测对象进行RT-PCR扩增S1基因，以确定最优化的引物对。方法如下：
(1)样品总RNA的提取
将四种血清型疫苗毒株含毒尿囊液样品分别取100μL，参照Trizol RNA提取试剂说明书进行提取。
(2)反转录为cDNA
在0.2ml离心管内依次加入下列成分:无核酸酶灭菌超纯水7.5μL、RNA溶液4μL，随机引物(0.2μg/μL)1μL，轻轻混匀，65℃水浴孵育5min后，冰浴2min，然后依次加入下列成分:5×反转录缓冲液4μL，dNTPs(10mmol/L)1μL，RNase抑制剂(20U/μL)0.5μL，M-MLV反转录酶(200U/μL)1μ1，轻轻混匀，25℃孵育10min后，42℃孵育30min，得到样本cDNA。
(3)PCR扩增
在0.2mL离心管中依次加入下列成分:无核酸酶灭菌超纯水17μL、10×PCR反应缓冲液2.5μL、cDNA 2μL、上游引物(10μmmol/L)0.5μL、下游引物(10μmmol/L)0.5μL、dNTP混合物(2.5mmol/L)2μL、Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.5μL，轻轻混匀后，以PCR仪自动设置退火温度梯度进行如下反应:94℃预变性5min，94℃30s，(50℃～70℃)30s,72℃40s，进行30个循环，循环结束72℃延伸10min。
PCR反应结束后，用1×TAE电泳缓冲液制备1.5％琼脂糖凝胶并按0.5μg/mL混入溴化乙锭(EB)，取10μL PCR产物加入凝胶孔中，选择5V/cm电压进行电泳，电泳时间约为30min，电泳结束后将凝胶置于紫外凝胶成像仪上观察并拍照，根据电泳结果确定样品中能否扩增出目的条带，如果扩增出452bp(M型)或458bp(4/91型、LDT3-A型或QX型)大小目的条带则证明为IBV检测阳性，否则为阴性。
各引物扩增电泳结果如图2～图7所示。结果显示，上游引物IB-VacUni-F3和下游引物IB-VacUni-R配对针对4种血清型疫苗毒株S1基因的扩增均表现出良好的特异性，且在50℃～61.4℃退火温度区间内，均能达到良好的扩增效果。而上游引物IB-VacUni-F1和上游引物IB-VacUni-F2分别与下游引物IB-VacUni-R配对均无法针对所有毒株扩增出预期大小的目的条带或扩增反应特异性较差，故确定上游引物IB-VacUni-F3和下游引物IB-VacUni-R配对作为最终组合用于鉴别M型、4/91型、LDT3-A型和QX型IBV疫苗株的半套式RT-PCR方法的首轮PCR扩增。
本发明提供的针对4种血清型疫苗株的优选通用引物对序列为:上游引物5'-GTKTACTACTACCAAAGTGCCT-3'(SEQ ID NO.1)；以及下游引物5'-GARGTRWAAACAAGATCACCAT-3'(SEQ ID NO.2)。
实施例2鉴别M型、4/91型、LDT3-A型和QX型传染性支气管炎病毒疫苗株半套式RT-PCR方法第二轮PCR引物(鉴别引物)设计。
根据第一轮PCR扩增的不同血清型疫苗毒株高变区序列，经过序列比对，筛选出在不同血清型间差异显著但在血清型内保守的区域设计出M型、4/91型、LDT3-A型和QX型疫苗株特异性鉴别引物，分别作为上游引物与第一轮PCR的通用下游引物IB-VacUni-R(SEQ IDNO.2)配对进行半套式PCR扩增。经过反复比对和筛选，最终获得的4条血清型特异性引物见表3。
表2半套式RT-PCR第二轮血清型特异性鉴别引物设计
分别用4种血清型特异性引物组合，对实施例1扩增出的第一轮PCR产物作为模板进行第二轮半套式PCR扩增，方法如下：
在0.2mL离心管中依次加入下列成分:无核酸酶灭菌超纯水18μL、10×PCR反应缓冲液2.5μL、模板(第一轮PCR产物)1μL、上游引物(10μmmol/L)0.5μL、下游引物(10μmmol/L)0.5μL、dNTP混合物(2.5mmol/L)2μL、Taq DNA聚合酶0.5μL，轻轻混匀后，以PCR仪自动设置退火温度梯度进行如下反应:94℃预变性5min，94℃30s，(50℃～60℃)30s,72℃30s，进行30个循环，循环结束72℃延伸10min。
PCR反应结束后，用1×TAE电泳缓冲液制备1.5％琼脂糖凝胶并按0.5μg/mL混入溴化乙锭(EB)，取10μL PCR产物加入凝胶孔中，选择5V/cm电压进行电泳，电泳时间约为30min，电泳结束后将凝胶置于紫外凝胶成像仪上观察并拍照，根据电泳结果确定样品中能否扩增出目的条带，如果Vac-Mass-F+IB-VacUni-R引物对扩增出194bp大小特异性条带，则说明样品中含有M型疫苗株，如果Vac-4/91-F+IB-VacUni-R引物对扩增出197bp大小特异性条带，则说明样品中含有4/91型毒株，如果Vac-LDT3A-F+IB-VacUni-R引物对扩增出200bp大小特异性条带，则说明样品中含有LDT3-A型疫苗株，如果Vac-QX-F+IB-VacUni-R引物对扩增出200bp大小特异性条带，则说明样品中含有QX型疫苗株。
各引物组合扩增电泳结果如图8～图11所示。结果显示，4种血清型特异性引物组合均能特异性扩增出各自对应血清型的目的条带，且在50℃～60℃退火温度区间内均能达到良好的扩增效果。
实施例3应用本发明的半套式RT-PCR对商品化疫苗进行检测和毒株鉴别
(1)样品总RNA的提取
取鸡传染性支气管炎活疫苗(H52株)、鸡传染性支气管炎活疫苗(H120株)、鸡传染性支气管炎活疫苗(Ma5株)、鸡传染性支气管炎活疫苗(4/91株)、鸡传染性支气管炎活疫苗(LDT3-A株)和鸡新城疫-传染性支气管炎二联活疫苗(LaSota株+QXL87株)各1瓶，用注射器向每瓶疫苗中加入2mL无核酸酶灭菌超纯水将冻干疫苗重悬，室温静置5min，每种疫苗样品分别取100μL混悬液，参照Trizol RNA提取试剂说明书进行提取总RNA。
(2)反转录为cDNA
在0.2ml离心管内依次加入下列成分:无核酸酶灭菌超纯水7.5μL、RNA溶液4μL，随机引物1μL，轻轻混匀，65℃水浴孵育5min后，冰浴2min，然后依次加入下列成分:5×反转录缓冲液4μL，dNTPs(10mmol/L)1μL，RNase抑制剂0.5μL，反转录酶1μ1，轻轻混匀，25℃孵育10min后，42℃孵育30min，得到样本cDNA。
(3)PCR扩增
①第一轮PCR扩增：在0.2mL离心管中依次加入下列成分:无核酸酶灭菌超纯水17μL、10×PCR反应缓冲液2.5μL、cDNA 2μL、上游引物(10μmmol/L)0.5μL、下游引物(10μmmol/L)0.5μL、dNTP混合物(2.5mmol/L)2μL、Taq DNA聚合酶0.5μL，轻轻混匀后，放置于PCR仪中进行如下反应:94℃预变性5min，94℃30s，60℃30s,72℃40s，进行30个循环，循环结束72℃延伸10min。试验同时设置超纯水作为阴性模板对照。
②第二轮PCR扩增：在0.2mL离心管中依次加入下列成分:无核酸酶灭菌超纯水18μL、10×PCR反应缓冲液2.5μL、模板(第一轮PCR产物)1μL、上游引物(10μmmol/L)0.5μL、下游引物(10μmmol/L)0.5μL、dNTP混合物(2.5mmol/L)2μL、Taq DNA聚合酶0.5μL，轻轻混匀后，放置于PCR仪中进行如下反应:94℃预变性5min，94℃30s，60℃30s,72℃30s，进行30个循环，循环结束72℃延伸10min。
(4)电泳
PCR反应结束后，用1×TAE电泳缓冲液制备1.5％琼脂糖凝胶并按0.5μg/mL混入溴化乙锭(EB)，取10μL PCR产物加入凝胶孔中，选择5V/cm电压进行电泳，电泳时间约为30min，电泳结束后将凝胶置于紫外凝胶成像仪上观察并拍照，根据电泳结果确定样品中能否扩增出目的条带。第一轮PCR扩增电泳结果如图12所示，结果显示针对所有疫苗样品均可扩增出预期大小的目的条带，而阴性对照未扩增出目的条带。第二轮PCR扩增电泳结果如图13～图16所示，结果显示所有4种血清型特异性引物组合均只能从含对应血清型毒株的疫苗样品扩增出预期大小的目的条带，而与含有其他血清型毒株的疫苗样品不能扩增出目的条带，阴性对照样品均不能扩增出目的条带。
(5)PCR产物测序验证
分别将扩增得到的PCR产物进行回收，送测序公司进行测序分析，测序结果经序列比对和Blast分析，结果显示扩增的序列对应血清型IBV疫苗株的相应S1基因片段一致。具体的H52毒株第一轮扩增片段序列为SEQ ID NO.9所示，H120毒株第一轮扩增片段序列为SEQ ID NO.10所示，Ma5毒株第一轮扩增片段序列为SEQ ID NO.11所示，4/91毒株第一轮扩增片段序列为SEQ ID NO.12所示，LDT3-A毒株第一轮扩增片段序列为SEQ ID NO.13所示,QXL87毒株第一轮扩增片段序列为SEQ ID NO.14所示；H52毒株第二轮扩增片段序列为SEQID NO.15所示，H120毒株第二轮扩增片段序列为SEQ ID NO.16所示，Ma5毒株第二轮扩增片段序列为SEQ ID NO 17所示，4/91毒株第二轮扩增片段序列为SEQ ID NO.18所示，LDT3-A毒株第二轮扩增片段序列为SEQ ID NO.19所示,QXL87毒株第二轮扩增片段序列为SEQ IDNO.20所示。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，如将实施例1的两步法RT-PCR改为一步法RT-PCR，或舍弃本发明中的半套式RT-PCR第一轮扩增的通用性引物而采用第二轮扩增的血清型特异性引物直接进行PCR分型，或将本发明的方法和试剂盒用于疫苗株以外的相同血清型的野毒株的鉴别等，这些对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 扬州大学
<120> 用于鉴别不同血清型传染性支气管炎病毒活疫苗的半套式RT-PCR分型引物及
试剂盒
<130>
<160> 20
<170> PatentIn version 3.5
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Claims (5)
1.用于鉴别不同血清型传染性支气管炎病毒活疫苗的半套式RT-PCR分型引物，其特征在于，由序列如SEQ ID NO.1－2所示的通用引物和序列如SEQ ID NO.3－6所示的血清型特异性引物组成；所述不同血清型是M型、4/91型、LDT3-A型和QX型。
2.一种用于鉴别不同血清型传染性支气管炎病毒活疫苗的半套式RT-PCR试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的用于鉴别不同血清型传染性支气管炎病毒活疫苗的半套式RT-PCR分型引物。
3.权利要求1所述分型引物在制备鉴别M型、4/91型、LDT3-A型和QX型4种血清型IBV活疫苗的半套式RT-PCR试剂盒中的应用。
4.一种鉴别4种血清型IBV疫苗株的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取待测样本总RNA并进行反转录合成cDNA；
(2)第一轮PCR扩增：先利用序列如SEQ ID NO.1－2所示的通用引物进行第一轮PCR扩增，对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，利用紫外凝胶成像仪检测目的条带，如果扩增出452bp或458bp大小目的条带则证明为IBV检测阳性，否则为阴性。
(3)以第一轮阳性的PCR产物为模板，利用引物对组合Vac-Mass-F+IB-VacUni-R、Vac-4/91-F+IB-VacUni-R、Vac-LDT3A-F+IB-VacUni-R和Vac-QX-F+IB-VacUni-R分别进行半套式PCR，对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，利用紫外凝胶成像仪检测目的条带，根据条带鉴别出4种血清型IBV疫苗株：
Vac-Mass-F+IB-VacUni-R引物对扩增出194bp大小特异性条带，为M型疫苗株；
Vac-4/91-F+IB-VacUni-R引物对扩增出197bp大小特异性条带，为4/91型毒株；
Vac-LDT3A-F+IB-VacUni-R引物对扩增出200bp大小特异性条带，为LDT3-A型疫苗株；
Vac-QX-F+IB-VacUni-R引物对扩增出200bp大小特异性条带，为QX型疫苗株；
其中，所述的引物IB-VacUni-R、Vac-Mass-F、Vac-4/91-F、Vac-LDT3A-F和Vac-QX-F的序列分别如SEQ ID NO.2－6所示。
5.一种鉴别不同血清型传染性支气管炎病毒活疫苗的检测试剂，其特征在于，含有序列如SEQ ID NO.1-6所示的特异性引物。
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| CN107326103A (zh) * | 2017-08-28 | 2017-11-07 | 聊城大学 | 一种三重rt‑pcr特异性扩增引物组及三重鉴定的rt‑pcr检测方法 |
| CN108315488A (zh) * | 2018-04-17 | 2018-07-24 | 山东新希望六和集团有限公司 | 用于鉴定鸡传染性支气管炎病毒毒株类型的引物、rt-pcr检测试剂盒及方法、应用 |
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2018
- 2018-08-24 CN CN201810972679.9A patent/CN108866242A/zh active Pending
Patent Citations (3)
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