TWI616535B

TWI616535B - Ｉｂｖ、ｃｓｆｖ及ｎｄｖ之高解析度熔解基因型比對

Info

Publication number: TWI616535B
Application number: TW102146755A
Authority: TW
Inventors: 珍克里斯多夫安道尼特; Ｊ西莎ＤＯＲ加葛奈奴
Original assignee: 梅里亞有限公司; 亞太特殊營養私人有限公司
Priority date: 2012-12-18
Filing date: 2013-12-17
Publication date: 2018-03-01
Also published as: TW201432053A; MY183053A; NZ709289A; SG11201504841YA; BR112015014271A2; AU2013362961A1; AU2017203670A1; CA2895324A1; CN104995315A; WO2014099929A1; PH12015501382B1; PH12015501382A1; CL2015001757A1; CO7461132A2; JP2016507225A; SG10201706147YA; AU2013362961B2; US10125401B2; HK1215593A1; US20140178860A1

Abstract

本發明係關於使用高解析度熔解技術區分及表徵IBV、CSFV及NDV病毒株，及鑑別新病毒株之方法。本發明亦提供用於該等方法之引子及套組。

Description

IBV、CSFV及NDV之高解析度熔解基因型比對

相關申請案之交叉引用

本申請案主張2012年12月18日申請之美國臨時申請案61/738,688之優先權。

聚合酶鏈反應(PCR)為引子延長反應，其提供一種用以活體外擴增特異性DNA或聚核苷酸，從而產生特定DNA序列之數千至數百萬個複本的方法。PCR現為在醫學及生物學研究實驗室中用於多種應用之通用且常常不可或缺之技術。此等技術包括用於定序之DNA選殖、基於DNA之系統發生，或基因之功能分析；遺傳疾病之診斷；基因指紋之鑑別；及傳染性疾病之偵測及診斷。基礎PCR之一些變化形式包括定量即時PCR(qPCR或RT-PCR)、對偶基因特異性PCR、不對稱PCR、熱啟動PCR、反轉錄PCR、多重PCR、巢式PCR、接合介導之PCR、序列間特異性PCR、熱不對稱交錯PCR及降落式PCR。此等PCR變化形式提供用於不同目的之多種用途。舉例而言，單核苷酸多形現象(SNP)(DNA中之單鹼基差異)可藉由對偶基因特異性PCR鑑別，qPCR在測定PCR反應中擴增之複本數目方面可提供極高精確度(Bartlett等人，「A Short History of the Polymerase Chain Reaction」,PCR Protocols,2003)。

近來，高解析度熔解(HRM)新增為一種用於高通量突變掃描之新分子技術(Zhou,L.等人，Clin.Chern.51,1770-1777,2005)。使用HRM測定突變係基於在與雙股DNA相互作用之螢光染料存在下DNA在暴露於升高之溫度時發生解離(參見例如US7,387,887；US7,582,429)。在此項技術中揭示眾多適當染料。突變的存在促使形成DNA異雙螺旋，繼而熔解行為發生變化。因此，此「突變掃描」技術偵測源自目標基因之PCR擴增子中之序列變化的存在。在HRM實驗中，首先在高解析度熔解染料存在下經由即時PCR擴增樣品DNA。該等染料之主要實例揭示於WO 2008/052742中。在PCR之後，可在相同即時儀器上進行連續熔解實驗，且用各別基因掃描軟體進行分析以鑑別序列變異體。

古典豬瘟(classical swine fever，CSF)，先前稱為豬霍亂，為侵襲家豬及野豬之高度蔓延性與多系統出血性疾病，其導致全世界養豬業的經濟損失且為根據陸生動物衛生法典(Terrestrial Animal Health Code)(OIE,2007)應向國際獸疫局(Office International des Epizooties)申報之疾病。病原體為古典豬瘟病毒(CSFV)，其為包膜、正義、單股RNA病毒，歸入黃病毒(Flaviviridae)科之瘟病毒屬(Pestivirus)中。在基因層面上，CSFV基於E2及NS5B基因之部分序列可分成基因型1、2及3。各基因型可進一步分成若干亞基因型，分別稱作1.1、1.2及1.3；2.1、2.2及2.3；及3.1、3.2、3.3及3.4(Paton等人，Vet Microbiol.73：137-157,2000)。在亞洲，CSF流行病普遍存在且基因型1、2及3已在若干亞洲國家中分離出。

CSFV可引起急性、亞急性及慢性豬病且對全世界養豬業造成相當大的威脅，從而引起嚴重經濟損失。對CSF之控制涉及根除或疫苗接種，其中根除在諸如歐盟(EU)之已開發國家中為較佳控制方法，從而可歸因於屠宰受感染豬隻而造成大量損失。另一方面，疫苗接種為如中國之開發中國家的主要控制策略。豬霍亂兔化病毒(Hog Cholera Lapinized Virus，HCLV)(亦稱為C病毒株)在1950年代中期研發且在中國及許多國家廣泛使用(Moorman等人，J Virol.70：763-770,1996)。使用HCLV疫苗進行大規模疫苗接種使得難以辨別接種疫苗之豬群中CSFV之野生型與HCLV病毒株(Van Oirshot,Vet Microbiol 96：367-384,2003)。使用CSFV之亞臨床及無症狀感染為普遍的(Moennig等人，Vet.J.165,11-20,2003；Tu,Virus Res.81,29-37,2001)，從而使得使用野生型CSFV之感染不易由農場主及獸醫識別，且不可藉由諸如病毒分離、抗原捕獲ELISA及螢光抗體測試之一般偵測分析偵測到。

已研發出多種診斷分析。然而，該等診斷分析均具有限制。病毒分離需要6-12天用於確認結果；ELISA不太敏感且常常產生假陰性結果；即時PCR分析較快且較敏感，但受交叉污染之高風險所限制且最為重要。此等分析中無一者能夠辨別CSFV之野生型與疫苗病毒株。先前，在EU已建立用於區別野生型CSFV與「Riems」疫苗病毒株之即時RT-PCR分析(Leifer等人，J.Virol.Methods 158,114-122,2009；Leifer等人，J.Virol.Methods 166,98-100,2010；Leifer等人，J.Gen.Virol.91,2687-2697,2010)，且在韓國研發出用於區分野生型與「K-LOM」疫苗病毒株CSFV之分析(Cho等人，Can J Vet Res 70：226-229,2006)。在中國，已描述用以基於探針結合位點處之核苷酸差異辨別野生型CSFV與HCLV病毒株疫苗之兩步即時RT-PCR分析及使用小溝結合(MGB)探針用於偵測野生型中之突變的一步即時RT-PCR分析(wt-rRT-PCR)。

通用偵測分析不太可能可用於所有國家，此係因為在不同國家已投與不同CSFV疫苗病毒株，例如在EU投與「Riems」、在韓國投與「K-LOM」及在中國投與「HCLV」。因此，需要研發一種價格實惠、容易執行且容易解釋結果之分析來辨別古典豬瘟之野生型與疫苗型。

傳染性支氣管炎(Infectious Bronchitis，IB)為在所有國家之養禽業中流行之疾病，其在大多數地區之發病率接近100%。其為最具經濟重要性之疾病。在雛雞中，呼吸疾病或腎炎導致死亡、增重減少及處理時廢棄，而在產蛋期雞中，疾病為亞臨床的且導致產蛋減少及蛋異常(Ignjatovic等人，Archives of Virology,2006)。IB爆發在接種疫苗之雞群中持續發生，此主要因為據信其係由S1基因之核苷酸點突變、插入、缺失或重組所產生之不同IBV血清型、亞型或變異體引起。

病原體傳染性支氣管炎病毒(IBV)屬於冠狀病毒(Coronaviridae)科。該病毒為包膜、正義、單股RNA病毒，其基因組尺寸為長度27.6kb。開頭20kb編碼病毒RNA依賴性RNA聚合酶及蛋白酶。整個基因組自5'至3'具有至少十個開放閱讀框架(ORF)且如下：5'-1a-1b-S(S1,S2)-3a,b,c(E)-M-5a,b-N-Poly(A)-3'，其編碼四個結構蛋白，包括刺突醣蛋白(S)、膜醣蛋白(M)、磷酸化核衣殼蛋白(N)及小膜蛋白(E)(Mardani等人，Arch Virol.155(10)：1581-6,2010)。

IBV在美國於1930年首次報導且此後在遍及四大洲之大多數國家已有報導：美洲(Johnson及Marquardt,Avian Dis.19：82-90,1975)、歐洲(Capua等人，Zentralbl Veterinarmed B.41：83-89,1994；Cavanagh及Davis,Arch Virol 130：471-476,1993；Gough等人，Vet Rec.130：493-494,1992)、亞洲(Wang等人，Avian Dis 41：279-282,1997)及澳洲(Ignjatovic及McWaters,J Gen Virol.72：2915-2922,1991；Lohr,Avian Dis.20：478-482,1976)。在馬來西亞，關於該疾病之流行性知之甚少。IB疾病早在1967年即首次報導，此時該疾病為輕度的且未獲准進行疫苗接種(Chong等人，Second symposium on Scientific and Technological Research in Malaysia and Singapore，第73-83頁，1967；Aziz等人，The 8^th Veterinary Association Malaysia Scientific Congress,1996年8月23-25日，Ipoh，第76-78頁)。變異體自至少1979年起已存在(Lohr,Proceedings of the 1^st International Symposium on Infectious Bronchitis,EF Kaleta及U.Heffels-Redmann(編)，第70-75頁，1988；de Wit等人Avian Pathology.40(3)：223-235,2011)，關於引起腎病-腎炎症候群，從而導致高死亡率之毒力更強病毒株的報導於1980年首次報導(Heng等人，Kajian Veterinar.12：1-8,1980；Aziz 1996)。在馬來西亞，關於IBD之新近公開案追溯至2000年、2004年及2009年，自1995年起已有關於變異型腎病原性IBV病毒株之臨床報導(Maizan,Proceeding 12^th FAVA and 14^th VAM congress,2002年8月28-28日，第116頁；Yap M.L等人Proceeding VAM Congress,2000年9月1-4日；Arshad等人J.Vet.Malaysia.14(1&2)：322002；Balkis等人Proceedings VAM Congress 2004；Zulperi等人Virus Genes.38：383-391,2009)。

在世界範圍內，已鑑別IBV之若干不同血清型及基因型且新變異體仍不斷出現。此等新變異體之一為QX樣IB。IB-QX自2004起已在中國流通並報導(Liu及Kong,Avian pathology,33：321-327,2004)。鑑別為QX之病毒主要與多種形式之腎病變相關聯。其他研究者在中國亦已報導類似病毒株(Liu等人，J of Gen Virol,86：719-725,2005)。在2007年，Cuiping等人(Vet.Microbio.,122：71,2007)確認由Liu等人(2005)呈現之資料，其報導在2003年與2005年之間自接種疫苗及未接種疫苗之雞群中分離腎病原性病毒株。類似發現亦已在俄羅斯及歐洲其他地區有報導(Bochkov等人，Avian Pathology,35：379-393,2006；Landman等人，Proceedings of the 14^th World Veterinary Poultry Congress,2005年8月22-26日，Istanbul,Turkey，第369頁)。

通用偵測分析不太可能可用於所有國家，此係因為在不同國家已投與不同IBV疫苗病毒株。因此，需要研發一種價格實惠、容易執行且容易解釋結果之分析來辨別傳染性支氣管炎(IB)之野生型與疫苗型。

儘管有密集疫苗接種程式，但新城雞瘟病毒(Newcastle disease virus，NDV)仍不斷威脅全世界的商業家禽農場。NDV為單股反鏈病毒(Mononegavirales)目、副黏液病毒(Paramyxoviridae)科及禽腮腺炎病毒(Avulavirus)屬之成員。NDV為具有由15,586個核苷酸組成之負義、不分節段、單股RNA基因組之包膜病毒。NDV之基因組包含六個基因：核蛋白(NP)、磷蛋白(P)、基質蛋白(M)、融合醣蛋白(F)、血球凝集素-神經胺酸酶(HN)、醣蛋白與大聚合酶蛋白(L)。在NDV中所見之六個基因當中，其兩個膜蛋白，F蛋白及HN蛋白在確定其毒性方面最為重要。

近年來，即時PCR方法的建立已使各種感染物之分子診斷取得重大發展，且已迅速縮短本領域中之獸醫從業者及農場主對快速而精確之結果之疾病診斷的周轉時間。已描述許多PCR分析用於使用若干不同TaqMan探針或SYBR green進行NDV偵測及基因型區分的即時PCR分析(Wise等人，J.Clin Microbiol,42：329-338,2004).Tan等人(J.Virol Method,160：149-156,2009)描述用於偵測及區分NDV基因型之SYBR Green I即時PCR，然而，此分析需要不同引子對用於偵測不同NDV基因型且在很大程度上依賴於分析熔解峰來區分NDV之三種基因型。儘管SYBR Green 1分析與其他即時偵測格局相比最具成本效益且為即時PCR之最簡易形式，然而，主要缺點在於染料分子與存在於包括非特異性PCR產物或引子二聚體之反應混合物中的任何雙股DNA結合。因此，對NDV測試之快速而具決定性之結果的當前分子診斷方法存在改良空間。

本發明係關於一種表徵IBV、CSFV或NDV之病毒株之方法或製程，其包含以下步驟：a)自病毒株產生cDNA；b)在即時聚合酶鏈反應(PCR)中使cDNA暴露於包含正向引子及反向引子之引子對，得到擴增子，其中該引子對對病毒基因組之基因或區域具特異性；c)在即時PCR之後即刻對包含擴增子之雙股產物進行高解析度熔解(HRM)曲線分析；及d)分析並比較HRM曲線，藉此表徵病毒株。IBV之基因可為S1基因。NDV之基因可為F、NP、P、M、HN或L基因。CSFV之區域可為四個結構蛋白(C、Erns、E1及E2)或八個非結構蛋白(Npro、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A及NS5B)區域。

本發明亦提供用於該等方法之引子及套組。

以下[實施方式]以實例提供，但不欲使本發明僅限於所述特定實施例，其可結合隨附圖式最佳地理解，在圖式中：圖1A及1B為鑑別指派給各DNA及蛋白質序列之SEQ ID NO的表格。

圖2描繪用於IBV之即時PCR的敏感度分析。

圖3描繪用以展示特異性之IB-QX的擴增曲線。

圖4展示用以展示特異性之IB-QX的熔解峰。

圖5描繪IB-QX之S1序列及blast結果。

圖6展示序列比較結果。

圖7展示IBV病毒株之序列一致性百分比。

圖8描繪IB-QX、IBnC90、Mass及793/B病毒株之HRM分析。

圖9描繪IB-QX及IBnC90病毒株之HRM分析。

圖10說明LBK病毒株(CSFV)之序列及blast結果。

圖11說明VRI病毒株(CSFV)之序列及blast結果。

圖12說明Pestiffa病毒株(CSFV)之序列及blast結果。

圖13說明MVP病毒株(CSFV)之序列及blast結果。

圖14說明QYHC病毒株(CSFV)之序列及blast結果。

圖15說明ZBC病毒株(CSFV)之序列及blast結果。

圖16說明YSC病毒株(CSFV)之序列及blast結果。

圖17描繪CSFV之野生型及疫苗型之HRM分析。

圖18描繪不同疫苗型CSFV病毒株之HRM分析。

圖19展示野生型CSFV及疫苗型CSFV之核苷酸序列比對。

圖20展示NDV疫苗病毒株之HRM分析。

圖21A及21B描繪NDV病毒株之核苷酸序列比對。

圖22說明NDV病毒株之胺基酸序列比對。

圖23展示在核苷酸及胺基酸層面上NDV病毒株之間的序列一致性。

圖24描繪NDV疫苗病毒株及野生型病毒株之HRM分析。

圖25描繪用以辨別強毒型/中間毒型病毒株及弱毒型病毒株之NDV病毒株的HRM分析。

應注意，在本發明中及尤其在申請專利範圍中，諸如「包含」及其類似形式之術語可具有美國專利法(U.S.Patent law)中賦予其之含義，例如，其可意謂「包括」及其類似形式；且諸如「基本上由......組成」之術語具有美國專利法中賦予其之含義，例如，其容許未明確列出之要素，但不包括見於先前技術中或影響本發明之基本或新穎特徵之要素。

出於解釋本說明書之目的，以下定義將適用且在適當時，以單數形式使用之術語亦將包括複數，反之亦然。除非本文另有明確指示，否則單數術語「一(a/an)」及「該」包括複數指示物。類似地，除非本文另有明確指示，否則字詞「或」欲包括「及」。字詞「或」意謂特定清單之任一個成員且亦包括彼清單之成員的任何組合。

本文所用之術語「動物」包括所有哺乳動物、鳥類及魚類。如本文所用之動物可選自由以下組成之群：馬科動物(例如馬)、犬科動物(例如犬、狼、狐狸、郊狼、豺)、貓科動物(例如獅子、老虎、家貓、野貓、其他大型貓，及其他貓科動物，包括獵豹及山貓)、牛科動物(例如牛)、豬科動物(例如豬)、羊科動物(例如綿羊、山羊、駝羊、大角羊)、鳥禽(例如雞、鴨、鵝、火雞、鵪鶉、雉、鸚鵡、雀、鷹、烏鴉、鴕鳥、鴯鶓及鶴鴕)、靈長類動物(例如原猴、跗猴、猴、長臂猿、猿)、人類及魚類。術語「動物」亦包括處於所有發育期之個體動物，包括胚胎期及胎兒期。

術語「多肽」及「蛋白質」在本文中可互換使用，其係指連續胺基酸殘基之聚合物。

術語「核酸」、「核苷酸」及「聚核苷酸」可互換使用且係指RNA、DNA、cDNA或cRNA及其衍生物，諸如含有經修飾之骨架者。應瞭解，本發明提供包含與本文所述序列互補之序列的聚核苷酸。本發明所涵蓋之「聚核苷酸」包括正向股(5'至3')與反向互補股(3'至5')。本發明之聚核苷酸可依不同方式製備(例如藉由化學合成、藉由基因選殖等)且可採用多種形式(例如線性或分支、單股或雙股或其雜交體、引子、探針等)。

術語「基因組DNA」或「基因組」可互換使用且係指宿主有機體之可遺傳性遺傳資訊。基因組DNA包含細胞核之DNA(亦稱作染色體DNA)，而且包含質體(例如葉綠體)及其他細胞器(例如粒線體)之DNA。本發明所涵蓋之基因組DNA或基因組亦係指病毒之RNA。RNA可為正股或負股RNA。本發明所涵蓋之術語「基因組DNA」包括含有與本文所述序列互補之序列的基因組DNA。術語「基因組DNA」亦係指信使RNA(mRNA)、互補DNA(cDNA)及互補RNA(cRNA)。如本文所用之術語「基因組RA(核酸)」包括RNA、mRNA、cRNA、DNA及cDNA。

廣泛使用之術語「基因」係指與生物功能相關之任何聚核苷酸區段。因此，基因或聚核苷酸包括如在基因組序列中之內含子及外顯子，或僅包括如在cDNA中之編碼序列，諸如以起始密碼子(甲硫胺酸密碼子)開始且以終止信號(終止密碼子)結束之開放閱讀框架(ORF)。基因及聚核苷酸亦可包括調控其表現之區域，諸如轉錄起始、轉譯及轉錄終止。因此，亦包括啟動子及核糖體結合區(一般而言，此等調控元件介於編碼序列或基因之起始密碼子上游約60個與250個核苷酸之間；Doree S M等人；Pandher K等人；Chung J Y等人)、轉錄終止子(一般而言，終止子位於編碼序列或基因之終止密碼子下游約50個核苷酸內；Ward C K等人)。基因或聚核苷酸亦係指表現mRNA或功能RNA之核酸片段，或編碼特異性蛋白質之核酸片段，及包括調控序列之核酸片段。

如本文所用之術語「異源DNA」係指來源於與接受者不同之有機體，諸如不同細胞類型或不同物種之DNA。該術語亦係指在宿主DNA之相同基因組上之DNA或其片段，其中異源DNA插入不同於其原始位置之基因組區域中。

多種核酸鹼基之縮寫包括鳥嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、腺嘌呤(A)及胞嘧啶(C)。

術語「PCR」係指聚合酶鏈反應，一種藉助於習知熱循環儀以指數方式擴增DNA之單一或數個複本之方法。PCR亦可指擴增DNA複本之習知方法，其需要凝膠電泳步驟以檢視經擴增之DNA。.「即時PCR」係指一種先進PCR方法，其能夠定量DNA複本及藉由偵測螢光量即時監測DNA之擴增。該方法不需要凝膠電泳，利用較少時間且提供較精確結果。

術語「擴增子」係指欲使用聚合酶鏈反應(PCR)方法擴增或倍增之一部分聚核苷酸。

術語「高解析度熔解(HRM)」係指用於偵測雙股DNA樣品中之突變、多形現象及遺傳差異之技術。該技術為用於DNA合成之相對較新方法，其於2002年藉由學院(University of Utah,US)與工業(Idaho Technology,US)之間的協作而引入(Reed等人2007)。高解析度熔解用於根據DNA樣品之解離行為來表徵DNA樣品，因為其隨著溫度升高自雙股DNA(dsDNA)轉變成單股DNA(ssDNA)。該技術使DNA樣品經受升高之溫度且記錄其自雙股形式(dsDNA)解離成單股形式(ssDNA)之細節。儀器以比先前方法高得多的最佳精度及熱精度收集螢光信號以產生新的應用可能性。

對雙股DNA樣品進行HRM分析。通常，聚合酶鏈反應(PCR)在HRM分析之前進行以擴增其相關突變所處之DNA區域。經擴增之此區域稱為擴增子。在PCR之後，開始HRM分析。過程為使擴增子DNA自約50℃升溫至約95℃。在此過程期間的某一點處，達到擴增子之熔解溫度且DNA之兩股分離或「熔解」分開。HRM之要點在於即時監測此過程。此係藉由使用螢光染料而達成，該螢光染料特異性地結合於雙股DNA且當結合時其發出明亮的螢光。在不存在雙股DNA之情況下，染料不會發生結合且其僅發出較低量之螢光。在HRM分析開始時，由於存在數十億之擴增子複本，故樣品中存在高螢光量。然而，隨著樣品加熱升溫且DNA之兩股熔解分開，雙股DNA之存在減少且因此螢光減少。HRM機器記錄過程且將資料繪製成曲線圖，稱為熔解曲線，其展示螢光量相對於溫度之曲線。HRM機器能夠以「高解析度」監測此過程，從而可能精確記載熔解曲線之差異且因此鑑別突變存在或不存在。

如本文所用之術語「引子」係指寡核苷酸或短單股核酸，其在與另一單股分子之互補部分雜交時，充當諸如在PCR中由具有DNA聚合酶活性之酶介導之聚合起始的起點。

如本文所用之術語「抗原」或「免疫原」意謂誘導宿主動物中之特異性免疫反應之物質。抗原可包含處於殺死、削弱或存活狀態之整個有機體；有機體之次單元或部分；含有具免疫原特性之插入物之重組載體；能夠在呈遞至宿主動物時誘導免疫反應之DNA段或片段；多肽、抗原決定基、半抗原或其任何組合。或者，免疫原或抗原可包含毒素或抗毒素。

如本文所用之術語「免疫原性蛋白質或肽」包括具免疫活性之多肽，就此而言，其一旦投與宿主，即能夠引起針對該蛋白質之體液及/或細胞類型之免疫反應。蛋白質片段較佳具有與總蛋白質實質上相同之免疫活性。因此，本發明之蛋白質片段包含至少一個抗原決定基或抗原決定子或基本上由其組成或由其組成。如本文所用之「免疫原性」蛋白質或多肽包括蛋白質之全長序列、其類似物或其免疫原性片段。「免疫原性片段」意謂蛋白質片段，其包括一或多個抗原決定基且因此引發上文所述之免疫反應。該等片段可使用此項技術中熟知之許多抗原決定基定位技術來鑑別。參見例如Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology，第66卷(Glenn E.Morris編，1996)。舉例而言，線性抗原決定基可藉由例如在固體支撐物上同時合成大量肽(該等肽對應於蛋白質分子之部分)及在該等肽仍附著於支撐物上時使該等肽與抗體反應來測定。該等技術在此項技術中為已知的且描述於例如美國專利第4,708,871號；Geysen等人，1984；Geysen等人，1986中。類似地，構形抗原決定基係藉由例如使用x射線結晶法及二維核磁共振確定胺基酸之空間構形來容易地鑑別。

術語「免疫原性蛋白質或肽」進一步涵蓋序列之缺失、添加及取代，只要多肽發揮產生如本文所定義之免疫反應之功能即可。術語「保守性變化」表示胺基酸殘基經另一生物學上類似之殘基置換；或核酸序列中核苷酸之置換，使得經編碼之胺基酸殘基不會變化或為另一生物學上類似之殘基。就此而言，尤其較佳之取代一般將在性質上為保守的，亦即，在胺基酸家族內發生之彼等取代。舉例而言，胺基酸一般分成四個家族：(1)酸性--天冬胺酸及麩胺酸；(2)鹼性--離胺酸、精胺酸、組胺酸；(3)非極性--丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸；及(4)不帶電極性--甘胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、半胱胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸。苯丙胺酸、色胺酸及酪胺酸有時歸類為芳族胺基酸。保守性變化之實例包括諸如異白胺酸、纈胺酸、白胺酸或甲硫胺酸之一個疏水性殘基取代另一個疏水性殘基，或一個極性殘基取代另一個極性殘基，諸如精胺酸取代離胺酸、麩胺酸取代天冬胺酸，或麩醯胺酸取代天冬醯胺，及其類似取代；或胺基酸經結構相關胺基酸之類似保守性置換，其不會對生物活性具有重大影響。因此，具有與參考分子實質上相同之胺基酸序列，但具有不會實質上影響蛋白質之免疫原性之少數胺基酸取代的蛋白質在參考多肽之定義內。藉由此等修飾產生之所有多肽均包括於本文中。術語「保守性變化」亦包括使用經取代之胺基酸替代未經取代之母胺基酸，其限制條件為針對經取代之多肽所產生之抗體亦與未經取代之多肽發生免疫反應。

對組合物或疫苗之「免疫反應」為在宿主中出現對相關組合物或疫苗之細胞及/或抗體介導之免疫反應。通常，「免疫反應」包括(但不限於)以下效應中之一或多者：產生抗體、B細胞、輔助T細胞及/或細胞毒性T細胞，其特異性地針對相關組合物或疫苗中所包括之抗原。宿主較佳將展現治療性或保護性免疫反應以便增強對新感染之抗性及/或降低疾病之臨床嚴重性。該保護將藉由受感染宿主通常所展現之症狀減少或缺乏、恢復時間較快及/或受感染宿主中之病毒效價降低來證實。

長度為N個核苷酸之基因組之可能病毒變異體的數目為4^N個可能變異體，此係因為存在4種不同核苷酸。舉例而言，長度僅為300個核苷酸之基因組存在10¹⁸⁰個不同變異體。(Martin A.Nowak及Robert McCredie May Virus Dynamics,Oxford University Press)。RNA病毒群體之基因組序列叢集於共同或平均序列周圍，但各基因組不同。具有特定突變之罕見基因組可經受住選擇事件，且該突變接著將在所有子代基因組中可見。準種理論預測病毒不僅為隨機突變體之集合，而且為變異體之相互作用性群組。(Vincent Racaniello 2009)。

變異體包括對偶基因變異體。術語「對偶基因變異體」係指含有引起蛋白質之胺基酸序列變化且存在於天然群體(例如病毒種類或品種)內之多形現象的聚核苷酸或多肽。該等天然對偶基因變化通常可引起聚核苷酸或多肽中1-5%之變異。對偶基因變異體可藉由對許多不同種類中之相關核酸序列進行定序來鑑別，其可藉由使用雜交探針鑑別彼等種類中之相同基因遺傳基因座而容易地進行。作為天然對偶基因變化之結果且不改變相關基因之功能活性的任何及所有該等核酸變化及所得胺基酸多形現象或變化欲處於本發明之範疇內。

關於序列之術語「一致性」可指例如具有一致核苷酸或胺基酸之位置數除以兩個序列中之較短序列中之核苷酸或胺基酸數目，其中兩個序列之比對可根據威爾伯與利普曼演算法(Wilbur and Lipman algorithm)(威爾伯與利普曼)來測定。兩個胺基酸序列之序列一致性或序列相似性或兩個核苷酸序列之間的序列一致性可使用Vector NTI套裝軟體(Invitrogen,1600 Faraday Ave.,Carlsbad,CA)來測定。當RNA序列據稱為相似的或與DNA序列具有一定程度之序列一致性或同源性時，DNA序列中之胸苷(T)視為等同於RNA序列中之尿嘧啶(U)。因此，鑒於DNA序列中之胸苷(T)視為等同於RNA序列中之尿嘧啶(U)，RNA序列處於本發明之範疇內且可來源於DNA序列。

IBV

本發明之一個實施例提供一種表徵IBV病毒株之製程或方法，其包含以下步驟：a)由自動物分離之IBV病毒株產生IBV cDNA；b)在即時聚合酶鏈反應(PCR)中使cDNA暴露於包含正向引子及反向引子之引子對，得到擴增子，其中該引子對對IBV基因組之S1基因具特異性；c)在即時PCR之後即刻對包含擴增子之雙股產物進行高解析度熔解(HRM)曲線分析；及d)分析並比較HRM曲線，藉此表徵IBV病毒株。

正向引子及反向引子可藉由比對已知IBV病毒株之S1基因之聚核苷酸序列且比較S1基因之保守區域來選擇。在該實施例之一個態樣中，正向引子具有如SEQ ID NO：29所示之聚核苷酸序列且反向引子具有如SEQ ID NO：30所示之聚核苷酸序列。

S1基因稱為刺突(S)醣蛋白。S1次單元帶有血清型特異性序列及誘導病毒中和抗體之抗原決定基。IBV之不同血清型、亞型或變異體據信係由S1基因之核苷酸點突變、插入、缺失或重組產生，其為造成IB在接種疫苗之雞群中爆發的原因(Zhou等人J.Vet Med.B51,147-152,2004)。S1醣蛋白之核苷酸定序通常用於測定IBV病毒株中之血清型差異(Kwon等人Avian Dis.1993)。

HRM曲線分析可根據製造商之說明書進行。舉例而言，若干製造商提供用於高解析度DNA熔解分析之儀器，諸如Applied Biosystems(ABI)、Bio-Rad、Cepheid、Corbett、Eppendorf、Idaho Technology、Roche及Stratagene。另外，亦存在若干在市場上可用於進行分析之飽和染料，諸如LCGreen^®(Idaho Technology Inc.)、Syto9^®(Invitrogen,Carlsbad,CA)、EvaGreen^®(Bioturn)及 LightCycler^® 480 ResoLight Dye(Roche,Indianapolis,IN)(Vossen RHAM等人Human Mutation 30(6),2009)。

即時PCR可使用以下參數進行：a)在95℃下初始變性3秒，b)在95℃下變性1分鐘，c)在55℃下黏接1分鐘，d)在72℃下延長1分鐘，及e)重複步驟b)-d)45分鐘，繼而進行熔解曲線分析(在95℃下維持1秒，在65℃下維持15秒及在95℃下持續)及在45℃下冷卻30秒。

本發明之方法可用於表徵及辨別已知IBV病毒株。已知IBV病毒株包括(但不限於)793/B病毒株、Massachusetts病毒株、QX樣病毒株、IBNC90病毒株、D274病毒株、Iowa病毒株、Arkansas病毒株、Holland 52病毒株、Connecticut 46病毒株、Beaudette US病毒株、California病毒株、Jilin病毒株、Holte病毒株、HK病毒株、D41病毒株、DE072病毒株、Spain/92/35病毒株、Egypt/F/03病毒株及在世界範圍內發現之其他病毒株。

本發明亦提供新穎IBV病毒株之鑑別，其中IBV序列不與一或多個具有緊密同源性之IBV序列中之任一者匹配。該方法包含以下步驟：a)由自動物分離之IBV病毒株產生IBV cDNA；b)在即時聚合酶鏈反應(PCR)中使cDNA暴露於包含正向引子及反向引子之引子對，得到擴增子，其中該引子對對IBV基因組之S1基因具特異性；c)在即時PCR之後即刻對包含擴增子之雙股產物進行高解析度熔解(HRM)曲線分析；d)分析並比較HRM曲線；及e)鑑別新穎IBV病毒株。藉由HRM曲線分析由此鑑別之新穎IBV病毒株可藉由對擴增子進行定序且將IBV擴增子序列與已知IBV序列比對來進一步表徵。新穎IBV病毒株與任何已知IBV序列可具有約50%、約60%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%之序列一致性。序列可為核苷酸序列或胺基酸序列(擴增子序列之轉譯)。

方法實施例之另一態樣提供一種區分受感染與接種疫苗(DIVA)之動物的方式。該方法包含以下步驟：a)由自動物分離之IBV病毒株產生IBV cDNA；b)在即時聚合酶鏈反應(PCR)中使cDNA暴露於包含正向引子及反向引子之引子對，得到擴增子，其中該引子對對IBV基因組之S1基因具特異性；c)在即時PCR之後即刻對包含擴增子之雙股產物進行高解析度熔解(HRM)曲線分析；及d)分析並比較HRM曲線，藉此判定cDNA來源於疫苗型病毒株抑或感染動物之病毒株。

本發明之一個實施例提供一種分離之聚核苷酸或引子，其具有如SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：30所示之序列。

本發明之另一實施例提供一種用於偵測IBV病毒株之套組，其包含：a)包含具有如SEQ ID NO：29所示之序列之正向引子及具有如SEQ ID NO：30所示之序列之反向引子的引子對；及b)描述用以進行即時PCR之參數及條件的說明書。

CSFV

本發明之一個實施例提供一種表徵CSFV病毒株之製程或方法，其包含以下步驟：a)由自動物分離之CSFV病毒株產生CSFV cDNA；b)在即時聚合酶鏈反應(PCR)中使cDNA暴露於包含正向引子及反向引子之引子對，得到擴增子，其中該引子對對CSFV基因組之NS5B或3'NTR區域具特異性；c)在即時PCR之後即刻對包含擴增子之雙股產物進行高解析度熔解(HRM)曲線分析；及d)分析並比較HRM曲線，藉此表徵CSFV病毒株。

正向引子及反向引子可藉由比對已知CSFV病毒株之NS5B或3'NTR區域之聚核苷酸序列且比較NS5B或3'NTR區域之保守區域來選擇。在該實施例之一個態樣中，正向引子具有如SEQ ID NO：8所示之聚核苷酸序列且反向引子具有如SEQ ID NO：9所示之聚核苷酸序列。

NS5B為RNA依賴性RNA聚合酶基因。3'NTR區域為病毒基因組之3'非轉譯區域。先前研究已顯示(Pan等人，J Vet Diag Inv,2008)，疫苗型CSFV之3' NTR中之顯著富T插入位點(其不存在於野生型CSFV中)使得兩種基因為適用於區分野生型與疫苗病毒株之遺傳標記物。

HRM曲線分析可根據製造商之說明書進行。

本發明之方法可用於表徵及辨別已知CSFV病毒株。已知CSFV病毒株包括(但不限於)ALD病毒株、Chinese病毒株(C病毒株)、GPE病毒株(Japanese病毒株)、C/HVRI病毒株(來自中國，基因型1.1)、Riems病毒株(來自中國)、Alfort 187病毒株、Ames病毒株、Margarita病毒株、Baker病毒株、New York病毒株、Purdue 115病毒株、Paderborn病毒株、Spreda病毒株、Oregon病毒株、Singer病毒株、Osloss病毒株、Moredun病毒株、Frijters病毒株及可見於文獻中之其他病毒株。

本發明亦提供新穎CSFV病毒株之鑑別，其中CSFV序列不與一或多個具有緊密同源性之CSFV序列中之任一者匹配。該方法包含以下步驟：a)由自動物分離之CSFV病毒株產生CSFV cDNA；b)在即時聚合酶鏈反應(PCR)中使cDNA暴露於包含正向引子及反向引子之引子對，得到擴增子，其中該引子對對CSFV基因組之NS5B或3'NTR區域具特異性；c)在即時PCR之後即刻對包含擴增子之雙股產物進行高解析度熔解(HRM)曲線分析；d)分析並比較HRM曲線；及e)鑑別新穎CSFV病毒株。藉由HRM曲線分析由此鑑別之新穎CSFV病毒株可藉由對擴增子進行定序且將CSFV擴增子序列與已知CSFV序列比對來進一步表徵。新穎CSFV病毒株與任何已知CSFV序列可具有約50%、約 60%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%之序列一致性。序列可為核苷酸序列或胺基酸序列(擴增子序列之轉譯)。

方法實施例之另一態樣提供一種區分受感染與接種疫苗(DIVA)之動物的方式。該方法包含以下步驟：a)由自動物分離之CSFV病毒株產生CSFV cDNA；b)在即時聚合酶鏈反應(PCR)中使cDNA暴露於包含正向引子及反向引子之引子對，得到擴增子，其中該引子對對CSFV基因組之NS5B或3'NTR區域具特異性；c)在即時PCR之後即刻對包含擴增子之雙股產物進行高解析度熔解(HRM)曲線分析；及c)分析並比較HRM曲線，藉此判定cDNA來源於疫苗病毒株抑或感染動物之病毒株。

本發明之一個實施例提供一種分離之聚核苷酸，其具有如SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9所示之序列。

本發明之另一實施例提供一種用於偵測CSFV病毒株之套組，其包含：a)包含具有如SEQ ID NO：8所示之序列之正向引子及具有如SEQ ID NO：9所示之序列之反向引子的引子對；及b)描述用以進行即時PCR之參數及條件的說明書。

NDV

本發明之一個實施例提供一種表徵NDV病毒株之製程或方法，其包含以下步驟：a)由自動物分離之NDV病毒株產生NDV cDNA；b)在即時聚合酶鏈反應(PCR)中使cDNA暴露於包含正向引子及反向引子之引子對，得到擴增子，其中該引子對對NDV基因組之F、NP、P、M、HN或L基因具特異性；c)在即時PCR之後即刻對包含擴增子之雙股產物進行高解析度熔解(HRM)曲線分析；及d)分析並比較HRM曲線，藉此表徵NDV病毒株。

正向引子及反向引子可藉由分別比對已知NDV病毒株之F基因或 NP基因或P基因或M基因或HN基因或L基因之聚核苷酸序列且比較F基因或NP基因或P基因或M基因或HN基因或L基因之保守區域來選擇。在該實施例之一個態樣中，正向引子具有如SEQ ID NO：17或31所示之聚核苷酸序列且反向引子具有如SEQ ID NO：18或32所示之聚核苷酸序列。

融合(F)蛋白負責介導病毒包膜與細胞膜之融合，且血球凝集素-神經胺酸酶(HN)蛋白涉及於細胞附著及釋放中(Phillips等人，Arch.Virol,143：1993-2002,1998；Tan等人，Arch.Virol,155：63-70,2010)。 NDV病毒株分成3個基因型：高毒力(強毒型)、中毒力(中間毒型)或無毒力(弱毒型)。傳統上，NDV基因型最通常係藉由定序及胺基酸序列分析來辨別。強毒型及中間毒型病毒株之F蛋白裂解位點之共同序列為112(R/K)RQ(R/K)RF117；弱毒型F裂解位點之共同序列為112(G/E)(K/R)Q(G/E)RL117。新近發現記載(Samal S等人J.Gen.Virol.2011)，F裂解位點之位置114處之麩醯胺酸變成鹼性殘基精胺酸(R)減少病毒複製且削弱病毒致病性。論文亦報導，當位置118處之異白胺酸(I)經纈胺酸取代時，致病性進一步降低。

HRM曲線分析可根據製造商之說明書進行。

即時PCR可使用以下參數進行：a)在95℃下初始變性3秒，b)在95℃下變性1分鐘，c)在60℃下黏接1分鐘，d)在72℃下延長1分鐘，及e)重複步驟b)-d)45分鐘，繼而進行熔解曲線分析(在95℃下維持1秒，在65℃下維持15秒及在95℃下持續)及在45℃下冷卻30秒。

本發明之方法可用於表徵及辨別已知NDV病毒株。已知NDV病毒株包括(但不限於)Avinew病毒株、LaSota病毒株、MVP-Mukteswar病毒株、ND-B1病毒株、Korea Dalguban病毒株、Herts 33病毒株、Essex'70病毒株、135/93病毒株、617/83病毒株、34/90病毒株、Beaudette C病毒株、D26病毒株、MC110病毒株、1154/98病毒株及可記載於文獻中之其他病毒株。

本發明亦提供新穎NDV病毒株之鑑別，其中NDV序列不與一或多個具有緊密同源性之NDV序列中之任一者匹配。該方法包含以下步驟：a)由自動物分離之NDV病毒株產生NDV cDNA；b)在即時聚合酶鏈反應(PCR)中使cDNA暴露於包含正向引子及反向引子之引子對，得到擴增子，其中該引子對對NDV基因組之F、NP、P、M、HN或L基因具特異性；c)在即時PCR之後即刻對包含擴增子之雙股產物進行高解析度熔解(HRM)曲線分析；d)分析並比較HRM曲線；及e)鑑別新穎NDV病毒株。藉由HRM曲線分析由此鑑別之新穎NDV病毒株可藉由對擴增子進行定序且將NDV擴增子序列與已知NDV序列比對來進一步表徵。新穎NDV病毒株與任何已知NDV序列可具有小於50%、小於60%、小於70%、小於75%、小於80%、小於85%、小於90%、小於91%、小於92%、小於93%、小於94%、小於95%、小於96%、小於97%、小於98%或小於99%之序列一致性。序列可為核苷酸序列。序列亦可為胺基酸序列(擴增子序列之轉譯)。

方法實施例之另一態樣提供一種區分受感染與接種疫苗(DIVA)之動物的方式。該方法包含以下步驟：a)由自動物分離之NDV病毒株產生NDV cDNA；b)在即時聚合酶鏈反應(PCR)中使cDNA暴露於包含正向引子及反向引子之引子對，得到擴增子，其中該引子對對NDV基因組之F、NP、P、M、HN或L基因具特異性；c)在即時PCR之後即刻對包含擴增子之雙股產物進行高解析度熔解(HRM)曲線分析；及d)分析並比較HRM曲線，藉此判定cDNA來源於疫苗病毒株抑或感染動物之病毒株。

本發明之一個實施例提供一種分離之聚核苷酸，其具有如SEQ ID NO：17、18、31或32所示之序列。

本發明之另一實施例提供一種用於偵測NDV病毒株之套組，其包含：a)包含具有如SEQ ID NO：17所示之序列之正向引子及具有如SEQ ID NO：18所示之序列之反向引子的引子對；或包含具有如SEQ ID NO：31所示之序列之正向引子及具有如SEQ ID NO：32所示之序列之反向引子的引子對；及b)描述用以進行即時PCR之參數及條件的說明書。

免疫原性組合物及疫苗

本發明亦提供分離IBV、CSFV或NDV之新穎病毒株。分離新穎病毒之方法為熟習此項技術者所熟知(參見例如Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology,1991,John Wiley and Sons,New York；Sambrook等人，Molecular Cloning：A laboratory manual,1989,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.中之方案)。

因此，本發明進一步涵蓋包含新穎IBV、CSFV或NDV之免疫原性組合物或疫苗。本發明之免疫原性組合物或疫苗可包括病毒培養物或製劑(例如呈不活化或削弱形式)或病毒之抗原或免疫原。本發明之免疫原性組合物或疫苗可進一步包含一或多種醫藥學上或獸醫學上可接受之載劑、媒劑、佐劑或賦形劑。

醫藥學上或獸醫學上可接受之載劑、媒劑、佐劑或賦形劑為熟習此項技術者所熟知。舉例而言，醫藥學上或獸醫學上可接受之載劑、媒劑、佐劑或賦形劑可為0.9% NaCl(例如鹽水)溶液或磷酸鹽緩衝液。可用於本發明方法之其他醫藥學上或獸醫學上可接受之載劑、媒劑、佐劑或賦形劑包括(但不限於)聚(L-麩胺酸)或聚乙烯吡咯啶酮。醫藥學上或獸醫學上可接受之載劑、媒劑、佐劑或賦形劑可為有助於投與載體(或在活體外由本發明載體表現之蛋白質)的任何化合物或化合物組合；有利地，載劑、媒劑、佐劑或賦形劑可有助於轉染及/或改良載體(或蛋白質)之儲藏。劑量及劑量體積在本文中以一般性描述來論述，且亦可在無任何不當實驗之情況下由熟練技師結合此項技術中之知識閱讀本發明來確定。

醫藥學上或獸醫學上可接受之載劑、賦形劑、媒劑或佐劑可為油包水乳液。適合油包水乳液之實例包括在4℃下穩定且呈流體之油基油包水疫苗乳液，其含有：6至50v/v%、較佳12至25v/v%之含抗原水相，50至94v/v%之全部或部分含有不可代謝油(例如礦物油，諸如石蠟油)及/或可代謝油(例如植物油或脂肪酸、多元醇或醇酯)之油相，0.2至20p/v%、較佳3至8p/v%之界面活性劑，後者全部或部分為任一聚甘油酯或聚甘油酯之混合物，該等聚甘油酯較佳為聚甘油(聚)蓖麻油酸酯，或聚氧乙烯蓖麻油或氫化聚氧乙烯蓖麻油。可用於油包水乳液中之界面活性劑之實例包括乙氧基化脫水山梨糖醇酯(例如聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇單油酸酯(TWEEN 80®)，可獲自AppliChem,Inc.,Cheshire,CT)；及脫水山梨糖醇酯(例如脫水山梨糖醇單油酸酯(SPAN 80®)，可獲自Sigma Aldrich,St.Louis,MO)。另外，關於油包水乳液，亦參見美國專利第6,919,084號，例如實例8。在一些實施例中，含抗原水相包含有包含一或多種緩衝劑之鹽水溶液。適合緩衝溶液之一個實例為磷酸鹽緩衝鹽水。在一個實施例中，油包水乳液可為水/油/水(W/O/W)三重乳液(美國專利第6,358,500號)。其他適合乳液之實例描述於美國專利第7,371,395號中。

本發明之免疫原性組合物及疫苗可包含一或多種醫藥學上或獸醫學上可接受之載劑、賦形劑、媒劑或佐劑或基本上由其組成。適用於實施本發明之載劑或佐劑為(1)丙烯酸或甲基丙烯酸之聚合物、順丁烯二酸酐及烯基衍生物聚合物；(2)免疫刺激序列(ISS)，諸如具有一或多個非甲基化CpG單元之寡去氧核糖核苷酸序列(Klinman等人，1996；WO98/16247)；(3)水包油乳液，諸如由M.Powell,M.Newman,Plenum Press 1995公開之「Vaccine Design,The Subunit and Adjuvant Approach」第147頁上所述之SPT乳液，及同一著作之第183頁上所述之乳液MF59；(4)含有四級銨鹽之陽離子脂質，例如DDA；(5)細胞激素；(6)氫氧化鋁或磷酸鋁；(7)皂素；或(8)本申請案中所列舉且以引用的方式併入本申請案中之任何文獻中所論述之其他佐劑；或(9)其任何組合或混合物。

現將經由以下非限制性實例進一步描述本發明。

實例

在實驗中使用J.Sambrook等人(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,New York,1989)所述之標準分子生物學技術。

實例1 IBV之HRM分析

在2011年，將來自不同農場及地區之總共56個樣品遞交給Vet Food Agro Diagnostics(M)Sdn.Bhd.以供常規IBV診斷。所接收之器官樣品範圍涉及肺、腎、盲腸扁桃腺、氣管及彙集器官。此等樣品疑似帶有IB病毒且經發送以供偵測指定病毒及確認。在此研究中，對所有此等樣品進行均化且藉由反轉錄酶PCR及即時PCR測試。

根據製造商之標準方案，使用Trizol LS試劑(Invitrogen,USA)進行核酸提取。

用於偵測Mass及793/B之多重反轉錄酶(RT)PCR

採用來自先前所述方法(Cavanagh等人，Avian Pathology,28：593-605,1999)之基於S1基因序列之多重PCR來偵測及區分兩種類型之IBV：793/B及Massachusetts。寡核苷酸(引子)序列如下：XCE2-^a：CTCTATAAACACCCTTACA(SEQ ID NO：1)；XCE2-^b：CACTGGTAATTTTTCAGATGG(SEQ ID NO：2)(RT PCR步驟)；XCE3-：CAGATTGCTTACAACCACC(SEQ ID NO：3)；BCE1+：AGTAGTTTTGTGTATAAACCA(SEQ ID NO：4)；DCE1+：ATACAATTATATCAAACCAGC(SEQ ID NO：5)；MCE1+： AATACTACTTTTACGTTACAC(SEQ ID NO：6)(巢式步驟)(Adzhar等人，Avian Pathology,25：817-836,1996；Cavanagh等人，Avian Pathology,28：593-605,1999)。反應條件為在45℃下進行反轉錄酶步驟1小時，在72℃下維持10分鐘，繼而在94℃下進行初始變性步驟5分鐘。擴增步驟為在94℃下維持1分鐘，在50℃下維持1.5分鐘，在72℃下維持2分鐘，重複30分鐘，繼而在72℃下最後延長2分鐘。巢式步驟在以下條件下進行：在94℃下初始變性5分鐘，在94℃下擴增1分鐘，在50℃下維持1.5分鐘及在72℃下維持2分鐘，持續總共30分鐘，繼而在72℃下最後延長10分鐘且保持於4℃下。

用於偵測IB-QX之一步RT-qPCR

以10μL SensiFAST SYBR green主混合物、0.8μL 20 pmol正向引子(CTTATGCAGTAGTCAA)(SEQ ID NO：29)及反向引子(CACGTGGAATCATGCCTGTTAT)(SEQ ID NO：30)、0.2μL反轉錄酶、0.4μL RNAse抑制劑、4μL模板及3.8μL ddH₂O之反應體積進行即時PCR。在LightCycler 480即時PCR儀器(Roche,Germany)中進行即時PCR反應。反應條件為在45℃下進行反轉錄酶步驟10分鐘，繼而在94℃下進行初始變性步驟2分鐘。擴增步驟為在94℃下維持5秒、在50℃下維持10秒及在72℃下延伸5秒。熔解曲線分析型態為在95℃下維持3秒，在58℃下維持1分鐘及在95℃下持續，繼而在45℃下冷卻30秒。

用以區分IBN-C90與IB-QX之HRM分析

藉由使用擴增IB之S1基因之高變區的如上文所述之相同引子對(SEQ ID NO：29及SEQ ID NO：30)建立分析。該分析由1μl高度飽和螢光染料(EvaGreen)、12.5μl主混合物(Sensimix,Bioline)、2μl 25mM MgCl₂、0.5μl引子對、模板及PCR級水組成。將樣品加載至384孔微孔盤中，且在即時PCR機器(LightCycler 480,Roche)中對其進行PCR 擴增。熱循環反應由初始變性(在95℃下3秒)組成。擴增由變性(在95℃下1分鐘)、黏接(在48℃下1分鐘)及延長(在72℃下1分鐘)組成。在PCR之後即刻進行高解析度熔解曲線分析。藉由使用已知陽性對照且與其熔解型態相比較來達成樣品的區分。

驗證 RT即時PCR之敏感度

由UV分光光度計量測參考材料之所有濃度。將濃度標準化至10pg/μl。使用終點稀釋(十倍連續稀釋)直至分析不再可偵測到目標有機體(無偵測信號)為止。

特異性

藉由針對5種其他有機體(IBV 793/B、IBV Mass、IBD、NDV、CAV、里奧病毒(Reovirus))測試該方案來分析測試之特異性。

定序

將用於定序(直接定序)之樣品發送至商業定序設備。基於製造商之方案(Analytik Jena,Germany)進行PCR淨化及凝膠純化。由BLAST(基本局部比對搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool))分析所獲得之結果以供確認參考材料。

結果

所測試之56個樣品中有15個(26.8%)對793/B病毒株呈陽性；56個中有9個(16%)對Massachusetts病毒株呈陽性；56個中有32個(57%)對QX樣病毒株呈陽性；發現先前據報導對IB呈陰性的56個案例中之18個(32%)當再測試時對IB-QX呈陽性。

驗證用於特異性偵測IB-QX之即時PCR分析 敏感度

圖2說明使用10ng/μL初始濃度之分析的敏感度。基於在最終稀釋度下以18.48得出之臨限值，據估計測試為高度敏感的且能夠偵測濃度低至100ag之病毒。

擴增曲線-IB-QX(特異性)

使用諸如IB-Massachusetts、IB-793/B、NDV、IBV及禽肺病毒(Avian PneumoVirus，APV)之其他緊密相關有機體測試分析之特異性。圖3說明來源於特異性分析之擴增曲線。

熔解峰(Tm)-IB-QX(特異性)

使用諸如IB-Massachusetts、IB-793/B、NDV、IBV及APV之其他緊密相關有機體測試分析之特異性。圖4說明來源於特異性分析之熔解峰。

藉由定序分析進行確認

對代表IB-QX病毒株之S1基因之PCR產物進行定序且序列展示於圖5中(SEQ ID NO：7)。該序列用於針對GenBank資料庫(NCBI)之BLAST。如藉由BLAST分析測定之BLAST結果及表列核苷酸序列得分的螢幕擷取畫面展示於圖5中。BLAST分析確認自PCR分析獲得之熔解峰及譜帶為IB-QX。

完成先前所報導之腎病原性IB(MH5365/95)與Genbank中之序列的比較，且如藉由BLAST分析測定之BLAST結果及表列核苷酸序列得分的螢幕擷取畫面展示於圖6中。BLAST分析確認於1995年分離出之腎病原性病毒株與泰國所發現之最新IB病毒株緊密相關。圖7展示7種緊密相關序列與先前在馬來西亞分離出之IB案例(MH5365/95及v9/04)的序列一致性矩陣。

圖8說明用以比較IB-QX、IBnC90、Mass及793/B之HRM分析。圖9描繪用以比較/偵測IB-QX及IBnC90之HRM分析。

自保留存檔樣品中成功偵測到IB-QX。所測試之26.8%樣品對變異型病毒株-793/B病毒株呈陽性，16%對經典IB-Massachusetts呈陽性；而所測試之57%對自2004年起流通之新QX樣病毒株呈陽性。發現先前據報導對IB呈陰性的56個案例中之18個(32%)當再測試時對IB-QX呈陽性。由於缺乏對照及缺乏用於QX病毒株之偵測方法，故一些2011 IB案例錯誤地報導為呈陰性。由此，自先前公開之論文成功修改得出一種用以精確偵測IB-QX之方法(H.J.Geerligs等人，Avian Pathology,40(1)：93-102,2011)。作出改變以將方法自3小時習知PCR修改為54分鐘即時PCR分析，該即時PCR分析可偵測低至100ag/μl之核酸。然而，儘管該方法高度敏感且具特異性，但預見新QX偵測分析因其不能偵測可能存在於家禽樣本中之其他病毒株，不能同時偵測若干不同類型之IB病毒株而具有限制。

如結果所示，採用基因掃描軟體之高解析度熔解分析(HRM)能夠基於S1基因之高變區辨別單一核苷酸差異以同時偵測4種病毒株(793/B、Mass、QX及IBnC90)，如圖8中所示。進行用以比較兩種病毒株(QX與IBnC90)之分析的可能性亦展示於圖9中。

實例2 CSFV之HRM分析

在此研究中，使用多種野生型及疫苗型CSFV病毒株。野生型病毒株包括標記為LBK之存檔保留樣品及標記為VRI之存檔保留樣品(來源於受攻擊豬隻-具有LBK病毒之豬隻)。疫苗型病毒株包括Pestiffa(活疫苗-C病毒株)、MVP(活疫苗-GPE病毒株)、QYHC(活疫苗)、ZBC(活疫苗)、YST(活疫苗)、YSC(活疫苗)。

反轉錄酶步驟

用以產生CSF之互補DNA之反轉錄酶步驟如下進行：藉由使用擴增CSFV序列之NS5B及3'NTR區域之引子組來建立分析，該等區域包涵兔化CSFV疫苗病毒株所特有之富T插入位點。引子組如下：正向引子5'-GTAGCAAGACTGGRAAYAGGTA-3'(SEQ ID NO：8)(Y=C或T，R=A或G)及反向引子5'-AAAGTGCTGTTAAAAATGAGTG-3'(SEQ ID NO：9)(Pan等人，2008)。即時PCR混合物由以下組成：10μl SYBR green主混合物(Bioline)、1.6μl各別引子組(10μM)、0.2μl反轉錄酶、0.4μl RNAse抑制劑及3.8μl PCR級水以補足每個反應20μl之最終體積。在LC480即時PCR儀器(LC 480,Roche)中於384孔微定量盤中對PCR混合物進行即時PCR擴增。

用以辨別CSFV基因型之CSFV之HRM曲線分析

對樣品進行HRM分析。該分析由1μl高度飽和螢光染料(EvaGreen)、12.5μl HRM主混合物(Sensimix Bioline)、2μl 25mM MgCl₂、1μl引子對(5μM)、2μl模板及PCR級水組成。使用與用於反轉錄酶步驟相同之引子對(SEQ ID NO：8及SEQ ID NO：9)進行HRM分析。引子對之獨特之處在於其對於野生型病毒株將產生367bp之擴增子尺寸且對於疫苗型病毒株將產生379bp，從而極其明顯地精確辨別野生型與疫苗型病毒株。將樣品加載至384孔微孔盤中，且在即時PCR機器(LightCycler 480,Roche)中對其進行PCR擴增。熱循環反應由初始變性(在95℃下3秒)組成。擴增由變性(在95℃下1分鐘)、黏接(在55℃下1分鐘)及延長(在72℃下1分鐘)組成。在PCR之後即刻進行高解析度熔解曲線分析。藉由使用已知陽性對照且比較其熔解型態來達成基因型的區分。

核苷酸序列分析

使用多種Bioinformatics軟體進行序列組裝及核苷酸序列分析，諸如用於多重序列比對之ClustalX/W，及Bioedit 7.0(序列比對編輯器7.0.5.2版，Tom Hall,US)。對所有序列進行針對Genbank資料庫(NCBI)之BLAST分析(blastn)。

LBK序列(SEQ ID NO：10)及blast結果展示於圖10中。PCR產生367bp PCR產物。LBK之定序及blast結果確認LBK為野生型ALD病毒株。

VRI序列(SEQ ID NO：11)及blast結果展示於圖11中。PCR產生 367bp PCR產物。VRI之定序及blast結果確認VRI為野生型ALD病毒株。

Pestiffa序列(SEQ ID NO：12)及blast結果展示於圖12中。PCR產生379bp PCR產物。Pestiffa之定序及blast結果確認其屬於疫苗病毒株，「Chinese」病毒株(C病毒株)。

MVP序列(SEQ ID NO：13)及blast結果展示於圖13中。PCR產生379bp PCR產物。MVP之定序及blast結果確認其屬於疫苗病毒株GPE，Japanese病毒株。

QYHC序列(SEQ ID NO：14)及blast結果展示於圖14中。PCR產生379bp PCR產物。QYHC之定序及blast結果確認其屬於疫苗病毒株C/HVRI，來自中國，基因型1.1。

ZBC序列(SEQ ID NO：15)及blast結果展示於圖15中。PCR產生379bp PCR產物。ZBC之定序及blast結果確認其屬於疫苗病毒株C/HVRI，來自中國，基因型1.1。

YSC序列(SEQ ID NO：16)及blast結果展示於圖16中。PCR產生379bp PCR產物。YSC之定序及blast結果確認其屬於疫苗病毒株Riems，Chinese病毒株。

CSFV之HRM曲線分析之結果

HRM分析能夠區分及分組疫苗型(Pestiffa)及野生型病毒株(LBK/VRI)(圖17)。一部分核苷酸序列比對顯示疫苗型中之富T插入及野生型中之缺失，其能夠分別區分野生型(LBK)及疫苗型(Pestiffa)病毒株(圖17)。HRM分析亦能夠區分及分組不同疫苗型(圖18)。野生型(LBK)及疫苗型(Pestiffa、ZBC、YSC、QYHC及MVP)之一部分核苷酸序列比對顯示疫苗型中之不同尺寸之富T插入及野生型中之缺失，其能夠區分野生型(LBK/VRI)及疫苗型(Pestiffa)病毒株(圖19)。

驗證-敏感度及特異性

藉由以10ng/μL之初始病毒濃度連續稀釋來確定分析之敏感度。基於得出之臨限值，據估計測試為敏感的且能夠偵測濃度低至100ag之目標。使用諸如PCV2、PRRS、Parvovirus、SIV之其他豬病毒測試分析之特異性。分析顯示，引子對不會擴增此等其他病毒且發現其對CSFV之偵測具特異性。

研究顯示分析為獨特的，因為引子對能夠產生不同擴增子尺寸，對於野生型(367bp)及疫苗型(379bp)。藉由高解析度熔解進行之分析與核酸定序組合確認，分析能夠快速偵測及區分野生型及疫苗型病毒株。

實例3 NDV之HRM分析

在馬來西亞14個家禽農場中自展現經典NDV臨床徵象之動物收集由氣管、腦、骨髓、肺、腎、脾、腸、淋巴結、盲腸扁桃腺、黏液囊、前胃、肝、心臟、胸腺及彙集器官組成之器官樣品。遵循製造商之標準方案，藉由使用Trizol LS試劑對器官樣品進行核酸提取。自先前所述之方法加以修改來建立即時PCR。即時PCR混合物由以下組成：10μl SYBR green主混合物、各別引子組及PCR級水以補足每個反應20μl之最終體積。在LC480即時PCR儀器(LC 480,Roche)中於384孔微定量盤中對PCR混合物進行即時PCR擴增。藉由使用與儀器一起提供之Absolute Quant軟體觀測熔解峰及熔解曲線。

定序、胺基酸序列分析、系統樹建構

引子組(5'-ATG GGCY CCA GAY CTT CTA C-3'(正向)(SEQ ID NO：17)、5'-CTG CCA CTG CTA GTT GTG ATA ATC C-3'(反向)(SEQ ID NO：18))用於擴增新城雞瘟病毒之融合蛋白基因。自先前所述之方法(Berhanu等人，Virol J.,7：183,2010)加以修改來建立PCR方案。即時PCR混合物由以下組成：10μl SYBR green主混合物、各別引子組及PCR級水以補足每個反應20μl之最終體積。在LC480即時PCR儀器 (LC 480,Roche)中於384孔微定量盤中對PCR混合物進行即時PCR擴增。藉由使用與儀器一起提供之Absolute Quant軟體觀測熔解峰及熔解曲線。熱型態設定如下：在95℃下預變性3秒，繼而進行在95℃下變性1分鐘、在56℃下黏接1分鐘及在72℃下延伸1分鐘之45個循環。進行熔解曲線分析以量測PCR產物之特異性。在PCR循環之後，將樣品加熱至95℃維持1秒且在65℃下維持15秒，接著以線性轉變速率持續加熱至95℃。使用LightCycler 480(Roche®)運作即時PCR循環。

相同引子組用於定序。根據製造商之方案並稍加修改(Analytik Jena,Germany)，藉由使用PCR淨化凝膠提取套組純化具有預期擴增子尺寸之PCR產物。在商業定序設備中使用BigDye Terminator 3.1版循環定序套組進行NDV之融合蛋白基因之定序。為確認所有陽性案例均為真正的新城雞瘟病毒，在Genbank資料庫中進行序列之基本局部比對搜索工具(BLAST)搜索。藉由使用BioEdit序列比對編輯器7.0.5.2版(Tom Hall,US)完成序列編輯及組裝。藉由使用ClustalX完成序列比對。藉由使用基於距離之鄰接法，使用Mega 5軟體(Biodesign Institute,Tempe,Arizona)建構系統樹，且使用以1000個重複比對計算之自舉法進行評估。使用BioEdit序列比對編輯器7.0.5.2版(Tom Hall,US)產生序列一致性矩陣。

DIVA(區分感染與疫苗)分析

對陽性NDV樣品進行DIVA分析。藉由使用以下引子組建立DIVA分析：正向引子5'-CTG CCA CTG CTA GTT GIG ATA ATC C-3'(SEQ ID NO：31，I=肌苷)、反向引子5'-CCT TGG TGA ITC TAT CCG IAG G-3'(SEQ ID NO：32，I=肌苷)，其擴增NDV之融合蛋白基因之高變區。該分析由10μl高度飽和螢光染料主混合物(Roche)、2μl 25mM MgCl₂、0.5μl引子對、模板及PCR級水組成。將樣品加載至384孔微孔盤中，且在即時PCR機器(LightCycler 480,Roche)中對其進行PCR 擴增。熱循環反應由初始變性(在95℃下3秒)組成。擴增由變性(在95℃下1分鐘)、黏接(在60℃下1分鐘)及延長(在72℃下1分鐘)組成。在PCR之後即刻進行高解析度熔解曲線分析。藉由使用疫苗作為陽性對照且比較其熔解曲線特徵來達成真正的NDV病毒分離株與疫苗病毒株之區分。

藉由高解析度熔解(HRM)曲線分析進行NDV基因型區分

對陽性NDV樣品進行HRM分析。藉由使用擴增NDV之融合蛋白基因之引子組(SEQ ID NO：17及SEQ ID NO：18)建立HRM分析。該分析由10μl高度飽和螢光染料主混合物(Roche)、2μl 25mM MgCl₂、0.5μl引子對、模板及PCR級水組成。將樣品加載至384孔微孔盤中，且在即時PCR機器(LightCycler 480,Roche)中對其進行PCR擴增。熱循環反應由初始變性(在95℃下3秒)組成。擴增由變性(在95℃下1分鐘)、黏接(在60℃下1分鐘)及延長(在72℃下1分鐘)組成。在PCR之後即刻進行高解析度熔解曲線分析。藉由使用已知陽性NDV基因型作為陽性對照且比較其熔解曲線特徵來達成NDV基因型之區分。藉由對陽性NDV分離株進行定序來確認分析。

驗證

基於ISO 17025及MIQE(關於公開定量即時PCR實驗之最低資訊(Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments))之典型驗證具有8個應測試之參數(分析敏感度、特異性、可重複性、回復性、再現性、耐久性/穩固性及純度/濃度)。在分析研發完成後，進行方案之簡單驗證以辨別其分析敏感度、特異性及藉由定序及胺基酸序列分析加以確認。

分析敏感度

研究之目的在於確定可偵測之相關目標作用物之偵測限(LOD)/最低濃度。藉由使用UV分光光度計量測參考材料之所有濃度。將濃度標準化至10pg/μl。使用終點稀釋(十倍連續稀釋)直至分析不再可偵測到目標有機體(無偵測信號)為止。

特異性

研究之目的在於評估在其他感染物存在下偵測相關目標作用物之分析的特異性。藉由針對5種其他有機體(傳染性支氣管炎病毒、傳染性法氏囊病病毒(Infectious Bursal Disease Virus)、滑膜黴漿菌(Mycoplasma synoviae)、雞敗血性黴漿菌(Mycoplasma gallisepticum)、禽肺病毒)測試該方案來分析測試之特異性。為使此參數合格，分析不應產生相同偵測信號(熔解峰)或不應產生其他有機體之任何偵測信號。該方法應具有足夠高的特異性以甚至在其他菌叢存在下仍僅偵測相關目標作用物。

定序及胺基酸序列分析

如上文所述進行參數分析。

結果抽樣

發現來自全部14個農場之樣品均對NDV呈陽性。

定序、胺基酸序列分析、系統樹建構

BLAST分析顯示所有序列樣品當與Genbank中之其他序列相比較時均為真正的NDV案例。十四種馬來西亞NDV分離株之融合(F)基因之胺基酸序列分析顯示，其中十一(11)種分離株歸類為強毒型病毒且三(3)種為弱毒型。11種強毒型病毒株具有F裂解位點基元112R-R-R-K-R-F117(SEQ ID NO：33)；而弱毒型病毒株中之2種具有F裂解位點基元112G-R-Q-G-R-L117(SEQ ID NO：34)，而1種序列在F2蛋白質之C端具有F裂解位點基元112G-K-Q-G-R-L117(SEQ ID NO：35)且在F1蛋白質之N端之胺基酸位置117處具有苯丙胺酸(F)殘基(Berhanu等人，Virol J.,7：183,2010)。系統樹分析揭示，馬來西亞分離株中之11種與基因型VIId病毒株緊密成群，1種馬來西亞分離株與基因型I一起成組，且分離株中之2種與基因型II成組。在成組形成基因型VIId之11種馬來西亞分離株當中，10種(F1、F2、F3、F4、F9、F10、F11、F12、F13、F14)與其他馬來西亞分離株具有97.9%至98.7%之序列一致相似性，先前由UPM之研究者報導，該等其他馬來西亞分離株為造成2004-2005年及2007年之新城雞瘟爆發的原因。所有此等分離株與印度尼西亞病毒株(cockatoo/14698/90)具有91%至92%之相似性。與基因型VIId成組之馬來西亞分離株之一(F8)與中國病毒株(Ch/2000)具有96.1%之相似性。在來自此研究之3種弱毒型病毒株分離株當中，兩種(F5、F6)與病毒株Lasota基因型2具有97.4%至97.5%之核苷酸序列相似性，而一種分離株(F7)與病毒株Ulster/67具有約88.8%之核苷酸序列相似性。

DIVA(區分感染與疫苗)分析

所有陽性馬來西亞分離株之DIVA分析顯示，其與Avinew或Lasota並無關聯(圖24)。藉由使用與儀器一起提供之基因掃描軟體來解析該分析。軟體之叢集演算法可使所有熔解曲線得以校正且其隨後叢集具有相同熔解特徵之所有樣品及資料。

藉由高解析度熔解(HRM)曲線分析進行NDV基因型區分

用以辨別NDV基因型之HRM分析與基因掃描分析及胺基酸序列分析相關聯(圖25)。類似於上文所述之DIVA分析，來自Roche之相同基因掃描軟體用於分析資料。十四種馬來西亞NDV分離株之融合(F)基因之胺基酸序列分析顯示，其中十一(11)種分離株歸類為強毒型病毒且三(3)種為弱毒型。11種強毒型病毒株具有F裂解位點基元112 R-R-R-K-R-F 117(SEQ ID NO：33)；而弱毒型病毒株中之2種具有F裂解位點基元112 G-R-Q-G-R-L 117(SEQ ID NO：34)，且1種序列在F2蛋白質之C端具有F裂解位點基元112 G-K-Q-G-R-L 117(SEQ ID NO：35)且在F1蛋白質之N端之胺基酸位置117處具有苯丙胺酸(F)殘基。此確認HRM分析適於其預期用途。

驗證

該分析對於20μl之總反應體積可偵測低至0.05ag。引子對NDVF基因具特異性且與如方法中所述之其他有機體並無關聯。

使用HRM分析更多NDV疫苗

藉由HRM分析更多NDV疫苗病毒株。此等疫苗包括：Avinew(Merial Limited)、Clone 30(Intervet)、KBNP-Dalguban(KBNP,Korea)、ND-B1(Merial Limited)及Mukteswar(Malaysian Vaccine Pharmaceuticals)。

該分析由1μl高度飽和螢光染料主混合物、2μl 25mM MgCl₂、12.5μl HRM主混合物、1μl引子對(SEQ ID NO：31及32)、模板及PCR級水組成。將樣品加載至384孔微孔盤中，且在即時PCR機器(LightCycler 480,Roche)中對其進行PCR擴增。熱循環反應由初始變性(在95℃下3秒)組成。擴增由變性(在95℃下1分鐘)、黏接(在56℃下1分鐘)及延長(在72℃下1分鐘)組成。在PCR之後即刻進行高解析度熔解曲線分析。

HRM分析能夠區分所測試之疫苗型(圖20)。NDV之五種疫苗型病毒株之整個基因組的一部分核苷酸序列比對展示於圖21中。在病毒之整個基因組中可觀測到多種核苷酸差異，其說明熔解曲線之相異性。NDV之五種疫苗型病毒株之融合蛋白基因之胺基酸序列的多重比對展示於圖22中。類似地，在多個位點處可觀測到多種差異。

疫苗型NDV之整個基因組之序列一致性矩陣及疫苗型NDV之融合(F)蛋白之胺基酸的序列一致性矩陣描繪於圖23中。

結果顯示，HRM(高解析度熔解)分析可明顯地將熔解曲線分成各疫苗型之排他性群組。五種疫苗型之融合蛋白基因之整個基因組及胺基酸之序列的多重比對顯示在遍及整個基因組之多個位點處存在多種核苷酸變化。在五個研究當中，KBNP疫苗型顯示在核苷酸位置4500至4506處存在六個核苷酸插入「CGTACG」。所測試之其他疫苗中無一者具有此序列。據報導，KBNP為重組La Sota病毒株(KBNP-C4152R2L)，其中藉由使F裂解基元自¹¹²RRQKR¹¹⁶(SEQ ID NO：45)突變成¹¹²GRQAR¹¹⁶(SEQ ID NO：46)，融合(F)及血球凝集素-神經胺酸酶(HN)基因經來自基因型VIId病毒之F及HN基因置換(圖22)。將作為標記物之六個核苷酸之序列插入基質蛋白與F基因之間的基因間區中以在不打破「六位規則」之情況下加以削弱(Cho等人，Clinical and Vaccine Immunology,15(10)：1572-9,2008)。此充當用於區分KBNP疫苗與Avinew之良好標記物。類似地，其他疫苗在多個位點處具有核苷酸差異，從而可能藉由HRM區分疫苗型。

藉由一致性矩陣工具對整個病毒基因組進行序列評分顯示，Avinew與ND Clone 30(Intervet)之間的相似性為99%，Avinew與Mukteswar(MVP)之間的相似性為87.7%，Avinew與KBNP(Korea Dalguban)之間的相似性為94.9%，且Avinew與ND-B1(Merial)之間的相似性為99.5%。

藉由一致性矩陣工具對疫苗型之融合蛋白基因進行胺基酸序列評分顯示，Avinew與ND Clone 30(Intervet)之間的相似性為99%，Avinew與Mukteswar(MVP)之間的相似性為88.9%，Avinew與KBNP(Korea Dalguban)之間的相似性為88.6%，且Avinew與ND-B1(Merial)之間的相似性為99%。

評分矩陣表明，NDV病毒之間的不相似性為不同的，基於核苷酸不相似性，Avinew與Mukteswar(MVP)之間的不相似性為12.7%；且基於其融合蛋白基因之胺基酸序列不相似性，Avinew與KBNP(Korea Dalguban)之間的不相似性為11.4%且Avinew與Mukteswar (MVP)之間的不相似性為11.1%。

進行驗證以評估分析，且發現該分析就敏感度及特異性而言適於其預期用途。

結果進一步證實，HRM分析能夠產生獨特熔解型態以明顯地鑑別各疫苗型。

<110> 美商龍馬躍公司珍克里斯多夫安道尼特J 西莎 D/O R 加葛奈奴

<120> IBV、CSFV及NDV之高解析度熔解基因型比對

<130> MER 12-208

<150> 61/738,688

<151> 2012-12-18

<160> 46

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> XCE2-a引子

<400> 1

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> XCE2-b引子

<400> 2

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> XCE3引子

<400> 3

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BCE1引子

<400> 4

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> DCE1引子

<400> 5

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MCE1引子

<400> 6

<210> 7

<211> 180

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> IB-QX病毒株之S1 DNA

<400> 7

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CSFV之正向引子

<220>

<221> misc_feature

<222> (14)..(14)

<223> r為A或G

<220>

<221> misc_feature

<222> (17)..(17)

<223> Y為C或T

<400> 8

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CSFV之反向引子

<400> 9

<210> 10

<211> 367

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> LBK之CSFV之DNA

<400> 10

<210> 11

<211> 367

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> VRI之CSFV之PCR產物

<400> 11

<210> 12

<211> 379

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Pestiffa之CSFV之PCR產物

<400> 12

<210> 13

<211> 379

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MVP之CSFV之PCR產物

<400> 13

<210> 14

<211> 379

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> QYHC之CSFV之PCR產物

<400> 14

<210> 15

<211> 379

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ZBC之CSFV之PCR產物

<400> 15

<210> 16

<211> 379

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> YSC之CSFV之PCR產物

<400> 16

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> NDV之正向引子1

<400> 17

<210> 18

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> NDV之反向引子1

<400> 18

<210> 19

<211> 534

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> NDV病毒株clone30之DNA

<400> 19

<210> 20

<211> 534

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> NDV病毒株Mukteswar之DNA

<400> 20

<210> 21

<211> 534

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> NDV病毒株B1之DNA

<400> 21

<210> 22

<211> 534

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> NDV病毒株VG/GA之DNA

<400> 22

<210> 23

<211> 540

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> NDV病毒株KBNP-C4152R2L之DNA

<400> 23

<210> 24

<211> 553

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> NDV病毒株clone30之蛋白質

<400> 24

<210> 25

<211> 553

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> NDV病毒株Mukteswar之蛋白質

<400> 25

<210> 26

<211> 553

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> NDV病毒株B1之蛋白質

<400> 26

<210> 27

<211> 553

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> NDV病毒株VG/GA之蛋白質

<400> 27

<210> 28

<211> 553

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> NDV病毒株KBNP之蛋白質

<400> 28

<210> 29

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> IBV之IB-QX之正向引子

<400> 29

<210> 30

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> IBV之IB-QX之反向引子

<400> 30

<210> 31

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> NDV之正向引子2

<220>

<221> misc_feature

<222> (17)..(17)

<223> N為肌苷

<400> 31

<210> 32

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> NDV之反向引子2

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(10)

<223> N為肌苷

<220>

<221> misc_feature

<222> (19)..(19)

<223> N為肌苷

<400> 32

<210> 33

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> NDV裂解位點基元1之F融合

<400> 33

<210> 34

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> NDV裂解位點基元2之F融合

<400> 34

<210> 35

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> NDV裂解位點基元3之F融合

<400> 35

<210> 36

<211> 1611

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> M5365之DNA

<400> 36

<210> 37

<211> 1593

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> V9/04之DNA

<400> 37

<210> 38

<211> 1710

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> THA50151之DNA

<400> 38

<210> 39

<211> 1710

<213> 人工序列

<212> DNA

<220>

<223> THA40151之DNA

<400> 39

<210> 40

<211> 1710

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> THA20151之DNA

<400> 40

<210> 41

<211> 1710

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> THA90151之DNA

<400> 41

<210> 42

<211> 1710

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> THA60151之DNA

<400> 42

<210> 43

<211> 1657

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> AF193423之DNA

<400> 43

<210> 44

<211> 1643

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> AY043312之DNA

<400> 44

<210> 45

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> F融合裂解基元4

<400> 45

<210> 46

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> F融合裂解基元5

<400> 46

Claims

一種表徵NDV病毒株之製程或方法，其包含以下步驟：a)自該NDV病毒株產生NDV cDNA；b)在即時聚合酶鏈反應(PCR)中使該cDNA暴露於包含正向引子及反向引子之引子對，得到擴增子，其中該引子對對NDV基因組之F基因具特異性；c)在該即時PCR之後即刻對包含該擴增子之雙股產物進行高解析度熔解(HRM)曲線分析；及d)分析並比較該HRM曲線，藉此表徵該NDV病毒株；其中該引子對包含具有如SEQ ID NO：17所示之序列之正向引子及具有如SEQ ID NO：18所示之序列之反向引子，或具有如SEQ ID NO：31所示之序列之正向引子及具有如SEQ ID NO：32所示之序列之反向引子。
如請求項1之製程或方法，其中該NDV病毒株係選自由以下組成之群：Avinew病毒株、LaSota病毒株、MVP-Mukteswar病毒株、ND-B1病毒株、Korea Dalguban病毒株、Herts 33病毒株、Essex'70病毒株、135/93病毒株、617/83病毒株、34/90病毒株、Beaudette C病毒株、D26病毒株、MC110病毒株及1154/98病毒株。
如請求項1或2之製程或方法，其進一步包含對擴增子進行定序及鑑別新穎NDV病毒株之步驟，其中該新穎NDV病毒株之F序列與已知NDV病毒株之F序列具有小於95%之序列一致性。
如請求項3之製程或方法，其進一步包含分離該新穎NDV病毒株之步驟。
如請求項1或2之製程或方法，其中該製程提供用於區分受感染與接種疫苗(DIVA)之動物的方式。
如請求項5之製程或方法，其中該製程進一步包含鑑別該NDV病毒株為疫苗型病毒株抑或感染該等動物之野生型病毒株之步驟。
如請求項1或2之製程或方法，其中該即時PCR包含以下步驟：a)在95℃下初始變性3秒；b)在95℃下變性1分鐘；c)在60℃下黏接1分鐘；d)在72℃下延長1分鐘；e)重複步驟b)-d)45次。
一種用於偵測NDV病毒株之套組，其包含：a)包含具有如SEQ ID NO：17所示之序列之正向引子及具有如SEQ ID NO：18所示之序列之反向引子的引子對；或包含具有如SEQ ID NO：31所示之序列之正向引子及具有如SEQ ID NO：32所示之序列之反向引子的引子對；及b)描述用以進行即時PCR之參數及條件的說明書。
一種用於HRM分析之引子對，其包含具有如SEQ ID NO：17所示之序列之正向引子及具有如SEQ ID NO：18所示之序列之反向引子；或包含具有如SEQ ID NO：31所示之序列之正向引子及具有如SEQ ID NO：32所示之序列之反向引子。