CN112795697A - 一种用于同时检测多种鸡传染性支气管炎病毒的引物对、试剂盒及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于同时检测多种鸡传染性支气管炎病毒的引物对、试剂盒及其检测方法。该引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和2所示；检测方法为：(1)提取样品RNA，反转录得到cDNA备用；(2)以步骤(1)所得cDNA为模板，采用权利要求1所述引物对其进行PCR扩增，回收纯化扩增产物后，根据扩增结果判断是否含有鸡传染性支气管炎病毒。本发明能够同时检测Mass、QX、793B、TW、ck/CH/LSC/99I、TC07‑2这6种常见基因型IBV，鉴定方法快速高效，能够大规模检测，适于推广应用。
Description
技术领域
本发明属于禽类病毒检测技术领域，具体涉及一种用于同时检测多种鸡传染性支气管炎病毒的引物对、试剂盒及其检测方法，可用于检测我国目前主要流行的基因型鸡传染性支气管炎病毒。
背景技术
传染性支气管炎(Infectious bronchitis,IB)是由冠状病毒科的传染性支气管炎病毒(Infectiousbronchitis virus,IBV)引起的一种急性、高度接触性传染病，以呼吸道症状、产蛋率和品质下降、肾脏病变等为特征。病鸡表现为咳嗽、喷嚏、发出气管啰音，幼鸡流鼻液，蛋鸡产蛋数量和质量下降，肉鸡食欲不振，肾型病鸡肾肿大、苍白，有大量尿酸盐沉积。各品种和年龄的鸡均易感，但主要侵害1～4周龄的幼鸡。
在鸡传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus，IBV)的检测和诊断中，由于其基因型种类多，不同基因型毒株之间全基因组序列差异较大(86％-98.8％)；在临床症状上与鸡新城疫、鸡传染性喉气管炎及鸡传染性鼻炎相似，所以IBV的实验室检测和诊断较为复杂困难。目前常规检测IBV的技术主要有病毒分离、血清学试验、病毒干扰试验和常规RT-PCR等,但这些方法在敏感性、特异性和时效性等方面都存在不足。常规RT-PCR方法以其简单、快捷的特点被用作IBV的实验室诊断方法，但该方法不能用于IBV的定量检测，并且对病毒含量很低的病料也不能够很好地检出。现阶段存在一些针对特定基因型IBV的荧光定量检测方法，其局限在于不能测定其它流行基因型IBV毒株。
发明内容
针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种用于同时检测多种鸡传染性支气管炎病毒的引物对、试剂盒及其检测方法，本发明能够同时检测目前主要流行基因型鸡传染性支气管炎病毒，主要是针对Mass、QX、793B、TW、ck/CH/LSC/99I、TC07-2这6种常见IBV基因型病毒，鉴定方法快速高效，能够大规模检测，适于推广应用。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种用于同时检测多种鸡传染性支气管炎病毒的引物对，该引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和2所示。
进一步地，引物对用于扩增鸡传染性支气管炎病毒的保守区域1ab，检测对象为全长的病毒基因组核酸而不是亚基因组核酸。
进一步地，鸡传染性支气管炎病毒为我国目前主要流行基因型鸡传染性支气管炎病毒，其包括Mass、QX、793B、TW、ck/CH/LSC/99I、TC07-2基因型中的至少一种。
一种同时检测多种鸡传染性支气管炎病毒的方法，包括以下步骤：
(1)提取样品RNA，反转录得到cDNA备用；
(2)以步骤(1)所得cDNA为模板，采用权利要求1所述引物对其进行PCR扩增，回收纯化扩增产物后，根据扩增结果判断是否含有鸡传染性支气管炎病毒。
进一步地，PCR扩增体系为：TB Green 10μL、DNA模板1μL、SEQ ID NO.1和2所示引物各0.8μL，最后用ddH2O补足至20μL。
进一步地，PCR扩增条件为：95℃预变性30s；95℃变性10s；58℃退火20s；72℃延伸25s，共40个循环。
一种用于同时检测多种鸡传染性支气管炎病毒的试剂盒，包括上述引物对。
一种测定鸡传染性支气管炎病毒载量的方法，包括以下步骤：
(1)构建标准质粒，并采用权利要求1所述引物对进行PCR扩增，得到标准曲线；
(2)提取样品RNA，反转录得到cDNA备用；
(3)引物对与样品分别进行普通PCR扩增，检测通用性；
(4)以步骤(2)所得cDNA为模板，按照权利要求4所述过程进行PCR扩增，然后按照公式：样品核酸拷贝数＝样品核酸拷贝数×10×6计算其核酸拷贝数即可。
本发明的有益效果为：
本发明方法快速高效，能够大规模检测样品，实时荧光定量(Real-Time PCR)整个反应时间约1h，一次反应可以检测96份样品，可进行大批量样品检测，既节约时间，又提高了检测效率，简化了操作步骤，同时无PCR产物和溴化乙锭的污染。荧光定量方法的建立可以实现对模板的定量，而且灵敏度高，特异性强，重复性好，无污染。
本发明方法可以用来测定动物器官中的病毒含量，确定病毒在组织中的核酸拷贝数，为IBV的致病机理研究奠定了基础；对于IBV的检测比普通RT-PCR方法灵敏度高，能检出普通RT-PCR不能检出的病料。
附图说明
图1为质粒标准曲线图；
图2为引物通用性凝胶电泳检测结果；
图3为采用本申请方法检测H120株(Mass型)的Cq值结果；
图4为采用本申请方法检测Sczy3(QX型)的Cq值结果；
图5为采用本申请方法检测4/91(793B型)的Cq值结果；
图6为采用本申请方法检测ck/CH/SCGH/190505(TW型)的Cq值结果；
图7为采用本申请方法检测ck/CH/GZGY/191021(ck/CH/LSC/99I型)的Cq值结果；
图8为采用本申请方法检测ck/CH/YNSL/160501(TC07-2型)的Cq值结果。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。
实施例1引物设计
IBV病毒的开放阅读框1ab是基因组中的保守区域，能够编码一系列病毒复制酶，包括ORF1a和ORF1b，分别编码2个多聚蛋白(Polyprotein)，即ppla与pplb，分别裂解为16个非结构蛋白(NSP1-11与NSP12-16)。参考Mass型中毒株H120基因组序列，并分析比较QX、793B、TW、ck/CH/LSC/99I、TC07-2基因型代表株在此区域上的通用性，选择出一对通用性较好的实时荧光定量PC R引物。常规PCR无法对IBV做定量检测，此引物能够扩增1ab区域目的片段，通过建立基于TB Green的实时荧光定量PCR反应，确定产物的溶解曲线峰值，得到Cq值，用来同时测定多种基因型IBV的病毒载量，引物具体序列如下。
1abF2：5’-GGTAAGCATTGAGTGTTGTGGTGA-3’(引物位置：2623-2646)(SEQ IDNO.1)；
1abR2：5’-GGTTCTGGTGCCTCTGGAAACA-3’(引物位置：2763-2784)(SEQ ID NO.2).
实施例2荧光定量标准曲线的绘制
1、构建标准质粒
参考PMD19-T克隆试剂盒说明书，以Mass型中H120株cDNA为模板，克隆162bp的PCR产物。获得阳性质粒1ab后对质粒进行核酸浓度测定，信息如表1。
表1质粒IBV1浓度
2、绘制标准曲线
荧光定量试剂盒为STARPremix Ex TapTMⅡ(Til RNaseH Plus)，通过正交实验确定了荧光定量PCR最佳反应体系为：引物0.8μL，模板1μL，ddH2O 7.4μL，SYBR 10μL，总体积20μL。
确定最佳反应程序为(Roche)：95℃预变性30s，95℃变形10s，60℃退火20s，72℃延伸20s，40个循环，于每次循环的退火结束时收集荧光信号。循环结束时先升温至95℃，再降至65℃，再升温至95℃，此间收集荧光信号并生成溶解曲线。
然后将阳性质粒连续10倍梯度稀释(10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6)，根据最佳反应体系得到标准曲线为：y＝-3.4168LgX+10.51。其扩增效率E＝96％，相关性系数R2＝0.99，如图1所示。
图1中A为阳性质粒连续10倍梯度稀释(10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6)后的不同稀释度在最佳反应体系的情况下进行荧光定量RT-PCR得到的扩增曲线，每个梯度均进行了两次重复试验，从左至右曲线依次表示10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6的扩增曲线；B为阳性质粒在不同稀释度下，荧光定量RT-PCR的溶解曲线；C为荧光定量RT-PCR检测IBV的标准曲线，该标准曲线为：y＝-3.4168LgX+10.51。其扩增效率E＝96％，相关性系数R2＝0.99。
实施例3荧光定量检测
1、模板RNA的提取
(1)抽取细胞上清，取200μL样品加入800μL Tri-zol后剧烈震荡15s；
(2)室温静置5min后加入200μL氯仿，剧烈震荡15s；
(3)静置5min后，4℃12000r/min离心15min；
(4)取上清液于另一EP管中加入600μL异丙醇；
(5)轻轻混匀后，室温静置10min；
(6)12000r/min离心10min，试管底部可能出现沉淀；
(7)弃上清，加入75％乙醇1mL,轻轻混匀(切勿触及沉淀)；
(8)4℃12000r/min离心5min；
(9)小心弃上清(可瞬时离心后吸去液体)室温静置5min；
(10)加入20μL～30μL无RNA酶水，溶解后放入-70℃保存。
2、cDNA制备
以步骤(1)提取得到的RNA进行反转录获得模板cDNA；
反转录体系为：5×Mix 2μL；ddH2O 3μL；RNA模板5μL；
反转录程序为：37℃15min；85℃5s；4℃forever。
3、凝胶电泳初步检测通用性
将引物对分别与Mass、QX、793B、TW、ck/CH/LSC/99I、TC07-2进行普通PCR扩增，将5μL扩增产物加入1.0％琼脂糖凝胶中，电压100V，电泳30min，紫外线检测，结果如图2，图2中条带由左至右依次为：阴性、Mass、QX、793B、TW、ck/CH/LSC/99I、TC07-2和Marker。
4、实时荧光定量试验
(1)试验毒株：四川农业大学鸡病研究室分离鉴定保存的IBV毒株H120株(Mass型)、Sczy3(QX型)、4/91(793B型)、ck/CH/SCGH/190505(TW型)、ck/CH/GZGY/191021(ck/CH/LSC/99I型)、ck/CH/YNSL/160501(TC07-2型)试剂：TB GreenTM Premix Ex TaqTM反应液(购于宝生物)，
八联管(购于美国AXYGEN公司)
仪器：罗氏LightCycler96实时荧光定量PCR仪
使用罗氏LightCycler96 PCR仪器进行扩增。反应体系如下：上下游引物各0.8μL，DNA样品1μL，ddH2O 7.4μL,TB Green 10μL。反应体系条件为：95℃预变性30s；95℃变性10s，58℃退火20s，72℃延伸25s，共40个循环。在循环结束后收集荧光信号形成扩增曲线。反应结束后经95℃10S，65℃60S，97℃1S由软件自动生成溶解曲线。
试验结果如下：
H120株(Mass型)：Cq平均值为14.37，其结果见图3；图3中A为引物1abF2、1abR2与LDT3进行荧光定量RT-PCR，两条曲线为两次重复试验，得到扩增曲线，平均Cq值为14.37；B为引物1abF2、1abR2与LDT3进行荧光定量RT-PCR的溶解曲线，两条曲线为两次重复试验结果。
Sczy3(QX型)：Cq平均值为20.77，其结果见图4；图4中A为引物1abF2、1abR2与QX-99I进行荧光定量RT-PCR，两条曲线为两次重复试验，得到扩增曲线，平均Cq值为20.77；B为引物1abF2、1abR2与QX-99I进行荧光定量RT-PCR的溶解曲线，两条曲线为两次重复试验结果。
4/91(793B型)：Cq平均值为18.99，其结果见图5；图5中A为引物1abF2、1abR2与4/91进行荧光定量RT-PCR，两条曲线为两次重复试验，得到扩增曲线，平均Cq值为18.99；B为引物1abF2、1abR2与4/91进行荧光定量RT-PCR的溶解曲线，两条曲线为两次重复试验结果。
ck/CH/SCGH/190505(TW型)：Cq平均值为17.50，其结果见图6；图6中A为引物1abF2、1abR2与793B进行荧光定量RT-PCR，两条曲线为两次重复试验，得到扩增曲线，平均Cq值为17.50；B为引物1abF2、1abR2与793B进行荧光定量RT-PCR的溶解曲线，两条曲线为两次重复试验结果。
ck/CH/GZGY/191021(ck/CH/LSC/99I型)：Cq平均值为19.52，其结果见图7；图7中A为引物1abF2、1abR2与TC07-2进行荧光定量RT-PCR，两条曲线为两次重复试验，得到扩增曲线，平均Cq值为19.52；B为引物1abF2、1abR2与TC07-2进行荧光定量RT-PCR的溶解曲线，两条曲线为两次重复试验结果。
ck/CH/YNSL/160501(TC07-2型)：Cq平均值为13.54，其结果见图8。图8中A为引物1abF2、1abR2与QXL87进行荧光定量RT-PCR，两条曲线为两次重复试验，得到扩增曲线，平均Cq值为13.54；B为引物1abF2、1abR2与QXL87进行荧光定量RT-PCR的溶解曲线，两条曲线为两次重复试验结果。
5、计算核酸拷贝数
从H120、Sczy3、4/91、ck/CH/SCGH/190505、ck/CH/GZGY/191021、ck/CH/YNSL/160501中分别取200μL抽提RNA，最后用30μLDEPC水溶解RNA。按最优体系，每种样品2个重复进行荧光定量PCR，样品核酸拷贝数(ng/μL)是经过标准曲线换算得到，样品的核酸拷贝数计算公式为：样品核算拷贝数×10×6，结果见表2。
表2样品核酸拷贝数
序列表
<110> 四川农业大学
<120> 一种用于同时检测多种鸡传染性支气管炎病毒的引物对、试剂盒及其检测方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggtaagcatt gagtgttgtg gtga 24
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggttctggtg cctctggaaa ca 22
Claims (8)
1.一种用于同时检测多种鸡传染性支气管炎病毒的引物对，其特征在于，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和2所示。
2.根据权利要求1所述的引物对，其特征在于，所述引物对用于扩增鸡传染性支气管炎病毒的保守区域1ab。
3.根据权利要求1所述的引物对，其特征在于，所述鸡传染性支气管炎病毒包括Mass、QX、793B、TW、ck/CH/LSC/99I、TC07-2基因型中的至少一种。
4.一种同时检测多种鸡传染性支气管炎病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取样品RNA，反转录得到cDNA备用；
(2)以步骤(1)所得cDNA为模板，采用权利要求1所述引物对其进行PCR扩增，回收纯化扩增产物后，根据扩增结果判断是否含有鸡传染性支气管炎病毒。
5.根据权利要求4所述的同时检测多种鸡传染性支气管炎病毒的方法，其特征在于，所述PCR扩增体系为：TB Green 10μL、DNA模板1μL、SEQ ID NO.1和2所示引物各0.8μL，最后用ddH2O补足至20μL。
6.根据权利要求4所述的同时检测多种鸡传染性支气管炎病毒的方法，其特征在于，所述PCR扩增条件为：95℃预变性30s；95℃变性10s；58℃退火20s；72℃延伸25s，共40个循环。
7.一种用于同时检测多种鸡传染性支气管炎病毒的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物对。
8.一种测定鸡传染性支气管炎病毒载量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)构建标准质粒，并采用权利要求1所述引物对进行PCR扩增，得到标准曲线；
(2)提取样品RNA，反转录得到cDNA备用；
(3)引物对与样品分别进行普通PCR扩增，检测通用性；
(4)以步骤(2)所得cDNA为模板，按照权利要求4所述过程进行PCR扩增，然后按照公式：样品核酸拷贝数＝样品核酸拷贝数×10×6计算其核酸拷贝数即可。
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