KR20150110531A - Ibv, csfv 및 ndv 의 고 해상도 용융 유전자형분석 - Google Patents

Ibv, csfv 및 ndv 의 고 해상도 용융 유전자형분석 Download PDF

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Abstract

본 발명은 고 해상도 용융 기술을 사용하는 IBV, CSFV 및 NDV 균주의 분별 및 특징화, 및 신규 균주의 확인 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 방법에 사용하기 위한 프라이머 및 키트를 제공한다.

Description

IBV, CSFV 및 NDV 의 고 해상도 용융 유전자형분석 {HIGH RESOLUTION MELT GENOTYPING OD IBV, CSFV AND NDV}
관련 출원에 대한 교차-참조
본 출원은 2012 년 12 월 18 일에 출원된 미국 가출원 61/738,688 의 우선권을 주장한다.
기술 분야
본 발명은 고 해상도 용융 기술을 사용하는 IBV, CSFV 및 NDV 균주의 분별 및 특징화, 및 신규 균주의 확인 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 방법에 사용하기 위한 프라이머 및 키트를 제공한다.
폴리머라아제 연쇄 반응 (PCR) 은 특이적 DNA 또는 폴리뉴클레오티드를 시험관 내에서 증폭시켜, 특정 DNA 서열의 수천 내지 수백만의 카피를 생성하는 방법을 제공하는 프라이머 신장 반응이다. PCR 은 이제 다양한 적용을 위한 의료적 및 생물학적 연구 실험실에서 사용되는 흔하고 종종 불가결한 기법이다. 이들은 서열분석, DNA-기반 계통발생론, 또는 유전자의 기능적 분석; 유전 질환의 진단; 유전자 지문의 확인; 및 감영성 질환의 검출 및 진단을 위해 DNA 클로닝을 포함한다. 기본적인 PCR 의 변형 중 몇몇은 정량적 실시간 PCR (qPCR 또는 RT-PCR), 대립형질-특이적 PCR, 비대칭 PCR, 고온 출발 PCR, 역 전사 PCR, 다중-PCR, 네스티드-PCR (nested-PCR), 라이게이션-매개 PCR, 상호서열-특이적 PCR, 열 비대칭 인터레이스 (interlaced) PCR 및 터치다운-PCR (touchdown-PCR) 을 포함한다. 상기 PCR 변형은 상이한 목적에 대해 다양한 용도를 제공한다. 예를 들어, 단일-뉴클레오티드 다형현상 (SNP) (DNA 내의 단일-염기 차이) 은 대립형질-특이적 PCR 에 의해 확인될 수 있고, qPCR 은 PCR 반응에서 증폭된 카피 수를 결정하는데 매우 높은 정확도를 제공할 수 있다 (Bartlett et al., "A Short History of the Polymerase Chain Reaction", PCR Protocols, 2003).
최근에, 고 해상도 용융 (HRM) 은 고 출력 돌연변이 스캐닝에 대한 신규한 분자적 기법으로서 부가되었다 (Zhou, L., et al., Clin. Chern. 51, 1770-1777, 2005). HRM 을 사용하는 돌연변이 측정은 이중-가닥 DNA 와 상호작용하는 형광 염료의 존재 하에 증가하는 온도에 노출되는 경우, DNA 의 해리에 기반한다 (참조, 예를 들어 US7,387,887; US7,582,429). 당업계에 기재된 수 많은 적합한 염료가 있다. 돌연변이의 존재는 DNA 이종이중체의 형성 후 용융 행태의 변화를 야기한다. 따라서, 상기 "돌연변이 스캐닝" 기법은 표적-유전자 유도된 PCR 앰플리콘에서의 서열 변화의 존재를 검출한다. HRM 실험에서, 샘플 DNA 를 먼저 고 해상도 용융 염료의 존재 하에 실시간 PCR 을 통해 증폭시킨다. 이러한 염료의 두드러지는 예는 WO 2008/052742 에 기재되어 있다. PCR 후, 연속적인 용융 실험은 동일한 Real Time Instrument 에서 수행하고, 각각의 Gene Scanning Software 로 분석하여 서열 변이체를 확인할 수 있다.
이전에 돼지 콜레라라고 공지된 고전적인 돼지 열병 (Classical swine fever: CSF) 은 전세계적으로 돼지 산업에서 경제적인 손실을 야기하는 가축 돼지 및 야생 돼지에 영향을 주는 고도로 전염성이고 전신성인 출혈성 질환이고, 육상동물위생규약 (Terrestrial Animal Health Code) 에 따라, 국제수역사무국 (Office International des Epizooties (OIE, 2007)) 에 신고해야하는 질환이다. 원인 인자는 플라비비리다에 (Flaviviridae) 과의 페스티바이러스 (Pestivirus) 속으로 분류되는 외피의, 양성-센스, 단일 가닥 RNA 바이러스인, 고전적인 돼지 열병 바이러스 (CSFV) 이다. 유전자 수준에서, CSFV 는 E2 및 NS5B 유전자의 일부 서열에 근거하여, 유전자형 1, 2 및 3 으로 나뉠 수 있다. 각각의 유전자형은 1.1, 1.2, 및 1.3; 2.1, 2.2 및 2.3; 및 3.1, 3.2, 3.3, 및 3.4 로서 각각 언급되는 여러 개의 서브-유전자형으로 추가로 분류될 수 있다 (Paton et al., Vet Microbiol. 73:137-157, 2000). 아시아에서, CSF 전염병은 어디에나 있고, 유전자형 1, 2 및 3 이 여러 아시아 국가에서 단리되었다.
CSFV 는 급성, 아급성 및 만성 돼지 질환을 야기할 수 있고, 심각한 경제적 손실을 초래하는 전세계적 돼지 산업에 상당한 위협을 일으킨다. CSF 의 통제는 근절 또는 백신접종을 포함하는데, 근절은 감염된 돼지의 도살에 기인하는 상당한 양의 손실에 기여하는 유럽 연합 (EU) 과 같은 선진국에서 바람직한 통제 방법이다. 한편 백신접종은 중국과 같은 개발도상 국가에서 주요한 통제 전략이다. 돼지 콜레라 라피나지드 바이러스 (Hog Cholera Lapinized Virus (HCLV)) (또한 C 균주로서 알려짐) 가 1950 년대 중반에 개발되었고, 중국 및 많은 국가에서 널리 사용된다 (Moorman et al., J Virol. 70:763-770, 1996). HCLV 백신으로의 광대한 백신접종은 백신화된 돼지 무리에서 CSFV 의 야생형과 HCLV-균주를 구별하는 것을 어렵게 만든다 (Van Oirshot, Vet Microbiol 96:367-384, 2003). CSFV 로의 준-임상적 및 무증상 감염이 보편적이어서 (Moennig et al., Vet. J. 165, 11-20, 2003; Tu, Virus Res. 81, 29-37, 2001) 야생형 CSFV 로의 감염이 농부 및 수의사에 의해 쉽게 인지될 수 없고, 일반적인 검출 어세이, 예컨대 바이러스 단리, 항원-포획 ELISA, 및 형광 항체 시험에 의해서는 검출되지 않는다.
다양한 진단 어세이가 개발되었다. 그러나, 이들은 모두 한계가 있다. 바이러스 단리는 결과의 확인을 위해 6-12 일을 필요로 하고; ELISA 는 매우 민감하지 않으며 종종 가 음성 결과를 산출하고; 실시간 PCR 어세이는 좀더 빠르고 더욱 민감하지만, 가장 중요하게는 교차 감염의 높은 위험에 의해 제한된다. 상기 어세이 중 어느 것도 CSFV 의 야생형과 백신 균주를 구별할 수 없다. 이전에, "Riems" 백신-균주로부터 야생형 CSFV 를 구별해내기 위한 실시간 RT-PCR 어세이가 EU 에서 성립되었고 (Leifer et al., J. Virol. Methods 158, 114-122, 2009; Leifer et al., J. Virol. Methods 166, 98-100, 2010; Leifer et al., J. Gen. Virol. 91, 2687-2697, 2010), 야생형과 "K-LOM' 백신-균주 CSFV 를 구별하기 위한 어세이가 한국에서 개발되었다 (Cho et al., Can J Vet Res 70:226-229, 2006). 중국에서는, 프로브 결합 부위에서의 뉴클레오티드 차이에 근거해 HCLV-균주 백신으로부터 야생형 CSFV 를 구별해내기 위한 2-단계 실시간 RT-PCR 어세이 및 야생형 내의 돌연변이의 검출을 위해 작은 홈 결합 (MGB) 프로브를 사용하는 1-단계 실시간 RT-PCR 어세이 (wt-rRT-PCR) 가 기재되었다.
상이한 CSFV 백신 균주가 상이한 국가에서 투여되었기 때문에 (예를 들어, EU 에서의 "Riems", 한국에서의 "K-LOM 및 중국에서의 "HCLV") 보편적인 검출 어세이가 모든 국가에서 사용될 수는 없을 것이다. 그러므로, 고전적인 돼지 열병에 대해 야생형과 백신-유형을 구별하기 위해, 입수가능하고, 실행하기가 용이하고 해석하기 용이한 어세이를 개발할 필요가 있다.
전염성 기관지염 (Infectious Bronchitis (IB)) 은 대부분의 국가에서 발병률 100% 에 달하는, 가금류 산업에서 모든 국가에서 유행하는 질환이다. 이것은 가장 경제적으로 중요한 질환이다. 영계에서, 호흡기 질환 또는 신염은 사망, 체중 감소 및 가공시 비난을 야기하는 반면, 산란 연령의 닭에서는, 본 질환은 준임상적이고 산란율 감소 및 비정상 달걀을 야기한다 (Ignjatovic et al., Archives of Virology, 2006). IB 발병은 주로 백신접종된 무리에서 발생이 지속되는데, 이것은 S1 유전자의 뉴클레오티드 지점 돌연변이, 삽입, 결실 또는 재조합에 의해 생성되는, IBV 의 상이한 혈청형, 서브유형 또는 변이형에 의해 야기되는 것으로 생각된다.
원인 인자인, 전염성 기관지염 바이러스 (Infectious Bronchitis Virus (IBV)) 는 코로나비리다에 (Coronaviridae) 과에 속한다. 이것은 27.6 kb 길이의 게놈 크기를 가진 외피가 있는, 양성-센스, 단일 가닥 RNA 바이러스이다. 첫번째 20 kb 는 바이러스 RNA-의존성 RNA 폴리머라아제 및 프로테아제를 인코딩한다. 전체 게놈은 5' 에서 3' 방향으로 적어도 10 개의 오픈 리딩 프레임 (ORF) 을 가지며, 하기와 같다: 스파이크 당단백질 (S), 막 당단백질 (M), 인산화된 뉴클레오캡시드 단백질 (N) 및 소형 막 단백질 (E) 을 포함하는 4 개의 구조적 단백질을 인코딩하는 5'-1a-1b-S(S1, S2)-3a,b,c(E)-M-5a,b-N-Poly(A)-3' (Mardani et al., Arch Virol. 155(10):1581-6, 2010).
IBV 는 먼저 1930 년에 미국에서 보고되었고, 보고된 이래로 미국 (Johnson and Marquardt, Avian Dis. 19:82-90, 1975), 유럽 (Capua et al., Zentralbl Veterinarmed B. 41:83-89, 1994; Cavanagh and Davis, Arch Virol 130:471-476, 1993; Gough et al., Vet Rec. 130:493-494, 1992), 아시아 (Wang et al., Avian Dis 41:279-282, 1997) 및 오스트레일리아 (Ignjatovic and McWaters, J Gen Virol. 72:2915-2922, 1991; Lohr, Avian Dis. 20:478-482, 1976) 의 4 개 대륙 도처에서 대부분의 국가에서 보고되었다. 말레이시아에서는, 질환의 유병률에 대해 알려진 바가 거의 없다. IB 질환의 첫번째 보고는 질환이 경미하였고 백신접종이 부적절했던 1967 년이었다 (Chong et al., Second symposium on Scientific and Technological Research in Malaysia and Singapore, pp73-83, 1967; Aziz et al., The 8th Veterinary Association Malaysia Scientific Congress, 23-25th August 1996, Ipoh, pp76-78). 적어도 1979 년 이래로 변이체가 존재하였고 (Lohr, Proceedings of the 1st International Symposium on Infectious Bronchitis, EF Kaleta & U. Heffels - Redmann (Eds), pp 70-75, 1988; de Wit et al. Avian Pathology. 40(3):223-235, 2011), 높은 치사율을 초래하는 신증-신염 증후군을 야기하는 좀더 치명적인 균주에 대한 보고서가 1980 년에 처음 보고되었다 (Heng et al., Kajian Veterinar. 12:1-8, 1980; Aziz 1996). 말레이시아에서 IBD 에 관련된 최근의 문헌은 2000, 2004 및 2009 년으로 거슬러 올라가, 1995 년 이래로 변이체 신장병원성 (nepropathogenic) IBV 균주에 대한 임상적 보고서가 있었다 (Maizan, Proceeding 12th FAVA and 14th VAM congress, 28-28 August 2002, pp116; Yap M.L et al. Proceeding VAM Congress 1-4 September., 2000; Arshad et al. J. Vet. Malaysia. 14 (1&2): 322002; Balkis et al. Proceedings VAM Congress 2004, Zulperi et al. Virus Genes. 38:383-391, 2009).
IBV 의 전세계적인, 여러 가지의 상이한 혈청형 및 유전자형이 확인되었고, 신규한 변이체가 여전히 출현하고 있다. 상기 신규한 변이체 중 하나는 QX-유사 IB 이다. IB-QX 는 유행 중이고 2004 년 이래로 중국에서 보고되었다 (Liu & Kong, Avian pathology, 33:321-327, 2004). QX 로서 확인된 바이러스가 신장 병리학의 다양한 형태와 우세하게 연관되었다. 다른 연구자들이 또한 중국에서 유사한 균주를 보고하였다 (Liu et al., J of Gen Virol, 86:719-725, 2005). 2007 년에, Cuiping et al. (Vet. Microbio., 122:71, 2007) 은 2003 년과 2005 년 사이에 백신접종된 및 백신접종되지 않은 닭의 무리로부터 신장병원성 균주의 단리를 보고하는 Liu et al. (2005) 에 의해 제시된 데이터를 확인하였다. 유사한 발견이 또한 러시아 및 유럽의 다른 지역에서 보고되었다 (Bochkov et al., Avian Pathology, 35:379-393, 2006; Landman et al., Proceedings of the 14th World Veterinary Poultry Congress, 22-26 August, 2005, Istanbul, Turkey, pp369).
상이한 IBV 백신 균주가 상이한 국가에서 투여되었기 때문에 보편적인 검출 어세이가 모든 국가에서 사용될 수는 없을 것이다. 그러므로, 전염성 기관지염 (IB) 에 대해 야생형과 백신-유형을 구별하기 위해, 입수가능하고, 실행하기가 용이하고 해석하기 용이한 어세이를 개발할 필요가 있다.
집중적인 백신접종 프로그램에도 불구하고, 뉴캐슬 질환 바이러스 (Newcastle disease virus: NDV) 는 전세계적으로 상업적 가금류 농장에 대해 지속적인 위협으로 남아있다. NDV 는 모노네가비랄레스 (Mononegavirales) 목, 파라믹소비리다에 (Paramyxoviridae) 과 및 아불라바이러스 (Avulavirus) 속의 일원이다. 이것은 15,586 개의 뉴클레오티드로 이루어진, 음성-센스, 비분절화된 단일-가닥 RNA 게놈을 갖는 외피 바이러스이다. 이의 게놈은 6 개의 유전자: 핵단백질 (NP), 인단백질 (P), 매트릭스 단백질 (M), 융합 당단백질 (F), 헤마글루티닌-뉴라미니다아제 (HN), 당단백질 및 대형 폴리머라아제 단백질 (L) 로 구성된다. NDV 에서 발견된 6 개의 유전자 중에서, 이의 2 개의 막 단백질인, F 단백질 및 HN 단백질이 이의 맹독성의 측정에 있어 가장 중요하다.
최근 실시간 PCR 방법의 성립은 다양한 전염성 인자의 분자적 진단에 대한 상당한 개발을 가져왔으며, 해당 분야의 수의사 및 농부에게 빠르고 정확한 결과를 위한 질환 진단을 위해 소요시간을 급속하게 삭감하였다. 많은 PCR 어세이가 여러 개의 상이한 TaqMan 프로브 또는 SYBR 그린 (green) 을 사용하는 NDV 검출 및 유전자형 구별을 위한 실시간 PCR 어세이에 대해 기재되었다 (Wise et al., J. Clin Microbiol, 42:329-338, 2004). Tan et al. (J. Virol Method, 160:149-156, 2009) 는 NDV 유전자형의 검출 및 구별을 위한 SYBR Green I 실시간 PCR 을 기재하고 있지만, 상기 어세이는 상이한 NDV 유전자형을 검출하기 위해 상이한 프라이머 쌍을 필요로 하고 NDV 의 3 개의 유전자형을 구별해내기 위한 용융 피크의 분석에 크게 의존한다. 비록 SYBR Green 1 어세이가 다른 실시간 검출 형태와 비교하여 성립하기에 가장 비욜 효율적이고 실시간 PCR 의 가장 용이한 형태이지만, 주요한 단점은 염료 분자가 비-특이적 PCR 생성물 또는 프라이머-이량체를 포함하는 반응 혼합물에 존재하는 임의의 이중-가닥 DNA 에 결합한다는 것이다. 따라서, NDV 시험의 빠르고 결정적인 결과를 위해 현행의 분자 진단 방법에서의 개선에 여지가 있다.
발명의 요약
본 발명은 하기 단계를 포함하는, IBV, CSFV 또는 NDV 의 균주를 특징화하는 방법 또는 과정에 관한 것이다: a) 바이러스 균주로부터 cDNA 를 생성하는 단계; b) 실시간 폴리머라아제 연쇄 반응 (PCR) 에서 cDNA 를 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 쌍에 노출시켜 앰플리콘을 산출하는 단계, 이때 프라이머 쌍은 바이러스 게놈의 유전자 또는 영역에 특이적임; c) 실시간 PCR 직후에 앰플리콘을 포함하는 이중-가닥 생성물에 대해 고 해상도 용융 (HRM) 곡선 분석을 수행하는 단계; 및 d) HRM 곡선을 분석 및 비교함으로써 바이러스 균주를 특징화하는 단계. IBV 에 대한 유전자는 S1 유전자일 수 있다. NDV 에 대한 유전자는 F, NP, P, M, HN 또는 L 유전자일 수 있다. CSFV 에 대한 영역은 4 개의 구조적 (C, Erns, E1 및 E2) 또는 8 개의 비-구조적 단백질 (Npro, P7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A 및 NS5B) 영역일 수 있다.
본 발명은 또한 이러한 방법에 사용하기 위한 프라이머 및 키트를 제공한다.
예시로서 제시된, 그러나 본 발명을 기재된 특정 구현예에만 제한하는 것으로 의도되지 않는 하기 상세한 설명은 첨부된 도면과 함께 가장 잘 이해될 수 있다:
도 1 은 각각의 DNA 및 단백질 서열에 배정된 SEQ ID NO 를 확인하는 표이다.
도 2 는 IBV 에 대한 실시간 PCR 의 민감성 어세이를 묘사한다.
도 3 은 특이성을 보여주기 위한 IB-QX 의 증폭 곡선을 묘사한다.
도 4 는 특이성을 보여주기 위한 IB-QX 의 용융 피크를 보여준다.
도 5 는 IB-QX 의 S1 서열 및 블라스트 결과를 묘사한다.
도 6 은 서열 비교 결과를 보여준다.
도 7 은 IBV 균주의 서열 일치성 백분율을 보여준다.
도 8 은 IB-QX, IBnC90, Mass 및 793/B 균주의 HRM 분석을 묘사한다.
도 9 는 IB-QX 및 IBnC90 균주의 HRM 분석을 묘사한다.
도 10 은 LBK 균주 (CSFV) 의 서열 및 블라스트 결과를 예증한다.
도 11 은 VRI 균주 (CSFV) 의 서열 및 블라스트 결과를 예증한다.
도 12 는 Pestiffa 균주 (CSFV) 의 서열 및 블라스트 결과를 예증한다.
도 13 은 MVP 균주 (CSFV) 의 서열 및 블라스트 결과를 예증한다.
도 14 는 QYHC 균주 (CSFV) 의 서열 및 블라스트 결과를 예증한다.
도 15 는 ZBC 균주 (CSFV) 의 서열 및 블라스트 결과를 예증한다.
도 16 은 YSC 균주 (CSFV) 의 서열 및 블라스트 결과를 예증한다.
도 17 은 CSFV 의 야생형 및 백신-유형의 HRM 분석을 묘사한다.
도 18 은 상이한 백신-유형 CSFV 균주의 HRM 분석을 묘사한다.
도 19 는 야생형 CSFV 및 백신-유형 CSFV 의 뉴클레오티드 서열 정렬을 보여준다.
도 20 은 NDV 백신 균주의 HRM 분석을 보여준다.
도 21 은 NDV 균주의 뉴클레오티드 서열 정렬을 묘사한다.
도 22 는 NDV 균주의 아미노산 서열 정렬을 예증한다.
도 23 은 뉴클레오티드 및 아미노산 수준에서 NDV 균주 사이의 서열 일치성을 보여준다.
도 24 는 NDV 백신 균주 및 야생형 균주의 HRM 분석을 묘사한다.
도 25 는 맹독형 (velogenic) /중간독형 (mesogenic) 균주 및 약독형 (lentogenic) 균주를 구별하기 위한 NDV 균주의 HRM 분석을 묘사한다.
본 명세서에서, 특히 청구항에서, "~ 을 포함한다", "~ 이 포함되는", "~ 을 포함함" 등과 같은 용어는 미국 특허법에서 이에 부여된 의미를 가질 수 있으며; 예를 들어, 이들은 "~ 에 포함된다", "~ 에 포함되는", "~ 에 포함됨" 등을 의미할 수 있고; "~ 로 본질적으로 이루어지는" 및 "~ 로 본질적으로 이루어지다" 와 같은 용어는 미국 특허법에서 이에 부여된 의미를 갖고, 예를 들어, 이들은 명백하게 언급되지 않은 요소를 포함하나, 선행 기술에서 발견되거나 본 발명의 기본적인 또는 신규한 특성에 영향을 미치는 요소는 배재한다는 점에 유의한다.
명세서를 해석하려는 목적으로, 하기 정의가 적용될 것이고 어디든 적합하게는, 단수로 사용되는 용어는 또한 복수를 포함할 것이며 역도 성립한다. 단수형 관사에는 문맥상 명백하게 다르게 언급되지 않는 한 복수의 지시대상이 포함된다. 유사하게는, "또는" 이라는 단어는 문맥상 명백하게 다르게 언급되지 않는 한 "및" 이 포함되는 것으로 의도된다. "또는" 이라는 단어는 특정 목록의 임의의 하나의 일원을 의미하고 또한 목록의 일원의 임의의 조합을 포함한다.
"동물" 은 본원에서 모든 포유류, 새 및 어류를 포함하는 것으로 사용된다. 본원에서 사용되는 바와 같은 동물은, 말류 (예를 들어, 말), 개류 (예를 들어, 개, 늑대, 여우, 코요테, 자칼), 고양이류 (예를 들어, 사자, 호랑이, 집고양이, 들고양이, 기타 큰 고양이, 및 치타 및 스라소니를 비롯한 기타 고양이과), 소류 (예를 들어, 소), 돼지류 (예를 들어, 돼지), 양류 (예를 들어, 양, 염소, 라마, 들소), 조류 (예를 들어, 닭, 오리, 거위, 칠면조, 메추라기, 꿩, 앵무새, 핀치, 매, 까마귀, 타조, 에뮤 및 화식조), 영장류 (예를 들어, 원원류, 안경원숭이, 원숭이, 긴팔원숭이, 유인원), 인간 및 어류로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다. "동물" 이라는 용어에는 또한 배아 및 태아 단계를 비롯한, 모든 발달 단계의 개개의 동물이 포함된다.
용어 "폴리펩티드" 및 "단백질" 은 연속 아미노산 잔기의 중합체를 언급하고자 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
용어 "핵산", "뉴클레오티드", 및 "폴리뉴클레오티드" 는 상호교환적으로 사용되고, RNA, DNA, cDNA, 또는 cRNA 및 이의 유도체, 예컨대 개질된 백본을 함유하는 것들을 말한다. 본 발명이 본원에 기재된 것들에 상보적인 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것으로 인식되어야만 한다. 본 발명에서 고려되는 "폴리뉴클레오티드" 는 정방향 가닥 (5' → 3') 및 역 상보적 가닥 (3' → 5') 을 모두 포함한다. 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드는 상이한 방식 (예를 들어, 화학적 합성에 의해, 유전자 클로닝에 의해 등) 으로 제조될 수 있고, 다양한 형태 (예를 들어, 선형 또는 분지형, 단일 또는 이중-가닥, 또는 이의 혼성체, 프라이머, 프로브 등) 를 취할 수 있다.
용어 "게놈 DNA", 또는 "게놈" 은 상호교환적으로 사용되고, 숙주 유기체의 상속가능한 유전 정보를 말한다. 게놈 DNA 는 핵의 DNA (또한 염색체 DNA 로서 언급됨) 뿐 아니라 색소체 (예를 들어, 엽록체) 및 기타 세포 소기관 (예를 들어, 미토콘드리아) 의 DNA 를 포함한다. 본 발명에서 고려되는 게놈 DNA 또는 게놈은 또한 바이러스의 RNA 를 말한다. RNA 는 양성 가닥 또는 음성 가닥 RNA 일 수 있다. 본 발명에서 고려되는 용어 "게놈 DNA" 은 본원에 기재된 것에 상보적인 게놈 DNA 함유 서열을 포함한다. 용어 "게놈 DNA" 는 또한 메신저 RNA (mRNA), 상보적 DNA (cDNA), 및 상보적 RNA (cRNA) 를 말한다. 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "게놈 RA (핵산)" 는 RNA, mRNA, cRNA, DNA 및 cDNA 를 포함한다.
용어 "유전자" 는 생물학적 기능과 연관되는 폴리뉴클레오티드의 임의의 분절을 언급하는데 폭넓게 사용된다. 따라서, 유전자 또는 폴리뉴클레오티드에는 게놈 서열에서와 같은 인트론 및 엑손, 또는 단지 cDNA 에서와 같은 코딩 서열, 예컨대, 출발 코돈 (메티오닌 코돈) 으로부터 출발하고 종료 신호 (중지 코돈) 에서 종료되는 오픈 리딩 프레임 (ORF) 이 포함된다. 유전자 및 폴리뉴클레오티드는 또한 이들의 발현을 조절하는 영역, 예컨대 전사 재시, 번역 및 전사 종료를 포함할 수 있다. 따라서, 또한 포함되는 것은 프로모터 및 리보솜 결합 영역 (일반적으로 상기 조절 요소는 대략 코딩 서열 또는 유전자의 출발 코돈의 60 내지 250 개 뉴클레오티드 업스트림에 있음; Doree S M et al.; Pandher K et al.; Chung J Y et al.), 전사 터미네이터 (일반적으로 터미네이터는 코딩 서열 또는 유전자의 중지 코돈의 대략 50 개 뉴클레오티드 다운스트림 내에 위치함; Ward C K et al.) 이다. 유전자 또는 폴리뉴클레오티드는 또한 mRNA 또는 기능적 RNA 를 발현하고, 또는 특이적 단백질을 인코딩하고, 조절 서열을 포함하는 핵산 단편을 말한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "이종 DNA" 는 수령자와 상이한 유기체, 예컨대 상이한 세포 유형 또는 상이한 종으로부터 유도된 DNA 를 말한다. 용어는 또한 이종 DNA 가 이의 원래 위치와 상이한 게놈의 영역 내로 삽입되는 숙주 DNA 의 동일한 게놈 상의 DNA 또는 이의 단편을 말한다.
다양한 핵산 염기에 대한 약어는 구아닌 (G), 티민 (T), 아데닌 (A) 및 사이토신 (C) 을 포함한다.
용어 "PCR" 은 통상의 유전자증폭기 (thermocycler) 에 의해 DNA 의 단일 또는 몇몇 카피를 기하급수적으로 증폭시키는 방법인 폴리머라아제 연쇄 반응 (Polymerase Chain Reaction) 을 말한다. PCR 은 또한 증폭된 DNA 를 보여주기 위한 젤 전기영동 단계를 필요로 DNA 카피를 증폭시키기 위한 통상의 방법을 말할 수 있다.
"실시간 PCR" 은 형광 수준을 측정함으로써 실시간으로 DNA 카피의 정량 및 DNA 의 증폭을 모니터링하는 것을 가능하게 하는 진보된 PCR 방법을 말한다. 방법은 젤 전기여동을 필요로 하지 않아, 시간을 덜 사용하고 더욱 정확한 결과를 제공한다.
용어 "앰플리콘" 은 폴리머라아제 연쇄 반응 (PCR) 방법론을 사용하여 증폭 또는 증대시키고자 하는 폴리뉴클레오티드의 부분을 말한다.
용어 "고 해상도 용융 (HRM)" 은 이중-가닥 DNA 샘플 내의 돌연변이, 다형현상 및 유전적 차이의 검출을 위한 기술을 말한다. 이것은 학계 (University of Utah, US) 와 산업계 (Idaho Technology, US) 간의 협력의 결과로서 2002 년에 도입되었던 DNA 분석에 대한 비교적 새로운 방법이다 (Reed et al. 2007). 고 해상도 용융은 온도가 증가하면서 이중-가닥 DNA (dsDNA) 에서 단일 가닥 DNA (ssDNA) 으로 이동하는 이들의 해리 행동에 따라 DNA 샘플을 특징화하기 위해 사용된다. 이 기법은, DNA 샘플을 증가하는 온도에 적용하고 이중-가닥 (dsDNA) 에서 단일 가닥 형태 (ssDNA) 로의 이들의 해리의 상세사항을 기록한다. 장비는 신규한 적용 가능성을 만들기 위해 이전의 방법보다 훨씬 더 최적이고 열 정확성을 가진 형광 신호를 수집한다.
HRM 분석은 이중-가닥 DNA 샘플 상에 수행된다. 전형적으로 폴리머라아제 연쇄 반응 (PCR) 은 관심의 이들의 돌연변이가 있는 DNA 영역을 증폭시키는 HRM 분석 이전에 수행된다. 증폭되는 상기 영역은 앰플리콘으로서 공지된다. PCR 후, HRM 분석을 시작한다. 과정은 앰플리콘 DNA 를 대략 50℃ 에서 대략 95℃ 까지 가온시키는 것이다. 상기 과정 동안 일부 지점에서, 앰플리콘의 용융 온도에 도달하고 DNA 의 2 개의 가닥이 분리되거나 "용융" 되어 떨어진다. HRM 의 본질은 상기 과정을 실시간으로 모니터링하는 것이다. 이것은 이중-가닥 DNA 에 특이적으로 결합하고 이것이 결합하였을 때 형광을 밝게 내는 형광 염료를 사용함으로써 달성된다. 이중-가닥 DNA 의 부재하에 염료는 결합할 것이 없어서, 오직 낮은 수준의 형광을 낸다. HRM 분석 시작시에 수백만 커피의 앰플리콘 때문에 샘플 내에는 높은 형광이 있다. 그러나 샘플이 가열되고 DNA 의 2 개의 가닥이 용융되어 떨어지면, 이중-가닥 DNA 의 존재가 감소하여, 형광도 감소한다. HRM 기계는 본 과정을 기록하고 형광 대 온도의 수준을 보여주는 용융 곡선으로서 공지된 그래프로서 데이터를 작성한다. HRM 기계는 본 과정을, 용융 곡선의 차이를 정확하게 문서화하고 따라서 돌연변이가 존재하는지 아닌지에 대한 확인을 가능하게 하는 "고 해상도" 로 모니터링하는 능력을 갖는다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "프라이머" 는 또다른 단일-가닥 분자의 상보적 부분과 혼성화시, 예컨대 PCR 에서, DNA 폴리머라아제 활성을 가진 효소에 의해 매개되는 중합의 개시를 위한 출발 지점으로서 작용하는올리고뉴클레오티드 또는 짧은 단일-가닥 핵산을 말한다.
본원에서 사용되는 바와 같은, 용어 "항원" 또는 "면역원" 은 숙주 동물에서 특이적인 면역 반응을 유도하는 물질을 의미한다. 항원은 전체 유기체 (치사된, 약독화된 또는 생); 유기체의 서브유닛 또는 일부; 면역원성 특성을 가진 삽입체를 함유하는 재조합 벡터; 숙주 동물에 대해 제시시 면역 반응을 유도할 수 있는 DNA 의 조각 또는 절편; 폴리펩티드, 에피토프, 합텐, 또는 임의의 이의 조합을 포함할 수 있다. 대안적으로, 면역원 또는 항원은 독소 또는 항독소를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같은, 용어 "면역원성 단백질 또는 펩티드" 에는 일단 숙주에 투여되면, 단백질에 대항하여 체액성 및/또는 세포성 유형의 면역 반응을 유발할 수 있다는 점에서 면역학적으로 활성인 폴리펩티드가 포함된다. 바람직하게는 단백질 단편은 총 단백질과 실질적으로 동일한 면역학적 활성을 갖는 그러한 것이다. 따라서, 본 발명에 따른 단백질 단편은 하나 이상의 에피토프 또는 항원 결정소를 포함하거나 이것으로 본질적으로 이루어지거나 이것으로 이루어진다. 본원에 사용되는 "면역원성" 단백질 또는 폴리펩티드에는 단백질의 전장 서열, 이의 유사체, 또는 이의 면역원성 단편이 포함된다. "면역원성 단편" 은 하나 이상의 에피토프를 포함하여 상기 기재되는 면역학적 반응을 도출하는 단백질의 단편을 의미한다. 이러한 단편은 당업계에 잘 공지된 임의의 수의 에피토프 맵핑 기술을 사용하여 확인될 수 있다. 예를 들어, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) 을 참조한다. 예를 들어, 선형 에피토프는 예를 들어, 동시에 고체 지지체 상에 다수의 펩티드를 합성하고 (상기 펩티드는 단백질 분자의 일부에 상응함), 상기 펩티드가 지지체에 여전히 부착된 채로 펩티드가 항체와 반응함으로써 측정될 수 있다. 이러한 기술은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, U.S. Pat. No. 4,708,871; Geysen et al., 1984; Geysen et al., 1986 에 기재되어 있다. 유사하게, 형태학적 에피토프는 예컨대, 예를 들어, x-선 결정학 및 2-차원 핵자기 공명에 의해 아미노산의 공간적 형태를 측정함으로써 쉽게 확인된다.
용어 "면역원성 단백질 또는 펩티드" 는 추가로, 폴리펩티드가 본원에 기재된 면역학적 반응을 산출하는 작용을 하기만 한다면, 서열에 대한 결실, 부가 및 치환을 고려한다. 용어 "보존성 변이" 는 아미노산 잔기의 또다른 생물학적으로 유사한 잔기로의 대체, 또는 인코딩된 아미노산 잔기가 변화하지 않거나, 또다른 생물학적으로 유사한 잔기인 식의 핵산 서열 내의 뉴클레오티드의 대체를 나타낸다. 이와 관련하여, 특히 바람직한 치환은 일반적으로 특성이 보존되는, 즉, 아미노산의 계열 내에서 일어나는 치환일 것이다. 예를 들어, 아미노산은 일반적으로 4 개의 계열: (1) 산성--아스파테이트 및 글루타메이트; (2) 염기성--라이신, 아르기닌, 히스티딘; (3) 무극성--알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판; 및 (4) 비전하 극성--글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌, 티로신으로 나누어진다. 페닐알라닌, 트립토판, 및 티로신은 종종 방향족 아미노산으로 분류된다. 보존성 변이의 예에는 하나의 소수성 잔기, 예컨대 이소류신, 발린, 류신 또는 메티오닌의 또다른 소수성 잔기에 대한 치환, 또는 하나의 극성 잔기의 또다른 극성 잔기에 대한 치환, 예컨대 아르기닌의 라이신에 대한, 글루탐산의 아스파르트산에 대한, 또는 글루타민의 아스파라긴에 대한 치환 등; 또는 아미노산의 생물학적 활성에 큰 영향을 주지 않을 구조적으로 관련된 아미노산으로의 유사한 보존성 대체가 포함된다. 참조 분자와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖지만 단백질의 면역원성에 실질적으로 영향을 주지 않는 미미한 아미노산 치환을 갖는 단백질이 따라서 참조 폴리펩티드의 정의 내에 있다. 상기 개질에 의해 제조된 모든 폴리펩티드가 본원에 포함된다. 용어 "보존성 변이" 에는 또한 미치환된 모체 아미노산 대신 치환된 아미노산의 사용을 포함하나, 단, 치환된 폴리펩티드에 대해 발생된 항체는 또한 미치환된 폴리펩티드와 면역반응한다.
조성물 또는 백신에 대한 "면역학적 반응" 은 관심의 조성물 또는 백신에 대한 세포성 및/또는 항체-매개 면역 반응의 숙주에서의 발달이다. 통상, "면역학적 반응" 은 하나 이상의 하기 효과를 포함하나 이에 제한되지 않는다: 관심의 조성물 또는 백신에 포함되는 항원 또는 항원에 대해 특이적으로 유도되는 항체, B 세포, 조력자 T 세포, 및/또는 세포독성 T 세포의 생성. 바람직하게는, 숙주는 새로운 감염에 대한 저항성이 향상될 및/또는 질환의 임상적 심각성이 감소되는 치료적 또는 보호적 면역학적 반응을 나타낼 것이다. 이러한 보호는 감염된 숙주에 의해 통상 나타내지는 증상의 감소 또는 결핍, 감염된 숙주에서의 빠른 회복 시간 및/또는 저하된 바이러스 역가에 의해 입증될 것이다.
N 개의 뉴클레오티드 길이를 가진 게놈에 대해 가능한 바이러스 변이체의 수는 4N 개의 변이체가 가능한데, 4 개의 상이한 뉴클레오티드가 있기 때문이다. 예를 들어, 오직 300 개의 뉴클레오티드 길이인 게놈에 대해서는 10180 개의 상이한 변이체가 있다. (Martin A. Nowak and Robert McCredie May Virus Dynamics ,Oxford University Press). RNA 바이러스 집단의 게놈 서열은 공통 또는 평균 서열 주위에 군집되나, 각각의 게놈은 상이하다. 특정 돌연변이를 가진 흔치 않은 게놈이 선택 사건에서 살아남을 수 있고, 이후 돌연변이는 모든 자손 게놈에서 발견될 것이다. 준종 (quasispecies) 이론은 바이러스가 랜덤 돌연변이체의 집합이 아니라, 변이체의 상호작용하는 그룹이라는 것을 예측한다. (Vincent Racaniello 2009).
변이체는 대립형질 변이체를 포함한다. 용어 "대립형질 변이체" 는 단백질의 아미노산 서열 내 변화를 야기하고 자연 집단 (예를 들어, 바이러스 종 또는 품종) 내에 존재하는 다형현상을 함유하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 말한다. 이러한 자연적인 대립형질 변이는 전형적으로는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 내에서 1-5% 변동을 야기할 수 있다. 대립형질 변이체는 다수의 상이한 종에서 관심의 핵산 서열의 서열분석에 의해 확인될 수 있는데, 이것은 상기 종 내에서 동일한 유전자 유전자 좌를 확인하기 위한 혼성화 프로브를 사용함으로써 쉽게 수행될 수 있다. 자연적인 대립형질 변이의 결과이고 관심의 유전자의 기능적 활성을 변형시키지 않는 임의의 및 모든 이러한 핵산 변이체 및 산출되는 아미노산 다형현상 또는 변이가, 본 발명의 범주 내에 있는 것으로 의도된다.
서열과 관련하여 용어 "일치성" 은 예를 들어, 2 개의 서열의 정렬이 Wilbur and Lipman 알고리즘 (Wilbur and Lipman) 에 따라 측정될 수 있는 2 개의 서열의 짧은 뉴클레오티드 또는 아미노산의 수로 나눈 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산을 가진 위치의 수를 말할 수 있다. 2 개의 아미노산 서열의 서열 일치성 또는 서열 유사성, 또는 2 개의 뉴클레오티드 서열 사이의 서열 일치성은 Vector NTI 소프트웨어 패키지 (Invitrogen, 1600 Faraday Ave., Carlsbad, CA) 를 사용하여 측정될 수 있다. RNA 서열이 유사한 것으로 언급되는 경우, 또는 DNA 서열과 서열 일치성 또는 상동성 정도를 갖는 경우, DNA 서열 내의 티미딘 (T) 은 RNA 서열 내의 우라실 (U) 과 동일한 것으로 고려된다. 따라서, RNA 서열은, DNA 서열 내의 티미딘 (T) 은 RNA 서열 내의 우라실 (U) 과 동일한 것으로 고려됨에 의해, 본 발명의 범주 내에 있고 DNA 서열로부터 유도될 수 있다.
IBV
본 발명의 하나의 구현예는 하기 단계를 포함하는 IBV 의 균주를 특징화하는 과정 또는 방법을 제공한다: a) 동물로부터 단리된 IBV 균주로부터 IBV cDNA 를 생성하는 단계; b) 실시간 폴리머라아제 연쇄 반응 (PCR) 에서 cDNA 를 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 쌍에 노출시켜 앰플리콘을 산출하는 단계, 이때 프라이머 쌍은 IBV 게놈의 S1 유전자에 특이적임; c) 실시간 PCR 직후에 앰플리콘을 포함하는 이중-가닥 생성물에 대해 고 해상도 용융 (HRM) 곡선 분석을 수행하는 단계; 및 d) HRM 곡선을 분석 및 비교함으로써 IBV 균주를 특징화하는 단계.
정방향 및 역방향 프라이머는 공지된 IBV 균주의 S1 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열을 정렬하고 S1 유전자의 보존된 영역과 비교함으로써 선택될 수 있다. 구현예의 하나의 양상에서, 정방향 프라이머는 SEQ ID NO:29 에 언급된 폴리뉴클레오티드 서열을 갖고, 역방향 프라이머는 SEQ ID NO:30 에 언급된 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는다.
S1 유전자는 스파이크 (spiked) (S) 당단백질로서 알려져 있다. S1 서브유닛은 바이러스 중화 항체를 유도하는 혈청형-특이적 서열 및 항원 에피토프를 가진다. IBV 의 상이한 혈청형, 서브유형 또는 변이체는, 백신접종된 닭 무리에서 IB 의 발병에 책임이 있었던, S1 유전자의 뉴클레오티드 지점 돌연변이, 삽입, 결실 또는 재조합에 의해 생성되는 것으로 생각되었다 (Zhou et al. J. Vet Med. B51, 147-152, 2004). S1 당단백질의 뉴클레오티드 서열분석은 IBV 균주 간의 혈청형 차이를 측정하는데 통상 사용된다 (Kwon et al. Avian Dis. 1993).
HRM 곡선 분석은 제조사의 지침에 따라 수행될 수 있다. 예를 들어, 여러 가지 제조사가 고-해상도 DNA 용융 분석의 사용을 위한 기구를 제공한다: 예컨대 Applied Biosystems (ABI), Bio-Rad, Cepheid, Corbett, Eppendorf, Idaho Technology, Roche 및 Stratagene. 또한, 어세이를 실시하기 위해 시판되는 여러 가지 염료가 있다: 예컨대 LCGreen® (Idaho Technology Inc.), Syto9® (Invitrogen, Carlsbad, CA), EvaGreen® (Bioturn) 및 LightCycler® 480 ResoLight Dye (Roche, Indianapolis, IN) (Vossen RHAM et al. Human Mutation 30 (6), 2009).
실시간 PCR 은 하기 파라미터를 사용하여 실시할 수 있다: a) 95℃ 에서 3 초의 초기 변성, b) 95℃ 에서 1 분의 변성, c) 55℃ 에서 1 분의 어닐링, d) 72℃ 에서 1 분의 신장, 및 e) 단계 b)-d) 를 45 회 반복 후, 용융 곡선 분석 (95℃ 에서 1 초, 65℃ 에서 15 초 및 95℃ 에서 지속적으로) 및 45℃ 에서 30 초 냉각.
본 발명의 방법은 공지된 IBV 균주를 특징화하고 구별하는데 사용될 수 있다. 공지된 IBV 균주는, 제한 없이, 793/B 균주, Massachusetts 균주, QX-유사 균주, IBNC90 균주, D274 균주, Iowa 균주, Arkansas 균주, Holland 52 균주, Connecticut 46 균주, Beaudette US 균주, California 균주, Jilin 균주, Holte 균주, HK 균주, D41 균주, DE072 균주, Spain/92/35 균주, Egypt/F/03 균주 및 전세계에서 발견되는 기타 균주를 포함한다.
본 발명은 또한 IBV 서열이 가까운 상동성을 가진 하나 이상의 IBV 서열 중 임의의 것과 정렬되지 않는 IBV 의 신규한 균주의 확인을 제공한다. 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: a) 동물로부터 단리된 IBV 균주로부터 IBV cDNA 를 생성하는 단계; b) 실시간 폴리머라아제 연쇄 반응 (PCR) 에서 cDNA 를 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 쌍에 노출시켜 앰플리콘을 산출하는 단계, 이때 프라이머 쌍은 IBV 게놈의 S1 유전자에 특이적임; c) 실시간 PCR 직후에 앰플리콘을 포함하는 이중-가닥 생성물에 대해 고 해상도 용융 (HRM) 곡선 분석을 수행하는 단계; d) HRM 곡선을 분석 및 비교하는 단계; 및 e) 신규한 IBV 균주를 확인하는 단계. HRM 곡선 분석에 의해 확인된 신규한 IBV 균주는 따라서 앰플리콘을 서열분석하고 IBV 앰플리콘 서열을 공지된 IBV 서열과 정렬시킴으로써 추가로 특징화될 수 있다. 신규한 IBV 균주는 임의의 공지된 IBV 서열과 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 서열 일치성을 가질 수 있다. 서열은 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열 (앰플리콘 서열의 번역) 일 수 있다.
방법 구현예의 또다른 양상은 감염된 및 백신접종된 (DIVA) 동물을 구별하기 위한 수단을 제공한다. 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: a) 동물로부터 단리된 IBV 균주로부터 IBV cDNA 를 생성하는 단계; b) 실시간 폴리머라아제 연쇄 반응 (PCR) 에서 cDNA 를 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 쌍에 노출시켜 앰플리콘을 산출하는 단계, 이때 프라이머 쌍은 IBV 게놈의 S1 유전자에 특이적임; c) 실시간 PCR 직후에 앰플리콘을 포함하는 이중-가닥 생성물에 대해 고 해상도 용융 (HRM) 곡선 분석을 수행하는 단계; 및 d) HRM 곡선을 분석 및 비교함으로써 cDNA 가 백신-유형 균주 또는 동물을 감염시킨 균주로부터 유도되는 지의 여부를 측정하는 단계.
본 발명의 하나의 구현예는 SEQ ID NO:29 또는 SEQ ID NO:30 에 언급된 서열을 갖는 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 프라이머를 제공한다.
본 발명의 또다른 구현예는 하기를 포함하는 IBV 균주를 검출하기 위한 키트를 제공한다: a) SEQ ID NO: 29 에 언급된 서열을 갖는 정방향 프라이머 및 SEQ ID NO:30 에 언급된 서열을 갖는 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 쌍; 및 b) 실시간 PCR 을 수행하기 위한 파라미터 및 조건을 기술하는 지침.
CSFV
본 발명의 하나의 구현예는 하기 단계를 포함하는 CSFV 의 균주를 특징화하는 과정 또는 방법을 제공한다: a) 동물로부터 단리된 CSFV 균주로부터 CSFV cDNA 를 생성하는 단계; b) 실시간 폴리머라아제 연쇄 반응 (PCR) 에서 cDNA 를 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 쌍에 노출시켜 앰플리콘을 산출하는 단계, 이때 프라이머 쌍은 CSFV 게놈의 NS5B 또는 3'NTR 영역에 특이적임; c) 실시간 PCR 직후에 앰플리콘을 포함하는 이중-가닥 생성물에 대해 고 해상도 용융 (HRM) 곡선 분석을 수행하는 단계; 및 d) HRM 곡선을 분석 및 비교함으로써 CSFV 균주를 특징화하는 단계.
정방향 및 역방향 프라이머는 공지된 CSFV 균주의 NS5B 또는 3'NTR 영역의 폴리뉴클레오티드 서열을 정렬하고 NS5B 또는 3'NTR 영역의 보존된 영역과 비교함으로써 선택될 수 있다. 구현예의 하나의 양상에서, 정방향 프라이머는 SEQ ID NO:8 에 언급된 폴리뉴클레오티드 서열을 갖고, 역방향 프라이머는 SEQ ID NO:9 에 언급된 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는다.
NS5B 는 RNA-의존성 RNA 폴리머라아제 유전자이다. 3'NTR 영역은 바이러스 게놈의 3' 비번역된 영역이다. 이전의 연구에서 (Pan et al., J Vet Diag Inv, 2008) CSFV 의 야생형에 부재하는 CSFV 의 백신-유형의 3' NTR 내의 두드러진 T-풍부 삽입 부위가 두 유전자를 야생형 및 백신 균주 사이의 구별을 위한 적합한 유전적 마커로 만든다는 것이 제시되었다.
HRM 곡선 분석은 제조사의 지침에 따라 수행될 수 있다.
실시간 PCR 은 하기 파라미터를 사용하여 실시할 수 있다: a) 95℃ 에서 3 초의 초기 변성, b) 95℃ 에서 1 분의 변성, c) 55℃ 에서 1 분의 어닐링, d) 72℃ 에서 1 분의 신장, 및 e) 단계 b)-d) 를 45 회 반복 후, 용융 곡선 분석 (95℃ 에서 1 초, 65℃ 에서 15 초 및 95℃ 에서 지속적으로) 및 45℃ 에서 30 초 냉각.
본 발명의 방법은 공지된 CSFV 균주를 특징화하고 구별하는데 사용될 수 있다. 공지된 CSFV 균주는, 제한 없이, ALD 균주, Chinese 균주 (C 균주), GPE 균주 (Japanese 균주), C/HVRI 균주 (중국 유래, 유전자형 1.1), Riems 균주 (중국 유래), Alfort 187 균주, Ames 균주, Margarita 균주, Baker 균주, New York 균주, Purdue 115 균주, Paderborn 균주, Spreda 균주, Oregon 균주, Singer 균주, Osloss 균주, Moredun strai, Frijters 균주 및 문헌에서 발견될 수 있는 기타 균주를 포함한다.
본 발명은 또한 CSFV 서열이 가까운 상동성을 가진 하나 이상의 CSFV 서열 중 임의의 것과 정렬되지 않는 CSFV 의 신규한 균주의 확인을 제공한다. 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: a) 동물로부터 단리된 CSFV 균주로부터 CSFV cDNA 를 생성하는 단계; b) 실시간 폴리머라아제 연쇄 반응 (PCR) 에서 cDNA 를 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 쌍에 노출시켜 앰플리콘을 산출하는 단계, 이때 프라이머 쌍은 CSFV 게놈의 NS5B 또는 3'NTR 영역에 특이적임; c) 실시간 PCR 직후에 앰플리콘을 포함하는 이중-가닥 생성물에 대해 고 해상도 용융 (HRM) 곡선 분석을 수행하는 단계; d) HRM 곡선을 분석 및 비교하는 단계; 및 e) 신규한 CSFV 균주를 확인하는 단계. HRM 곡선 분석에 의해 확인된 신규한 CSFV 균주는 따라서 앰플리콘을 서열분석하고 CSFV 앰플리콘 서열을 공지된 CSFV 서열과 정렬시킴으로써 추가로 특징화될 수 있다. 신규한 CSFV 균주는 임의의 공지된 CSFV 서열과 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 서열 일치성을 가질 수 있다. 서열은 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열 (앰플리콘 서열의 번역) 일 수 있다.
방법 구현예의 또다른 양상은 감염된 및 백신접종된 (DIVA) 동물을 구별하기 위한 수단을 제공한다. 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: a) 동물로부터 단리된 CSFV 균주로부터 CSFV cDNA 를 생성하는 단계; b) 실시간 폴리머라아제 연쇄 반응 (PCR) 에서 cDNA 를 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 쌍에 노출시켜 앰플리콘을 산출하는 단계, 이때 프라이머 쌍은 CSFV 게놈의 NS5B 또는 3'NTR 영역에 특이적임; c) 실시간 PCR 직후에 앰플리콘을 포함하는 이중-가닥 생성물에 대해 고 해상도 용융 (HRM) 곡선 분석을 수행하는 단계; 및 d) HRM 곡선을 분석 및 비교함으로써 cDNA 가 백신 균주 또는 동물을 감염시킨 균주로부터 유도되는 지의 여부를 측정하는 단계.
본 발명의 하나의 구현예는 SEQ ID NO:8 또는 SEQ ID NO:9 에 언급된 서열을 갖는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명의 또다른 구현예는 하기를 포함하는 CSFV 균주를 검출하기 위한 키트를 제공한다: a) SEQ ID NO:8 에 언급된 서열을 갖는 정방향 프라이머 및 SEQ ID NO:9 에 언급된 서열을 갖는 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 쌍; 및 b) 실시간 PCR 을 수행하기 위한 파라미터 및 조건을 기술하는 지침.
NDV
본 발명의 하나의 구현예는 하기 단계를 포함하는 NDV 의 균주를 특징화하는 과정 또는 방법을 제공한다: a) 동물로부터 단리된 NDV 균주로부터 NDV cDNA 를 생성하는 단계; b) 실시간 폴리머라아제 연쇄 반응 (PCR) 에서 cDNA 를 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 쌍에 노출시켜 앰플리콘을 산출하는 단계, 이때 프라이머 쌍은 NDV 게놈의 F, NP, P, M, HN 또는 L 유전자에 특이적임; c) 실시간 PCR 직후에 앰플리콘을 포함하는 이중-가닥 생성물에 대해 고 해상도 용융 (HRM) 곡선 분석을 수행하는 단계; 및 d) HRM 곡선을 분석 및 비교함으로써 NDV 균주를 특징화하는 단계.
정방향 및 역방향 프라이머는 공지된 NDV 균주의 F 유전자, 또는 NP 유전자, 또는 P 유전자, 또는 M 유전자, 또는 HN 유전자, 또는 L 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열을 각각 정렬시키고, F 유전자, 또는 NP 유전자, 또는 P 유전자, 또는 M 유전자, 또는 HN 유전자, 또는 L 유전자의 보존된 영역을 비교함으로써 선택될 수 있다. 구현예의 하나의 양상에서, 정방향 프라이머는 SEQ ID NO:17 또는 31 에서 언급된 바와 같은 폴리뉴클레오티드 서열을 갖고, 역방향 프라이머는 SEQ ID NO:18 또는 32 에서 언급된 바와 같은 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는다.
융합 (F) 단백질은 바이러스 외피와 세포막의 융합을 매개하는 것을 담당하고, 헤마글루티닌-뉴라미니다아제 (HN) 단백질은 세포 부착 및 방출에 관여한다 (Phillips, et al., Arch. Virol, 143:1993-2002, 1998; Tan et al., Arch. Virol, 155:63-70, 2010). NDV 균주는, 고도로 치명적인 (맹독형), 중간인 (중간독형) 또는 비치명적인 (약독형) 3 가지 유전자형으로 분류된다. 종래에, NDV 유전자형은 서열분석 및 아미노산 서열 분석에 의해 가장 흔히 구별된다. 맹독형 및 중간독형 균주의 F 단백질 분할 부위의 공통 서열은 112(R/K)RQ(R/K)RF117 이고; 약독형 F 분할 부위의 공통 서열은 112(G/E)(K/R)Q(G/E)RL117 이다. 최근에 발견된 F 분할 부위의 위치 114 에서 글루타민의 염기성 잔기 아르기닌 (R) 으로의 변화가 바이러스 복제를 감소시키고 바이러스 병원성을 약독화시켰다는 문헌이 있다 (Samal S et al. J. Gen. Virol. 2011). 논문에는 또한 병원성은 위치 118 에서의 이소류신 (I) 을 발린으로 치환하였을 때 추가로 감소되었다고 보고하였다.
HRM 곡선 분석은 제조사의 지침에 따라 수행될 수 있다.
실시간 PCR 은 하기 파라미터를 사용하여 실시할 수 있다: a) 95℃ 에서 3 초의 초기 변성, b) 95℃ 에서 1 분의 변성, c) 60℃ 에서 1 분의 어닐링, d) 72℃ 에서 1 분의 신장, 및 e) 단계 b)-d) 를 45 회 반복 후, 용융 곡선 분석 (95℃ 에서 1 초, 65℃ 에서 15 초 및 95℃ 에서 지속적으로) 및 45℃ 에서 30 초 냉각.
본 발명의 방법은 공지된 NDV 균주를 특징화하고 구별하는데 사용될 수 있다. 공지된 NDV 균주는, 제한 없이, Avinew 균주, LaSota 균주, MVP-Mukteswar 균주, ND-B1 균주, Korea Dalguban 균주, Herts 33 균주, Essex'70 균주, 135/93 균주, 617/83 균주, 34/90 균주, Beaudette C 균주, D26 균주, MC110 균주, 1154/98 균주 및 문헌에서 공개될 수 있는 기타 균주를 포함한다.
본 발명은 또한 NDV 서열이 가까운 상동성을 가진 하나 이상의 NDV 서열 중 임의의 것과 정렬되지 않는 NDV 의 신규한 균주의 확인을 제공한다. 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: a) 동물로부터 단리된 NDV 균주로부터 NDV cDNA 를 생성하는 단계; b) 실시간 폴리머라아제 연쇄 반응 (PCR) 에서 cDNA 를 정방향 및 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 쌍에 노출시켜 앰플리콘을 산출하는 단계, 이때 프라이머 쌍은 NDV 게놈의 F, NP, P, M, HN 또는 L 유전자에 특이적임; c) 실시간 PCR 직후에 앰플리콘을 포함하는 이중-가닥 생성물에 대해 고 해상도 용융 (HRM) 곡선 분석을 수행하는 단계; d) HRM 곡선을 분석 및 비교하는 단계; 및 e) 신규한 NDV 균주를 확인하는 단계. HRM 곡선 분석에 의해 확인된 신규한 NDV 균주는 따라서 앰플리콘을 서열분석하고 NDV 앰플리콘 서열을 공지된 NDV 서열과 정렬시킴으로써 추가로 특징화될 수 있다. 신규한 NDV 균주는 임의의 공지된 NDV 서열과 50% 미만, 60% 미만, 70% 미만, 75% 미만, 80% 미만, 85% 미만, 90% 미만, 91% 미만, 92% 미만, 93% 미만, 94% 미만, 95% 미만, 96% 미만, 97% 미만, 98% 미만, 또는 99% 미만의 서열 일치성을 가질 수 있다. 서열은 뉴클레오티드 서열일 수 있다. 서열은 또한 아미노산 서열 (앰플리콘 서열의 번역) 일 수 있다.
방법 구현예의 또다른 양상은 감염된 및 백신접종된 (DIVA) 동물을 구별하기 위한 수단을 제공한다. 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: a) 동물로부터 단리된 NDV 균주로부터 NDV cDNA 를 생성하는 단계; b) 실시간 폴리머라아제 연쇄 반응 (PCR) 에서 cDNA 를 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 쌍에 노출시켜 앰플리콘을 산출하는 단계, 이때 프라이머 쌍은 NDV 게놈의 F, NP, P, M, HN 또는 L 유전자에 특이적임; c) 실시간 PCR 직후에 앰플리콘을 포함하는 이중-가닥 생성물에 대해 고 해상도 용융 (HRM) 곡선 분석을 수행하는 단계; 및 d) HRM 곡선을 분석 및 비교함으로써 cDNA 가 백신 균주 또는 동물을 감염시킨 균주로부터 유도되는 지의 여부를 측정하는 단계.
본 발명의 하나의 구현예는 SEQ ID NO:17, 18, 31 또는 32 에 언급된 서열을 갖는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명의 또다른 구현예는 하기를 포함하는 NDV 균주를 검출하기 위한 키트를 제공한다: a) SEQ ID NO:17 에 언급된 서열을 갖는 정방향 프라이머 및 SEQ ID NO:18 에 언급된 서열을 갖는 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 쌍; 또는 SEQ ID NO:31 에 언급된 서열을 갖는 정방향 프라이머 및 SEQ ID NO:32 에 언급된 서열을 갖는 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 쌍; 및 b) 실시간 PCR 을 수행하기 위한 파라미터 및 조건을 기술하는 지침.
면역원성 조성물 및 백신
본 발명은 또한 IBV, CSFV 또는 NDV 의 신규한 균주를 단리하는 것을 제공한다. 신규한 바이러스를 단리하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다 (참조, 예를 들어, protocols in Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, 1991, John Wiley and Sons, New York; Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory manual, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.).
따라서, 본 발명은 신규 IBV, CSFV 또는 NDV 를 포함하는 면역원성 조성물 또는 백신을 추가로 이해한다. 본 발명에 따른 면역원성 조성물 또는 백신은 바이러스 배양물 또는 제제 (예를 들어, 불활성화된 또는 약독화된), 또는 바이러스의 항원 또는 면역원을 포함할 수 있다. 본 발명의 면역원성 조성물 또는 백신은 하나 이상의 약학적으로 또는 수의학적으로 허용가능한 담체, 비히클, 아주반트, 또는 부형제를 추가로 포함할 수 있다.
약학적으로 또는 수의학적으로 허용가능한 담체, 비히클, 아주반트, 또는 부형제는 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 약학적으로 또는 수의학적으로 허용가능한 담체, 비히클, 아주반트, 또는 부형제는 0.9% NaCl (예를 들어, 식염수) 용액 또는 인산염 완충액일 수 있다. 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 기타 약학적으로 또는 수의학적으로 허용가능한 담체, 비히클, 아주반트, 또는 부형제에는 폴리-(L-글루타메이트) 또는 폴리비닐피롤리돈이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 약학적으로 또는 수의학적으로 허용가능한 담체, 비히클, 아주반트, 또는 부형제는 벡터 (또는 시험관 내에서 본 발명의 벡터로부터 발현되는 단백질) 의 투여를 용이하게 하는 임의의 화합물 또는 화합물의 조합일 수 있다; 유리하게는, 담체, 비히클, 아주반트, 또는 부형제는 트랜스펙션을 용이하게 하고/거나 벡터 (또는 단백질) 의 보존을 개선할 수 있다. 투여량 및 투여 부피는 일반적 설명에서 본원에 논의되고, 또한 임의의 과도한 실험 없이, 당업자의 지식과 연관하여 본 명세서로부터 당업자에 의해 결정될 수 있다.
약학적으로 또는 수의학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 비히클 또는 아주반트는 유중수 에멀젼일 수 있다. 적합한 유중수 에멀젼의 예는 6 내지 50 v/v% 의 항원-함유 수성 상, 바람직하게는 12 내지 25 v/v%, 50 내지 94 v/v% 의, 전체적으로 또는 부분적으로 비-대사가능한 오일 (예를 들어, 광유 예컨대 파라핀 오일) 및/또는 대사가능한 오일 (예를 들어, 식물성 오일, 또는 지방산, 폴리올 또는 알코올 에스테르) 을 함유하는 오일 상, 0.2 내지 20 p/v% 의 계면활성제, 바람직하게는 3 내지 8 p/v% 의 계면활성제 (이는 전체적으로 또는 부분적으로, 또는 폴리글리세롤 에스테르와의 혼합물임, 상기 폴리글리세롤 에스테르는 바람직하게는 폴리글리세롤 (폴리)리시놀레에이트, 또는 폴리옥시에틸렌 리신 오일 또는 그 밖의 수소첨가된 폴리옥시에틸렌 리신 오일임) 를 포함하는 4℃ 에서 안정하고 유체인 오일-기재 유중수 백신 에멀젼을 포함한다. 유중수 에멀젼에 사용될 수 있는 계면활성제의 예는 에톡시화 소르비탄 에스테르 (예를 들어, 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노올레에이트 (TWEEN 80®), AppliChem, Inc., Cheshire, CT 에서 이용가능) 및 소르비탄 에스테르 (예를 들어, 소르비탄 모노올레에이트 (SPAN 80®), Sigma Aldrich, St. Louis, MO 에서 이용가능) 를 포함한다. 또한, 유중수 에멀젼과 관련하여, 또한 미국 특허 번호 6,919,084, 예를 들어, 실시예 8 을 참조한다. 일부 구현예에서, 항원-함유 수성 상은 하나 이상의 완충제를 포함하는 식염수를 포함한다. 적합한 완충 용액의 예는 인산염 완충 식염수이다. 하나의 구현예에서, 유중수 에멀젼은 수/유/수 (W/O/W) 삼중 에멀젼 (미국 특허 번호 6,358,500) 일 수 있다. 기타 적합한 에멀젼의 예는 미국 특허 번호 7,371,395 에 기재되어 있다.
본 발명에 따른 면역학적 조성물 및 백신은 하나 이상의 약학적으로 또는 수의학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 비히클 또는 아쥬반트를 포함하거나 이것으로 본질적으로 이루어질 수 있다. 본 발명의 실시에 사용하기 위한 적합한 담체 또는 아쥬반트는 (1) 아크릴 또는 메타크릴산의 중합체, 말레 무수물 및 알케닐 유도체 중합체, (2) 면역자극 서열 (ISS), 예컨대 하나 이상의 비-메틸화된 CpG 단위를 갖는 올리고데옥시리보뉴클레오티드 서열 (Klinman et al., 1996; WO98/16247), (3) 수중유 에멀젼, 예컨대 "Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach" 출판: M. Powell, M. Newman, Plenum Press 1995 의 페이지 147 에 기재된 SPT 에멀젼, 및 동일한 문헌의 페이지 183 에 기재된 에멀젼 MF59, (4) 4 차 암모늄 염, 예를 들어, DDA 를 함유하는 양이온성 지질, (5) 사이토카인, (6) 수산화알루미늄 또는 알루미늄 포스페이트, (7) 사포닌 또는 (8) 본 출원 내에 참조로서 인용되고 도입된 임의의 문헌에서 논의된 기타 아쥬반트, 또는 (9) 이의 임의의 조합 또는 혼합물이다.
이제 본 발명은 하기 비-제한적인 실시예에 의해 추가로 설명될 것이다.
실시예
J. Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989) 에 의해 기재된 표준 분자 생물학 기법이 실험에 사용되었다.
실시예 1 IBV 의 HRM 분석
상이한 농장 및 지역으로부터 총 56 개의 샘플을 2011 년 정규 IBV 진단을 위해 Vet Food Agro Diagnostics (M) Sdn. Bhd. 로 제출하였다. 수취된 기관 샘플은 폐, 신장, 맹장 편도선, 기관지 및 모집된 기관의 범위에 이르렀다. 상기 샘플은 IB 바이러스를 가지고 있는 것으로 의심되었고, 특정화된 바이러스의 검출 및 확인을 위해 송부되었다. 모든 상기 샘플을 균질화하고, 본 연구에서 역전사효소 PCR 및 실시간 PCR 에 의해 시험하였다.
핵산 추출을 표준 제조사 프로토콜에 따라 Trizol LS 시약 (Invitrogen, USA) 을 사용하여 실시하였다.
Mass 및 793/B 의 검출을 위한 다중 역전사효소 (RT) PCR
이전에 기재된 방법 (Cavanagh et al., Avian Pathology, 28:593-605, 1999) 으로부터 S1 유전자 서열에 근거한 다중을 2 가지 유형의 IBV: 793/B 및 Massachusetts 의 검출 및 구별을 위해 사용하였다. 올리고뉴클레오티드 (프라이머) 서열은 다음과 같았다: XCE2-a: CTCTATAAACACCCTTACA (SEQ ID NO:1); XCE2-b: CACTGGTAATTTTTCAGATGG (SEQ ID NO:2) (RT PCR 단계); XCE3-: CAGATTGCTTACAACCACC (SEQ ID NO:3); BCE1+: AGTAGTTTTGTGTATAAACCA (SEQ ID NO:4); DCE1+: ATACAATTATATCAAACCAGC (SEQ ID NO:5); MCE1+: AATACTACTTTTACGTTACAC (SEQ ID NO:6) (네스티드 (Nested) 단계) (Adzhar et al., Avian Pathology, 25:817-836, 1996; Cavanagh et al., Avian Pathology, 28:593-605,1999). 반응 조건은 45℃ 에서 1 시간, 72℃ 에서 10 분의 역전사효소 단계 후, 94℃ 에서 5 분의 초기 변성 단계였다. 증폭 단계는 94℃ 에서 1 분, 50℃ 에서 1.5 분, 72℃ 에서 2 분을 30 회 반복하였고, 그 후 72℃ 에서 2 분의 최종 신장이 이어졌다. 네스테드 단계는 하기 조건으로 실행되었다: 94℃ 에서 5 분의 초기 변성, 94℃ 에서 1 분, 50℃ 에서 1.5 분 및 72℃ 에서 2 분의, 총 30 회 동안의 증폭, 이후 72℃ 에서 10 분의 최종 신장 및 4℃ 에서의 유지.
IB-QX 의 검출을 위한 1-단계 RT-qPCR
실시간 PCR 을 10μL 의 반응 부피의 SensiFAST SYBR 그린 마스터 믹스, 0.8μL 의 20 pmol 정방향 프라이머 (CTTATGCAGTAGTCAA) (SEQ ID NO:29) 및 역방향 프라이머 (CACGTGGAATCATGCCTGTTAT) (SEQ ID NO:30), 0.2μL 의 역전사효소, 0.4μL 의 RNAse 억제제, 4μL 의 템플레이트 및 3.8μL 의 ddH20 로 실시하였다. 실시간 PCR 반응을 LightCycler 480 실시간 PCR 기구 (Roche, Germany) 에서 실시하였다. 반응 조건은 45℃ 에서 10 분의 역전사효소 단계 후, 94℃ 에서 2 분의 초기 변성 단계였다. 증폭 단계는 94℃ 에서 5 초, 50℃ 에서 10 초 및 72℃ 에서 5 초의 신장이었다. 용융 곡선 분석 프로파일은 95℃ 에서 3 초, 58℃ 에서 1 분 및 95℃ 로 지속 후, 45℃ 에서 30 초의 냉각이었다.
IBN-C90 및 IB-QX 를 차별화하기 위한 HRM 어세이
어세이는 IB 의 S1 유전자의 과-가변 영역을 증폭시키는 상기 기재된 바와 같은 동일한 프라이머 쌍 (SEQ ID NO:29 및 SEQ ID NO:30) 을 사용함으로써 성립되었다. 어세이는 1μL 의 고도로 포화된 형광 염료 (EvaGreen), 12.5μl 마스터 믹스 (Sensimix, Bioline), 2μL 의 25mM MgCl2, 0.5μL 의 프라이머 쌍, 템플레이트 및 PCR 등급 물로 이루어졌다. 샘플을 384-웰 마이크로웰 플레이트 내에 로딩하고 실시간 PCR 기계 (LightCycler 480, Roche) 중의 PCR 증폭에 적용하였다. 열 사이클링 반응은 초기 변성 (3 초, 95℃) 으로 이루어졌다. 증폭은 변성 (1 분, 95℃), 어닐링 (1 분, 48℃) 및 신장 (1 분, 72℃) 으로 이루어졌다. PCR 이후에 고 해상도 용융 곡선 분석을 즉시 후속하였다. 샘플의 구별은 공지된 양성 대조군을 사용하고 이들의 용융 프로파일을 비교함으로써 달성되었다.
입증
RT 실시간 PCR 의 민감성
참조 재료의 모든 농도를 UV Spectrophotometer 에 의해 측정하였다. 농도를 10pg/μl 로 표준화시켰다. 어세이가 더이상 표적 유기체를 검출할 수 없을 때까지 (검출 신호 없음) 최종-지점 희석 (10 배 연속 희석) 을 사용하였다.
특이성
시험의 특이성을 5 개의 기타 유기체 (IBV 793/B, IBV Mass, IBD, NDV, CAV, Reovirus) 에 대해 시험 및 프로토콜에 의해 수행하였다.
서열분석
서열분석 (직접 서열분석) 을 위한 샘플을 상업적 서열분석 설비로 송부하였다. PCR 클린 업 (clean up) 및 젤 정제를 제조사의 프로토콜 (Analytik Jena, Germany) 에 기반하여 실시하였다. 수득된 결과를 참조 재료의 확인을 위해 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) 에 의해 분석하였다.
결과
시험된 56 개 중 15 개 (26.8%) 의 샘플은 793/B 균주에 대해 양성이었고, 56 개 중 9 개 (16%) 가 Massachusetts 균주에 대해 양성이었고; 56 개 중 32 개 (57%) 가 QX-유사 균주에 대해 양성이었고; IB 에 대해 음성으로서 이전에 보고되었던 56 개 경우 중 18 개 (32%) 가 재시험하였을 때 IB-QX 에 대해 양성인 것으로 밝혀졌다.
IB-QX 의 특이적 검출을 위한 실시간 PCR 어세이의 입증
민감성
도 2 는 10 ng/μL 의 초기 농도로의 어세이의 민감성을 예증한다. 최종 희석 수준에서 18.48 에서 유도된 역치에 근거하여, 시험이 매우 민감하며, 100ag 정도의 낮은 농도에서도 바이러스를 검출할 수 있을 것이라고 추정된다.
증폭 곡선 - IB-QX (특이성)
어세이의 특이성을 IB-Massachusetts, IB-793/B, NDV, IBV 및 Avian PneumoVirus (APV) 와 같은 기타 가깝게 관련된 유기체로 시험하였다. 도 3 은 특이성 어세이로부터 유도된 증폭 곡선을 예증한다.
용융 피크 (Tm) - IB-QX (특이성)
어세이의 특이성을 IB-Massachusetts, IB-793/B, NDV, IBV 및 APV 와 같은 기타 가깝게 관련된 유기체로 시험하였다. 도 4 는 특이성 어세이로부터 유도된 용융 피크를 예증한다.
서열분석에 의한 확인
IB-QX 균주의 S1 유전자를 나타내는 PCR 생성물을 서열분석하고 서열을 도 5 (SEQ ID NO:7) 에 제시한다. 서열을 GenBank 데이터베이스 (NCBI) 에 대한 BLAST 에 사용하였다. BLAST 분석에 의해 측정된 바와 같은 블라스트 결과의 스크린 샷 및 표에 작성된 뉴클레오티드 서열 점수가 도 5 에 제시된다. BLAST 분석으로 PCR 분석으로부터 수득된 용융 피크 및 밴드가 IB-QX 인 것을 확인한다.
이전에 보고된 신장병원성 IB (MH5365/95) 와 Genbank 에서의 서열의 비교를 수행하였고, BLAST 분석에 의해 측정된 바와 같은 블라스트 결과의 스크린 샷 및 표에 작성된 뉴클레오티드 서열 점수가 도 6 에 제시된다. BLAST 분석으로 1995 년에 단리된 신장병원성 균주가 태국에서 발견된 최근의 IB 균주와 가깝게 연관되어 있다는 것을 확인한다. 도 7 은 말레이시아에서 이전에 단리된 IB 경우 (MH5365/95 및 v9/04) 에 대해 7 개의 가깝게 연관된 서열의 서열 일치성 매트릭스를 보여준다.
도 8 은 IB-QX, IBnC90, Mass 및 793/B 를 비교하기 위한 HRM 분석을 예증한다. 도 9 는 IB-QX 및 IBnC90 을 비교/검출하기 위한 HRM 분석을 묘사한다.
IB-QX 는 보유된 보관된 샘플로부터 성공적으로 검출되었다. 시험된 26.8% 샘플은 변이체 균주 - 793/B 균주에 대해 양성이었고, 16% 는 고전적 IB - Massachusetts 에 대해 양성이었던 반면; 시험된 57% 는 2004 이래로 유행 중인 신규한 QX-유사 균주에 대해 양성이었다. IB 에 대해 음성으로서 이전에 보고되었던 56 개 경우 중 18 개 (32%) 가 재시험하였을 때 IB-QX 에 대해 양성인 것으로 밝혀졌다. QX 균주에 대한 대조군의 결핍 및 검출 방법의 결핍으로 인해, 2011 IB 경우 중 일부는 음성으로 거짓으로 보고되었다. 여기서부터 비롯되어, 방법은 IB-QX 를 정확하게 검출하기 위해 이전에 공개된 논문 (H. J. Geerligs et al., Avian Pathology, 40(1):93-102, 2011) 으로부터 성공적으로 변형되었다. 변화는 3 시간의 통상의 PCR 로부터 100ag/μl 정도로 적은 핵산을 검출할 수 있을 54 분 실시간 PCR 어세이로 방법을 변형하는 것으로 만들어졌다. 그러나, 방법이 고도로 민감하고 특이적일지라도, 신규한 QX 검출 어세이가 가금류 시편에 존재할 수 있는 다른 균주를 검출할 수 없고, IB 균주의 여러 개의 상이한 유형을 동시에 검출할 수 없을 것이므로 이에 제한이 있다는 것으로 예상된다.
결과가 보여주듯이, 유전자 스캐닝 소프트웨어를 사용하는 고 해상도 용융 어세이 (HRM) 는 도 8 에서 제시되는 바와 같이 4 균주 (793/B, Mass, QX 및 IBnC90) 를 동시에 검출하기 위한 S1 유전자의 과가변 영역에 근거한 단일 뉴클레오티드 차이를 구별할 수 있다. 2 가지 균주 (QX 및 IBnC90) 를 비교하기 하기 위한 어세이를 수행하는 가능성은 또한 도 9 에 제시된다.
실시예 2 CSFV 의 HRM 분석
본 연구에서, 다양한 야생형 및 백신-유형 CSFV 균주가 사용되었다. 야생형 균주는 LBK 로서 라벨링된 보관된 보유된 샘플 및 VRI (LBK 바이러스로 접종된 돼지-돼지로부터 유도됨) 로서 라벨링된 보관된 보유된 샘플을 포함하였다. 백신 유형 균주는 Pestiffa (생 백신 - C 균주), MVP (생 백신 - GPE 균주), QYHC (생 백신), ZBC (생 백신), YST (생 백신), YSC (생 백신) 를 포함하였다.
역전사효소 단계
CSF 의 상보적 DNA 를 생성하기 위한 역전사효소 단계를 하기와 같이 실시하였다: 어세이는 라피나지드 CSFV 백신 균주에 독특한 T-풍부 삽입 부위를 포함하는 CSFV 서열의 NS5B 및 3'NTR 영역을 증폭시키는 프라이머 세트를 사용함으로써 성립되었다. 프라이머 세트는 하기와 같다: 정방향 프라이머 5'-GTAGCAAGACTGGRAAYAGGTA-3' (SEQ ID NO:8) (Y=C 또는 T, R=A 또는 G) 및 역방향 프라이머 5'-AAAGTGCTGTTAAAAATGAGTG-3' (SEQ ID NO:9) (Pan et al., 2008). 실시간 PCR 혼합물은 10μl 의 SYBR 그린 마스터 믹스 (Bioline), 1.6μL 의 각각의 프라이머 세트 (10μM), 0.2ul 의 역전사효소, 0.4μL 의 RNAse 억제제 및 반응 당 20μl 의 최종 부피를 만들기 위한 3.8μL 의 PCR 등급 물로 이루어졌다. PCR 혼합물을 LC480 Real Time PCR 기구 (LC 480, Roche) 의 384-웰 마이크로플레이트 내의 실시간 PCR 증폭에 적용하였다.
이의 유전자형을 구별하기 위한 CSFV 의 HRM 곡선 분석
샘플을 HRM 어세이에 적용하였다. 어세이는 1 μL 의 고도로 포화된 형광 염료 (EvaGreen), 12.5μL 의 HRM 마스터 믹스 (Sensimix Bioline), 2μL 의 25mM MgCl2, 1μL 의 프라이머 쌍 (5μM), 2μL 의 템플레이트 및 PCR 등급 물로 이루어졌다. 역전사효소 단계에 사용되는 동일한 프라이머 쌍 (SEQ ID NO:8 및 SEQ ID NO:9) 을 HRM 어세이에 사용하였다. 프라이머 쌍의 독특성은 이것이 야생형 균주에 대해 367 bp 및 백신-유형 균주에 대해 379 bp 의 앰플리콘 크기를 생성하여 야생형과 백신-유형 균주를 정확하게 구별해내는 것을 매우 명백하게 할 것이라는 점이다. 샘플을 384-웰 마이크로웰 플레이트 내에 로딩하고 실시간 PCR 기계 (LightCycler 480, Roche) 중의 PCR 증폭에 적용하였다. 열 사이클링 반응은 초기 변성 (3 초, 95℃) 으로 이루어졌다. 증폭은 변성 (1 분, 95℃), 어닐링 (1 분, 55℃) 및 신장 (1 분, 72℃) 으로 이루어졌다. PCR 이후에 고 해상도 용융 곡선 분석을 즉시 후속하였다. 유전자형의 구별은 공지된 양성 대조군을 사용하고 이들의 용융 프로파일을 비교함으로써 달성되었다.
뉴클레오티드 서열 분석
서열 어셈블리 및 뉴클레오티드 서열 분석을 다중 서열 정렬을 위한 ClustalX/W 및 Bioedit 7.0 (서열 정렬 Editor version 7.0.5.2, Tom Hall, US) 과 같은 다양한 Bioinformatics 소프트웨어를 사용하여 수행하였다. 모든 서열을 Genbank 데이터베이스 (NCBI) 에 대한 BLAST 분석 (blastn) 에 적용하였다.
LBK 서열 (SEQ ID NO:10) 및 블라스트 결과를 도 10 에 제시한다. PCR 로 367bp PCR 생성물을 생성하였다. LBK 의 서열분석 및 블라스트 결과로 LBK 가 야생형 ALD 균주인 것을 확인하였다.
VRI 서열 (SEQ ID NO:11) 및 블라스트 결과는 도 11 에 제시된다. PCR 로 367bp PCR 생성물을 생성하였다. VRI 의 서열분석 및 블라스트 결과로 VRI 이 야생형 ALD 균주인 것을 확인하였다.
Pestiffa 서열 (SEQ ID NO:12) 및 블라스트 결과는 도 12 에 제시된다. PCR 로 379bp PCR 생성물을 생성하였다. Pestiffa 의 서열분석 및 블라스트 결과로 이것이 백신 균주, "Chinese" 균주 (C 균주) 에 속한다는 것을 확인하였다.
MVP 서열 (SEQ ID NO:13) 및 블라스트 결과는 도 13 에 제시된다. PCR 로 379bp PCR 생성물을 생성하였다. MVP 의 서열분석 및 블라스트 결과로 이것이 백신 균주 GPE, Japanese 균주에 속한다는 것을 확인하였다.
QYHC 서열 (SEQ ID NO:14) 및 블라스트 결과는 도 14 에 제시된다. PCR 로 379bp PCR 생성물을 생성하였다. QYHC 의 서열분석 및 블라스트 결과로 이것이 백신 균주 C/HVRI, 중국 유래, 유전자형 1.1 에 속한다는 것을 확인하였다.
ZBC 서열 (SEQ ID NO:15) 및 블라스트 결과는 도 15 에 제시된다. PCR 로 379bp PCR 생성물을 생성하였다. ZBC 의 서열분석 및 블라스트 결과로 이것이 백신 균주 C/HVRI, 중국 유래, 유전자형 1.1 에 속한다는 것을 확인하였다.
YSC 서열 (SEQ ID NO:16) 및 블라스트 결과는 도 16 에 제시된다. PCR 로 379bp PCR 생성물을 생성하였다. YSC 의 서열분석 및 블라스트 결과로 이것이 백신 균주 Riems, Chinese 균주에 속한다는 것을 확인하였다.
CSFV 의 HRM 곡선 분석의 결과
HRM 어세이는 백신-유형 (Pestiffa) 및 야생형 균주 (LBK/VRI) 를 구별하고 그룹화할 수 있었다 (도 17). 뉴클레오티드 서열 정렬의 일부는 야생형 (LBK) 과 백신-유형 (Pestiffa) 균주의 구별을 가능하게 하는, 각각 백신-유형 내의 T-풍부 삽입 및 야생형 내의 결실을 보인다 (도 17). HRM 어세이는 또한 상이한 백신-유형을 구별하고 그룹화할 수 있었다 (도 18). 야생형 (LBK) 및 백신-유형 (Pestiffa, ZBC, YSC, QYHC 및 MVP) 의 뉴클레오티드 서열 정렬의 일부는 야생형 (LBK/VRI) 과 백신-유형 (Pestiffa) 균주의 구별을 가능하게 하는, 백신-유형 내의 T-풍부 삽입 및 야생형 내의 결실의 다양한 크기를 보여준다 (도 19).
입증 - 민감성 및 특이성
어세이의 민감성을 10ng/μL 의 초기 바이러스 농도로 연속 희석에 의해 실시하였다. 유도된 역치에 근거하여, 시험이 매우 민감하며, 100ag 정도의 낮은 농도에서도 표적을 검출할 수 있을 것이라고 추정된다. 어세이의 특이성을 PCV2, PRRS, Parvovirus, SIV 와 같은 다른 돼지 바이러스와 함께 시험하였다. 본 분석은 프라이머 쌍이 상기 다른 바이러스는 증폭시키지 않았으며 CSFV 의 검출에 특이적인 것으로 발견되었음을 보여주었다.
연구는 프라이머 쌍이 야생형 (367 bp) 및 백신-유형 (379 bp) 의 상이한 앰플리콘 크기를 발생시킬 수 있으므로 어세이가 독특하다는 것을 보여준다. 핵산 서열분석과 조합된 고 해상도 용융에 의한 분석으로 어세이가 야생형 및 백신-유형 균주를 빠르게 검출하고 구별할 수 있다는 것을 확인한다.
실시예 3 NDV 의 HRM 분석
기관지, 뇌, 골수, 폐, 신장, 비장, 장, 림프절, 맹장 편도선, 활액, 전위, 간, 심장, 흉선 및 모집된 기관으로 이루어진 기관 샘플을 고전적인 NDV 임상 징후를 나타내는 동물로부터 말레이시아에서 14 곳의 가금류 농장으로부터 수집하였다. 기관 샘플을 표준 제조사 프로토콜에 따라 Trizol LS 시약을 사용함으로써 핵산 추출에 적용하였다. 실시간 PCR 을 이전에 기재된 방법으로부터 변형하여 달성하였다. 실시간 PCR 혼합물은 10 ul 의 SYBR 그린 마스터 믹스, 각각의 프라이머 세트 및 반응 당 20 ul 의 최종 부피를 만들기 위한 PCR 등급 물로 이루어졌다. PCR 혼합물을 LC480 Real Time PCR 기구 (LC 480, Roche) 의 384-웰 마이크로플레이트 내의 실시간 PCR 증폭에 적용하였다. 용융 피크 및 용융 곡선을 기구와 함께 제공된 Absolute Quant Software 를 사용함으로써 관찰하였다.
서열분석, 아미노산 서열 분석, 계통발생 건설
프라이머 세트 (5'-ATG GGCY CCA GAY CTT CTA C-3' (정방향) (SEQ ID NO:17), 5'-CTG CCA CTG CTA GTT GTG ATA ATC C-3' (역방향)(SEQ ID NO:18) 를 뉴캐슬 질환 바이러스의 융합 단백질 유전자를 증폭시키기 위해 사용하였다. PCR 프로토콜을 이전에 기재된 방법으로부터 변형하여 성립하였다 (Berhanu et al., Virol J., 7:183, 2010). 실시간 PCR 혼합물은 10 μl 의 SYBR 그린 마스터 믹스, 각각의 프라이머 세트 및 반응 당 20 μl 의 최종 부피를 만들기 위한 PCR 등급 물로 이루어졌다. PCR 혼합물을 LC480 Real Time PCR 기구 (LC 480, Roche) 의 384-웰 마이크로플레이트 내의 실시간 PCR 증폭에 적용하였다. 용융 피크 및 용융 곡선을 기구와 함께 제공된 Absolute Quant Software 를 사용함으로써 관찰하였다. 열 프로파일은 다음과 같이 설정되었다: 95℃ 에서 3 초의 전-변성, 이후 95℃ 에서 1 분 변성 45 회 사이클, 56℃ 에서 어닐링에 대해 1 분, 72℃ 에서 신장에 대해 1 분. 용융 곡선 분석을 PCR 생성물의 특이성을 측정하기 위해 수행하였다. PCR 사이클링 후, 샘플을 95℃ 로 1 초 동안 65℃ 로 15 초 동안 가열한 다음 선형 전이율로 연속으로 95℃ 로 가열하였다. 실시간 PCR 사이클을 LightCycler 480 (Roche®) 을 사용하여 실행하였다.
동일한 프라이머 세트를 서열분석을 위해 사용하였다. 예상되는 앰플리콘 크기의 PCR 생성물을 약간의 변형과 함께 제조사의 프로토콜에 따라 PCR 클린-업 젤 추출 키트를 사용함으로써 정제하였다 (Analytik Jena, Germany). NDV 의 융합 단백질 유전자의 서열분석을 BigDye Terminator v3.1 사이클 서열분석 키트를 사용하는 상업적 서열분석 설비에서 수행하였다. 모든 양성의 경우가 참 뉴캐슬 질환 바이러스였음을 확인하기 위해, 서열의 Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) 조사를 Genbank 데이터베이스에서 수행하였다. 서열 편집 및 어셈블리를 BioEdit Sequence Alignment Editor 버전 7.0.5.2 (Tom Hall, US) 를 사용하여 실시하였다. 서열 정렬을 ClustalX 를 사용함으로써 수행하였다. Mega 5 소프트웨어 (Biodesign Institute, Tempe, Arizona) 를 사용함으로써 거리-기반 이웃 연결법을 사용하여 계통발생 나무를 건설하고, 정렬의 1000 회 반복에 대해 계산된 부트스트랩핑 (bootstrapping) 방법을 사용하여 평가하였다. 서열 일치성 매트릭스를 BioEdit Sequence Alignment Editor 버전 7.0.5.2 (Tom Hall, US) 를 이용하여 발생시켰다.
DIVA (감염된 대 백신의 구별) 어세이
양성 NDV 샘플을 DIVA 어세이에 적용하였다. DIVA 어세이를 NDV 의 융합 단백질 유전자의 과-가변 영역을 증폭시키는 프라이머 세트: 정방향 프라이머 5'-CTG CCA CTG CTA GTT GIG ATA ATC C-3' (SEQ ID NO:31, I = 이노신), 역방향 프라이머 5'-CCT TGG TGA ITC TAT CCG IAG G-3' (SEQ ID NO:32, I = 이노신) 를 사용하여 성립하였다. 어세이는 10μL 의 고도로 포화된 형광 염료 마스터 믹스 (Roche), 2μL 의 25mM MgCl2, 0.5μL 의 프라이머 쌍, 템플레이트 및 PCR 등급 물로 이루어졌다. 샘플을 384-웰 마이크로웰 플레이트 내에 로딩하고 실시간 PCR 기계 (LightCycler 480, Roche) 중의 PCR 증폭에 적용하였다. 열 사이클링 반응은 초기 변성 (3 초, 95℃) 으로 이루어졌다. 증폭은 변성 (1 분, 95℃), 어닐링 (1 분, 60℃) 및 신장 (1 분, 72℃) 으로 이루어졌다. PCR 이후에 고 해상도 용융 곡선 분석을 즉시 후속하였다. 참 NDV 바이러스 단리물 대 백신 균주의 구별은 양성 대조군으로서 백신을 사용하고 이들의 용융 곡선 특징을 비교함으로써 달성되었다.
고 해상도 용융 (HRM) 곡선 분석에 의한 NDV 유전자형 구별
양성 NDV 샘플을 HRM 어세이에 적용하였다. HRM 어세이를 NDV 의 융합 단백질 유전자를 증폭시키는 프라이머 세트 (SEQ ID NO:17 및 SEQ ID NO:18) 를 사용하여 성립하였다. 어세이는 10μL 의 고도로 포화된 형광 염료 마스터 믹스 (Roche), 2μL 의 25mM MgCl2, 0.5μL 의 프라이머 쌍, 템플레이트 및 PCR 등급 물로 이루어졌다. 샘플을 384-웰 마이크로웰 플레이트 내에 로딩하고 실시간 PCR 기계 (LightCycler 480, Roche) 중의 PCR 증폭에 적용하였다. 열 사이클링 반응은 초기 변성 (3 초, 95℃) 으로 이루어졌다. 증폭은 변성 (1 분, 95℃), 어닐링 (1 분, 60℃) 및 신장 (1 분, 72℃) 으로 이루어졌다. PCR 이후에 고 해상도 용융 곡선 분석을 즉시 후속하였다. NDV 유전자형의 구별은 공지된 양성 NDV 유전자형을 양성 대조군으로서 사용하고 이들의 용융 곡선 특징을 비교함으로써 달성되었다. 어세이의 확인은 양성 NDV 단리물을 서열분석함으로써 수행되었다.
입증
ISO 17025 및 MIQE (Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments) 에 근거한 전형적인 입증은 시험되어야만 하는 8 개의 파라미터 (분석 민감성, 특이성, 반복성, 회수, 재현성, 견고성/강건성 및 순도/농도) 가 있었다. 어세이의 개발 완료 시, 프로토콜의 단순한 입증은 이의 분석적 민감성, 특이성 및 서열분석 및 아미노산 서열 분석에 의한 확인을 구별하기 위해 실시되었다.
분석적 민감성
본 연구의 목적은 검출 한계 (LOD)/검출할 수 있는 관심의 표적 인자의 최저 농도를 측정하기 위한 것이다. 참조 재료의 모든 농도를 UV Spectrophotometer 에 의해 측정하였다. 농도를 10pg/μl 로 표준화시켰다. 어세이가 더이상 표적 유기체를 검출할 수 없을 때까지 (검출 신호 없음) 최종-지점 희석 (10 배 연속 희석) 을 사용하였다.
특이성
본 연구의 목적은 기타 전염성 인자의 존재 하에 관심의 표적 인자를 검출하기 위한 어세이의 특이성을 평가하기 위한 것이다. 시험의 특이성은 5 가지 다른 유기체 (Infectious Bronchitis Virus, Infectious Bursal Disease Virus, Mycoplasma synoviae, Mycoplasma gallisepticum, Avian pneumovirus) 에 대해 프로토콜을 시험함으로써 수행하였다. 상기 파라미터를 통과하기 위해, 어세이는 동일한 검출 신호 (용융 피크) 를 생성하지 않아야만 하거나 또는 기타 유기체의 임의의 검출 신호를 생성하지 않아야만 한다. 방법은 심지어 다른 플로라 (flora) 의 존재하에서도 관심의 표적 만을 검출하기에 특이적으로 충분해야만 한다.
서열분석 및 아미노산 서열 분석.
파라미터는 상기 기재된 바와 같이 수행되었다.
결과
샘플채취
모든 14 개의 농장으로부터의 샘플은 NDV 에 대해 양성인 것으로 밝혀졌다.
서열분석, 아미노산 서열 분석, 계통발생 건설
BLAST 분석은 모든 서열 샘플이, Genbank 에서의 다른 서열과 비교할 때 참 NDV 경우였다는 것을 보여주었다. 14 개 Malaysian NDV 단리물의 융합 (F) 유전자의 아미노산 서열 분석은 11 개 (11) 의 단리물이 맹독형 바이러스로서 분류되었고 3 개 (3) 가 약독형이었다는 것을 보여주었다. 11 개의 맹독형 균주는 F 분할 부위 모티프 112R-R-R-K-R-F117 (SEQ ID NO:33) 를 가진 반면, 2 개의 약독형 균주는 F 분할 부위 모티프 112G-R-Q-G-R-L117 (SEQ ID NO:34) 를 가졌고, 1 개의 서열은 F2 단백질의 C-말단에 F 분할 부위 모티프 112G-K-Q-G-R-L117 (SEQ ID NO:35) 및 F1 단백질의 N-말단의 아미노산 위치 117 에 페닐알라닌 (F) 잔기를 가졌다 (Berhanu et al., Virol J., 7:183, 2010). 계통발생 분석은 유전자형 VIId 균주와 밀접하게 군집화된 Malaysian 단리물 11 개 중에서, 1 개의 Malaysian 단리물은 유전자형 I 과 함께 그룹화되고 2 개의 본 단리물은 유전자형 II 와 함께 그룹화되었음을 밝혔다. 유전자형 VIId 를 형성하도록 그룹지어진 단리물 11 개의 Malaysian 중에서, 10 개 (F1, F2, F3, F4, F9, F10, F11, F12, F13, F14) 는 UPM 으로부터 연구자에 의해 이전에 보고되었던 2004-2005 및 2007 년의 뉴캐슬 질환 발발에 책임이 있는 다른 Malaysian 단리물과 97.9 내지 98.7% 서열 일치성 유사성을 가졌다. 모든 상기 단리물은 Indonesian 균주 (cockatoo/14698/90) 와 91-92% 유사성을 갖는다. 유전자형 VIId 와 함께 그룹화된 1 개 (F8) 의 Malaysian 단리물은 China 균주 (Ch/2000) 와 96.1% 유사성을 가졌다. 상기 연구로부터 3 개의 약독형 균주 단리물 중에서, 2 개 (F5, F6) 는 균주 Lasota, 유전자형 2 와 97.4-97.5 % 뉴클레오티드 서열 유사성을 갖는 반면, 하나의 단리물 (F7) 은 균주 Ulster/67 과 대략 88.8% 뉴클레오티드 서열 유사성을 가졌다.
DIVA (감염된 대 백신의 구별) 어세이
양성 Malaysian 단리물 모두에 대한 DIVA 어세이는 이들이 Avinew 또는 Lasota 와 관련성이 없다는 것을 보여주었다 (도 24). 어세이를 장비가 공급된 Gene Scanning 소프트웨어를 사용함으로써 분석하였다. 소프트웨어의 군집화 알고리즘은 모든 용융 곡선을 표준화시키는 것을 가능하게 하고, 이것은 이어서 동일한 용융 특성을 갖는 모든 샘플 및 데이터를 군집한다.
고 해상도 용융 (HRM) 곡선 분석에 의한 NDV 유전자형 구별
NDV 유전자형을 구별하기 위한 HRM 어세이는 유전자 스캐닝 분석 및 아미노산 서열 분석과 연관되었다 (도 25). 상기 기재된 DIVA 어세이와 유사하게, 동일한 Gene Scanning 소프트웨어 (Roche) 를 데이터 분석에 사용하였다. 14 개의 Malaysian NDV 단리물의 융합 (F) 유전자의 아미노산 서열 분석은 11 개 (11) 의 단리물이 맹독형 바이러스로서 분류되었고 3 개 (3) 가 약독형이었다는 것을 보여주었다. 11 개의 맹독형 균주는 F 분할 부위 모티프 112 R-R-R-K-R-F 117 (SEQ ID NO:33) 를 가진 반면, 2 개의 약독형 균주는 F 분할 부위 모티프 112 G-R-Q-G-R-L 117 (SEQ ID NO:34) 를 가졌고, 1 개의 서열은 F2 단백질의 C-말단에 F 분할 부위 모티프 112 G-K-Q-G-R-L 117 (SEQ ID NO:35) 및 F1 단백질의 N-말단의 아미노산 위치 117 에 페닐알라닌 (F) 잔기를 가졌다. 이것은 HRM 어세이가 이의 의도된 용도에 적합하다는 것을 확인시켜준다.
입증
어세이는 20μl 의 총 반응 부피에 대해 0.05ag 정도의 적은 양을 검출할 수 있을 것이다. 프라이머는 NDV F 유전자에 특이적이었고, 방법론에 언급되는 바와 같이 다른 유기체와 관련성은 없었다.
HRM 을 사용하는 더많은 NDV 백신의 분석
더많은 NDV 백신 균주를 HRM 에 의해 분석하였다. 상기 백신은 다음을 포함한다: Avinew (Merial Limited), Clone 30 (Intervet), KBNP-Dalguban (KBNP, Korea), ND-B1 (Merial Limited), 및 Mukteswar (Malaysian Vaccine Pharmaceuticals).
어세이는 1μL 의 고도로 포화된 형광 염료 마스터 믹스, 2μL 의 25mM MgCl2, 12.5μL 의 HRM 마스터믹스, 1μL 의 프라이머 쌍 (SEQ ID NO:31 및 32), 템플레이트 및 PCR 등급 물로 이루어졌다. 샘플을 384-웰 마이크로웰 플레이트 내에 로딩하고 실시간 PCR 기계 (LightCycler 480, Roche) 중의 PCR 증폭에 적용하였다. 열 사이클링 반응은 초기 변성 (3 초, 95℃) 으로 이루어졌다. 증폭은 변성 (1 분, 95℃), 어닐링 (1 분, 56℃) 및 신장 (1 분, 72℃) 으로 이루어졌다. PCR 이후에 고 해상도 용융 곡선 분석을 즉시 후속하였다.
HRM 어세이로 시험된 백신-유형을 구별할 수 있었다 (도 20). NDV 의 5 개의 백신-유형 균주의 전체 게놈의 뉴클레오티드 서열 정렬의 일부가 도 21 에 제시된다. 다양한 뉴클레오티드 차이는 용융 곡선의 구별을 설명하는 바이러스의 게놈을 통해 관찰될 수 있다. NDV 의 5 개의 백신-유형 균주의 융합 단백질 유전자의 아미노산 서열의 복합 정렬은 도 22 에 제시된다. 유사하게 다양한 차이가 다양한 부위에서 관찰될 것이다.
백신-유형 NDV 의 전체 게놈의 서열 일치성 매트릭스 및 백신-유형 NDV 의 융합 (F) 단백질의 아미노산의 서열 일치성 매트릭스는 도 23 에 명시된다.
결과는 HRM (고 해상도 용융) 분석이 용융 곡선을 각각의 백신-유형에 대해 독점적인 그룹으로 분명하게 분리할 수 있다는 것을 보여주었다. 전체 게놈의 서열 및 5 개의 백신-유형의 융합 단백질 유전자의 아미노산의 복합 정렬은 전체 게놈을 통해 복합 부위에서 다양한 뉴클레오티드 변이를 보였다. 5 가지 연구 중에서, KBNP-백신 유형은 뉴클레오티드 위치 4500 내지 4506 에서 6 개의 뉴클레오티드 삽입 "CGTACG" 을 보였다. 시험된 기타 백신 중 어느 것도 상기 서열을 가지지 않았다. KBNP 가 융합 (F) 및 헤마글루티닌-뉴라미니다아제 (HN) 유전자가 F 분할 모티프를 112RRQKR116 (SEQ ID NO:45) 에서 112GRQAR116 (SEQ ID NO:46) 로 돌연변이시킴으로써 유전자형 VIId 바이러스로부터 F 및 HN 유전자로 대체된, 재조합체 La Sota 균주 (KBNP-C4152R2L) 이라는 것이 보고된다 (도 22). 6 개의 뉴클레오티드 서열을 마커로서 "6 의 법칙 (rule of six)" 을 깨뜨리지 않고 약화를 위해 매트릭스 단백질 및 F 유전자 사이의 유전자간 영역 내로 삽입하였다 (Cho et al., Clinical and Vaccine Immunology, 15(10):1572-9, 2008). 이것은 KBNP 백신을 Avinew 와 차등하기 위한 좋은 마커로서 담당한다. 유사하게는, 다른 백신은 HRM 에 의해 백신-유형을 차등시키는 것을 가능하게 만드는 다양한 부위에 뉴클레오티드 차이를 갖는다.
전체 바이러스 게놈에 대한 정체성 매트릭스 도구에 의한 서열의 점수화는 Avinew 및 ND Clone 30 (Intervet) 사이에 99% 유사성, Avinew 및 Mukteswar (MVP) 사이에 87.7% 유사성, Avinew 및 KBNP (Korea Dalguban) 사이에 94.9% 유사성 및 Avinew 및 ND-B1 (Merial)사이에 99.5% 유사성을 나타내었다.
백신-유형의 융합 단백질 유전자에 대한 정체성 매트릭스 도구에 의한 아미노산 서열의 점수화는 Avinew 및 ND Clone 30 (Intervet) 사이에 99% 유사성, Avinew 및 Mukteswar (MVP) 사이에 88.9% 유사성, Avinew 및 KBNP (Korea Dalguban) 사이에 88.6% 유사성 및 Avinew 및 ND-B1 (Merial) 사이에 99% 유사성을 나타내었다.
점수화 매트릭스는 NDV 바이러스 사이의 비유사성이 뉴클레오티드 비유사성에 대해 Avinew 및 Mukteswar (MVP) 사이에 12.7% 및 이의 융합 단백질 유전자의 아미노산 서열 비유사성에 대해 Avinew 및 KBNP (Korea Dalguban) 사이에 11.4% 및 Avinew 및 Mukteswar (MVP) 사이에 11.1% 로 다양하다는 것을 제시한다.
입증은 상기 어세이를 평가하기 위해 실시되었고, 어세이는 민감성 및 특이성에 있어 이의 의도되는 용도에 적합한 것으로 발견되었다.
결과는 HRM 어세이가 각각의 백신-유형을 뚜렷히 확인하기 위해 독특한 용융 프로파일을 생성할 수 있었다는 것을 추가로 입증하였다.
SEQUENCE LISTING <110> Merial Limited Audonnet, Jean-Chirstophe Seetha, Jaganathan <120> High Resolution Melt Genotyping of IBV, CSFV and NDV <130> MER 12-208 <150> 61/738,688 <151> 2012-12-18 <160> 46 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> XCE2-a primer <400> 1 ctctataaac acccttaca 19 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> XCE2-b primer <400> 2 cactggtaat ttttcagatg g 21 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> XCE3 primer <400> 3 cagattgctt acaaccacc 19 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> BCE1 primer <400> 4 agtagttttg tgtataaacc a 21 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> DCE1 primer <400> 5 atacaattat atcaaaccag c 21 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> MCE1 primer <400> 6 aatactactt ttacgttaca c 21 <210> 7 <211> 180 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> S1 DNA of IB-QX strain <400> 7 gttctgcaca agggtgcact gttggtgtta ttaaggatgt ttataatcaa agtgtggctt 60 ccatagctat gacagcacct cttcagggta tggcttggtc taaggcacaa ttctgtagtg 120 cacactgtaa cttttctgaa attacagttt ttgtcacaca ttgttatagt agtggtagtg 180 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> forward primer for CSFV <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> r is A or G <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> Y is C or T <400> 8 gtagcaagac tggraayagg ta 22 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> reverse primer for CSFV <400> 9 aaagtgctgt taaaaatgag tg 22 <210> 10 <211> 367 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> DNA of CSFV of LBK <400> 10 tagcaagact gggaataggt acatacctgg agagggccac accctgcaag gaagacacta 60 tgaagaactg gtgctagcaa gaaagcaggt caacaacttt caagggacag acaggtataa 120 tctaggtcca atagtcaata tggtgctaag gaggctgaga gtcatgatga tgaccttgat 180 tgggagaggg gtatgagcgt ggttaacccg cgatctggac ccgctattag gactctattg 240 tagataacac tatttatttt tatttattta gatattacta tttgtttatt tatttattta 300 ttgaatgagt aagaactggt acaaactacc tcgtgttacc acactacact catttttaac 360 agcactt 367 <210> 11 <211> 367 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> PCR product of CSFV of VRI <400> 11 tagcaagact gggaacaggt acaccccggg ggaaggccac accctgcaag gaagacacta 60 tgaagaactg gtgctagcaa gaaagcaggt caacaacttt caagggacag acaggtataa 120 tctaggtcca atagtcaata tggtgctaag gaggctgaga gtcatgatga tgaccttgat 180 tgggagaggg gtatgagcgt ggttaacccg cgatctggac ccgctattag gactctattg 240 tagataacac tatttatttt tatttattta gatattacta tttgtttatt tatttattta 300 ttgaatgagt aagaactggt acaaactacc tcgtgttacc acactacact catttttaac 360 agcactt 367 <210> 12 <211> 379 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> PCR product of CSFV of Pestiffa <400> 12 gtagcagggg ggggaaggga gacatacccg gggggggaaa cagcttgcac ggaagacatt 60 atgaagaact ggtgttggca agaaaacaga tcaacaactt tcaagggaca gacaggtaca 120 acctaggccc aatagtcaac atggtgttaa ggaggctgag agtcatgatg atgacgctga 180 tagggagagg ggcatgagcg cgggtaaccc gggatctgaa cccgccagta ggaccctatt 240 gtagataaca ctaatttttt tttttttttt tttttttttt ttagatatta ttatttattt 300 tttttttttt ttttaaaaaa aaaaaaaatt tttttaaact acctcaagtt accacactac 360 actcattttt agggggggg 379 <210> 13 <211> 379 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> PCR product of CSFV of MVP <400> 13 tagttagtag aaagacggga aaagggtaca ccccgggagg ggcccacccc ctgcagggga 60 gacattatga agaactggtg ttggcaagaa aacagatcaa aaactttcaa gggacagaca 120 ggtacaatct aggcccaata gtcaacatgg tgttaaggag gctgagagtc atattattgc 180 ccttattggg gaggggggta tgagcgcggg caacccggga tctggacccg ccagtaggac 240 cctattgtag ataacactaa ttttttattt atttagatat tattatttat ttatttattt 300 atttattgaa tgagtaagaa ctggcacaaa ctacctcaag ttaccacacc tccctccttt 360 tttacagccc ttttaatgg 379 <210> 14 <211> 379 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> PCR product of CSFV of QYHC <400> 14 tgtagcaaga ctgggaatag gtacataccc ggagagggtc acaccctgca aggaagacat 60 tatgaagaac tggtgttggc aagaaaacag atcaacaact ttcaagggac agacaggtac 120 aacctaggcc caatagtcaa catggtgtta aggaggctga gagtcatgat gatgacgctg 180 atagggagag gggcatgagc gcgggtaacc cgggatctga acccgccagt aggaccctat 240 tgtagataac actaattttc ttttttcttt tttatttatt tagatattat tatttattta 300 tttatttatt tatgaatgag taagaactgg tataaacacc tcaagtcacc acactacact 360 catttttaac agcacttta 379 <210> 15 <211> 379 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> PCR product of CSFV of ZBC <400> 15 tgtagcaaga ctgggaatag gtacatcccc ggggaaggtc acaacatgca aggaagacat 60 tatgaagaac tggtgttggc aagaaaacag atcaacaact ttcaagggac agacaggtac 120 aacctaggcc caatagtcaa catggtgtta aggaggctga gagtcatgat gatgacgctg 180 atagggagag gggcatgagc gcgggtaacc cgggatctga acccgccagt aggaccctat 240 tgtagataac actaattttc ttttttcttt tttatttatt tagatattat tatttattta 300 tttatttatt tattgaatga gtaagaactg gtataaacac ctcaagacca cactacactc 360 atttttaaca gcactttaa 379 <210> 16 <211> 379 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> PCR product of CSFV of YSC <400> 16 gggggccccc cggaaaagtt aaaccctgca cgagacattc aatgaagaac tggtgttggc 60 aagaaaacag atcaacaact ttcaagggac agacaggtac aacctaggcc caatagtcaa 120 catggtgtta aggaggctga gagtcatgat gatgacgctg atagggagag gggcatgagc 180 gcgggtaacc cgggatctga acccgccagt aggaccctat tgtagacaac actaatcttt 240 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttaga tatttttttt tttttttttt 300 tttttttttt aaaaaagcaa aaactggtat aaaccccccc cccccccccc cccccttttt 360 tttttaaaaa aactttagc 379 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> forward primer 1 for NDV <400> 17 atgggcycca gaycttctac 20 <210> 18 <211> 25 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> reverse primer 1 for NDV <400> 18 ctgccactgc tagttgtgat aatcc 25 <210> 19 <211> 534 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> DNA of NDV strain clone30 <400> 19 ataagctgcg tctctgagat tgcgctccgc ccactcaccc agatcatcat gacacaaaaa 60 actaacctgt cttgattatt tacagttagt ttacctgtct atcaagttag aaaaaacacg 120 ggtagaagat tctggatccc ggttggcgcc ctccaggtgc aagatgggct ccagaccttc 180 taccaagaac ccagcaccta tgatgctgac tatccgggtt gcgctggtac tgagttgcat 240 ctgtccggca aactccattg atggcaggcc tcttgcagct gcaggaattg tggttacagg 300 agacaaagcc gtcaacatat acacctcatc ccagacagga tcaatcatag ttaagctcct 360 cccgaatctg cccaaggata aggaggcatg tgcgaaagcc cccttggatg catacaacag 420 gacattgacc actttgctca ccccccttgg tgactctatc cgtaggatac aagagtctgt 480 gactacatct ggagggggga gacaggggcg ccttataggc gccattattg gcgg 534 <210> 20 <211> 534 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> DNA of NDV strain Mukteswar <400> 20 ataggccgta tccctgagac tgcaattcac ccgccttccc aaaacaccat gacaccagat 60 aatgatctgt cttgattact tacagttagt ttccctgtct atcaaattag aaaaaacacg 120 ggtagaagag ttcggatccc ggccggcgca ccaaaagcgc aagatgggcc ccagatcttc 180 taccaggatc ccagtacctc taatgctgac catacggatc acgctggcac tgagttatgt 240 ccgtctgaca agttctcttg atggcaggcc tcttgcagcc gcagggatcg tggtaacagg 300 ggataaagca gttaacatat acacctcatc ccagacaggg tcaatcatag tcaagttact 360 cccaaatatg cccaaggaca aagaggcatg tgcaaaagcc ccattggagg cttacaacag 420 gacactgact actttgctta ccccccttgg tgattctatc cgcaggatac aagagtctgt 480 gactacatcc ggaggaagga gacagagacg ctttataggt gccattattg gcag 534 <210> 21 <211> 534 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> DNA of NDV strain B1 <400> 21 ataagctgcg tctctgagat tgcgctccgc ccactcaccc agatcatcat gacacaaaaa 60 actaatctgt cttgattatt tacagttagt ttacctgtcc atcaagttag aaaaaacacg 120 ggtagaagac tctggatccc ggttggcgcc ctccaggtgc aggatgggct ccagaccttt 180 taccaagaac ccagcaccta tgatgctgac tatccgggtc gcgctggtat tgagttgcat 240 ctgtccggca aactccattg atggcaggcc ttttgcagct gcaggaattg tggttacagg 300 agacaaagca gtcaacatat acacctcatc ccagacagga tcaatcatag ttaagctcct 360 cccgaatctg cccaaggata aggaggcatg tgcgaaagcc cccttggatg catacaacag 420 gacattgacc actttgctca ccccccttgg tgactctatc cgtaggatac aagagtctgt 480 gactacatct ggagggggga gacaggggcg ccttataggc gccattattg gcgg 534 <210> 22 <211> 534 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> DNA of NDV strain VG/GA <400> 22 ataagctgcg tctctgagat tgcgctccgc ccactcaccc agatcatcat gacacaaaaa 60 actaatctgt cttgattatt tacagttagt ttacctgtcc atcaagttag aaaaaacacg 120 ggtagaagat tctggatccc ggttggcgcc ctccaggtgc aggatgggct ccagaccttc 180 taccaagaac ccagcaccta tgatgctgac tatccgggtc gcgctggtac tgagttgcat 240 ctgtccggca aactccattg atggcaggcc tcttgcagct gcaggaattg tggttacagg 300 agacaaagca gtcaacatat acacctcatc ccagacagga tcaatcatag ttaagctcct 360 cccgaatctg cccaaggata aggaggcatg tgcgaaagcc cccttggatg catataacag 420 gacattgacc actttgctca ccccccttgg tgactctatc cgtagaatac aagagtctat 480 gactacatct ggagggggga gacaggggcg ccttataggc gccattattg gcgg 534 <210> 23 <211> 540 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> DNA of NDV strain KBNP-C4152R2L <400> 23 ataagctgcg tctctgagat tgcgctccgc ccactcaccc agatcatcat gacacaaaaa 60 actaatctgt cttgattatt tacagttagt ttacctgtct atcaagttag aaaaaacacg 120 cgtacgggta gaagagtctg gatcccgacc ggcacattca ggacgcaata tgggctccaa 180 actttctacc aggattccag cacctctgat gctgaccacc cggattacgc tgatattgag 240 ctgtatccgt ccgacaagct ctcttgacgg caggcctctt gcagctgcag gaattgtagt 300 aacaggagat aaggcagtca atgtatacac ctcgtctcag acagggtcaa tcatagtcaa 360 gttgctcccg aatatgccca gggataaaga ggcgtgtgca aaagccccat tagaggcata 420 taacagaaca ctgactactt tgctaactcc tcttggcgac tccatccgca agatccaagg 480 gtctgtgtcc acgtctggag gaggcagaca agcacgcctg ataggtgctg ttattggcag 540 <210> 24 <211> 553 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> protein of NDV strain clone30 <400> 24 Met Gly Ser Arg Pro Ser Thr Lys Asn Pro Ala Pro Met Met Leu Thr 1 5 10 15 Ile Arg Val Ala Leu Val Leu Ser Cys Ile Cys Pro Ala Asn Ser Ile 20 25 30 Asp Gly Arg Pro Leu Ala Ala Ala Gly Ile Val Val Thr Gly Asp Lys 35 40 45 Ala Val Asn Ile Tyr Thr Ser Ser Gln Thr Gly Ser Ile Ile Val Lys 50 55 60 Leu Leu Pro Asn Leu Pro Lys Asp Lys Glu Ala Cys Ala Lys Ala Pro 65 70 75 80 Leu Asp Ala Tyr Asn Arg Thr Leu Thr Thr Leu Leu Thr Pro Leu Gly 85 90 95 Asp Ser Ile Arg Arg Ile Gln Glu Ser Val Thr Thr Ser Gly Gly Gly 100 105 110 Arg Gln Gly Arg Leu Ile Gly Ala Ile Ile Gly Gly Val Ala Leu Gly 115 120 125 Val 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tagaggtttg ctagcatgtc aatataatac tggcaatttt 720 tcagaaggct tctacctttt tactaattat agtttagtta aggaaaagtt attgtttatc 780 cgaaggagtg taaatcactc gggcgttaac caattcactt ttactaatgt aagtaaagcc 840 cagcctaata gggggggtgt tcaacttttc catttatatc aaacgcaacc agctcagagg 900 ggtaatataa ttttaattgg ccatttctca gtcagtctgt gtataaagca agtgatttta 960 tgtatgggtc ttatcccccc tagttgttct tttagaccag aaaccattac cagtggtttg 1020 tggtttaatt ccttgtcagt ttctcttact tatggacccc tacagggagg gtgcaagcaa 1080 tctgtcttca gtagtaaggc aacgtgttgt tatgcctact cttataatgg cccaagggca 1140 tgtaaaggtg tttattcagg tgaattaagt acgagttttg aatgtggatt gctggtttat 1200 gttactaaga gtgatggctc tcgtatacag actagaacgg agcccttagt attaacgcaa 1260 ctcaattata ataatattac tttagataag tgtgttgcct ataatatata tggcagagta 1320 ggccaaggtt ttattactaa tgtgactgat tctgctgcta attttagtta tttagcagat 1380 ggtgggttag ctattttaga tacttcgggc gccatagatg tttttgttgt acagggcagc 1440 tatggtctta attattacaa ggttaatcct tgtgaagatg ttaaccaaca gtttgtagtg 1500 tctggtggca atatagttgg tattcttact tctagaaatg aaacaggttc tgaacaggtt 1560 gagaaccagt tttatgttaa gttaaccaat agctcacatc gtcgcaggcg t 1611 <210> 37 <211> 1593 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> DNA of V9/04 <400> 37 atgttggtga agtcactgtt cttagtgact cttttgtttg cactatgtag tgctaatttg 60 tataataatg atagttatgt ttactactac cagagtgcat tgagaccccc taatggctgg 120 cacttacaag gaggcgctta tgcagtagtt aacagttctg tacgttataa taatgcaggt 180 tcattatcag catgcactgt tggtattatt aaggatgtgt ttaattctac agcggcttct 240 atttctatga tagcaccgca attaggtatg tcgtggtcca aggcacaaat ttgtacggca 300 cactgtaatt tctcggatgt tacagttttt gtcacacatt gttatagtag tggtagtggg 360 tcttgtccta taacaggcat gattccacag aatcatattc gtatttctgc catgaaaaat 420 ggttatttat tttataattt aacagttagt gtatctaagt accctacttt taaatccttt 480 caatgtgtta ataatcaaac atccgtctac cttaatggag accttgttta cacttctaac 540 acgaccactg ctgttacatc aacgggtggg gattttaaag caagtggacc tggtacttac 600 agtggtatga agcagtttca ggccttaact tatttgttaa tggcactgta ccagaggtat 660 tttggcgatg accccctaga ggttgctagc atgtcatata atactggcaa ttttcagaag 720 gctttacctt ttactaataa aagttattta ggaaagttat gttttctgag agagggtaaa 780 tcactttggt ttaacaaatt tccccgttta aaggaaataa tgccccacct atacgggagg 840 tgtggtagtt ttatttgttc caaactcaaa ctgcgaaatg ggttattaca ctttaaattt 900 ctcgtttctc agcgggtttc ggtatgtggc aagggtttta atgtatgggt cttaccgccc 960 caaagtgtat ttttagtcca gaaaccatta ataatgggtt tatggtttaa ttcactttct 1020 atttcatttg cttatggtcc tcttcagggt ggatgcaagc aatctgtttt tcaaggtaga 1080 gcaacgtgtt gttttgctta ttcatataat ggccctcacg catgtaaagg tgtttacagt 1140 ggtgagttat ctaagttttt tgaatgtgga ttgttggttt atgttactaa gagtgatggc 1200 tcgcgtatac aaacagccac tgaaccacca gtcataactc aacacaacta taataatatt 1260 acattggata agtgtgttga gtataacata tatggcaaaa caggccaagg ttttattact 1320 aatgtaacta actctgctgc tagttataat tatttagcag attcaggatt ggctatctta 1380 gatacatctg gtgccataga catctttgtt gtacaaggtg ctcatggtct taattattat 1440 aaagttaacc cctgtgaaga tgttaaccaa caatttgtag tgtctggtgg tagtatagtt 1500 ggtattctca cctcacgtaa tgaaagtggc tctcagtcta ttgaggatca attttatatc 1560 aaacttgtta atggaacacg gcgtgttaga cgt 1593 <210> 38 <211> 1710 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> DNA of THA50151 <400> 38 atgttggtga attcactgtt cctagtgacg tttttgtttg cactatgtag tgctaatttg 60 tatattaata atagttatgt ttactactac cagagtgcat ttagaccccc tactggttgg 120 catttacaag gaggtgctta tgcagtagtt aatagttctg tatattataa taacgcaggt 180 ggttcctctg aatgcactgc tggtattatt aaggatgttt ataatcttag cgcagctgct 240 atatctatga cagcaccacc tacaggtatg tcatggtctg cttcacaatt ttgtacagca 300 cactgtaact tttctgattt tacagtgttt gttacacatt gttttaaaag tggtcatgga 360 cattgtcctt taacaggtct aataccaagg aattacattc gcatctctgc tatgagaaat 420 ggtcttcttt tttataattt aacagttagt gtatctaaat accctaattt taaatctctt 480 caatgtgtta ataatgccac atctgtgtat ttaaatggtg accttgtttt ctcttctaac 540 atgactactg atgttacatc agcgggtgtg tattttaaag caggtggacc tgttatttat 600 agtgttatga aacagtttaa ggttctggct tactttgtta atggtactgt gcaagatgta 660 atcctgtgcg atgacacacc tagaggtttg ctagcctgtc aatataacac tggcaatttt 720 tcagatggct tttatccttt tactaatagt actttagtta gggaaaagtt cattgtctat 780 cgcgaaagta gtgttaatac tactctggcg ttaactaatt tcacttttac taatgtaagt 840 aatgcacagc ctaatagtgg tggtgttcat acttttcatt tatatcaaac gcaaacagct 900 cagagtggtt attataattt taatttgtca tttctgagtc agtttgtgta taaagcaagt 960 gattttatgt atgggtctta tcaccctagt tgttctttta gaccggaaac cattaacagt 1020 ggtttgtggt ttaattcctt gtcagtttct cttacttatg gacccctaca gggagggtgt 1080 aagcaatctg tctttagtgg tagggcaacg tgttgttatg cctactctta taatggccca 1140 agggcatgta aaggtgttta ttcaggtgaa ttaagcacga gttttgaatg tggattgctg 1200 gtttatgtta ctatgagtgc tggctctcgt atacagacta gaacggagcc cttagtatta 1260 acgcaacaca attataataa tattacttta gataagtgtg ttgactataa tatatatggc 1320 agagtaggcc aaggttttat tactaatgtg actgattctg ctgctaattt tagttattta 1380 gcagatggtg ggttagctat tttagatact tcgggtgcca tagatgtttt tgttgtacag 1440 ggcatctatg gtcttaatta ttacaaggtt aatccttgtg aagatgttaa ccaacagttt 1500 gtagtgtctg gtggtaatat agttggcttt ctcacttctc gtaatgaaac tggttctcag 1560 cctattgaga 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tactttgtta atggtactgt gcaagatgta 660 atcctgtgtg atgacacacc tagaggtttg ctagcctgtc aatataacac tggcagtttt 720 tcagatggct tttatccttt tactaatagt actttagtta gggaaaagtt cattgtctat 780 cgcgaaagta gtgttaatac tactctggcg ttaactaatt tcacttttac taatgtaagt 840 aatgcacagc ctaatagtgg tggtgttcat acttttcatt tatatcaaac gcaaacagct 900 cagagtggtt attataattt taatttgtca tttctgagtc agtttgtgta taaagcaagt 960 gattttatgt atgggtctta tcaccctagt tgttctttta gaccggaaac cattaacagt 1020 ggtttgtggt ttaattcctt gtcagtttct cttacttatg gacccctaca gggagggtgt 1080 aagcaatctg tctttagtgg tagggcaacg tgttgttatg cctactctta taatggccca 1140 agggcatgta aaggtgttta ttcaggtgaa ttaagcacga gttttgaatg tggattgctg 1200 gtttatgtta ctatgagtgc tggctctcgt atacagacta gaacggagcc cttagtatta 1260 acgcaacaca attataataa tattacttta gataagtgtg ttgactataa tatatatggc 1320 agagtaggcc aaggttttat tactaatgtg actgattctg ctgctaattt tagttattta 1380 gcagatggtg ggttagctat tttagatact tcgggtgcca tagatgtttt tgttgtacag 1440 ggcatctatg gtcttaatta ttacaaggtt aatccttgtg aagatgttaa ccaacagttt 1500 gtagtgtctg gtggtaatat agttggcttt ctcacttctc gtaatgaaac tggttctcag 1560 cctattgaga accaatttta tgttaaactc actaatgtaa gtcgtcgtca cagacgttcc 1620 attagtgaaa atgttacaag ctgtccatac gtaagttatg gcaggttttg tatacaacct 1680 gatggtctta ttaagcaaat agtaccgcaa 1710 <210> 40 <211> 1710 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> DNA of THA20151 <400> 40 atgttggtga attcactgtt cctagtgacg tttttgtttg cactatgtag tgctaatttg 60 tatattaata atagttatgt ttactactac cagagtgcat ttagaccccc tactggttgg 120 catttacaag gaggtgctta tgcagtagtt aatagttctg tatattataa taacgcaggt 180 ggttcctctg aatgcactgc tggtattatt aaggatgttt ataatcttag cgcagctgct 240 atatctatga cagcaccacc tacaggtatg tcatggtctg cttcacaatt ttgtacagca 300 cactgtaact tttctgattt tacagtgttt gttacacatt gttttaaaag tggtcatgga 360 cattgtcctt taacaggtct aataccaaag aattacattc gcatctctgc tatgagaaat 420 ggtcttcttt tttataattt aacagttagt gtatctaaat accctaattt taaatctctt 480 caatgtgtta ataatgccac atctgtgtat ttaaatggtg accttgtttt ctcttctaac 540 atgactactg atgttacatc agcgggtgtg tattttaaag caggtggacc tgttatttat 600 agtgttatga aacagtttaa ggttctggct tactttgtta atggtactgt gcaagatgta 660 atcctgtgtg atgacacacc tagaggtttg ctagcctgtc aatataacac tggcaatttt 720 tcagatggct tttatccttt tactaatagt actttagtta gggaaaagtt cattgtctat 780 cgcgaaagta gtgttaatac tactctggcg ttaactaatt tcacttttac taatgtaagt 840 aatgcacagc ctaatagtgg tggtgttcat acttttcatt tatatcaaac gcaaacagct 900 cagagtggtt attataattt taatttgtca tttctgagtc agtttgtgta taaagcaagt 960 gattttatgt atgggtctta tcaccctagt tgttctttta gaccggaaac cattaacagt 1020 ggtttgtggt ttaattcctt gtcagtttct cttacttatg gacccctaca gggagggtgt 1080 aagcaatctg tctttagtgg tagggcaacg tgttgttatg cctactctta taatggccca 1140 agggcatgta aaggtgttta ttcaggtgaa ttaagcacga gttttgaatg tggattgctg 1200 gtttatgtta ctatgagtgc tggctctcgt atacagacta gaacggagcc cttagtatta 1260 acgcaacaca attataataa tattacttta gataagtgtg ttgactataa tatatatggc 1320 agagtaggcc aaggttttat tactaatgtg actgattctg ctgctaattt tagttattta 1380 gcagatggtg ggttagctat tttagatact tcgggtgcca tagatgtttt tgttgtacag 1440 ggcatctatg gtcttaatta ttacaaggtt aatccttgtg aagatgttaa ccaacagttt 1500 gtagtgtctg gtggtaatat agttggcttt ctcacttctc gtaatgaaac tggttctcag 1560 cctattgaga accaatttta tgttaaactc actaatgtaa gtcgtcgtca cagacgttcc 1620 attagtgaaa atgttacaag ctgtccatac gtaagttatg gcaggttttg tatacaacct 1680 gatggtctta ttaagcaaat agtaccgcaa 1710 <210> 41 <211> 1710 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> DNA of THA90151 <400> 41 atgttggtga attcactgtt cctagtgacg tttttgtttg cactatgtag tgctaatttg 60 tatattaata atagttatgt ttactactac cagagtgcat ttagaccccc tactggttgg 120 catttacaag gaggtgctta tgcagtagtt aatagttctg tatattataa taacgcaggt 180 ggttcctctg aatgcactgc tggtattatt aaggatgttt ataatcttag cgcagctgct 240 atatctatga cagcaccacc tataggtatg tcatggtctg cttcacaatt ttgtacagca 300 cactgtaact tttctgattt tacagtgttt gttacacatt gttttaaaag tggtcatgga 360 cattgtcctt taacaggtct aataccaaag aattacattc gcatctctgc tatgagaaat 420 ggtcttcttt tttataattt aacagttagt gtatctaaat accctaattt taaatctctt 480 caatgtgtta ataatgccac atctgtgtat ttaaatggtg accttgtttt ctcttctaac 540 atgactactg atgttacatc agcgggtgtg tattttaaag caggtggacc tgttatttat 600 agtgttatga aacagtttaa ggttctggct tactttgtta atggtactgt gcaagatgta 660 atcctgtgtg atgacacacc tagaggtttg ctagcctgtc aatataacac tggcaatttt 720 tcagatggct tttatccttt tactaatagt actttagtta gggaaaagtt cattgtctat 780 cgcgaaagta gtgttaatac tactctggcg ttaactaatt tcacttttac taatgtaagt 840 aatgcacagc ctaatagtgg tggtgttcat acttttcatt tatatcaaac gcaaacagct 900 cagagtggtt attataattt taatttgtca tttctgagtc agtttgtgta taaagcaagt 960 gattttatgt atgggtctta tcaccctagt tgttctttta gaccggaaac cattaacagt 1020 ggtttgtggt ttaattcctt gtcagtttct cttacttatg gacccctaca gggagggtgt 1080 aagcaatctg tctttagtgg tagggcaacg tgttgttatg cctactctta taatggccca 1140 agggcatgta aaggtgttta ttcaggtgaa ttaagcacga gttttgaatg tggattgctg 1200 gtttatgtta ctatgagtgc tggctctcgt atacagacta gaacggagcc cttagtatta 1260 acgcaacaca attataataa tattacttta gataagtgtg 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ctatgagtgc tggctctcgt atacagacta gaacggagcc cttagtatta 1260 acgcaacaca attataataa tattacttta gataagtgtg ttgactataa tatatatggc 1320 agagtaggcc aaggttttat tactaatgtg actgattctg ctgctaattt tagttattta 1380 gcagatggtg ggttagctat tttagatact tcgggtgcca tagatgtttt tgttgtacag 1440 ggcatctatg gtcttaatta ttacaaggtt aatccttgtg aagatgttaa ccaacagttt 1500 gtagtgtctg gtggtaatat agttggcttt ctcacttctc gtaatgaaac tggttctcag 1560 cctattgaga accaatttta tgttaaactc actaatgtaa gtcgtcgtca cagacgttcc 1620 attagtgaaa atgttacaag ctgtccatac gtaagttatg gcaggttttg tatacaacct 1680 gatggtctta ttaagcaaat agtaccgcaa 1710 <210> 43 <211> 1657 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> DNA of AF193423 <400> 43 atgttgggga agtcactgtt tttagtgacc attttgtgtg cactatgtag tgcaaatttg 60 ttcgattctg ctaataatta tgtgtactac taccaaagtg cctttaggcc tccaaatgga 120 tggcatttgc aagggggtgc ttatgcagta gtgaattcca ctaattatag taataatgca 180 ggttctgcac ctcagtgcac tgttggtgtt attaaggacg tctataatca aagtgcggct 240 tctatagcta tgacagcacc tcttcagggt atggcttggt ctaagtcaca attttgtagt 300 gcacactgta acttttctga aattacagtt tttgtcacac attgttatag tagtggtagc 360 gggtcttgtc ctataacagg catgattcca cgtgatcata ttcgtatttc tgcaatgaaa 420 aatggttctt tattttataa tttaacagtt agcgtatcta aataccctaa ttttaaatct 480 tttcaatgtg ttaacaactt cacatctgtt tatttaaatg gtgatcttgt ttttacttcc 540 aacaaaacta ctgatgttac gtcagcaggt gtgtatttta aagcaggtgg acctgtaaat 600 tataatatta tgaaagaatt taaggttctt gcttactttg ttaatggtac agcacaagat 660 gtaattttgt gcgataattc ccccaagggt ttgctagcct gtcaatataa cactggcaat 720 ttttcagatg gcttttatcc ttttactaat agtactttag ttagggaaaa gttcattgtc 780 tatcgcgaaa gtagtgttaa tactactctg gcgttaacta atttcacttt tactaatgta 840 agtaatgcac agcctaatag tggtggtgtt aatacttttc atttatatca aacacaaaca 900 gctcagagtg gttattataa ttttaatttg tcatttctga gtcagtttgt gtataaggca 960 agtgatttta tgtatgggtc ttaccaccct agttgttctt ttagaccaga aaccattaat 1020 agtggtttgt ggtttaattc cttgtcagtt tctcttactt atggacccct acagggaggg 1080 tgtaagcaat ctgtttttag tggtaaggca acgtgttgtt atgcctactc ttataatggc 1140 ccaagggcat gtaaaggtgt ttattcaggt gaattaagca tgaattttga atgtggattg 1200 ctggtttatg ttactaagag tcatggctct cgtatacaga ctagaacgga gcccttagta 1260 ttaacgcaac acaattataa taatattact ttagataagt gtgttgctta taatatatat 1320 ggcagagtag gccaaggttt tattactaat gtgactgatt ctgctgctaa ttttagttat 1380 ttagcagatg gtgggttagc tattttagat acgtcgggtg ccatagatgt ttttgttgta 1440 aagggcagct atggtcttaa ttattacaag gttaatcctt gtgaagatgt taaccaacag 1500 tttgtagtgt ctggtggcaa tatagttggc attcttactt ctagaaatga aacaggttct 1560 gaacaggttg agaaccagtt ttatgttaag ttaaccaata gctcacatcg tcgcaggcgt 1620 tctattggcc aaaacgtaac aacttgccct tatgtta 1657 <210> 44 <211> 1643 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> DNA of AY043312 <400> 44 atgttgggga agtcactgtt tttagtgacc attttgtgtg cactatgtag tgcaaatttg 60 tttgattctg ccaataatta tgtgtactac taccaaagtg cctttaggcc tccaaatgga 120 tggcatctgc aagggggtgc ttatgcagta gtgaattcta ctaatcatac taataatgcc 180 ggttctgcaa gtgggtgcac tgttggtgtt attaaggacg tctataatca aagtgcggct 240 tccatagcta tgacagcacc tcttcagggt atggcttggt ctaagtcaca attttgtagt 300 gcacactgta acttttctga aattacagtt tttgtcacac attgttatag tagtggtaca 360 gggtcttgtc ctataacagg catgattgca cgtgatcata ttcgtatttc tgcaatgaaa 420 aatggttctt tattttataa tttaacagtt agcgtatcta aataccctaa ttttaagtct 480 tttcaatgtg ttaacaactt cacatctgtt tatttaaatg gtgatcttgt ttttacttcc 540 aacaaaacta ctgatgttac gtcagcaggt gtgtatttta aagcaggtgg acctgtaaat 600 tatagtatta tgaaagaatt taaggttctt gcttactttg ttaatggtac agcacaagat 660 gtaattttgt gtgacaattc ccccaagggt ttgctagcct gtcaatataa cactggcaat 720 ttttcggatg gcttttatcc ttttactaat agtactttag ttagggaaaa gttcattgtc 780 tatcgcgaaa gtagtgttaa tactactctg gcgttaacta atttcacttt tactaatgta 840 agtaatgcac agcctaatag tggtggtgtt catacttttc atttatatca aacacaaaca 900 gctcagagtg gttattataa ttttaatttg tcatttctga gtcagtttgt gtataaggca 960 agtgatttta tgtatgggtc ttaccaccct agttgttctt ttagaccaga aaccattaat 1020 agtggtttgt ggtttaattc cttgtcagtt tctcttactt acggacccct acagggaggg 1080 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Claims (30)

  1. 하기 단계를 포함하는, IBV 의 균주를 특징화하는 방법 또는 과정:
    a) IBV 균주로부터 IBV cDNA 를 생성하는 단계;
    b) 실시간 폴리머라아제 연쇄 반응 (PCR) 에서 cDNA 를 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 쌍에 노출시켜 앰플리콘을 산출하는 단계, 이때 프라이머 쌍은 IBV 게놈의 S1 유전자에 특이적임;
    c) 실시간 PCR 직후에 앰플리콘을 포함하는 이중-가닥 생성물에 대해 고 해상도 용융 (HRM) 곡선 분석을 수행하는 단계; 및
    d) HRM 곡선을 분석 및 비교함으로써 IBV 균주를 특징화하는 단계.
  2. 제 1 항에 있어서, 프라이머 쌍이 SEQ ID NO:29 에 언급된 서열을 갖는 정방향 프라이머 및 SEQ ID NO:30 에 언급된 서열을 갖는 역방향 프라이머를 포함하는 과정 또는 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, IBV 균주가 793/B 균주, Massachusetts 균주, QX-유사 균주, IBNC90 균주, D274 균주, Iowa 균주, Arkansas 균주, Holland 52 균주, Connecticut 46 균주, Beaudette US 균주, California 균주, Jilin 균주, Holte 균주, HK 균주, D41 균주, DE072 균주, Spain/92/35 균주, 및 Egypt/F/03 균주로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, IBV 균주의 S1 서열이 하나 이상의 IBV S1 서열과 약 95% 서열 일치성으로 정렬되지 않는 IBV 의 신규한 균주의 확인 단계를 추가로 포함하는 과정 또는 방법.
  5. 제 4 항에 있어서, IBV 의 신규한 균주의 단리 단계를 추가로 포함하는 과정 또는 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 과정이 감염된 및 백신접종된 (DIVA) 동물의 구별 수단을 제공하는 과정 또는 방법.
  7. 제 6 항에 있어서, 과정이 IBV 균주가 백신-유형 균주 또는 동물을 감염시킨 야생형 균주인지 여부의 확인 단계를 추가로 포함하는 과정 또는 방법.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 실시간 PCR 이 하기 단계를 포함하는 과정 또는 방법:
    a) 95℃ 에서 3 초의 초기 변성;
    b) 95℃ 에서 1 분의 변성;
    c) 55℃ 에서 1 분의 어닐링;
    d) 72℃ 에서 1 분의 신장;
    e) 단계 b)-d) 의 45 회의 반복.
  9. 하기를 포함하는 IBV 균주의 검출용 키트:
    a) SEQ ID NO:29 에 언급된 서열을 갖는 정방향 프라이머 및 SEQ ID NO:30 에 언급된 서열을 갖는 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 쌍;
    b) 실시간 PCR 을 수행하기 위한 파라미터 및 조건을 기술하는 지침.
  10. SEQ ID NO:29 또는 SEQ ID NO:30 에 언급된 서열을 갖는 HRM 분석을 위한 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 프라이머.
  11. 하기 단계를 포함하는, CSFV 의 균주의 특징화 과정 또는 방법:
    a) CSFV 균주로부터 CSFV cDNA 를 생성하는 단계;
    b) 실시간 폴리머라아제 연쇄 반응 (PCR) 에서 cDNA 를 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 쌍에 노출시켜 앰플리콘을 산출하는 단계, 이때 프라이머 쌍은 CSFV 게놈의 NS5B 또는 3'NTR 영역에 특이적임;
    c) 실시간 PCR 직후에 앰플리콘을 포함하는 이중-가닥 생성물에 대해 고 해상도 용융 (HRM) 곡선 분석을 수행하는 단계; 및
    d) HRM 곡선을 분석 및 비교함으로써 CSFV 균주를 특징화하는 단계.
  12. 제 11 항에 있어서, 프라이머 쌍이 SEQ ID NO:8 에 언급된 서열을 갖는 정방향 프라이머 및 SEQ ID NO:9 에 언급된 서열을 갖는 역방향 프라이머를 포함하는 과정 또는 방법.
  13. 제 11 항 또는 제 12 항에 있어서, CSFV 균주가 ALD 균주, Chinese 균주 (C 균주), GPE 균주 (Japanese 균주), C/HVRI 균주 (중국 유래, 유전자형 1.1), Riems 균주 (중국 유래), Alfort 187 균주, Ames 균주, Margarita 균주, Baker 균주, New York 균주, Purdue 115 균주, Paderborn 균주, Spreda 균주, Oregon 균주, Singer 균주, Osloss 균주, Moredun strai, 및 Frijters 균주로 이루어지는 군으로부터 선택되는 과정 또는 방법.
  14. 제 11 항에 있어서, CSFV 균주의 NS5B 또는 3'NTR 서열이 하나 이상의 CSFV 균주의 NS5B 또는 3'NTR 서열과 약 95% 서열 일치성으로 정렬되지 않는 CSFV 의 신규한 균주의 확인 단계를 추가로 포함하는 과정 또는 방법.
  15. 제 14 항에 있어서, CSFV 의 신규한 균주의 단리 단계를 추가로 포함하는 과정 또는 방법.
  16. 제 11 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 과정이 감염된 및 백신접종된 (DIVA) 동물의 구별 수단을 제공하는 과정 또는 방법.
  17. 제 16 항에 있어서, 과정이 CSFV 균주가 백신-유형 균주 또는 동물을 감염시킨 야생형 균주인지 여부의 확인 단계를 추가로 포함하는 과정 또는 방법.
  18. 제 11 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서, 실시간 PCR 이 하기 단계를 포함하는 과정 또는 방법:
    a) 95℃ 에서 3 초의 초기 변성;
    b) 95℃ 에서 1 분의 변성;
    c) 55℃ 에서 1 분의 어닐링;
    d) 72℃ 에서 1 분의 신장;
    e) 단계 b)-d) 의 45 회의 반복.
  19. 하기를 포함하는 CSFV 균주의 검출용 키트:
    a) SEQ ID NO:8 에 언급된 서열을 갖는 정방향 프라이머 및 SEQ ID NO:9 에 언급된 서열을 갖는 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 쌍;
    b) 실시간 PCR 을 수행하기 위한 파라미터 및 조건을 기술하는 지침.
  20. SEQ ID NO:8 또는 SEQ ID NO:9 에 언급된 서열을 갖는 HRM 분석을 위한 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 프라이머.
  21. 하기 단계를 포함하는, NDV 의 균주의 특징화 과정 또는 방법:
    a) NDV 균주로부터 NDV cDNA 를 생성하는 단계;
    b) 실시간 폴리머라아제 연쇄 반응 (PCR) 에서 cDNA 를 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 쌍에 노출시켜 앰플리콘을 산출하는 단계, 이때 프라이머 쌍은 NDV 게놈의 F, NP, P, M, HN 또는 L 유전자에 특이적임;
    c) 실시간 PCR 직후에 앰플리콘을 포함하는 이중-가닥 생성물에 대해 고 해상도 용융 (HRM) 곡선 분석을 수행하는 단계; 및
    d) HRM 곡선을 분석 및 비교함으로써 NDV 균주를 특징화하는 단계.
  22. 제 21 항에 있어서, 프라이머 쌍이 SEQ ID NO:17 에 언급된 서열을 갖는 정방향 프라이머 및 SEQ ID NO:18 에 언급된 서열을 갖는 역방향 프라이머를 포함하거나, 또는 SEQ ID NO:31 에 언급된 서열을 갖는 정방향 프라이머 및 SEQ ID NO:32 에 언급된 서열을 갖는 역방향 프라이머를 포함하는 과정 또는 방법.
  23. 제 21 항 또는 제 22 항에 있어서, NDV 균주가 Avinew 균주, LaSota 균주, MVP-Mukteswar 균주, ND-B1 균주, Korea Dalguban 균주, Herts 33 균주, Essex'70 균주, 135/93 균주, 617/83 균주, 34/90 균주, Beaudette C 균주, D26 균주, MC110 균주, 및 1154/98 균주로 이루어지는 군으로부터 선택되는 과정 또는 방법.
  24. 제 21 항에 있어서, NDV 균주의 F, NP, P, M, HN 또는 L 서열이 하나 이상의 NDV F, NP, P, M, HN 또는 L 서열과 약 95% 서열 일치성으로 정렬되지 않는 NDV 의 신규한 균주의 확인 단계를 추가로 포함하는 과정 또는 방법.
  25. 제 24 항에 있어서, NDV 의 신규한 균주의 단리 단계를 추가로 포함하는 과정 또는 방법.
  26. 제 21 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서, 과정이 감염된 및 백신접종된 (DIVA) 동물의 구별 수단을 제공하는 과정 또는 방법.
  27. 제 26 항에 있어서, 과정이 NDV 균주가 백신-유형 균주 또는 동물을 감염시킨 야생형 균주인지 여부의 확인 단계를 추가로 포함하는 과정 또는 방법.
  28. 제 21 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서, 실시간 PCR 이 하기 단계를 포함하는 과정 또는 방법:
    a) 95℃ 에서 3 초의 초기 변성;
    b) 95℃ 에서 1 분의 변성;
    c) 60℃ 에서 1 분의 어닐링;
    d) 72℃ 에서 1 분의 신장;
    e) 단계 b)-d) 의 45 회의 반복.
  29. 하기를 포함하는 NDV 균주 균주의 검출용 키트:
    a) SEQ ID NO:17 에 언급된 서열을 갖는 정방향 프라이머 및 SEQ ID NO:18 에 언급된 서열을 갖는 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 쌍; 또는 SEQ ID NO:31 에 언급된 서열을 갖는 정방향 프라이머 및 SEQ ID NO:32 에 언급된 서열을 갖는 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 쌍; 및
    b) 실시간 PCR 을 수행하기 위한 파라미터 및 조건을 기술하는 지침.
  30. SEQ ID NO:17, 18, 31, 또는 32 에 언급된 서열을 갖는 HRM 분석을 위한 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 프라이머.
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