CN104995315A

CN104995315A - Ibv、csfv和ndv的高分辨熔解基因分型

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Publication number: CN104995315A
Application number: CN201380071551.0A
Authority: CN
Inventors: J-C·奥多内; S·贾甘纳坦
Original assignee: Asia Pacific Special Nutrients Sdn Bhd; Cimmeria Limited-Liability Co
Current assignee: Merial Ltd; Asia Pacific Special Nutrients Sdn Bhd; Cimmeria Limited-Liability Co
Priority date: 2012-12-18
Filing date: 2013-12-17
Publication date: 2015-10-21
Also published as: CA2895324A1; AU2017203670A1; TWI616535B; CL2015001757A1; BR112015014271A2; AU2013362961A1; CO7461132A2; KR20150110531A; HK1215593A1; PH12015501382B1; MY183053A; EP2935629A1; PE20151407A1; SA515360607B1; MX2015007843A; US10125401B2; SG11201504841YA; WO2014099929A1; AU2013362961B2; PH12015501382A1

Abstract

本发明涉及使用高分辨熔解技术区分和表征IBV、CSFV和NDV毒株和鉴定新毒株的方法。本发明还提供随这类方法使用的底物和试剂盒。

Description

IBV、CSFV和NDV的高分辨熔解基因分型

相关申请的交叉引用

本申请要求2012年12月18日提交的美国临时申请61/738,688的优先权。

技术领域

发明背景

聚合酶链反应(PCR)是一种引物延伸反应，所述反应提供一种在体外扩增特定DNA或多核苷酸、产生数千个至数百万个特定DNA序列副本的方法。PCR现在是医学研究实验室和生物学研究实验室中用于多种应用的常见和经常不可替代的技术。这些应用包括用于测序、基于DNA的系统发生或基因功能分析的DNA克隆；诊断遗传疾病；鉴定遗传指纹；及检测和诊断传染病。基本PCR的某些变型包含定量实时PCR(qPCR或RT-PCR)、等位基因特异性PCR、非对称PCR、热启动PCR、逆转录PCR、多重PCR、巢式PCR、连接介导的PCR、序列间特异性PCR、热不对称交错PCR和温度递降PCR。这些PCR变型针对不同用途提供广泛类型的用途。例如，可以通过等位基因特异性PCR鉴定单核苷酸多态性(SNP)(DNA中的单碱基差异)、qPCR可以在PCR反应中扩增的副本数目提供极高精度(Bartlett等人,“A Short History ofthe Polymerase Chain Reaction”，PCR Protocols,2003)。

最近，增加了高分辨熔解(HRM)法作为一种用于高通量突变扫描的新分子技术(Zhou,L.等人,Clin.Chern.51,1770-1777,2005)。使用HRM确定突变基于与双链DNA相互作用的荧光染料存在下暴露于递增温度时DNA的解离(参见，例如US7,387,887；US7,582,429)。本领域中存在许多适宜的染料。突变的存在导致DNA异源双链体形成，随后熔解行为改变。因此，这种“突变扫描”技术检测靶基因衍生的PCR扩增子中序列变异的存在。在HRM实验中，首先在高分辨熔解染料存在下借助实时PCR扩增样品DNA。这类染料的知名实例在WO 2008/052742中公开。在PCR后，后续熔解实验可以在同一个实时仪上进行，并用相应的基因扫描软件分析以鉴定序列变体。

经典猪瘟(CSF)，先前称作猪霍乱，是一种侵袭家猪和野猪的高度接触性和多系统出血性疾病，它在全球养猪业中造成经济损失并且根据陆生动物卫生法典，是世界动物卫生组织法定报告疾病(OIE，2007)。致病因子是经典猪瘟病毒(CSFV)，它是一种有囊膜、正义、单链RNA病毒，归属于黄病毒科(Flaviviridae)的瘟病毒属(Pestivirus)。在遗传水平，基于E2基因和NS5B基因的部分序列，CSFV可以划分成基因型1、2和3。每个基因型可以划分成亚基因型，分别称作1.1、1.2和1.3；2.1、2.2和2.3；以及3.1、3.2、3.3和3.4(Paton等人,Vet Microbiol.73:137-157,2000)。在亚洲，CSF流行性是普遍存在的，并且已经在几个亚洲国家分离基因型1、2和3。

CSFV可以引起急性、亚急性和慢性猪病，并且对全球养猪业造成重大威胁，造成严重经济损失。CSF的控制涉及根除或接种，其中根除是在发达国家如欧盟(EU)的优选控制方法，因屠宰感染猪造成庞大数量的损失。在另一方面，接种是在发展中国家如中国的主要控制策略。猪瘟兔化病毒(HCLV)(也称作C株)在二十世纪五十年代中期开发并且在中国和许多国家广泛使用(Moorman等人,J Virol.70:763-770,1996)。用HCLV疫苗大规模接种造成在接种的猪群中难以区分CSFV的野生型株和HCLV株(Van Oirshot,Vet Microbiol 96:367-384,2003)。CSFV亚临床感染和无症状感染是普遍存在的(Moennig等人,Vet.J.165,11-20,2003；Tu,Virus Res.81,29-37,2001)，产生无法由农民和兽医师可容易识别及无法通过一般检测法如病毒分离、抗原捕获ELISA和荧光抗体试验可检出的野生型CSFV感染。

已经开发各种诊断测定法。然而，它们全部具有局限性。病毒分离需要6-12日以证实结果；ELISA并不非常敏感并经常产生假阴性结果；实时PCR测定法更快和更敏感，但是受交叉污染高风险限制并且是最重要的。这些测定法均不能够区分CSFV的野生型毒株和疫苗毒株。之前，已经在EU建立了区分野生型CSFV与“Riems”疫苗毒株的实时RT-PCR测定法(Leifer等人,J.Virol.Methods 158,114-122,2009；Leifer等人,J.Virol.Methods 166,98-100,2010；Leifer等人,J.Gen.Virol.91,2687-2697,2010)，并且在韩国开发了一种区分野生型CSFV和“K-LOM’疫苗毒株CSFV的测定法(Cho等人,Can J Vet Res70:226-229,2006)。在中国，已经描述了一种基于探针结合位点处核苷酸差异区分野生型CSFV与HCLV-株疫苗的两步骤实时RT-PCR测定法和一种使用小沟结合(MGB)探针结合检测野生型中突变的单步骤实时RT-PCR测定法(wt-rRT-PCR)。

不太可能的是可在全部国家中使用一种通用检测法，因为不同CSFV疫苗株已经在不同国家施用，例如，在EU施用“Riems”，在韩国施用“K-LOM”，而在中国施用“HCLV”。因此，需要开发一种实惠、易于执行并易于解释结果以区分经典猪瘟野生型和疫苗型的测定法。

传染性支气管炎(IB)是一种在全部国家养禽业流行的疾病，在大部分地区发生率接近100％。它是经济上最重要的疾病。在雏鸡中，呼吸道疾病或肾炎导致死亡、增重下降和加工时非难，而在产蛋期鸡中，这种疾病为亚临床的并导致产蛋量下降和异常蛋(Ignjatovic等人,Archives of Virology,2006)。IB暴发持续在接种鸡群中出现，主要地因为认为IB暴发由不同的IBV血清型、亚型或变体引起，所述血清型、亚型或变体因S1基因的核苷酸点突变、插入、缺失或重组生成。

致病因子，传染性支气管炎病毒(IBV)属于冠状病毒科(Coronaviridae)。它是一种有囊膜正义单链RNA病毒，基因组长度27.6kb。前20kb编码病毒RNA依赖性RNA聚合酶和蛋白酶。整个基因组从5’至3’具有至少10个可读框(ORF)并如下：5’-1a-1b-S(S1、S2)-3a、b、c(E)-M-5a、b-N-Poly(A)-3’，编码4种结构蛋白，包括纤突糖蛋白(S)、膜糖蛋白(M)、磷酸化核衣壳蛋白(N)和小的膜蛋白(E)(Mardani等人,Arch Virol.155(10):1581-6,2010)。

IBV于1930年首次在美国报道并且自此以后已经在遍及以下四大洲的大部分国家报道：美洲(Johnson和Marquardt,Avian Dis.19:82-90,1975)、欧洲(Capua等人,Zentralbl Veterinarmed B.41:83-89,1994；Cavanagh和Davis,Arch Virol 130:471-476,1993；Gough等人,Vet Rec.130:493-494,1992)、亚洲(Wang等人,Avian Dis 41:279-282,1997)和大洋洲(Ignjatovic和McWaters,J Gen Virol.72:2915-2922,1991；Lohr,Avian Dis.20:478-482,1976)。在马来西亚，关于本疾病的流行率知之甚少。IB病的首次报道早至1967年，病情温和并且接种无保障(Chong等人,Second symposium on Scientific and Technological Research inMalaysia and Singapore，第73-83页，1967；Aziz等人,The 8^th VeterinaryAssociation Malaysia Scientific Congress,23-25^th August 1996,Ipoh,第76-78页)。变体已经自至少1979年起存在(Lohr,Proceedings of the 1^stInternational Symposium on Infectious Bronchitis,EF Kaleta & U.Heffels–Redmann(Eds),第70-75页,1988；de Wit等人,AvianPathology.40(3):223-235,2011)，在1980年首次报告了一个毒力更强的毒株，所述毒株引起导致高死亡率的肾病-肾炎综合征(Heng等人,Kajian Veterinar.12:1-8,1980；Aziz 1996)。与马来西亚IBD相关的最近发表回溯至2000年、2004年和2009年，自1995年起临床报道了肾病变型变异IBV毒株(Maizan,2002年8月28日-28日，Proceeding 12^th FAVA and14^th VAM congress第116页；Yap M.L等人,2000年9月1日-4日Proceeding VAM Congress；Arshad等人,J.Vet.Malaysia.14(1&2):322002；Balkis等人,Proceedings VAM Congress 2004,Zulperi等人,Virus Genes.38:383-391,2009)。

世界范围内，已经鉴定出几种不同的IBV血清型和基因型并且新变体仍然不断出现。这些新变体之一是QX样IB。IB-QX已经呈循环性并自2004起在中国报道(Liu和Kong，Avian pathology,33:321-327,2004)。被鉴定为QX的病毒优势地与多种形式的肾病变相关。其他研究者还已经在中国报道了相似的毒株(Liu等人,J of Gen Virol,86:719-725,2005)。在2007年，Cuiping等人(Vet.Microbio.,122:71,2007)证实了Liu等人(2005)呈献的数据，所述数据报告在2003年和2005年之间从接种的鸡群和未接种的鸡群分离肾型毒株。相似的研究结果也已经在俄罗斯和欧洲其他地区报道(Bochkov等人,Avian Pathology,35:379-393,2006；Landman等人,Proceedings of the 14^th World Veterinary PoultryCongress,22-26August,2005,Istanbul,Turkey,第369页)。

不太可能的是可在全部国家中使用一种通用检测法，因为在不同国家施用了不同的IBV疫苗株。因此，需要开发一种实惠、易于执行并易于解释结果以区分传染性支气管炎(IB)野生型和疫苗型的测定法。

尽管采用密集接种计划，新城疫病毒(NDV)仍总是威胁全球商业养禽场。NDV是单分子负链RNA病毒目(Mononegavirales)、副粘病毒科(Paramyxoviridae)和禽腮腺炎病毒属(Avulavirus)的成员。它是一种包膜病毒，具有由15,586个核苷酸组成的负义、不分节段单链RNA基因组。其基因组由六个基因组成：核蛋白(NP)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、融合糖蛋白(F)、血凝素-神经氨酸酶(HN)、糖蛋白和大聚合酶蛋白(L)。NDV中存在的六个基因当中，其两种膜蛋白即F蛋白和HN蛋白在决定其毒力方面最重要。

近年来实时PCR方法的建立已经导致多种传染介质的分子诊断学取得明显进展，并且已经快速削减为现场兽医师和农民提供快速和精确结果的疾病诊断结果周转时间。已经针对使用几种不同TaqMan探针或SYBR绿进行NDV检测和基因型区分的实时PCR分析描述了许多PCR测定法(Wise等人,J.Clin Microbiol,42:329-338,2004)。Tan等人(J.Virol Method,160:149-156,2009)描述了用于检测和区分NDV基因型的SYBR绿I实时PCR，然而这种测定法需要不同引物对用于检测不同NDV基因型并且严重依赖分析熔解峰来区分三个NDV基因型。尽管SYBR绿1测定法是与其他实时检测样式相比，建立实时PCR的成本最有效和最容易形式，然而，主要缺点是染料分子结合于反应混合物中存在的任何双链DNA(包括非特异性PCR产物或引物-二聚体)。因此，存在改善当前分子诊断方法以提供快速和结论性NDV检验结果的空间。

发明简述

本发明涉及一种表征IBV、CSFV或NDV的方法或过程，所述方法或过程包括步骤：a)从病毒株产生cDNA；b)在实时聚合酶链反应(PCR)中使所述cDNA暴露于包含正向引物和反向引物的引物对以产生扩增子，其中所述引物对是对病毒基因组的某个基因或区域特异的；c)在实时PCR后立即对包含扩增子的双链产物进行高分辨熔解(HRM)曲线分析；和d)分析并比较HRM曲线，从而表征病毒株。IBV的基因可以是S1基因。NDV的基因可以是F、NP、P、M、HN或L基因。CSFV的区域可以是四种结构性(C、Erns、E1和E2)或8种非结构性蛋白(Npro、P7、NS2、NS3、NS4A，NS4B，NS5A和NS5B)区域。

本发明还提供随这类方法使用的底物和试剂盒。

附图简述

以下详细描述可以结合附图最好地理解，所述详细描述以举例方式给出，但不意在将本发明唯一地限于所述的具体实施例，其中：

图1是确定向各DNA序列和蛋白质序列赋予的SEQ ID NO的表。

图2描述用于IBV的实时PCR的灵敏度分析。

图3描述IB-QX的扩增曲线以显示特异性。

图4显示IB-QX的熔解峰以显示特异性。

图5描述IB-QX的S1序列和blast结果。

图6显示序列比较结果。

图7显示IBV毒株的序列同一性百分比。

图8描述IB-QX株、IBnC90株、Mass和793/B株的HRM分析。

图9描述IB-QX株和IBnC90株的HRM分析。

图10显示LBK株(CSFV)的序列和blast结果。

图11显示VRI株(CSFV)的序列和blast结果。

图12显示Pestiffa株(CSFV)的序列和blast结果。

图13显示MVP株(CSFV)的序列和blast结果。

图14显示QYHC株(CSFV)的序列和blast结果。

图15显示ZBC株(CSFV)的序列和blast结果。

图16显示YSC株(CSFV)的序列和blast结果。

图17描述野生型和疫苗型CSFV的HRM分析。

图18描述不同疫苗型CSFV株的HRM分析。

图19显示野生型CSFV和疫苗型CSFV的核苷酸序列比对结果。

图20显示NDV疫苗株的HRM分析。

图21描述NDV毒株的核苷酸序列比对结果。

图22显示NDV毒株的氨基酸序列比对结果。

图23在核苷酸和氨基酸水平显示NDV毒株之间的序列同一性。

图24描述NDV疫苗株和野生型株的HRM分析。

图25描述HRM分析NDV毒株，以区分强毒株/中等毒力株和弱毒株。

详述

应当指出，在本申请中、特别是在权利要求中，术语如“包含”(“comprises”,“comprised”,“comprising”)等可以具有美国专利法中对其赋予的含义；例如，它们可以意指“包括”(“includes”,“included”,“including”)等；并且术语如“基本上由……组成”和“基本上由……组成”具有美国专利法中对它们所赋予的含义，例如，它们允许没有明确记载的元素，但是排除现有技术中存在或影响本发明基本特征或新特征的元素。

出于解释本说明书的目的，以下定义将适用，并且在适宜的任何时候，以单数使用的术语还将包括复数形式并且反之亦然。除非上下文另外清楚地指出，否则单数术语“一个”、“一种”和“该”包括复数称谓。类似地，除非上下文另外清楚地指出，否则词语“或”意指包括“和”。词语“或”意指特定列出的任何一成员并且还包括该列出的成员的任意组合。

术语“动物”在本文中用来包括全部哺乳动物、鸟类和鱼类。如本文所用的动物可以选自：马科动物(例如，马)、犬科动物(例如，犬、狼、狐、郊狼、豺)、猫科动物(例如，狮、虎、家猫、野猫、其他大型猫和其他猫科动物，包括猎豹和猞猁)、牛族动物(例如，牛)、猪(例如，猪)、羊(例如，绵羊、山羊、羊驼、野牛)、禽类(例如，鸡、鸭、鹅、火鸡、鹌鹑、雉、鹦鹉、雀、隼、乌鸦、鸵鸟、鸸鹋和鹤鸵)、灵长类(例如，原猴、眼睛猴、猴、长臂猿、猿)、人类和鱼类。术语“动物”还包括处于全部发育阶段(包括胚和胎儿阶段)的个体动物。

术语“多肽”和“蛋白质”在此互换地使用来指连续氨基酸残基的聚合物。

术语“核酸”、“核苷酸”和“多核苷酸”互换使用并且指RNA、DNA、cDNA或cRNA及其衍生物，如含有修饰主链的那些。应当理解本发明提供这样的多核苷酸，它们包含与本文所述那些序列互补的序列。本发明中构思的“多核苷酸”包括正向互补链(5’至3’)和反向互补链(3’至5’)。本发明的多核苷酸可以按不同的方式(例如通过化学合成、通过基因克隆等)制备并且可以采取多种形式(例如直链或支链、单链或双链、或其杂合分子、引物、探针等)。

术语“基因组DNA”或“基因组”互换地使用并且指可遗传的宿主生物遗传信息。基因组DNA包括核DNA(也称作染色体DNA)，还包括质体(例如，叶绿体)和其他细胞器(例如，线粒体)的DNA。本发明中构思的基因组DNA或基因组还涉及病毒的RNA。该RNA可以是正链或负链RNA。本发明中构思的术语“基因组DNA”包括含有与本文所述的那些序列互补的序列的基因组DNA。术语“基因组DNA”还指信使RNA(mRNA)、互补性DNA(cDNA)和互补性RNA(cRNA)。如本文所用的术语“基因组RA(核酸)”包括RNA、mRNA、cRNA、DNA和cDNA。

术语“基因”广泛地用来指与生物学功能相关的多核苷酸的任何区段。因此，基因或多核苷酸包括如基因组序列中那样的内含子和外显子，或仅包含如cDNA中那样始于起始密码子(甲硫氨酸密码子)并止于终止信号(终止密码子)的编码序列，如可读框(ORF)。基因和多核苷酸还可以包含调节其表达如转录启动、翻译和转录终止的区域。因此，还包括启动子和核糖体结合区(通常，这些调节元件位于编码序列或基因的起始密码子上游约60个核苷酸和250个核苷酸之间；Doree S M等人；Pandher K等人；Chung J Y等人)、转录终止子(通常，终止子是位于编码序列或基因的终止密码子下游大约50个核苷酸范围内；Ward C K等人)。基因或多核苷酸还指表达mRNA或功能性RNA或编码特定蛋白质并包含调节序列的核酸片段。

如本文所用，术语“异源DNA”指来自不同的生物的DNA，如与接受者不同的细胞类型或不同的物种。该术语还指在宿主DNA的相同基因组上的DNA或其片段，在所述相同基因组中，异源DNA插入该基因组的与其原始位置不同的区域。

多种核酸碱基的缩写包含鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、腺嘌呤(A)和胞嘧啶(C)。

术语“PCR”指聚合酶链反应，一种用于借助常规热循环仪以指数方式扩增DNA单个副本或某些副本的方法。PCR还可指一种用于扩增DNA副本的常规方法，其中所述常规方法需要凝胶电泳步骤以观察扩增的DNA。

“实时PCR”指能够通过检测荧光水平对DNA副本定量并实时监测DNA扩增的高级PCR方法。该方法不需要凝胶电泳，利用更少的时间并提供更精确的结果。

术语“扩增子”指使用聚合酶链反应(PCR)方法学待扩增或已扩增的一部分多核苷酸。

术语“高分辨熔解(HRM)”指检测双链DNA样品中突变、多态性和遗传差异的技术。它是一项相对新的用于DNA分析的方法，该方法在2002年作为因学术界(美国犹他大学)和工业界(Idaho Technology，美国)(Reed等人,2007)间合作的结果引入。高分辨熔解法用来根据DNA样品随温度渐增从双链DNA(dsDNA)转变成单链DNA(ssDNA)时的解离行为表征DNA样品。这项技术使DNA样品经历递增的温度并记录它们从双链形式(dsDNA)解离至单链形式(ssDNA)的细节。仪器采用比此前方法明显好得多的最佳和热精度采集荧光信号以产生新的应用可能性。

对双链DNA样品进行HRM分析。一般，在HRM分析之前进行聚合酶链反应(PCR)以扩增其中存在其目的突变的DNA区域。扩增的这个区域称作扩增子。在PCR后，开始HRM分析。该过程是将扩增子DNA从约50℃加温直至约95℃。在这个过程期间的某个点，达到扩增子的解链温度并且DNA的两条链分离或“熔解”。HRM的实质是实时监测这个过程。通过使用与双链DNA特异性结合并结合时它发射明亮荧光的荧光染料实现这一点。在不存在双链DNA的情况下，染料无法与之结合并且它仅发射低水平荧光。在HRM分析伊始，样品中因数十亿拷贝的扩增子而存在高水平荧光。但是随着将样品加热并且DNA两条链熔解分开，双链DNA的存在减少并且因此荧光减少。HRM仪记录这个过程并且将数据绘制成一条显示荧光水平与温度的曲线，称作解链曲线(melt curve)。HRM仪具有以“高分辨”监测这个过程的能力，从而使得精确记录解链曲线中的差异成为可能，并因此鉴定突变是否存在或不存在。

如本文所用，术语“引物”指寡核苷酸或短单链核酸，所述寡核苷酸或短单链核酸与另一个单链分子的互补部分杂交时充当启动具有DNA聚合酶活性的酶介导的聚合的起点，如PCR中那样。

如本文所用，术语“抗原”或“免疫原”意指在宿主动物中诱导特异性免疫反应的物质。抗原可以包括杀死、致弱或活的完整生物、生物的亚单位或部分；含有具有免疫原特征的插入物的重组载体；一片或一段能够在呈递至宿主动物时诱导免疫反应的DNA；多肽、表位、半抗原或其任意组合。另外，免疫原或抗原可以包括毒素或抗毒素。

如本文所用的术语“免疫原性蛋白质或肽”包括下述多肽，所述多肽以如此意义有免疫活性，从而一旦施用至宿主，它够激发针对该蛋白质的体液型和/或细胞型免疫反应。优选地，蛋白质片段是这样的，从而它具有与完整蛋白基本上相同的免疫活性。因此，本发明的蛋白质片段包含至少一个表位或抗原决定簇或基本上由其组成或由其组成。如本文所用，“免疫原性”蛋白质或多肽，包括全长序列的蛋白质、其类似物或其免疫原性片段。“免疫原性片段”意指包含一个或多个表位并且因此激发上述免疫反应的蛋白质片段。可以使用任何数目的本领域熟知的表位定位技术鉴定这类片段。参见，例如，Epitope Mapping Protocols，引自Methods in Molecular Biology,第66卷(Glenn E.Morris编著1996)。例如，可以通过以下方式确定线性表位：在固相支持物上同时合成大量肽，这些肽与蛋白质分子的各部分相对应，并且在肽仍与支持物连接的情况下，使所述肽与抗体反应。这类技术是本领域已知的并且在例如美国专利号4,708,871；Geysen等人，1984；Geysen等人，1986中描述。类似地，通过确定氨基酸的空间构象容易地鉴定构象表位，如通过例如X射线结晶学和二维核磁共振法。

术语“免疫原性蛋白质或肽”还构思对序列的缺失、添加和置换，只要多肽发挥作用以产生如本文定义的免疫反应。术语“保守变异”指一个氨基酸残基由另一个生物学相似的残基替换，或如此替换核酸序列中的一个核苷酸，从而编码的氨基酸残基不变或是另一个生物学上相似的残基。在这个方面，特别优选的置换将在本质上通常是保守的，即，在氨基酸家族内发生的那些置换。例如，氨基酸通常划分成4个家族：(1)酸性家族-天冬氨酸和谷氨酸；(2)碱性家族-赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性家族-丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；和(4)不带电荷的极性家族-甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时划归为芳族氨基酸。保守变异的例子包含将一个疏水性残基如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸置换成另一个疏水性残基，或将一个极性残基置换成另一个极性残基，如将精氨酸置换成赖氨酸，将谷氨酸置换成天冬氨酸，或将谷氨酰胺置换成天冬酰胺等；或将一个氨基酸类似地保守替换为结构上相关的将对生物活性没有重大影响的氨基酸。下述蛋白质因此是落入参考多肽的定义范围内，所述蛋白质具有与参考分子基本上相同的氨基酸序列，但是拥有基本上不影响蛋白质的免疫原性的微小氨基酸置换。通过这些修饰产生的全部多肽均包含于本文中。术语“保守变异”还包括使用取代的氨基酸代替未取代的母氨基酸，条件是针对取代的多肽所产生的抗体还与未取代的多肽发生免疫反应。

针对某组合物或疫苗的“免疫反应”是宿主中形成针对目的组合物或疫苗的细胞免疫反应和/或抗体介导的免疫反应。通常，“免疫反应”包括但不限于以下一种或多种效应：产生直接特异性针对目的组合物或疫苗中所包含的一种抗原或多种抗原的抗体、B细胞、辅助T细胞和/或细胞毒T细胞。优选地，宿主将如此显示治疗性或保护性免疫反应，从而提高针对新感染的抗性和/或降低疾病的临床严重性。这种保护作用将在感染的宿主中由以下展示：正常情况下感染宿主表现的症状减轻或缺少、恢复时间更快和/或病毒滴度降低。

具有N个核苷酸长度的基因组的可能病毒变体数目是4^N种可能的变体，原因是存在4种不同核苷酸。例如，仅300个核苷酸的基因组存在10¹⁸⁰种不同变体。(Martin A.Nowak和Robert McCredie May VirusDynamics,Oxford University Press)。RNA病毒群的基因组序列围绕共有或平均序列聚类，但是每个基因组是不同的。具有特定突变的稀有基因组可以逃避选择事件，并且这种突变将随后存在于全部子代基因组中。准种理论预测病毒不仅仅是一组随机突变体，也是互作性变体集合。(Vincent Racaniello 2009)。

变体包括等位变体。术语“等位变体”指含有多态性的多核苷酸或多肽，所述多态性导致蛋白质的氨基酸序列发生变化并存在于天然群体(例如，病毒物种或变种)。这类天然等位变型一般可以在多核苷酸或多肽中产生1-5％变异。可以通过对众多不同物种中的目的核酸序列测序鉴定等位变体，这可以通过使用杂交探针鉴定这些物种中的相同基因遗传座容易地实施。作为天然等位变异结果并且不改变目的基因的功能活性的任何和全部这类核酸变型以及所产生的氨基酸多态性或变型，均意在本发明的范围内。

术语“同一性”就序列而言可以例如指具有相同核苷酸或氨基酸的位置数目除以两个序列中较短者的核苷酸或氨基酸数目，其中可以根据Wilbur和Lipman算法(Wilbur和Lipman)确定两个序列的比对结果。可以使用Vector NTI软件包(Invitrogen,1600Faraday Ave.,Carlsbad,CA)确定两个氨基酸序列的序列同一性或序列相似性或两个核苷酸序列之间的序列同一性。当RNA序列称作是相似的或与DNA序列具有某个程度的序列同一性或同源性时，将DNA序列的胸苷(T)视为等同于RNA序列中的尿嘧啶(U)。因此，RNA序列处于本发明的范围内，并且，通过将DNA序列的胸苷(T)视为等同于RNA序列中的尿嘧啶(U)，可以自DNA序列导出RNA序列。

IBV

本发明的一个实施方案提供一种表征IBV毒株的过程或方法，所述过程或方法包括步骤：a)从分离自动物的IBV毒株产生IBV cDNA；b)在实时聚合酶链反应(PCR)中使cDNA暴露于包含正向引物和反向引物的引物对以产生扩增子，其中所述引物对是对IBV基因组的S1基因特异的；c)在实时PCR后立即对包含扩增子的双链产物进行高分辨熔解(HRM)曲线分析；并且d)分析并比较HRM曲线，从而表征IBV毒株。

可以通过将已知IBV毒株的S1基因的多核苷酸序列比对并比较S1基因的保守区，选择正向引物和反向引物。在实施方案的一个方面，正向引物具有如SEQ ID NO:29中所示的多核苷酸序列并且反向引物具有如SEQ ID NO:30中所示的多核苷酸序列。

S1基因称作纤突(S)糖蛋白。S1亚基携带血清型特异性序列和诱导病毒中和抗体的抗原表位。认为不同的IBV血清型、亚型或变体由造成接种鸡群中IB暴发的S1基因核苷酸点突变、插入、缺失或重组生成(Zhou等人,J.Vet Med.B51,147-152,2004)。常使用S1糖蛋白的核苷酸测序以确定IBV毒株之间的血清型差异(Kwon等人,Avian Dis.1993)。

可以根据制造商的说明书进行HRM曲线分析。例如，几家制造商提供用于高分辨率DNA熔解分析的仪器，如Applied Biosystems(ABI)、Bio-Rad、Cepheid、Corbett、Eppendorf、Idaho Technology、Roche和Stratagene。此外，存在还用于实施测定法的市场上可获得的几种饱和染料，如(Idaho Technology Inc.)、(Invitrogen,Carlsbad,CA)、(Bioturn)和480 ResoLight Dye(Roche,Indianapolis,IN)(Vossen RHAM等人,Human Mutation 30(6),2009)。

可以使用以下参数实施实时PCR：a)在95℃初始变性3秒，b)在95℃变性1分钟，c)在55℃复性1分钟，d)在72℃延伸1分钟，和e)重复步骤b)-d)45次，随后解链曲线分析(连续地95℃1秒，65℃ 15秒和95℃)并且在45℃冷却30秒。

本发明的方法可以用来表征并区分已知的IBV毒株。已知的IBV毒株包括但不限于793/B株、Massachusetts株、QX样株、IBNC90株、D274株、Iowa株、Arkansas株、Holland 52株、Connecticut 46株、Beaudette US株、California株、Jilin株、Holte株、HK株、D41株、DE072株、西班牙/92/35株、埃及/F/03株和全世界存在的其他毒株。

本发明也提供新IBV毒株的鉴定，其中IBV序列不以紧密同源性与一个或多个IBV序列的任一者对齐。该方法包括步骤：a)从分离自动物的IBV毒株产生IBV cDNA；b)在实时聚合酶链反应(PCR)中使cDNA暴露于包含正向引物和反向引物的引物对以产生扩增子，其中所述引物对是对IBV基因组的S1基因特异的；c)在实时PCR后立即对包含扩增子的双链产物进行高分辨熔解(HRM)曲线分析；d)分析并比较HRM曲线，并且e)鉴定新IBV毒株。如此通过HRM曲线分析鉴定的新IBV毒株可以通过以下方式进一步表征：对扩增子测序并将IBV扩增子序列与已知IBV序列比对。新IBV毒株可以与任何已知的IBV序列具有约50％、约60％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％序列同一性。序列可以是核苷酸序列或氨基酸序列(扩增子序列的翻译)。

该方法的实施方案的另一个方面提供一种用于区分感染动物和接种(DIVA)动物的手段。该方法包括步骤：a)从动物分离的IBV毒株产生IBVcDNA；b)在实时聚合酶链反应(PCR)中使cDNA暴露于包含正向引物和反向引物的引物对以产生扩增子，其中所述引物对是对IBV基因组的S1基因特异的；c)在实时PCR后立即对包含扩增子的双链产物进行高分辨熔解(HRM)曲线分析；和d)分析并比较HRM曲线，因而确定所述cDNA是否来自疫苗型毒株或感染动物的毒株。

本发明的一个实施方案提供分离的多核苷酸或引物，所述分离的多核苷酸或引物具有如SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:30中所述的序列。

本发明的另一个实施方案提供一种用于检测IBV毒株的试剂盒，所述试剂盒包含：a)引物对，其包含具有如SEQ ID NO:29中所示序列的正向引物和具有如SEQ ID NO:30中所示序列的反向引物；和b)描述进行实时PCR的参数和条件的说明书。

CSFV

本发明的一个实施方案提供一种表征CSFV毒株的过程或方法，所述过程或方法包括步骤：a)从分离自动物的CSFV毒株产生CSFVcDNA；b)在实时聚合酶链反应(PCR)中使cDNA暴露于包含正向引物和反向引物的引物对以产生扩增子，其中所述引物对是对CSFV基因组的NS5B或3’NTR区特异的；c)在实时PCR后立即对包含扩增子的双链产物进行高分辨熔解(HRM)曲线分析；和d)分析并比较HRM曲线，从而表征CSFV毒株。

可以通过将已知CSFV毒株的NS5B区或3’NTR区的多核苷酸序列对齐并比较NS5B区或3’NTR区的保守区，选择正向引物和反向引物。在实施方案的一个方面，正向引物具有如SEQ ID NO:8中所示的多核苷酸序列并且反向引物具有如SEQ ID NO:9中所示的多核苷酸序列。

NS5B是RNA依赖性RNA聚合酶基因。3’NTR区是病毒基因组的3’非翻译区。先前研究已经显示(Pan等人,J Vet Diag Inv，2008)在野生型CSFV中不存在的在疫苗型CSFV 3’NTR中的明显T丰富插入位点使得这两种基因成为区分野生型株和疫苗株的合适遗传标记。

可以根据制造商的说明书进行HRM曲线分析。

可以使用以下参数实施实时PCR：a)在95℃初始变性3秒，b)在95℃变性1分钟，c)在55℃复性1分钟，d)在72℃延伸1分钟，和e)重复步骤b)-d)45次，随后解链曲线分析(连续地95℃ 1秒，65℃ 15秒和95℃)并且在45℃冷却30秒。

本发明的方法可以用来表征并区分已知的CSFV毒株。已知的CSFV毒株包括但不限于ALD株、中国株(C株)、GPE株(日本株)、C/HVRI株(来自中国，基因型1.1)、Riems株(来自中国)、Alfort 187株、Ames株、Margarita株、Baker株、纽约株、Purdue 115株、Paderborn株、Spreda株、Oregon株、Singer株、Osloss株、Moredun株、Frijters株和可以在文献中找到的其他毒株。

本发明也提供新CSFV毒株的鉴定，其中CSFV序列不以紧密同源性与一个或多个CSFV序列的任一者对齐。该方法包括步骤：a)从分离自动物的CSFV毒株产生CSFV cDNA；b)在实时聚合酶链反应(PCR)中使cDNA暴露于包含正向引物和反向引物的引物对以产生扩增子，其中所述引物对是对CSFV基因组的NS5B或3’NTR区特异的；c)在实时PCR后立即对包含扩增子的双链产物进行高分辨熔解(HRM)曲线分析；d)分析并比较HRM曲线，并且e)鉴定新CSFV毒株。如此通过HRM曲线分析鉴定的新CSFV毒株可以通过以下方式进一步表征：对扩增子测序并将CSFV扩增子序列与已知CSFV序列比对。新CSFV毒株可以与任何已知的CSFV序列具有约50％、约60％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％序列同一性。序列可以是核苷酸序列或氨基酸序列(扩增子序列的翻译)。

该方法的实施方案的另一个方面提供一种用于区分感染动物和接种(DIVA)动物的手段。该方法包括步骤：a)从分离自动物的CSFV毒株产生CSFV cDNA；b)在实时聚合酶链反应(PCR)中使cDNA暴露于包含正向引物和反向引物的引物对以产生扩增子，其中所述引物对是对CSFV基因组的NS5B或3’NTR区特异的；c)在实时PCR后立即对包含扩增子的双链产物进行高分辨熔解(HRM)曲线分析；和d)分析并比较HRM曲线，因而确定所述cDNA是否来自疫苗株或感染动物的毒株。

本发明的一个实施方案提供分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸具有如SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9中所述的序列。

本发明的另一个实施方案提供一种用于检测CSFV毒株的试剂盒，所述试剂盒包含：a)引物对，其包含具有如SEQ ID NO:8中所示序列的正向引物和具有如SEQ ID NO:9中所示序列的反向引物；和b)描述进行实时PCR的参数和条件的说明书。

NDV

本发明的一个实施方案提供一种表征NDV毒株的过程或方法，所述过程或方法包括步骤：a)从分离自动物的NDV毒株产生NDV cDNA；b)在实时聚合酶链反应(PCR)中使cDNA暴露于包含正向引物和反向引物的引物对以产生扩增子，其中所述引物对是对NDV基因组的F、NP、P、M、HN或L基因特异的；c)在实时PCR后立即对包含扩增子的双链产物进行高分辨熔解(HRM)曲线分析；和d)分析并比较HRM曲线，从而表征NDV毒株。

可以通过将已知NDV毒株的F基因、或NP基因、或P基因、或M基因、或HN基因、或L基因的多核苷酸序列分别对齐并比较F基因、或NP基因、或P基因、或M基因、或HN基因、或L基因的保守区，选择正向引物和反向引物。在实施方案的一个方面，正向引物具有如SEQID NO:17或31中所示的多核苷酸序列并且反向引物具有如SEQ ID NO:18或32中所示的多核苷酸序列。

融合(F)蛋白负责介导病毒包膜与细胞膜的融合，血凝素-神经氨酸酶(HN)蛋白参与细胞接合和释放(Phillips等人,Arch.Virol,143:1993-2002,1998；Tan等人,Arch.Virol,155:63-70,2010)。NDV毒株划分成3个基因型，高度强毒(强毒)、中等毒力(中等毒)或无毒力(弱毒)。传统上，最常见地通过测序和氨基酸序列分析区分NDV基因型。强毒株和中等毒力株的F蛋白切割位点的共有序列是112(R/K)RQ(R/K)RF117；弱毒F切割位点的共有序列是112(G/E)(K/R)Q(G/E)RL117。最新研究结果报道了(Samal S等人,J.Gen.Virol.2011)，F切割位点的位置114处谷氨酰胺变成碱性残基精氨酸(R)降低病毒复制并减弱病毒致病性。该论文还报道，当位置118处的异亮氨酸(I)由缬氨酸置换时，致病性进一步减少。

可以根据制造商的说明书进行HRM曲线分析。

可以使用以下参数实施实时PCR：a)在95℃初始变性3秒，b)在95℃变性1分钟，c)在60℃复性1分钟，d)在72℃延伸1分钟，和e)重复步骤b)-d)45次，随后解链曲线分析(连续地95℃ 1秒，65℃ 15秒和95℃)并且在45℃冷却30秒。

本发明的方法可以用来表征并区分已知的NDV毒株。已知的NDV毒株包括但不限于Avinew株、LaSota株、MVP-Mukteswar株、ND-B1株、韩国Dalguban株、Herts 33株、Essex’70株、135/93株、617/83株、34/90株、Beaudette C株、D26株、MC110株、1154/98株和可以在文献中记录的其他毒株。

本发明也提供新NDV毒株的鉴定，其中NDV序列不以紧密同源性与一个或多个NDV序列的任一者对齐。该方法包括步骤：a)从分离自动物的NDV毒株产生NDV cDNA；b)在实时聚合酶链反应(PCR)中使cDNA暴露于包含正向引物和反向引物的引物对以产生扩增子，其中所述引物对是对NDV基因组的F、NP、P、M、HN或L基因特异的；c)在实时PCR后立即对包含扩增子的双链产物进行高分辨熔解(HRM)曲线分析；d)分析并比较HRM曲线；并且e)鉴定新NDV毒株。如此通过HRM曲线分析鉴定的新NDV毒株可以通过以下方式进一步表征：对扩增子测序并将NDV扩增子序列与已知NDV序列比对。新NDV毒株可以与任何已知的NDV序列具有小于50％、小于60％、小于70％、小于75％、小于80％、小于85％、小于90％、小于91％、小于92％、小于93％、小于94％、小于95％、小于96％、小于97％、小于98％、或小于的99％序列同一性。序列可以是核苷酸序列。序列也可以是氨基酸序列(扩增子序列的翻译)。

该方法的实施方案的另一个方面提供一种用于区分感染动物和接种(DIVA)动物的手段。该方法包括步骤：a)从分离自动物的NDV毒株产生NDV cDNA；b)在实时聚合酶链反应(PCR)中使cDNA暴露于包含正向引物和反向引物的引物对以产生扩增子，其中所述引物对是对NDV基因组的F、NP、P、M、HN或L基因特异的；c)在实时PCR后立即对包含扩增子的双链产物进行高分辨熔解(HRM)曲线分析；并且d)分析并比较HRM曲线，从而确定所述cDNA是否来自疫苗株或感染动物的毒株。

本发明的一个实施方案提供分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸具有如SEQ ID NO:17、18、31或32中所述的序列。

本发明的另一个实施方案提供一种用于检测NDV毒株的试剂盒，所述试剂盒包含：a)引物对，其包含具有如SEQ ID NO:17中所示序列的正向引物和具有如SEQ ID NO:18中所示序列的反向引物，或引物对，其包含具有如SEQ ID NO:31中所示序列的正向引物和具有如SEQ IDNO:32中所示序列的反向引物；以及b)描述进行实时PCR的参数和条件的说明书。

免疫原性组合物和疫苗

本发明还提供分离IBV、CSFV或NDV新毒株。用于分离新病毒的方法是本领域技术人员熟知(参见，例如，在Ausubel等人,CurrentProtocols in Molecular Biology,1991,John Wiley and Sons,New York；Sambrook等人,Molecular Cloning:A laboratory manual,1989,ColdSpring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.中的方案)。

因此，本发明进一步涵盖包含新IBV、CSFV或NDV的免疫原性组合物或疫苗。本发明的免疫原性组合物或疫苗可以包含(例如，失活或减毒的)病毒培养物或制备物或病毒抗原或免疫原。本发明的免疫原性组合物或疫苗还可以包含一种或多种可药用或可兽用的载体、溶媒、佐剂或赋形剂。

可药用或可兽用的载体、溶媒、佐剂或赋形剂是本领域技术人员熟知的。例如，可药用或可兽用载体、溶媒、佐剂或赋形剂可以是0.9％NaCl(例如，盐水)溶液或磷酸盐缓冲液。可以用于本发明方法的其他可药用或可兽用载体、溶媒、佐剂或赋形剂，包括但不限于聚(L-谷氨酸)或聚乙烯吡咯烷酮。可药用或可兽用的载体、溶媒、佐剂或赋形剂可以是任何化合物或化合物组合促进施用载体(或从本发明载体体外表达的蛋白质)；有利地，载体、溶媒、佐剂或赋形剂可以促进转染和/或改善载体(或蛋白质)保存。剂量和剂量体积在本文于总体描述中讨论并且还可以在不进行任何过多实验的情况下，由技术人员因本公开阅读内容连同本领域知识而决定。

可药用或可兽用的载体、赋形剂、溶媒或佐剂可以是油包水乳液。合适的油包水乳液的例子包含稳定并且在4℃为流体的油基油包水疫苗乳液，所述乳液含有：6v/v％至50v/v％含有抗原的水相，优选地12v/v％至25v/v％、50v/v％至94v/v％总体或部分含有不可代谢油(例如，矿物油如石蜡油)和/或可代谢油(例如，植物油或脂肪酸、多元醇或醇酯)的油相，0.2p/v％至20p/v％、优选地3p/v％至8p/v％的表面活性剂，后者总体或部分地是聚甘油酯或与聚甘油酯混合，所述聚甘油酯优选地是聚甘油(聚)蓖麻油酸酯、或聚氧乙烯蓖麻毒蛋白油或其他氢化聚氧乙烯蓖麻毒蛋白油。可以用于油包水乳液中的表面活性剂的例子包括乙氧基化山梨糖醇酐酯(例如，聚氧乙烯(20)山梨醇酐单油酸酯从AppliChem,Inc.,Cheshire,CT可获得)和山梨糖醇酐酯(例如，从Sigma Aldrich,St.Louis,MO可获得的山梨醇酐单油酸酯)。此外，关于油包水乳液，还参见美国专利号6,919,084，例如，实施例8。在一些实施方案中，含有抗原的水相包含了含有一种或多种缓冲剂的盐水溶液。合适缓冲溶液的例子是磷酸盐缓冲盐水。在一个实施方案中，油包水乳液可以是水/油/水(W/O/W)三重乳液(美国专利号6,358,500)。其他合适乳液的例子在美国专利号7,371,395中描述。

本发明的免疫原性组合物和疫苗可以包含一种或多种可药用或可兽用的载体、赋形剂、载体或佐剂或基本上由其组成。用于本发明实施的合适载体或佐剂是(1)丙烯酸或甲基丙烯酸、马来酐的聚合物和烯基衍生物聚合物，(2)免疫刺激序列(ISS)，如具有一个或多个非甲基化CpG单位的寡脱氧核糖核苷酸序列(Klinman等人，1996；WO98/16247)，(3)水包油乳液，如在M.Powell,M.Newman,Plenum Press 1995出版的“Vaccine Design,The Subunit and Adjuvant Approach”第147页上描述的SPT乳液和在相同著作第183页上描述的乳液MF59，(4)含有季铵盐的阳离子脂质，例如，DDA，(5)细胞因子，(6)氢氧化铝或磷酸铝，(7)皂素或，(8)在通过引用方式援引并并入本申请的任何文献中讨论的其他佐剂，或(9)任何组合或它们的混合物。

本发明将现在通过以下非限制性实施例进一步描述。

实施例

实验中使用J.Sambrook等人(Molecular Cloning:A LaboratoryManual,第2版,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,New York,1989)描述的标准分子生物学技术。

实施例1 IBV的HRM分析

2011年来自不同农场和位置的总计56份样品提交至Vet Food AgroDiagnostics(M)Sdn.Bhd.用于例行IBV诊断。接受的器官样品范围是肺、肾、盲肠扁桃体、气管和汇集的器官。这些样品疑似携带IB病毒并送交以检测指定的病毒并证实。全部这些样品均匀浆并在这项研究中通过逆转录酶PCR和实时PCR进行检验。

根据标准制造商的方案，使用Trizol LS试剂(Invitrogen，美国)实施核酸提取。

用于检测Mass和793/B的多重逆转录酶(RT)PCR

来自前述方法(Cavanagh等人,Avian Pathology,28:593-605,1999)的基于S1基因序列的多重RT-PCR用于检测和区分两种类型的IBV：793/B株和Massachusetts株。寡核苷酸(引物)序列如下：XCE2-^a：CTCTATAAACACCCTTACA(SEQ ID NO:1)；XCE2-^b：CACTGGTAATTTTTCAGATGG(SEQ ID NO:2)(RT PCR步骤)；XCE3-：CAGATTGCTTACAACCACC(SEQ ID NO:3)；BCE1+：AGTAGTTTTGTGTATAAACCA(SEQ ID NO:4)；DCE1+：ATACAATTATATCAAACCAGC(SEQ ID NO:5)；MCE1+：AATACTACTTTTACGTTACAC(SEQ ID NO:6)(巢式步骤)(Adzhar等人,Avian Pathology,25:817-836,1996；Cavanagh等人,AvianPathology,28:593-605,1999)。反应条件是逆转录酶步骤：在45℃ 1小时，72℃ 10分钟，随后在94℃初始变性步骤5分钟。扩增步骤是在94℃ 1分钟，50℃ 1.5分钟和72℃ 2分钟，重复30次，随后在72℃终末延伸2分钟。巢式步骤按以下条件实施：在94℃初始变性5分钟，在94℃ 1分钟、50℃ 1.5分钟和72℃ 2分钟进行扩增，总计30次，随后在72℃终末延伸10分钟和保持在4℃。

检测IB-QX的单步骤RT-qPCR

按以下实施实时PCR：反应体积10μL SensiFAST SYBR绿主混合物(green master mix)，0.8μL 20pmol正向引物(CTTATGCAGTAGTCAA)(SEQ ID NO:29)和反向引物(CACGTGGAATCATGCCTGTTAT)(SEQ ID NO:30)、0.2μL逆转录酶、0.4μL RNA酶抑制物、4μL模板和3.8μLddH₂O。在LightCycler 480实时PCR仪(Roche，德国)中实施实时PCR反应。反应条件是：逆转录酶步骤在45℃ 10分钟，随后在94℃初始变性步骤2分钟。扩增步骤是在94℃ 5秒，50℃ 10秒和在72℃延伸5秒。解链曲线概况是95℃ 3秒，58℃ 1分钟和95℃继续，随后在45℃冷却30秒。

区分IBN-C90和IB-QX的HRM测定法

通过使用如上文所述的扩增IB的S1基因高变区的相同引物对(SEQID NO:29和SEQ ID NO:30)建立该测定法。该测定法由1μl高饱和性荧光染料(EvaGreen)、12.5μl主混合物(Sensimix,Bioline)、2μl 25mMMgCl₂、0.5μl引物对、模板和PCR级水组成。将样品装入384孔微孔平板并且在实时PCR仪(LightCycler 480，Roche)中进行PCR扩增。热循环反应由初始变性(在95℃ 3秒)组成。扩增由变性(在95℃ 1分钟)、复性(在48℃ 1分钟)和延伸(在72℃ 1分钟)组成。PCR后立即进行高分辨解链曲线分析。通过使用已知的阳性对照并与样品的解链曲线比较，实现样品区分。

验证

RT实时PCR的灵敏度

通过紫外分光光度计测量参比物质的全部浓度。将浓度标准化至10pg/μl。使用终点稀释(10倍连续稀释物)直至该测定法不再能够检出靶生物(无检测信号)。

特异性

通过针对5种其他生物(IBV 793/B、IBV Mass、IBD、NDV、CAV、呼肠孤病毒)检验本方案，实施检验的特异性。

测序

用于测序(直接测序)的样品送至商业测序机构。基于制造商的方案(Analytik Jena，德国)进行PCR净化和凝胶纯化。通过BLAST(基本局部比对检索工具)分析获得的结果以证实参比物质。

结果

测试的56份样品中15份样品(26.8％)呈793/B株阳性，56份样品中9份样品(16％)呈Massachusetts株阳性；56份样品中32份样品(57％)呈QX样株阳性；56个范例中先前报告为IB阴性的18个范例(32％)在复测时发现呈IB-QX阳性。

验证用于特异性检测IB-QX的实时PCR测定法

灵敏度

图2显示初始浓度为10ng/μL时测定法的灵敏度。基于最终稀释水平处18.48推导的阈值，估计该检验法高度灵敏并且或许能够在低至100ag的浓度检出病毒。

扩增曲线–IB-QX(特异性)

用其他密切相关的生物如IB-Massachusetts、IB-793/B、NDV、IBV和禽肺病毒(APV)检验测定法的特异性。图3显示衍生自特异性测定法的扩增曲线。

熔解峰(Tm)-IB-QX(特异性)

用其他密切相关的生物如IB-Massachusetts、IB-793/B、NDV、IBV和APV检验测定法的特异性。图4显示衍生自特异性测定法的熔解峰。

通过测序分析证实

对代表IB-QX株S1基因的PCR产物测序，并且在图5中显示序列(SEQ ID NO:7)。该序列用来针对GenBank数据库(NCBI)进行BLAST。图5中显示BLAST结果的筛选命中和如通过BLAST分析所确定的表格化核苷酸序列评分。BLAST分析证实，从PCR分析获得的熔解峰和条带是IB-QX。

将先前报道的肾病原性(nepropathogenic)IB(MH5365/95)与Genbank中序列比较并且图6中显示BLAST结果的筛选命中和如通过BLAST分析所确定的表格化核苷酸序列评分。BLAST分析证实，1995年分离的肾型毒株与泰国最近存在的最近IB毒株密切。图7显示7个密切相关序列相对于马来西亚先前分离的IB范例(MH5365/95和v9/04)的序列同一性矩阵。

图8显示比较IB-QX株、IBnC90株、Mass和793/B株的HRM分析。图9描述比较/检测IB-QX和IBnC90的HRM分析。

IB-QX成功地从保留的归档样品检出。26.8％的受检样品测试呈变异株-793/B株阳性，16％呈经典IB-Massachusetts州阳性；57％受检样品呈2004年以来流行的新QX样株阳性。56个范例中先前报告为IB阴性的18个范例(32％)在复测时发现呈IB-QX阳性。归因于缺少对照和缺少针对QX株的检测方法，一些2011年IB范例错误地报道为阴性。从那以来，从先前发表的论文成功地改良一种方法以精确检测IB-QX(H.J.Geerligs等人,Avian Pathology,40(1):93-102,2011)。做出改变以将该方法从3小时常规PCR改良为可检出低至100ag/μl核酸的54分钟实时PCR测定法。然而，尽管该方法高度灵敏并特异，但是预计该新QX检测法具有其局限性，因为它将不能够检出可能在家禽标本中存在的其他毒株，不能够同时检出几种不同类型的IB毒株。

如结果显示，一种利用基因扫描软件的高分辨熔解测定法(HRM)基于S1基因高变区能够区分单核苷酸差异以同时检出如图8中所示的4种毒株(793/B、Mass、QX和IBnC90)。还在图9中显示了实施该测定法以比较两个毒株(QX和IBnC90)的可能性。

实施例2CSFV的HRM分析

在这项研究中，使用多种野生型和疫苗型CSFV毒株。野生型株包括标称为LBK的归档保留样品和标称为VRI的归档保留样品(来自攻毒的猪-携带所述LBK病毒的猪)。疫苗型毒株包括Pestiffa(活疫苗-C株)、MVP(活疫苗-GPE株)、QYHC(活疫苗)、ZBC(活疫苗)、YST(活疫苗)、YSC(活疫苗)。

逆转录酶步骤

产生CSF的互补DNA的逆转录酶步骤如下实施：通过使用扩增涵盖兔化CSFV疫苗株独有的T丰富插入位点的CSFV序列NS5B区和3’NTR区的引物组，建立该测定法。引物组如下：正向引物5’-GTAGCAAGACTGGRAAYAGGTA-3’(SEQ ID NO:8)(Y＝C或T，R＝A或G)和反向引物5’-AAAGTGCTGTTAAAAATGAGTG-3’(SEQID NO:9)(Pan等人,2008)。实时PCR混合物由10μl SYBR绿主混合物(Bioline)、1.6μl相应引物组(10μM)，0.2μl逆转录酶、0.4μl RNA酶抑制剂和3.8μl PCR级水组成，每个反应补足终体积20μl。将PCR混合物在LC480实时PCR仪(LC480，Roche)中的384孔微量平板内进行实时PCR扩增。

HRM曲线分析CSFV以区分其基因型

使得样品接受HRM测定法。该测定法由1μl高饱和性荧光染料(EvaGreen)、12.5μl HRM主混合物(Sensimix,Bioline)、2μl 25mMMgCl₂、1μl引物对(5μM)、2μl模板和PCR级水组成。将针对逆转录酶步骤所用相同的引物对(SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9)用于HRM测定法。引物对的独特性是它将对野生型株产生367bp大小的扩增子并对疫苗型毒株产生379bp大小的扩增子，从而使得精确区分野生型和疫苗型毒株非常明显。将样品装入384孔微孔平板并且在实时PCR仪(LightCycler 480，Roche)中进行PCR扩增。热循环反应由初始变性(在95℃ 3秒)组成。扩增由变性(在95℃ 1分钟)、复性(在55℃ 1分钟)和延伸(在72℃ 1分钟)组成。PCR后立即进行高分辨解链曲线分析。通过使用已知的阳性对照并比较样品的解链曲线，实现基因型区分。

核苷酸序列分析

使用各种生物信息学软件如用于多序列比对的ClustalX/W和Bioedit7.0(序列比对编辑器第7.0.5.2版，Tom Hall，US)，进行序列装配和核苷酸序列分析。将全部序列针对GenBank数据库(NCBI)进行BLAST分析(blastn)。

图10中显示LBK序列(SEQ ID NO:10)和blast结果。PCR产生367bp PCR产物。LBK的测序和blast结果证实LBK是野生型ALD株。

图11中显示VRI序列(SEQ ID NO:11)和blast结果。PCR产生367bpPCR产物。VRI的测序和blast结果证实VRI是野生型ALD株。

图12中显示Pestiffa序列(SEQ ID NO:12)和blast结果。PCR产生379bp PCR产物。Pestiffa的测序和blast结果证实它属于疫苗株，“中国”株(C毒株)。

图13中显示MVP序列(SEQ ID NO:13)和blast结果。PCR产生379bp PCR产物。MVP的测序和blast结果证实它属于疫苗株GPE，日本株。

图14中显示QYHC序列(SEQ ID NO:14)和blast结果。PCR产生379bp PCR产物。QYHC的测序和blast结果证实它属于疫苗株C/HVRI，来自中国，基因型1.1。

图15中显示ZBC序列(SEQ ID NO:15)和blast结果。PCR产生379bp PCR产物。ZBC的测序和blast结果证实它属于疫苗株C/HVRI，来自中国，基因型1.1。

图16中显示YSC序列(SEQ ID NO:16)和blast结果。PCR产生379bp PCR产物。YSC的测序和blast结果证实它属于疫苗株Riems，中国株。

HRM曲线分析CSFV的结果

HRM测定法能够区分疫苗型(Pestiffa)毒株和野生型毒株(LBK/VRI)并且对其分组(图17)。一部分核苷酸序列比对结果显示疫苗型中的T丰富插入位点和野生型中的缺失，这能够分别区分野生型(LBK)毒株和疫苗型(Pestiffa)毒株(图17)。HRM测定法还能够区分不同的疫苗型并且对其分组(图18)。野生型(LBK)和疫苗型(Pestiffa、ZBC、YSC、QYHC和MVP)的一部分核苷酸序列比对结果显示疫苗型中的T丰富插入位点和野生型中的缺失，这能够区分野生型(LBK/VRI)毒株和疫苗型(Pestiffa)毒株(图19)。

验证-灵敏度和特异性

通过以初始病毒浓度10ng/μL的连续稀释，实施测定法的灵敏度。基于推导的阈值，估计该检验法灵敏并且能够在低至100ag的浓度检出靶。用其他猪病毒如PCV2、PRRS、细小病毒、SIV检验测定法的特异性。我们的分析显示，该引物对无法扩增这些其他病毒，并且发现该引物对特异性检测CSFV。

研究显示该测定法是独特的，因为该引物对能够针对野生型(367bp)和疫苗型(379bp)产生不同的扩增子大小。通过与核酸测序联合的高分辨熔解分析证实了该测定法能够快速地检测并区分野生型和疫苗型毒株。

实施例3NDV的HRM分析

在马来西亚的14个养禽场从表现经典NDV临床体征的动物采集由气管、脑、骨髓、肺、肾、脾、肠、淋巴结、盲肠扁桃体、法氏囊、前胃、肝、心、胸腺和汇总器官组成的器官样品。通过使用Trizol LS试剂，按照制造商的标准方案，对器官样品进行核酸提取。由前述方法进行调整，建立实时PCR。实时PCR混合物由10μl SYBR绿主混合物、各引物组和PCR级水组成，每个反应补足终体积20μl。将PCR混合物在LC480实时PCR仪(LC480，Roche)中的384孔微量平板内进行实时PCR扩增。通过使用仪器提供的Absolute Quant软件观察熔解峰和解链曲线。

测序、氨基酸序列分析、系统发育构建

引物组(5'-ATG GGCY CCA GAY CTT CTA C-3'(正向引物)(SEQID NO:17)、5'-CTG CCA CTG CTA GTT GTG ATA ATC C-3'(反向引物)(SEQ ID NO:18)用于扩增新城疫病毒的融合蛋白基因。从前述方法连同修改，建立实时PCR(Berhanu等人,Virol J.,7:183,2010)。实时PCR混合物由10μl SYBR绿主混合物、各引物组和PCR级水组成，每个反应补足终体积20μl。将PCR混合物在LC480实时PCR仪(LC480，Roche)中的384孔微量平板内进行实时PCR扩增。通过使用仪器提供的AbsoluteQuant软件观察熔解峰和解链曲线。热分布设定为：在95℃预变性3秒，随后45个以下循环：在95℃变性1分钟，在56℃复性1分钟和在72℃延伸1分钟。进行解链曲线分析以测量PCR产物的特异性。在PCR循环后，将样品加热到95℃ 1秒和65℃ 15秒并且随后继续以线性转变速率加热到95℃。使用LightCycler 480运行实时PCR循环。

相同的引物组用于测序。根据制造商的操作方案并略作修改(Analytik Jena，德国)，通过使用PCR净化凝胶提取试剂盒纯化具有预期扩增子大小的PCR产物。在商业测序机构中使用BigDye终止子v3.1循环测序试剂盒进行NDV融合蛋白基因的测序。为了证实全部阳性范例是真实的新城疫病毒，在Genbank数据库中进行序列的基本局部比对检索工具(BLAST)检索。通过使用BioEdit序列比对编辑器第7.0.5.2版(TomHall，美国)进行序列编辑和装配。通过使用ClustalX进行序列比对。通过使用基于距离的邻接方法，通过使用Mega5软件(Biodesign Institute，Tempe，Arizona)构建进化系统树，并使用根据1000次比对重复计算的自展方法评价它。采用BioEdit序列比对编辑器第7.0.5.2版(Tom Hall，美国)生成序列同一性矩阵。

DIVA(区分感染株与疫苗株)测定法

使阳性NDV样品接受DIVA测定法。通过使用扩增NDV的融合蛋白基因高变区的以下引物组建立DIVA测定法：正向引物5’-CTG CCACTG CTA GTT GIG ATA ATC C-3’(SEQ ID NO:31，I＝肌苷)，反向引物5’-CCT TGG TGA ITC TAT CCG IAG G-3’(SEQ ID NO:32，I＝肌苷)。该测定法由10μl高饱和性荧光染料主混合物(Roche)、2μl 25mMMgCl₂、0.5μl引物对、模板和PCR级水组成。将样品装入384孔微孔平板并且在实时PCR仪(LightCycler 480，Roche)中进行PCR扩增。热循环反应由初始变性(在95℃ 3秒)组成。扩增由变性(在95℃ 1分钟)、复性(在60℃ 1分钟)和延伸(在72℃ 1分钟)组成。PCR后立即进行高分辨解链曲线分析。通过使用疫苗作为阳性对照和比较它们的解链曲线特征标识，实现真实的NDV病毒分离株与疫苗株的区分。

通过高分辨熔解(HRM)曲线分析进行NDV基因型区分

使得阳性NDV样品接受HRM测定法。通过使用扩增NDV的融合蛋白基因的引物组(SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18)建立HRM测定法。该测定法由10μl高饱和性荧光染料主混合物(Roche)、2μl 25mMMgCl₂、0.5μl引物对、模板和PCR级水组成。将样品装入384孔微孔平板并且在实时PCR仪(LightCycler480，Roche)中进行PCR扩增。热循环反应由初始变性(在95℃ 3秒)组成。扩增由变性(在95℃ 1分钟)、复性(在60℃ 1分钟)和延伸(在72℃ 1分钟)组成。PCR后立即进行高分辨解链曲线分析。通过使用已知的阳性NDV基因型作为阳性对照并比较其解链曲线特征标识，实现NDV基因型区分。通过对阳性NDV分离株测序验证测定法。

验证

基于ISO 17025和MIQE(关于实时定量PCR实验的发表需要满足的最低要求试验信息量，Minimum Information for Publication ofQuantitative Real-Time PCR Experiments)的常见验证具有应当测试的8个参数(分析灵敏度、特异性、可重复性、回收率、重现性、耐久性/稳健性和纯度/浓度)。一旦完成测定法的开发，对该方案实施简单验证以区分其分析性灵敏度、特异性并通过测序和氨基酸序列证实。

分析性灵敏度

本研究的目的是确定可以检出的目的靶物质的检测限(LOD)/最低浓度。通过使用紫外分光光度计测量参比物质的全部浓度。将浓度标准化至10pg/μl。使用终点稀释(10倍连续稀释物)直至该测定法不再能够检出靶生物(无检测信号)。

特异性

本研究的目的是评定测定法在其他传染介质存在下检出目的靶物质的特异性。通过针对5种其他生物(传染性支气管炎病毒、传染性法氏囊病病毒、滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae)、鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum)、禽肺病毒)检验本方案，实施检验的特异性。为了通过这个参数，测定法不应当产生相同的检测信号(熔解峰)或不应当产生其他生物的任何检测信号。该方法应当足够特异以便甚至在其他菌群存在下仅检出目的靶物质。

测序和氨基酸序列分析

如上文所述实施参数。

结果

采样

来自全部14个农场的样品均发现呈NDV阳性。

测序、氨基酸序列分析、系统发育构建

BLAST分析显示与Genbank中的其他序列比较时，全部序列样品均是真实NDV范例。十四个马来西亚NDV分离株的融合(F)基因的氨基酸序列分析显示，十一个(11)分离株归属为强毒病毒，并且三个(3)分离株归属为弱毒病毒。11个强毒毒株具有F切割位点基序112R-R-R-K-R-F117(SEQ ID NO:33)，而2个弱毒毒株具有F切割位点基序112G-R-Q-G-R-L117(SEQ ID NO:34)，同时1个序列在F2蛋白的C末端具有F切割位点基序112G-K-Q-G-R-L117(SEQ ID NO:35)并在F1蛋白N末端的氨基酸位置117处具有苯丙氨酸(F)残基(Berhanu等人,Virol J.,7:183,2010)。系统发育分析揭示11个马来西亚分离株与基因型VIId株紧密聚类，1个马来西亚分离株与基因型I和2个我们的分离株(其划分为基因型II)在一起分组。分组以形成基因型VIId的11个马来西亚分离株当中，10个分离株(F1、F2、F3、F4、F9、F10、F11、F12、F13、F14)与先前由来自UPM的研究者报告在2004-2005年和2007年造成新城疫暴发的其他马来西亚分离株具有在97.9％至98.7％之间的序列身份相似性。全部这些分离株与印度尼西亚株(美冠鹦鹉/14698/90)具有91-92％之间的相似性。一个划归为基因型VIId的(F8)马来西亚分离株与中国株(Ch/2000)具有96.1％相似性。来自这项研究的3个弱毒株分离株当中，两个分离株(F5、F6)与基因型2Lasota株具有97.4-97.5％之间的核苷酸序列相似性，而一个分离株(F7)与Ulster/67株具有约88.8％的核苷酸序列相似性。

DIVA(区分感染株与疫苗株)测定法

全部阳性马来西亚分离株的DIVA测定法显示它们与Avinew或Lasota没有关系(图24)。通过使用随仪器供应的基因扫描软件分析该测定法。该软件的聚类算法允许全部解链曲线归一化并随后它使全部样品和具有相同熔解特征的数据聚类。

通过高分辨熔解(HRM)曲线分析进行NDV基因型区分

区分NDV基因型的HRM测定法与基因扫描分析和氨基酸序列分析相关(图25)。与上文描述的DIVA测定法相似，来自Roche的相同基因扫描软件用于分析数据。十四个马来西亚NDV分离株的融合(F)基因的氨基酸序列分析显示，十一个(11)分离株归属为强毒病毒，并且三个(3)分离株归属为弱毒病毒。11个强毒毒株具有F切割位点基序112R-R-R-K-R-F 117(SEQ ID NO:33)，而2个弱毒毒株具有F切割位点基序112G-R-Q-G-R-L 117(SEQ ID NO:34)，并且1个序列在F2蛋白的C末端具有F切割位点基序112G-K-Q-G-R-L 117(SEQ ID NO:35)并在F1蛋白N末端的氨基酸位置117处具有苯丙氨酸(F)残基。这证实HRM测定法符合其预期用途。

验证

该测定法可以对20μl总反应体积检出低至0.05ag。引物是NDV F基因特异的并且如方法学中所述与其他生物没有关系。

使用HRM分析更多NDV疫苗

通过HRM分析更多NDV疫苗株。这些疫苗包括：Avinew(MerialLimited)、Clone 30(Intervet)、KBNP-Dalguban(KBNP，韩国)、ND-B1(Merial Limited)和Mukteswar(Malaysian Vaccine Pharmaceuticals)。

该测定法由1μl高饱和性荧光染料、2μl 25mM MgCl₂、12.5μlHRM主混合物、1μl引物对(SEQ ID NO:31和32)、模板和PCR级水组成。将样品装入384孔微孔平板并且在实时PCR仪(LightCycler 480，Roche)中进行PCR扩增。热循环反应由初始变性(在95℃ 3秒)组成。扩增由变性(在95℃ 1分钟)、复性(在56℃ 1分钟)和延伸(在72℃ 1分钟)组成。PCR后立即进行高分辨解链曲线分析。

HRM测定法能够区分测试的疫苗型(图20)。图21中显示五个NDV疫苗型毒株全基因组的一部分核苷酸序列比对结果。可以观察到遍及整个病毒基因组各处的多个核苷酸差异，这解释了解链曲线的区别。图22中显示五个NDV疫苗型毒株的融合蛋白基因的氨基酸序列的多重比对结果。类似地，可以在多个位点观察到各种差异。

图23中描述了疫苗型NDV全基因组的序列同一性矩阵和疫苗型NDV融合(F)蛋白的氨基酸的序列同一性矩阵。

结果显示HRM(高分辨熔解)分析可以明晰地将解链曲线针对每个疫苗型划分成互斥组。五个疫苗型的全基因组序列和融合蛋白基因序列的多重比对在遍及全基因组的多个位点显示各种核苷酸变异。这五项研究中，KBNP疫苗类型在核苷酸位置4500至4506处显示六核苷酸插入“CGTACG”。测试的其他疫苗均没有这个序列。据报道KBNP是一个重组La Sota毒株(KBNP-C4152R2L)，其中通过F切割基序从¹¹²RRQKR¹¹⁶(SEQ ID NO:45)突变成¹¹²GRQAR¹¹⁶(SEQ ID NO:46)(图22)，融合基因(F)和血凝素-神经氨酸酶基因(HN)由来自基因型VIId病毒的F和HN基因替换。为了不破坏“六定律判”的情况下减毒，将这个六核苷酸序列插入基质蛋白和F基因之间的基因间区作为标记(Cho等人,Clinical and Vaccine Immunology,15(10):1572-9,2008)。这充当了区分KBNP疫苗与Avinew的良好标记。类似地，其他疫苗在多个位点具有核苷酸差异，这使得通过HRM区分疫苗型成为可能。

通过同一性矩阵工具对病毒全基因组进行的序列评分显示出Avinew和ND克隆30(Intervet)之间的99％相似性、Avinew和Mukteswar(MVP)之间的87.7％相似性、Avinew和KBNP(韩国Dalguban)之间的94.9％相似性、Avinew和ND-B1(Merial)之间的99.5％相似性。

通过同一性矩阵工具对疫苗型融合蛋白基因进行的氨基酸序列评分显示出：Avinew和ND克隆30(Intervet)之间的99％相似性、Avinew和Mukteswar(MVP)之间的88.9％相似性、Avinew和KBNP(韩国Dalguban)之间的88.6％相似性、Avinew和ND-B1(Merial)之间的99％相似性。

评分矩阵表明，NDV病毒间的不相似性如下：基于核苷酸不相似性，在Avinew和Mukteswar(MVP)之间以12.7％变动；并且，基于其融合蛋白基因的氨基酸序列不相似性，在Avinew和KBNP(韩国Dalguban)之间以11.4％变动，在Avinew和Mukteswar(MVP)之间以11.1％变动。

实施验证以评估该测定法，并且发现该测定法就灵敏度和特异性而言符合其预期用途。

该结果进一步表明：HRM测定法能够产生明晰地鉴定每个疫苗型的独特解链曲线。

序列表

Claims

1.表征IBV毒株的过程或方法，其包括以下步骤：

a)从IBV毒株产生IBV cDNA；

b)在实时聚合酶链反应(PCR)中使所述cDNA暴露于包含正向引物和反向引物的引物对以产生扩增子，其中所述引物对是对于IBV基因组的S1基因特异的；

c)在所述实时PCR后立即对包含所述扩增子的双链产物进行高分辨熔解(HRM)曲线分析；以及

d)分析和比较所述HRM曲线，从而表征所述IBV毒株。

2.根据权利要求1所述的过程或方法，其中引物对包含具有如SEQID NO:29中所示序列的正向引物和具有如SEQ ID NO:30中所示序列的反向引物。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述IBV毒株选自793/B株、Massachusetts株、QX-样株、IBNC90株、D274株、Iowa株、Arkansas株、Holland 52株、Connecticut 46株、Beaudette US株、California株、Jilin株、Holte株、HK株、D41株、DE072株、西班牙/92/35株和埃及/F/03株。

4.根据权利要求1所述的过程或方法，还包括鉴定新IBV毒株的步骤，其中所述IBV毒株的S1序列不与一个或多个IBV S1序列以约95％序列同一性对齐。

5.根据权利要求4所述的过程或方法，还包括分离所述新IBV毒株的步骤。

6.根据权利要求1-5任一项所述的过程或方法，其中所述过程提供用于区分感染动物和接种(DIVA)动物的手段。

7.根据权利要求6所述的过程或方法，其中所述过程还包括步骤：鉴定所述IBV毒株是否为疫苗型毒株或感染所述动物的野生型毒株。

8.根据权利要求1-7任一项所述的过程或方法，其中所述实时PCR包括以下步骤：

a)在95℃初始变性3秒；

b)在95℃变性1分钟；

c)在55℃复性1分钟；

d)在72℃延伸1分钟；

e)重复步骤b)-d)45次。

9.用于检测IBV毒株的试剂盒，其包含：

a)引物对，所述引物对包含具有如SEQ ID NO:29中所示序列的正向引物和具有如SEQ ID NO:30中所示序列的反向引物；

b)描述进行实时PCR的参数和条件的说明书。

10.用于HRM分析的分离的多核苷酸或引物，其具有如SEQ IDNO:29或SEQ ID NO:30中所示的序列。

11.表征CSFV毒株的过程或方法，其包括步骤：

a)从CSFV毒株产生CSFV cDNA；

b)在实时聚合酶链反应(PCR)中使所述cDNA暴露于包含正向引物和反向引物的引物对以产生扩增子，其中所述引物对是对于CSFV基因组的NS5B或3’NTR区特异的；

d)分析和比较所述HRM曲线，从而表征所述CSFV毒株。

12.根据权利要求11所述的过程或方法，其中所述引物对包含具有如SEQ ID NO:8中所示序列的正向引物和具有如SEQ ID NO:9中所示序列的反向引物。

13.根据权利要求11或12所述的过程或方法，其中所述CSFV毒株选自ALD株、中国株(C株)、GPE株(日本株)、C/HVRI株(来自中国，基因型1.1)、Riems株(来自中国)、Alfort 187株、Ames株、Margarita株、Baker株、纽约株、Purdue 115株、Paderborn株、Spreda株、Oregon株、Singer株、Osloss株、Moredun株和Frijters株。

14.根据权利要求11所述的过程或方法，还包括鉴定新CSFV毒株的步骤，其中所述CSFV毒株的NS5B或3’NTR序列不与一个或多个IBV S1序列以约95％序列同一性对齐。

15.根据权利要求14所述的过程或方法，还包括分离新CSFV毒株的步骤。

16.根据权利要求11-15任一项所述的过程或方法，其中所述过程提供用于区分感染动物和接种(DIVA)动物的手段。

17.根据权利要求16所述的过程或方法，还包括步骤：鉴定所述CSFV毒株是否为疫苗型毒株或感染所述动物的野生型毒株。

18.根据权利要求11-17任一项所述的过程或方法，其中所述实时PCR包括以下步骤：

a)在95℃初始变性3秒；

b)在95℃变性1分钟；

c)在55℃复性1分钟；

d)在72℃延伸1分钟；

e)重复步骤b)-d)45次。

19.用于检测CSFV毒株的试剂盒，其包含：

a)引物对，所述引物对包含具有如SEQ ID NO:8中所示序列的正向引物和具有如SEQ ID NO:9中所示序列的反向引物；

b)描述进行实时PCR的参数和条件的说明书。

20.用于HRM分析的分离的多核苷酸或引物，其具有如SEQ IDNO:8或SEQ ID NO:9所示的序列。

21.表征NDV毒株的过程或方法，其包括步骤：

a)从IBV毒株产生NDV cDNA；

b)在实时聚合酶链反应(PCR)中使所述cDNA暴露于包含正向引物和反向引物的引物对以产生扩增子，其中所述引物对是对于NDV基因组的F、NP、P、M、HN或L基因特异的；

c)在所述实时PCR后立即对包含扩增子的双链产物进行高分辨熔解(HRM)曲线分析；以及

d)分析和比较所述HRM曲线，从而表征所述NDV毒株。

22.根据权利要求21所述的过程或方法，其中所述引物对包含具有如SEQ ID NO:17中所示序列的正向引物和具有如SEQ ID NO:18中所示序列的反向引物，或具有如SEQ ID NO:31中所示序列的正向引物和具有如SEQ ID NO:32中所示序列的反向引物。

23.根据权利要求21或22所述的过程方法，其中所述NDV毒株选自Avinew株、LaSota株、MVP-Mukteswar株、ND-B1株、韩国Dalguban株、Herts 33株、Essex’70株、135/93株、617/83株、34/90株、Beaudette C株、D26株、MC110株和1154/98株。

24.根据权利要求21所述的过程或方法，还包括鉴定新NDV毒株的步骤，其中所述NDV毒株的F、NP、P、M、HN或L序列不与一个或多个NDV F、NP、P、M、HN或L序列以约95％序列同一性对齐。

25.根据权利要求24所述的过程或方法，还包括分离新NDV毒株的步骤。

26.根据权利要求21-25任一项所述的过程或方法，其中所述过程提供用于区分感染动物和接种(DIVA)动物的手段。

27.根据权利要求26所述的过程或方法，其中所述过程还包括步骤：鉴定所述NDV毒株是否为疫苗型毒株或感染所述动物的野生型毒株。

28.根据权利要求21-27任一项所述的过程或方法，其中所述实时PCR包括以下步骤：

a)在95℃初始变性3秒；

b)在95℃变性1分钟；

c)在60℃复性1分钟；

d)在72℃延伸1分钟；

e)重复步骤b)-d)45次。

29.用于检测NDV毒株的试剂盒，其包含：

a)引物对，其包含具有如SEQ ID NO:17中所示序列的正向引物和具有如SEQ ID NO:18中所示序列的反向引物；或引物对，其包含具有如SEQ ID NO:31中所示序列的正向引物和具有如SEQ ID NO:32中所示序列的反向引物；以及

b)描述进行实时PCR的参数和条件的说明书。

30.用于HRM分析的分离的多核苷酸或引物，其具有如SEQ IDNO:17、18、31或32所示的序列。