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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis einer neuen Variante des IB-Virus, bei dem die das S-Protein kodierende Nukleinsäuresequenz oder die Aminosäuresequenz oder jeweils Teile davon nachgewiesen werden. Die Erfindung betrifft ferner ein KIT für ein solches Verfahren.
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Hintergrund der Erfindung
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In den vergangenen Jahren wurden häufig nennenswerte Legeleistungseinbrüche in Hühnerherden beobachtet, die mit üblichen gesundheitsfördernden Maßnahmen nicht oder nur unwesentlich zu mindern waren. Durch umfangreiches Beobachten entwickelte sich der Verdacht, dass dieser Legeleistungseinbruch auf ein Virus zurückzuführen sein könnte, ein Virus, das die infektiöse Bronchitis auslöst.
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Die Infektiöse Bronchitis (IB) ist eine Viruserkrankung der Vögel, die vor allem Haushuhn und Fasan befällt. Erreger ist das Infektiöse-Bronchitis-Virus (IBV), ein Coronavirus.
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Viren sind infektiöse Partikel, die sich als Virionen außerhalb von Zellen (extrazellulär) durch Übertragung verbreiten, aber als Viren nur innerhalb einer geeigneten Wirtszelle (intrazellulär) vermehren können. Alle Viren enthalten die genetische Information zu ihrer Vermehrung und Ausbreitung, besitzen aber weder die Fähigkeit einer eigenständigen Replikation noch einen eigenen Stoffwechsel und sind deshalb auf den Stoffwechsel einer Wirtszelle angewiesen. Daher sind sich Virologen weitgehend darüber einig, Viren nicht zu den Lebewesen zu rechnen. Bislang sind etwa 3.000 Virenarten identifiziert worden. Viren befallen Zellen von Eukaryoten (Pflanzen, Pilze, Tiere, Menschen) und Prokaryoten (Bakterien und Archaeen).
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Das Coronavirus ist Mitglied der Familie der Coronaviridae, die eine Familie innerhalb der Ordnung Nidovirales ist. Die Familie Coronaviridae wird auf der Grundlage von phylogenetischen Eigenschaften und Wirtsspektrum in zwei Unterfamilien und die Gattungen Alpha-, Beta- und Gamma- (ehemals Gruppen 1, 2 und 3 der alten Gattung Coronavirus) und Deltacoronavirus sowie Torovirus und Bafinovirus unterteilt. Das Coronavirus ist der Unterfamilie Coronavirinae, darin der Gattung Gamma-Coronavirus, zugeordnet. Die Spezies-Bezeichnung nach ICTV lautet: Avian Coronavirus. Diese umfasst neben dem Infektiöse-Bronchitis-Virus (IBV), also den Erreger der Infektiösen Bronchitis, beispielsweise auch Truthahn/Puten-Coronavirus (TCoV) und Fasanen-Coronavirus (PhCoV), Enten-Coronavirus, Gänse-Coronavirus und Tauben-Coronavirus.
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Mit Genomlängen von mehr als 30.000 Nukleotiden gehören die Coronaviridae zu den RNA-Viren mit den größten bekannten Genomen. Im Gegensatz zur üblicherweise hohen Fehlerrate der RNA-Polymerase anderer RNA-Viren, die zu einer Beschränkung der Genomlänge auf etwa 10.000 Nukleotide führt, wird bei Coronaviren eine relativ hohe genetische Stabilität unter anderem durch eine 3'-5'-Exoribonuklease-Funktion des Proteins Nsp-14 erreicht. Das einzelsträngige RNA-Genom der Coronaviren ist etwa 27.600 bis 31.000 Nukleotide (nt) lang, womit Coronaviren die längsten Genome aller bekannten RNA-Viren aufweisen. Am 5'-Ende befinden sich eine 5'-Cap-Struktur und eine nicht-kodierende Region (UTR, untranslated region, „nicht translatierte Region“) von etwa 200 bis 400 nt, die eine 65 bis 98 nt kurze, sogenannte Leader-Sequenz enthält. Am 3'-Ende fügt sich eine weitere UTR von 200 bis 500 nt an, die in einem poly(A)-Schwanz endet. Das Genom der Coronaviren enthält 6 bis 14 Offene Leserahmen (ORFs, „open reading frames“), von denen die beiden größten, die Gene für die Nichtstrukturproteine 1a und 1b, nahe am 5'-Ende liegen und sich mit unterschiedlichen Leserastern geringfügig überlappen. Die Überlappungsstelle bildet eine Haarnadelstruktur, die bei 20 bis 30 % der Lesedurchläufe einen Leserastersprung bei der Translation an den Ribosomen ermöglicht und so zur Synthese von geringeren Mengen des 1b-Proteins führt.
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Morphologisch betrachtet besitzen die 120 bis 160 nm großen Virionen eine Virushülle, in die 3 oder 4 verschiedene Membranproteine eingelagert sind: Das große, glykosylierte S-Protein (180 bis 220 kDa) bildet als Trimer mit seinen keulenförmigen, etwa 20 nm nach außen ragenden Spikes (Peplomere) das charakteristische, kranzförmige Aussehen der Coronaviren (lat. corona: Kranz, Krone). In geringeren Mengen liegt ein zweites Membranprotein E (9 bis 12 kDa) vor. Beim Humanen Coronavirus OC43 und den Coronaviren der Gruppe 2 liegt zusätzlich das HE-Protein (Hämagglutin-Esterase-Protein, 65 kDa) vor. Das ebenfalls in der Hülle verankerte M-Protein (23 bis 35 kDa) ist nach innen gerichtet und bekleidet die Innenseite der Virushülle (Matrixprotein). Im Inneren befindet sich ein helikaler Nukleoproteinkomplex. Dieser besteht aus dem Nukleoprotein N (50 bis 60 kDa), das mit einem Strang einer einzelsträngigen RNA mit positiver Polarität komplexiert ist. Bestimmte nach außen ragende Aminosäurereste des N-Proteins interagieren mit dem Matrixprotein M, so dass das Kapsid mit der Membraninnenseite assoziiert ist.
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Die Vertreter der Virusfamilie Coronaviridae verursachen bei verschiedenen Wirbeltieren wie Säugetieren, Nagetieren, Fischen und Vögeln sehr unterschiedliche Erkrankungen. Coronaviren sind genetisch hochvariabel und einzelne Virusspezies können durch Überwindung der Artenbarriere auch mehrere Wirtspezies infizieren.
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Bei Vögeln erfolgt die Ausscheidung des Virus über Sekrete und Exkrete. Eintrittspforten des Virus sind vor allem Lidbindehäute und Schleimhäute des oberen Verdauungstraktes und des Atemsystems. Die Übertragung erfolgt vor allem als Tröpfcheninfektion, wobei mit Viren beladene Staubkörner und Tröpfchen weite Entfernungen zurücklegen können. Das Virus besiedelt das Flimmerepithel der Atemwege, aber auch der Reproduktionstrakt und die Nieren können befallen werden. In Geflügelbeständen breitet sich die infektiöse Bronchitis (IB) rasch aus und vor allem Jungtiere zeigen eine hohe Erkrankungshäufigkeit (Morbidität bis zu 100%). Die Mortalität variiert je nach Virus-Variante. Die Inkubationszeit beträgt 18 bis 36 Stunden. Klinisch treten Atemnot, Nasenausfluss, röchelnde Atemgeräusche, Niesen und Bindehautentzündung auf. Zudem sind Allgemeinstörungen mit Fressunlust zu beobachten. Eileiterinfektionen führen später zu Legestörungen wie blassen, dünnschaligen, deformierten Eiern, Windeiern, deutlich verminderter oder vollständig fehlender Legetätigkeit („falsche Leger“) und verminderter Schlupfrate. Die Dauer der Erkrankung kann variieren. Bei manchen Virus-Stämmen kann eine Niereninfektion nachfolgen, die zu einer hohen Mortalität durch Nierenversagen bzw. Blutvergiftung (Toxinämie) führen kann. Bei vordergründiger Atemwegsproblematik verenden Hühner teils aufgrund von trachealer Okklusion durch Schleim und weitere Entzündungsprodukte.
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Die schnelle Ausbreitung im Bestand und die klinischen Erscheinungen erlauben eine Verdachtsdiagnose. Die Diagnosestellung kann mit Hilfe pathologischer Untersuchung verendeter Vögel sowie anhand molekularbiologischer, serologischer und virologischer Nachweisverfahren erfolgen. Differentialdiagnostisch sind z.B. Mykoplasmose, Infektiöse Laryngotracheitis, Infektiöser Hühnerschnupfen und Newcastle-Krankheit, aber auch nichtinfektiöse Erkrankungen (Fütterungsfehler, Managementfehler) abzugrenzen. Eine Behandlung ist allenfalls symptomatisch möglich. Die Bekämpfung basiert daher vor allem auf der prophylaktischen Impfung, die bereits unmittelbar nach Schlupf des Kükens (Broiler) bzw. in den ersten Lebenswochen der Tiere erfolgen kann. Je nach Infektionsdruck ist die Impfung in gefährdeten Gebieten in regelmäßigen Abständen gemäß Impfstoffherstellerangaben, gegebenenfalls auch unter Einsatz mehrerer Impfstoff-Varianten, zu wiederholen.
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Derzeit erscheint aufgrund häufig auftretender Infektionen des Infektiösen Bronchitis Virus auch in geimpften Herden die Bekämpfungs- bzw. Prophylaxestrategie durchaus verbesserungswürdig. Die Haltung von Geflügel in der Aufzucht- sowie Produktionsphase stellt angesichts des Vorkommens der Infektiösen Bronchitis nach wie vor eine große Herausforderung dar. Die Erkrankung eines Bestandes ist sowohl unter Aspekten der Tiergesundheit und somit dem Allgemeinbefinden der erkrankten Tiere, als auch unter wirtschaftlichen Aspekten von großer Bedeutung. Wie bereits eingangs erläutert ist die Infektiöse Bronchitis (IB) eine akute und hoch ansteckende Erkrankung der Atemwege von Hühnern. Die Krankheit wird durch das Infektiöse Bronchitis Virus (IBV), einem Coronavirus, verursacht und ist gekennzeichnet durch respiratorische Symptome, einschließlich Keuchen, Husten, Niesen, tracheales Rasseln und Nasenausfluss. Bei jungen Hühnern kann schwere Atemnot auftreten. Bei Legehennen wird Atemnot, Nephritis, (erheblicher) Rückgang der Eierproduktion und der Verlust der Eierqualität im Inneren (wässriges Eiweiß) und Äußeren (dünnschalige Eier, weiche, unregelmäßige, raue Schalen, fehlende Schalen (Windeier)) beobachtet.
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Zur Ätiologie des Infektiösen Bronchitis Virus (IBV) ist festzuhalten, dass IBV das erste beschriebene Coronavirus ist und genetisch und phänotypisch sehr stark variiert, mit hunderten von beschriebenen Serotypen und Stämmen. Coronaviren enthalten das größte bekannte virale RNA-Genom nach Anzahl von Nukleotiden, mit annähernd 30.000 Basen. Die RNA bildet einen einzelnen Strang und einzelnes Segment. Die IBV-Diversität basiert auf einem Fehler der Transkription, der von hoher Relevanz ist, wenn er in genomischen Sequenzen auftritt, die für Proteine kodieren, die bei der Anlagerung an die Zielzelle oder beim Induzieren von Immunantworten beteiligt sind. Aufgrund von Transkriptionsfehlern können Varianten auftreten, die in krankheitsanfälligen Hühnern einen evolutionären Vorteil aufweisen. Es können sehr große genomische Veränderungen stattfinden, z.B. mit vollständigem Gen-Austausch, durch Reassortment („Neuanordnung“) bei der Replikation, wobei multiple subgenomische mRNAs erzeugt werden und das Reassortment bei Coinfektionen ermöglichen.
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Die gegenwärtige IBV-Problematik lässt sich somit wie folgt zusammenfassen:
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Das Infektiöse Bronchitis Virus (IBV) ist der Erreger einer akuten und hoch ansteckenden Krankheit, die Hühner jeden Alters befällt und eine große wirtschaftliche Belastung in der Geflügelindustrie darstellt. Das Virus weist ein breites Spektrum von antigenetisch und genetisch unterschiedlichen Virustypen auf, was Prävention und Kontrolle dieses Erregers äußerst komplex macht. Das IB-Virus ist hauptsächlich beim Huhn zu finden. Darüber hinaus können das IB-Virus oder IBV-ähnliche und andere Vogelcoronaviren in Haus- und Wildtieren, einschließlich Hausgeflügel, Rebhühnern, Gänsen, Tauben, Perlhühnern, Krickenten, Enten und Pfauen auftreten (Cavanagh, D., 2005, Coronaviruses in poultry and other birds, Avian Pathol. 34 (6), 439–448; Cavanagh, D., 2007, Coronavirus avian infection bronchitis virus, Vet. Res. 38(2), 281–297).
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Das IBV ist ein einzelsträngiges, positiv-orientiertes RNA-Virus der Familie Coronaviridae, Gattung Gammacoronavirus (Cavanagh und Naqi, 2003; International Committee on Taxonomy von Viren, http://www.ictvonline.org/virustaxonomy.asp). Das virale Genom enthält zwei nicht-translatierte Regionen (UTRs) am 5'- und 3'-Enden (Boursnell et al, 1987; Ziebuhr et al, 2000), zwei überlappende offene Leserahmen (ORFs), die für die Polyproteine 1a und 1ab kodieren, und Regionen, die für die wichtigsten Strukturproteine kodieren – Spike (S), Hülle (E), Membran (M) und Nucleocapsid (N) (Spaan et al, 1988; Sutou et al., 1988.). Darüber hinaus wurden zwei akzessorische Gene, ORF3 und ORF5, welche die Proteine 3a und 3b beziehungsweise 5a und 5b exprimieren, beschrieben (Casais et al, 2005; Hodgson et al, 2006; Lai und Cavanagh, 1997). Das S-Protein (–3462 nt), das in der Oberfläche der Virusmembran lokalisiert ist, ist der wichtigste Auslöser für neutralisierende Antikörper (Cavanagh und Naqi, 1997; Winter et al., 2008) und ist für die Virusbindung und das Eindringen in die Wirtszellen verantwortlich (Cavanagh et al, 1986a; Koch et al, 1990; Niesters et al, 1987). Es wird post-translational an einer Spaltstelle mit multiplen basischen Aminosäuren (Cavanagh et al., 1986b) in die Amino-terminale S1-(–535 Aminosäuren) und die Carboxyl-terminale S2-Untereinheit (–627 Aminosäuren) gespalten.
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Die Beobachtung, dass sich IB Serotypen auf der genomischen Ebene um 20% bis 25% und in bis zu 50% der Aminosäuren des S1-Proteins (Cavanagh et al., 2005) unterscheiden können, hat zu beträchtlicher Aufmerksamkeit (Cavanagh und Gelb 2008) geführt. Solche Variabilität kann zu wichtigen biologischen Unterschieden zwischen Stämmen führen und als Ergebnis einer begrenzten Anzahl von Aminosäureveränderungen im Spike-Protein können neuartige Serotyp-Varianten entstehen. Nukleotid-Heterogenität ist im S1-Teil des S-Gens weit verbreitet, und ist größtenteils innerhalb drei verschiedener hypervariabler Regionen (HVRS) im S1-Gen (aa 38–67, 91–141 und 274–387) (Cavanagh et al, 1988; häufigsten Moore et al., 1997) enthalten. Demgemäß wurde üblicherweise die Analyse der vollständigen oder teilweisen S1-Gen-Nukleotidsequenz verwendet, um virale genetische Typen zu bestimmen.
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Derzeit sind mehr als 50 verschiedene antigenetische und genetische Typen von IBV anerkannt, einige mit erheblichen wirtschaftlichen Auswirkungen auf die Tierhaltung, und einige andere auf bestimmte geographische Gebiete beschränkt (de Wit et al, 2011a; Jackwood, 2012). Eine wirksame Überwachung wird in erster Linie auf die Identifizierung des krankheitsverursachenden Virustyps gestützt (Jackwood und de Wit, 2013). Eine Vielzahl von Verfahren ist entwickelt worden, um IBV-Stämme zu differenzieren. Systeme, welche die antigenetischen oder genetischen Eigenschaften eines Isolats untersuchen, ermöglichen die Beschreibung von Serotypen und Genotypen, während Methoden, die auf die Immunantwort von Hühnern gegen eine Herausforderung mit einem IBV-Stamm ausgerichtet sind, zur Definition von Protektortypen führen (Lohr, 1988). Von großer Bedeutung ist jedoch, dass die Genotyp-, Serotyp- oder Protektortyp-basierten Ansätze IB-Viren nicht immer in der gleichen Weise eingruppieren. Mangels schneller und geeigneter biologischer Assays zur Klassifizierung von IBV, sind Analysen der S1-Sequenzdaten die am häufigsten verwendeten Verfahren, um IBV-Stämme Gruppen zuzuordnen, die bislang scheinbar willkürlich in genetische Typen, Genotypen, Kladden oder Cluster unterteilt werden.
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Das Infektiöse Bronchitis Virus (IBV) ist der Erreger einer hoch ansteckenden Krankheit in der globalen Geflügelindustrie, was gravierende wirtschaftliche Verluste verursacht. Das Virus existiert in einer Vielzahl genetisch unterschiedlicher Virustypen. Sowohl phylogenetische Analyse als auch Messungen der paarweisen Ähnlichkeit zwischen Nukleotid- oder Aminosäuresequenzen wurden verwendet, um IBV-Stämme zu klassifizieren. Bis vor kurzem gab es allerdings keinerlei Konsens über die Methode, mit der IBV-Sequenzen verglichen werden sollten. Heterogene Bezeichnungen genetischer Gruppen, die mit phylogenetischer Geschichte unvereinbar sind, wurden übernommen, was zu einer verwirrenden Koexistenz mehrerer Systeme der Genotypisierung führte.
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Die Akzeptanz einer international anerkannten viralen Nomenklatur ist jedoch von entscheidender Bedeutung für die Durchführung fundierter Studien und um neue Erkenntnisse bezüglich Epidemiologie und Evolution von IBV zu erzielen und zu evaluieren. Um die vorstehend beschriebene Problematik des Standes der Wissenschaft zu lösen, haben nun Valastro et al. ein, in 2016 publiziertes (Valastro V., Holmes E.C., Britton P., Fusaro A., Jackwood M.W., Cattoli G., Monne I., S1 gene-based phylogeny of infectious bronchitis virus: An attampt to harmonize virus classification, Infection, Genetics and Evolution, 39 (2016), 349–364), neues Klassifikationsschema auf Basis phylogenetischer Beziehungen (basierend auf dem S1-Gen) entwickelt, das aktualisiert und überarbeitet werden kann, sobald neue S1-Sequenzen verfügbar werden. Valastro et al. beschreiben ein einfaches und reproduzierbares Phylogenie-basiertes Klassifizierungssystem kombiniert mit einer eindeutigen und rationalen Nomenklatur der Abstammungslinie für die Zuordnung von IBV-Stämmen. Durch die Verwendung von vollständigen S1-Gensequenzen konnten diese miteinander verglichen und prozentuale Ähnlichkeiten und Divergenzen zueinander ermittelt werden. Die Sequenzanalysen resultierten in eine Einteilung in 6 Genotypen, wobei ein Grenzwert von ca. 30% Sequenzunterschied zwischen den einzelnen IBV-Stämmen im S1-Gen ermittelt wurde, ab dem die Stämme einem neuen Genotyp zugeordnet wurden. Die große Mehrheit der IBV-Stämme gehört dem Genotyp I an und bildet innerhalb dieses Genotyps wiederum Subcluster aus, welche als Linien innerhalb eines Genotyps bezeichnet werden. Für den Genotyp I werden insgesamt 27 Linien und für die Genotypen II–VI jeweils eine Linie beschrieben. Neben den Genotypen und Linien werden einzelne S1-Gensequenzen von IBV-Stämmen als UV (Unique Variant) bezeichnet. Diese konnten keiner der definierten Linien zugeordnet werden. Aufgrund der umfangreichen Veränderungsrate innerhalb der IB-Viren, schlagen Valastro et al. vor, dass der Rückschluss auf die phylogenetischen Beziehungen allein ein besser geeignetes Kriterium für die Sequenz-Klassifizierung darstellt als paarweise Sequenzvergleiche, zumal das von Valastro et al. vorgestellte Klassifikationsschema beim Auffinden neuer S1-Sequenzen aktualisiert und überarbeitet werden kann.
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Den Erfindern ist es gelungen, eine neue Variante des IBV zu isolieren und zu sequenzieren. Diese neue Variante sowie Varianten davon werden nachfolgend auch als IB80 benannt. Die IB-Variante „IB80“ ist genauer beschrieben in der deutschen Patentanmeldung mit dem Amtsaktenzeichen DE 102016215118.5. Diese Anmeldung wird im Wege der Verweisung insbesondere hinsichtlich der darin offenbarten Sequenzen Bestandteil dieses Textes. Dieses neue Virus wird für die eingangsbeschriebenen Legeleistungseinbrüche zumindest mitverantwortlich gemacht.
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Dementsprechend besteht ein Bedarf darin, ein geeignetes Nachweisverfahren für das Vorhandensein der IB-Variante „IB80“ in einer biologischen Probe zur Verfügung zu haben. Bevorzugt sollte dieses Verfahren über eine hohe Spezifität verfügen und vor allem gegenüber dem Vorliegen anderer IBV-Varianten unterscheiden können.
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Beschreibung der Erfindung
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Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zum Nachweis des IB Virus, Variante IB80, umfassend die Schritte,
- a) Bereitstellen einer Probe, die potentiell das IB Virus, Variante IB80 erhält,
- b) Bereitstellen eines Nachweissystems, das das S Gen des IB Virus, Variante IB80 mit der Nukleinsäure der Sequenz SEQ ID NO: 1 oder das Produkt des S Gens des IB Virus, Variante IB80 mit der Nukleinsäure der Sequenz SEQ ID NO: 1 und/oder ein Protein mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 2 nachweist, und
- c) Nachweisen des IB Virus, Variante IB80 mit Hilfe des in Schritt b) bereitgestellten Nachweissystems im Falle, dass die in Schritt a) bereitgestellte Probe IB Virus, Variante IB80 enthält.
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Kern des Verfahrens ist dabei, dass sich das Nachweissystem auf den Nachweis des Vorhandenseins des S-Gens des IB80-Virus oder des Genproduktes des S-Gens stützt. Die Sequenz dieses Gens war bislang nicht bekannt und die Aufklärung dieser Sequenz ermöglicht somit erstmalig das Nachweisverfahren.
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Als Nachweisverfahren auf Basis des gerade Beschriebenen eignen sich im Prinzip alle dem Fachmann für solche Zwecke geeignete Nachweisverfahren. Bevorzugte Beispiele für solche Nachweisverfahren sind Immunfluoreszenz gestützte Verfahren, Nachweise per isothermaler Amplifikation, Real-Time PCR Nachweise mit Farbstoffen wie zum Beispiel SYBR, Real-Time PCR basierte Nachweise mittels Taqman Sonden, Molecular Beacons, Minor Groover Bindern oder Amplifluor, Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET), Fluoreszenz in situ Hybridisierung, Antikörper gestützte Nachweisverfahren wie ELISA oder Lateral Flow Testsysteme und insbesondere eine Real-Time RT-PCR. Als Probe eignet sich im Prinzip jede Probe, die für das entsprechende Nachweisverfahren geeignet ist. Hier wird der Fachmann die entsprechenden Auswahlen treffen.
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Im Schritt b) des erfindungsgemäßen Verfahrens wird ein Nachweissystem bereitgestellt, das das S-Gen des IB80-Virus oder das Gen-Produkt dieses S-Gens nachweisen kann. Hierbei reicht für einen Nachweis selbstverständlich, dass auch das Vorhandensein von Fragmenten des Gens beziehungsweise des Proteins nachgewiesen werden. Bevorzugt ist das Nachweissystem so spezifisch, dass es Sequenzen mit einer Sequenz ID Identität zu SEQ ID: NO: 1 von ≥ 85 % beziehungsweise zu Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 2 von ebenfalls ≥ 85 % nachweist. Bevorzugt betrifft der erfindungsgemäße Nachweis nur Sequenzen mit einer Identität von ≥ 90 %, weiterbevorzugt ≥ 95 %, noch weiter bevorzugt ≥ 98 % und ganz besonders bevorzugt ≥ 99 % zur SEQ ID NO: 1 oder NO: 2.
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Im Schritt c) wird in Abhängigkeit von dem eingesetzten Nachweissystem geprüft, ob die nachzuweisende Nukleinsäure (einschließlich deren Fragmente) oder die nachzuweisende Aminosäuresequenz vorhanden sind. Mit diesem Verfahren ist es möglich, das Vorhandensein von IB80 in einer biologischen Probe zuverlässig festzustellen. Da IB80 im S1-Gen sich deutlich von anderen IB-Virus-Varianten unterscheidet, ist das eingesetzte Nachweisverfahren besonders zuverlässig.
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Bevorzugt ist eine erfindungsgemäßes Verfahren, wobei das in Schritt b) bereitgestellte System spezifische Antikörper gegen eine Nukleinsäure der Sequenz SEQ ID NO: 1 oder das Produkt des S Gens des IB Virus, Variante IB80 mit der Nucleinsäure der Sequenz SEQ ID NO: 1 und/oder ein Protein mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 2 umfasst. Da die genetische Struktur des IB80-Virus aufgeklärt ist, ist es auch möglich, entsprechende Antikörper, bevorzugt monoklonale Antikörper, gegen die Nukleinsäure des S-Gens beziehungsweise die Aminosäuresequenz des dazugehörigen Proteins zu erzeugen. Hierzu wird auf die oben genannte deutsche Patentanmeldung für das IB80-Virus verwiesen. Dem Fachmann sind eine Vielzahl von Antikörper gestützten Nachweissystemen bekannt. Somit ist es möglich, ein zuverlässiges Nachweissystem auf Basis von Antikörpern einzusetzen.
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Bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren, wobei das in Schritt b) bereitgestellte System eine reverse Transkription der Nukleinsäure Sequenz SEQ ID NO: 1 oder eines Teiles davon in DNA gewährleistet.
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Da IB-Viren RNA-Viren sind, kann es vorteilhaft sein, wenn für Nachweisverfahren die RNA dieser Viren, hier insbesondere die Sequenz des S1-Gens oder eines Teils davon in DNA umgeschrieben werden.
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Bevorzugt erfolgt die reverse Transkription über eine M-MLV Reverse Transkriptase oder ähnliche.
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Bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren, wobei das in Schritt b) bereitgestellte System eine Amplifikation wenigstens eines Abschnitts der in DNA transkribierten Nucleinsäure der Sequenz SEQ ID NO: 1 gewährleistet. Nachweissysteme, die auf Basis der Amplifikation von DNA beruhen, sind der Fachwelt bekannt und sind gut etabliert.
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Bevorzugt erfolgt die Amplifikation durch den Einsatz einer Taq DNA Polymerase oder ähnliche. Besonders bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren, wobei das in Schritt b) bereitgestellte System eine unter PCR-Bedingungen ein Nachweissignal erzeugende Sonde gegen einen Abschnitt der in DNA transkribierten Nukleinsäure der Sequenz SEQ ID NO: 1 umfasst.
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In diesem Zusammenhang bedeutet „unter PCR Bedingungen“, dass die Sonde während der Amplifikationsphase durch die Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) an einen Abschnitt der transkribierten Nukleinsäure insbesondere einen amplifizierten Abschnitt der transkribierten Nukleinsäure bindet.
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Das Nachweissignal der Sonde kann jedes geeignete Nachweissignal sein, zum Beispiel ein Farbstoff, radioaktive Markierung, wobei ein Fluoreszenzsignal im Sinne der Erfindung besonders bevorzugt ist.
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Mit diesen Signalen und mit der Bindungsfähigkeit der Sonde ist es möglich, bereits während der Amplifikationsphase Erkenntnisse über das Vorhandensein von IB80 und sogar über die Konzentration dieser Variante in der zu messenden Probe zu gewinnen.
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Bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren, wobei das Nachweissystem eine Real-Time RT-PCR umfasst.
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Real-Time RT-PCR ist ein Verfahren, das für viele Anwendungen etabliert ist. Es liefert schnell und zuverlässig Daten über die nachzuweisende Verbindung beziehungsweise in diesem Falle über die nachzuweisende Virusvariante IB80.
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Bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren, wobei das Nachweissystem ein Primer der SEQ ID NO: 3 und/oder einen Primer der SEQ ID NO: 4 und/oder eine Sonde der SEQ ID NO: 5 umfasst.
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Besonders bevorzugt ist es in diesem Zusammenhang, dass ein Primer der SEQ ID NO: 3 und einem Primer der SEQ ID NO: 4 eingesetzt wird. Ganz besonders bevorzugt ist, dass hierzu zusätzlich noch eine Sonde der SEQ ID NO: 5 eingesetzt wird.
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Diese Primer und diese Sonde haben sich als besonders geeignet für das erfindungsgemäße Verfahren herausgestellt.
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Bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren, wobei das Nachweissystem eine Positivkontrolle für das IB Virus, Variante IB80 und/oder eine Negativkontrolle für das IB Virus, Variante IB80 umfasst.
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Durch das Vorsehen einer Positiv- und/oder einer Negativkontrolle sind die Ergebnisse des Nachweisverfahrens besonders gut verifizierbar.
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Teil der Erfindung ist auch ein Kit für ein erfindungsgemäßes Verfahren, umfassend ein Primerpaar zur Amplifikation eines Abschnitts der in DNA transkribierten Nukleinsäure der Sequenz SEQ ID NO: 1 oder spezifische Antikörper gegen (i) eine Nukleinsäure der Sequenz SEQ ID NO: 1 und/oder (ii) das Produkt des S-Gens des IB Virus, Variante IB80 mit der Nucleinsäure der Sequenz SEQ ID NO: 1 und/oder ein Protein mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 2 sowie weitere Reagenzien für das Nachweisverfahren wie oben definiert.
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Bevorzugt umfasst das erfindungsgemäße Kit dabei ein Primerpaar gemäß der SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 4.
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Mittels dieses Kits ist das erfindungsgemäße Nachweisverfahren besonders gut durchführbar.
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Bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Kit, wobei als weitere Reagenzien eine Sonde zum Binden an einen Teil der in DNA transkribierten Nukleinsäure der Sequenz SEQ ID NO: 1 und/oder einen oder mehrere geeignete Puffer und/oder geeignete Nukleotide und/oder eine RNA-abhängige DNA-Polymerase und/oder eine DNA-abhängige DNA-Polymerase zum Amplifizieren eines Teils der in DNA transkribierten Nukleinsäure der Sequenz SEQ ID NO: 1 enthalten sind.
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Dabei sind die weiteren Reagenzien bevorzugt die oben als bevorzugt beschriebenen Varianten. Erläuterung der Sequenzen:
| SEQ ID NO: 1 | S-Gen von IB80 |
| SEQ ID NO: 2 | S-Protein von IB80 |
| SEQ ID NO: 3 | Beispiel für einen Forward Primer |
| SEQ ID NO: 4 | Beispiel für einen Reverse Primer |
| SEQ ID NO: 5 | Beispiel für eine Sonde |
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Nachfolgend wird die Erfindung anhand eines Beispiels näher definiert:
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Beispiel
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System für ein erfindungsgemäßes Verfahren
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1. Oligonukleotid-Design:
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Basierend auf der Genomsequenz des S-Gens (SEQ ID NO: 1) des Infektiösen Bronchitis Virus „Variante IB80“ wurden Sequenzen für Primerpaare sowie entsprechende Hydrolyse-Sonden zum spezifischen Nachweis in der Real-Time RT-PCR händisch erarbeitet und etabliert. Aufgrund der hohen Divergenz zu allen übrigen IBV-Stämmen in der Gen-Sequenz dieser Region wurde das S1-Gen für den Nachweis per Real-Time PCR ausgewählt. Ein bevorzugtes Primer/Sonden Setup für eine Real-Time PCR ist in Tabelle 1 dargestellt. Tabelle 1: Primer- und Sondensequenzen IB80 Real-Time RT-PCR
| Name | Sequenz 5´-3´ | SEQ ID NO: |
| IB80-F | AGTGTAGTATAGTAGGTGACAAT | 3 |
| IB80-R | ACATCATGTGCTGTACCATT | 4 |
| IB80-P | FAM-CCACCTATTTTAGCAGGTTATATTGTAGTTGGT-BHQ1 | 5 |
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2. Real-Time RT-PCR Setup:
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Das Setup für die Real-Time RT-PCR in einem finalen Volumen von 20 µl ist in Tabelle 2 angegeben. Tabelle 2: PCR Setup
| Komponente | Volumen | Finale Konzentration |
| BCD 2x RT-qPCR-Mix (AniCon Labor GmbH, Deutschland) | 10 µl | 1x |
| IB80-F | var | 400 nM |
| IB80-R | var | 400 nM |
| IB80-P | var | 100 nM |
| H2O molbiol | add 16 µl | |
| RNA (Probe) | 4 µl | |
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3. Temperaturprofil:
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Die IB80 Real-Time RT-PCR wird bei Verwendung des BCD 2x RT-qPCR-Mixes mit dem in Tabelle 3 dargestellten Temperaturprofil gefahren. Tabelle 3: Temperaturprofil der IB80 Real-Time RT-PCR
| Schritt | Funktion | Temperatur/Zeit | Zyklen |
| 1 | Reverse Transkription | 50°C für 10 min | 1x |
| 2 | Aktivierung Polymerase und Denaturierung | 95°C für 1 min | 1x |
| 3 | Denaturierung | 95°C für 10 sec | insg. 42 Wiederholungen von Schritt 3 & 4 |
| 4 | Annealing und Extension | 60°C für 60 sec |
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4. Kontrollen
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Zur Sicherstellung der Validität des real-time RT-PCR Laufes kann eine IB80 Positivkontrolle (z.B. Virusisolat hinterlegt bei Public Health England – National Collection of Pathogenic Viruses) und/oder eine Negativkontrolle eingestellt werden. Die IB80 Positivkontrolle sollte auf einen CT-Wert zwischen 25 und 30 eingestellt werden, um eine stabile Amplifikation bei einem niedrigen Kreuzkontaminationsrisiko sicherzustellen.
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Die Qualität der RNA-Aufbereitung der fraglichen Probe bezüglich der Eignung zur Reversen Transkription und Amplifikation sollte bevorzugt geprüft sein, z.B. anhand des parallelen Nachweises von sog. „Housekeeping“ Zielgenen oder artifiziell der Probe zugefügten RNA-Produkten.
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5. Auswertung
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Alle Proben mit einem CT-Wert < 42 im FAM-spezifischen Kanal werden als positiv bewertet. Nur Kurvenverläufe mit einer typischen exponentiellen Amplifikation sind als positiv anzusehen. Mit dem System aus diesem Beispiel lässt sich das erfindungsgemäße Verfahren zuverlässig durchführen und IB80 in biologischen Proben nachweisen.
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Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25.
Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
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Zitierte Nicht-Patentliteratur
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- Cavanagh, D., 2005, Coronaviruses in poultry and other birds, Avian Pathol. 34 (6), 439–448 [0014]
- Cavanagh, D., 2007, Coronavirus avian infection bronchitis virus, Vet. Res. 38(2), 281–297 [0014]
- Cavanagh und Naqi, 2003 [0015]
- International Committee on Taxonomy von Viren, http://www.ictvonline.org/virustaxonomy.asp [0015]
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- Ziebuhr et al, 2000 [0015]
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