CN115725781A - 一种快速鉴别ibdv超强毒株、新型变异株和弱毒疫苗株的高分辨率熔解曲线试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速鉴别IBDV超强毒株、新型变异株和弱毒疫苗株的高分辨率熔解曲线试剂盒。所述试剂盒包括HRM Master Mix，特异性引物对HRM‑F/HRM‑R，无阳性核酸的ddH₂O以及三种不同致病型IBDV的标准品质粒。通过实验证明：本发明试剂盒能够快速准确的鉴别IBDV超强毒株、新型变异株和弱毒疫苗株，具有通用性好、灵敏度高、特异性强、重复性好、操作简单和快速准确等特点，同时反应过程无需开盖、有效避免了污染问题，并且扩增产物还可用于凝胶电泳分析和后续测序。本发明为临床上流行的不同致病型IBDV快速准确的鉴别与检测提供了新的技术和手段。

Description

一种快速鉴别IBDV超强毒株、新型变异株和弱毒疫苗株的高 分辨率熔解曲线试剂盒

技术领域

本发明涉及分子生物学和养殖技术领域，具体涉及一种快速鉴别IBDV超强毒株、新型变异株和弱毒疫苗株的高分辨率熔解曲线试剂盒。

背景技术

传染性法氏囊病(Infectious bursal disease，IBD)是由传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus，IBDV)引起的一种急性、高度传染性的家禽病毒性疾病中最具经济破坏性的免疫抑制病毒性疾病之一，严重威胁着世界范围内的家禽健康，造成巨大经济损失。IBDV主要以中枢免疫器官法氏囊中的B淋巴细胞为靶点，导致严重的免疫抑制，进而增加对其他病原体的易感性，降低疫苗接种的有效性。目前我国临床上存在超强毒株、新型变异株和弱毒疫苗株三种主要的致病类型毒株，其中新型变异株为近几年来在中国新发现的致病型。虽然在家禽业进行了大规模的IBD疫苗接种计划，但不同类型的IBDV从免疫和未免疫的鸡群中越来越多的被分离出来。与其他节段RNA病毒一样，不同致病类型的IBDV可以在野外共同传播，长期的混合感染可能为病毒进化(如基因重排，基因组片段内的重组等)提供条件。目前已证实不同致病类型IBDV毒株的基因重排和片段内的重组可改变病毒株的毒力和抗原特性，进而有助于其逃避宿主的免疫系统和突破目前商品疫苗提供的保护，给养禽业该病的防控带来巨大的挑战。

虽然目前已经有几种方法被开发出来用于IBDV超强毒株和弱毒疫苗株的鉴别，如常规RT-PCR+克隆测序分析，但该方法操作繁琐，自动化程度不高，耗时长(5～7天)，且测序成本高；限制性片段长度多态性逆转录聚合酶链反应(RT-PCR-RFLP)方法不仅操作复杂、极为耗时(5～6小时)，还存在酶切位点不够可靠，部分结果不容易判断的问题。另外，以上方法均只能对单独感染样品进行鉴别，而不能鉴别混合感染样品中不同致病型毒株。因此，急需开发一种可快速、准确地鉴别临床上流行的不同致病型IBDV混合感染样品的试剂盒，以解决临床上长期以来不能对感染鸡群的IBDV致病型进行快速准确鉴别的技术难题。

发明内容

本发明的一个目的是提供用于鉴别IBDV超强毒株、IBDV新型变异株和IBDV弱毒疫苗株的特异性引物对。

本发明提供的用于鉴别IBDV超强毒株、IBDV新型变异株和IBDV弱毒疫苗株的特异性引物对由引物HRM-F和引物HRM-R组成；

所述引物HRM-F为如下a1)或a2)：

a1)序列表中序列1所示的单链DNA分子；

a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的单链DNA分子；

所述HRM-R为如下a3)或a4)：

a3)序列表中序列2所示的单链DNA分子；

a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的单链DNA分子。

上述特异性引物对中，所述引物HRM-F和所述引物HRM-R的摩尔比可为1:1。

本发明的另一个目的是提供上述特异性引物对的新用途。

本发明提供了上述特异性引物对在如下b1)-b10)中任一种中的应用：

b1)鉴别或辅助鉴别IBDV超强毒株、IBDV新型变异株和IBDV弱毒疫苗株；

b2)区分或辅助区分IBDV超强毒株、IBDV新型变异株和IBDV弱毒疫苗株；

b3)鉴定或辅助鉴定待测毒株为IBDV超强毒株、IBDV新型变异株还是IBDV弱毒疫苗株；

b4)检测或辅助检测待测样品是否感染IBDV超强毒株、IBDV新型变异株和/或IBDV弱毒疫苗株；

b5)检测或辅助检测待测样品中IBDV超强毒株、IBDV新型变异株或IBDV弱毒疫苗株的含量；

b6)制备鉴别或辅助鉴别IBDV超强毒株、IBDV新型变异株和IBDV弱毒疫苗株的产品；

b7)制备区分或辅助区分IBDV超强毒株、IBDV新型变异株和IBDV弱毒疫苗株的产品；

b8)制备鉴定或辅助鉴定待测毒株为IBDV超强毒株、IBDV新型变异株还是IBDV弱毒疫苗株的产品；

b9)制备检测或辅助检测待测样品是否感染IBDV超强毒株、IBDV新型变异株和/或IBDV弱毒疫苗株的产品；

b10)制备检测或辅助检测待测样品中IBDV超强毒株、IBDV新型变异株或IBDV弱毒疫苗株的含量的产品。

本发明还有一个目的是提供含有上述特异性引物对的试剂盒；所述试剂盒的功能为如下c1)-c5)中任一种：

c1)鉴别或辅助鉴别IBDV超强毒株、IBDV新型变异株和IBDV弱毒疫苗株；

c2)区分或辅助区分IBDV超强毒株、IBDV新型变异株和IBDV弱毒疫苗株；

c3)检测或辅助检测待测毒株为IBDV超强毒株、IBDV新型变异株还是IBDV弱毒疫苗株；

c4)检测或辅助检测待测样品是否感染IBDV超强毒株、IBDV新型变异株和/或IBDV弱毒疫苗株；

c5)检测或辅助检测待测样品中IBDV超强毒株、IBDV新型变异株或IBDV弱毒疫苗株的含量。

进一步的，所述试剂盒还包括IBDV超强毒株标准品质粒、IBDV新型变异株标准品质粒和IBDV弱毒疫苗株标准品质粒。

所述IBDV超强毒株标准品质粒的核苷酸序列具体如序列表中序列3所示；

所述IBDV新型变异株标准品质粒的核苷酸序列具体如序列表中序列4所示；

所述IBDV弱毒疫苗株标准品质粒的核苷酸序列具体如序列表中序列5所示。

更进一步的，所述试剂盒还可包括用于进行PCR扩增的其它试剂，如HRM MasterMix和ddH₂O。

本发明还有一个目的是提供一种检测或辅助检测待测毒株为IBDV超强毒株、IBDV新型变异株还是IBDV弱毒疫苗株的方法。

本发明提供的检测或辅助检测待测毒株为IBDV超强毒株、IBDV新型变异株还是IBDV弱毒疫苗株的方法包括如下步骤：提取待测毒株的RNA，然后将所述RNA反转录为cDNA，再以cDNA为模板，采用上述特异性引物对进行PCR扩增，同时以IBDV超强毒株、IBDV新型变异株和IBDV弱毒疫苗株标准品质粒分别作为IBDV超强毒株、IBDV新型变异株和IBDV弱毒疫苗株的对照样品在相同条件下进行PCR扩增；最后根据待测毒株与对照样品的高分辨率熔解曲线判断待测毒株为IBDV超强毒株、IBDV新型变异株还是IBDV弱毒疫苗株：

若待测毒株的高分辨率熔解曲线与IBDV超强毒株对照样品的高分辨率熔解曲线一致，则待测毒株为IBDV超强毒株；

若待测毒株的高分辨率熔解曲线与IBDV新型变异株对照样品的高分辨率熔解曲线一致，则待测毒株为IBDV新型变异株；

若待测毒株的高分辨率熔解曲线与IBDV弱毒疫苗株对照样品的高分辨率熔解曲线一致，则待测毒株为IBDV弱毒疫苗株。

本发明还有一个目的是提供一种检测或辅助检测待测样品是否感染IBDV超强毒株、IBDV新型变异株和/或IBDV弱毒疫苗株的方法。

本发明提供的检测或辅助检测待测样品是否感染IBDV超强毒株、IBDV新型变异株和/或IBDV弱毒疫苗株的方法包括如下步骤：提取待测样品的RNA，然后将所述RNA反转录为cDNA，再以cDNA为模板，采用上述特异性引物对进行PCR扩增，同时以IBDV超强毒株、IBDV新型变异株和IBDV弱毒疫苗株标准品质粒分别作为IBDV超强毒株、IBDV新型变异株和IBDV弱毒疫苗株的对照样品在相同条件下进行PCR扩增；最后根据待测样品与对照样品的高分辨率熔解曲线判断待测样品是否感染IBDV超强毒株、IBDV新型变异株和/或IBDV弱毒疫苗株：

若待测样品的高分辨率熔解曲线与IBDV超强毒株对照样品的高分辨率熔解曲线一致，则待测样品感染IBDV超强毒株，否则待测样品未感染IBDV超强毒株；

若待测样品的高分辨率熔解曲线与IBDV新型变异株对照样品的高分辨率熔解曲线一致，则待测样品感染IBDV新型变异株，否则待测样品未感染IBDV新型变异株；

若待测样品的高分辨率熔解曲线与IBDV弱毒疫苗株对照样品的高分辨率熔解曲线一致，则待测样品感染IBDV弱毒疫苗株，否则待测样品未感染IBDV弱毒疫苗株。

上述任一所述高分辨率熔解曲线可为峰形熔解曲线和/或标准化熔解曲线。在实际应用中，可单独根据峰形熔解曲线进行鉴别与检测，也可同时根据峰形熔解曲线和标准化熔解曲线进行鉴别与检测。

本发明最后一个目的是提供一种检测或辅助检测待测样品中IBDV超强毒株、IBDV新型变异株或IBDV弱毒疫苗株的含量的方法。

本发明提供的检测或辅助检测待测样品中IBDV超强毒株、IBDV新型变异株或IBDV弱毒疫苗株的含量的方法包括如下步骤：提取待测样品的RNA，然后将所述RNA反转录为cDNA，再以cDNA为模板，采用上述特异性引物对进行PCR扩增，得到待测样品的Cq值(Cq值是样品反应曲线与阈值线相交的PCR循环数，该值表明从样本中检测出真实阳性信号所花费的循环数)，将所述待测样品的Cq值代入IBDV超强毒株、IBDV新型变异株或IBDV弱毒疫苗株的标准曲线方程，即可得到待测样品中IBDV超强毒株、IBDV新型变异株或IBDV弱毒疫苗株的含量；

所述标准曲线方程按照如下方法获得：采用上述特异性引物对对系列已知浓度的IBDV超强毒株、IBDV新型变异株或IBDV弱毒疫苗株标准品质粒溶液进行PCR扩增，测定各浓度的IBDV超强毒株、IBDV新型变异株或IBDV弱毒疫苗株标准品溶液对应的Cq值，从而获得IBDV超强毒株、IBDV新型变异株或IBDV弱毒疫苗株标准品质粒溶液浓度与Cq值之间的标准曲线方程。

上述任一所述方法中，所述PCR扩增的反应程序如下：94℃预变性2min；95℃变性10s，60℃退火30s，循环40次；HRM分析仪器熔解温度设定是以每步升温0.04℃速率从75℃到95℃进行荧光信号的收集。

所述PCR扩增的反应体系如下：HRM Master Mix 10μL，上游引物HRM-F 0.2μL，下游引物HRM-R 0.2μL，cDNA 1μL，ddH₂O补足体系至20μL。所述上游引物HRM-F和所述下游引物HRM-R在反应体系中的终浓度均为0.2μM。

所述PCR扩增的仪器为荧光定量

96仪器。

上述任一所述应用或方法中，所述待测样品可为单一感染样品或混合感染样品。

所述单一感染样品可为感染IBDV超强毒株、IBDV新型变异株或IBDV弱毒疫苗株的样品。

所述混合感染样品可为感染IBDV超强毒株、IBDV新型变异株和IBDV弱毒疫苗株中至少两种毒株的样品，如二重混合感染样品和三重混合感染样品。

上述任一所述IBDV超强毒株具体为IBDV超强毒株NN1172。

上述任一所述IBDV新型变异株具体为IBDV新型变异株QZ191002。

上述任一所述IBDV弱毒疫苗株具体为IBDV弱毒疫苗株B87。

本发明具有如下优点：

1、本发明利用的高分辨率熔解曲线(high-resolution melting，HRM)技术是一种用于基因分析的新技术，它基于单核苷酸的熔解温度不同而形成不同形态的熔解曲线这一技术原理，可以检测出单个碱基的差异，具有极高的敏感性，此外还具有自动化程度高、高通量、闭管操作以及成本低等优点。

2、本发明采用一步法进行扩增，整个扩增时间为60分钟，不仅节省了工作时间，而且该方法灵敏度高。而常规方法的普通PCR+酶切鉴定常需要5至6小时之间，步骤繁琐且增加了工作量。

3、本发明提供的快速鉴别IBDV超强毒株、新型变异株和弱毒疫苗株的高分辨率熔解曲线试剂盒仅需一对引物即可鉴别IBDV三种不同致病类型(超强毒株、新型变异株和弱毒疫苗株)，熔解峰简洁明了，可同时定性检出单一和混合感染样品(包括各种二重混合感染和三重混合感染)，同时分别建立了三种不同致病类型毒株的标准曲线，还可对单一感染样品进行定量分析。

4、由于IBDV三种致病类型毒株因序列差异不大而常常难以通过常规普通PCR来直接鉴别，如果用普通PCR方法需要根据三种不同类型病毒序列同时设计三种不同的引物，但由于序列同源性较高，很难设计出能够准确区分三种不同类型毒株的引物序列。而本发明不同于以往的方法，通过大量的比对筛查IBDV超强毒株、新型变异株和弱毒疫苗株基因组中GC含量不同的区域来设计引物，仅需一对引物就可以同时区分IBDV三种不同致病型毒株。并且该方法操作简单，反应快速，成本低廉，敏感性、特异性好，反应过程无需开盖、避免了污染问题，另外扩增产物还可用于凝胶电泳，后续测序和序列分析等操作，大大提高了IBDV的鉴别检测效率。

本发明建立了一种可快速准确鉴别IBDV超强毒株、新型变异株和弱毒疫苗株的高分辨率熔解曲线试剂盒，为临床上流行的不同致病型IBDV的快速准确地鉴别与检测提供了新的技术和手段，极大的提高了临床鉴别与检测的效率。

附图说明

图1为快速鉴别IBDV超强毒株、新型变异株和弱毒疫苗株的高分辨率熔解曲线试剂盒的标准化熔解曲线示意图。

图2为快速鉴别IBDV超强毒株、新型变异株和弱毒疫苗株的高分辨率熔解曲线试剂盒的峰形熔解曲线示意图。

图3为快速鉴别IBDV超强毒株、新型变异株和弱毒疫苗株的高分辨率熔解曲线试剂盒的特异性试验示意图。A为RT-qPCR-HRM特异性峰形熔解曲线。B为RT-qPCR-HRM特异性扩增产物凝胶电泳图。其中，M：DL 2000Marker；1-10分别为禽白血病病毒(ALV)、马立克氏病病毒(MDV)、新城疫病毒(NDV)、传染性喉气管炎病毒(ILTV)、腺病毒4型(FAdV-4)、禽网状内皮组织增生症病毒(REV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、禽流感病毒(AIV)、禽偏肺病毒(aMPV)和禽呼肠孤病毒(ARV)的扩增产物，11-13分别为IBDV超强毒株NN1172、新型变异株QZ191002和弱毒疫苗株B87的扩增产物；14：阴性对照。

图4为快速鉴别IBDV超强毒株、新型变异株和弱毒疫苗株的高分辨率熔解曲线试剂盒的灵敏性试验示意图。

图5为采用快速鉴别IBDV超强毒株、新型变异株和弱毒疫苗株的高分辨率熔解曲线试剂盒建立的三种不同致病型IBDV标准曲线方程示意图。

图6为采用快速鉴别IBDV超强毒株、新型变异株和弱毒疫苗株的高分辨率熔解曲线试剂盒检测混合质粒样品的结果示意图。

图7为采用快速鉴别IBDV超强毒株、新型变异株和弱毒疫苗株的高分辨率熔解曲线试剂盒检测人工混合感染模型样品的结果示意图。其中，A：NN1172单独感染组；B：B87单独感染组；C：QZ191002单独感染组；D：NN1172+B87二重混合感染组；E：NN1172+QZ191002二重混合感染组；F：B87+QZ191002二重混合感染组；G：NN1172+B87+QZ191002三重混合感染组。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的IBDV超强毒株NN1172记载于文献“Wang W,Huang Y,Ji Z,ChenG,Zhang Y,Qiao Y,Shi M,Li M,Huang T,Wei T,Mo M,He X,Wei P.The Full Region ofN-Terminal in Polymerase of IBDV Plays an Important Role in Viral Replicationand Pathogenicity:Either Partial Region or Single Amino Acid V4I SubstitutionDoes Not Completely Lead to the Virus Attenuation to Three-YellowChickens.Viruses.2021Jan14；13(1):107.doi:10.3390/v13010107.”中。

下述实施例中的IBDV新型变异株QZ191002和弱毒疫苗株B87均记载于文献“WangW,Huang Y,Zhang Y,Qiao Y,Deng Q,Chen R,Chen J,Huang T,Wei T,Mo M,He X,WeiP.The emerging naturally reassortant strain of IBDV(genotype A2dB3)havingsegment Afrom Chinese novel variant strain and segment B from HLJ 0504-likevery virulent strain showed enhanced pathogenicity to three-yellowchickens.Transbound Emerg Dis.2021Sep 28.doi:10.1111/tbed.14336.”中。

实施例1、一种快速鉴别IBDV超强毒株、新型变异株和弱毒疫苗株的高分辨率熔解曲线试剂盒及其使用方法

一、快速鉴别IBDV超强毒株、新型变异株和弱毒疫苗株的高分辨率熔解曲线试剂盒

本发明的快速鉴别IBDV超强毒株、新型变异株和弱毒疫苗株的高分辨率熔解曲线试剂盒包括：HRM Master Mix(天根生化科技(北京)股份有限公司)、以IBDV超强毒株、新型变异株和弱毒疫苗株VP3基因中GC含量明显不同的区域(2450～2603bp)作为检测目标，在其两侧保守序列设计的一对特异性引物对HRM-F/HRM-R、无阳性核酸的ddH₂O以及三种不同致病型IBDV标准品质粒。

特异性引物对的上游引物HRM-F：5′-GCAGCAGCCAATGTGGAC-3′(序列1)；

特异性引物对的下游引物HRM-R：5′-CCGCTTGTGGTGCGTTTG-3′(序列2)。

三种不同致病型IBDV标准品质粒分别为IBDV超强毒株NN1172标准品质粒pMD18-T-NN1172、IBDV新型变异株QZ191002标准品质粒pMD18-T-QZ191002和IBDV弱毒疫苗株B87标准品质粒pMD18-T-B87。其中，IBDV超强毒株NN1172标准品质粒pMD18-T-NN1172的核苷酸序列如序列3所示。IBDV新型变异株QZ191002标准品质粒pMD18-T-QZ191002的核苷酸序列如序列4所示。IBDV弱毒疫苗株B87标准品质粒pMD18-T-B87的核苷酸序列如序列5所示。

二、快速鉴别IBDV超强毒株、新型变异株和弱毒疫苗株的高分辨率熔解曲线试剂盒的使用方法

利用步骤一中的快速鉴别IBDV超强毒株、新型变异株和弱毒疫苗株的高分辨率熔解曲线试剂盒检测IBDV的方法(该方法命名为RT-qPCR-HRM方法)包括如下步骤：

分别以步骤1中的三种标准品质粒为模板，采用步骤1中的高分辨率熔解曲线试剂盒中的特异性引物对进行PCR扩增，得到PCR产物。

PCR扩增仪器：荧光定量

96仪器。

PCR扩增反应程序：94℃预变性2min；95℃变性10s，60℃退火30s，循环40次；HRM分析仪器(Roche，LightCycier 96)熔解温度设定是以每步升温0.04℃速率从75℃到95℃进行荧光信号的收集。

PCR扩增反应体系：HRM Master Mix 10μL，上游引物HRM-F 0.2μL，下游引物HRM-R0.2μL，cDNA 1μL，ddH₂O补足体系至20μL。上游引物HRM-F和下游引物HRM-R在反应体系中的终浓度均为0.2μM。

将PCR产物进行凝胶电泳分析，可见扩增出大小为154bp的目的片段。将目的片段回收纯化后，经连接转化挑选阳性克隆测序，测序结果通过NCBI的BLAST进行验证，表明扩增的片段为IBDV序列。

4、高分辨率熔解曲线分析(HRM分析)

1)标准化熔解曲线

标准化熔解曲线示意图如图1所示。其中，红色曲线为IBDV超强毒株NN1172，浅蓝色曲线为IBDV新型变异株QZ191002，橙色为IBDV弱毒疫苗株B87。从图中可以看出，三种不同致病型IBDV因GC含量不同而存在明显的熔解曲线差异。

2)峰形熔解曲线

峰形熔解曲线示意图如图2所示。其中，红色曲线为IBDV超强毒株NN1172，浅蓝色曲线为IBDV新型变异株QZ191002，橙色为IBDV弱毒疫苗株B87。从图中可以看出：三种不同致病型IBDV因GC含量不同而具有不同的熔解峰和不同的Tm值。

实施例2、快速鉴别IBDV超强毒株、新型变异株和弱毒疫苗株的高分辨率熔解曲线试剂盒的特异性检测

供试病毒：禽白血病病毒(ALV)、马立克氏病病毒(MDV)、新城疫病毒(NDV)、传染性喉气管炎病毒(ILTV)、腺病毒4型(FAdV-4)、禽网状内皮组织增生症病毒(REV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、禽流感病毒(AIV)、禽偏肺病毒(aMPV)、禽呼肠孤病毒(ARV)、IBDV超强毒株NN1172、IBDV新型变异株QZ191002和IBDV弱毒疫苗株B87。

1、RNA提取

分别从供试病毒中提取病毒核酸(RNA)。

2、反转录

将步骤1中获得的病毒RNA反转录为cDNA。

3、RT-qPCR

采用实施例1步骤二中的RT-qPCR-HRM方法对供试病毒cDNA进行检测，以验证该方法的特异性。同时以无阳性核酸的ddH₂O作为阴性对照。

结果如图3所示。结果显示：只有三种不同致病型IBDV检测出现RT-qPCR-HRM特异性峰形熔解曲线和扩增产物凝胶电泳图的特异性条带，其余常见病毒检测结果均为阴性。说明该方法具有良好的特异性。

实施例3、快速鉴别IBDV超强毒株、新型变异株和弱毒疫苗株的高分辨率熔解曲线试剂盒的灵敏性检测

供试样品：分别将IBDV超强毒株NN1172标准品质粒pMD18-T-NN1172、IBDV新型变异株QZ191002标准品质粒pMD18-T-QZ191002和IBDV弱毒疫苗株B87标准品质粒pMD18-T-B87进行10倍梯度稀释，分别得到10^-1稀梯度的不同毒株标准品质粒溶液、10^-2稀梯度的不同毒株标准品质粒溶液、10^-3稀梯度的不同毒株标准品质粒溶液、10^-4稀梯度的不同毒株标准品质粒溶液、10^-5稀梯度的不同毒株标准品质粒溶液、10^-6稀梯度的不同毒株标准品质粒溶液、10^-7稀梯度的不同毒株标准品质粒溶液、10^-8稀梯度的不同毒株标准品质粒溶液、10^-9稀梯度的不同毒株标准品质粒溶液和10^-10稀梯度的不同毒株标准品质粒溶液。

10^-1稀梯度的IBDV超强毒株NN1172标准品质粒溶液浓度为6.12×10⁹copies/μL；

10^-1稀梯度的IBDV新型变异株QZ191002标准品质粒溶液浓度为6.11×10⁹copies/μL；

10^-1稀梯度的IBDV弱毒疫苗株B87标准品质粒溶液浓度为6.75×10⁹copies/μL；

10^-2稀梯度的IBDV超强毒株NN1172标准品质粒溶液浓度为6.12×10⁸copies/μL；

10^-2稀梯度的IBDV新型变异株QZ191002标准品质粒溶液浓度为6.11×10⁸copies/μL；

10^-2稀梯度的IBDV弱毒疫苗株B87标准品质粒溶液浓度为6.75×10⁸copies/μL；

10^-3稀梯度的IBDV超强毒株NN1172标准品质粒溶液浓度为6.12×10⁷copies/μL；

10^-3稀梯度的IBDV新型变异株QZ191002标准品质粒溶液浓度为6.11×10⁷copies/μL；

10^-3稀梯度的IBDV弱毒疫苗株B87标准品质粒溶液浓度为6.75×10⁷copies/μL；

10^-4稀梯度的IBDV超强毒株NN1172标准品质粒溶液浓度为6.12×10⁶copies/μL；

10^-4稀梯度的IBDV新型变异株QZ191002标准品质粒溶液浓度为6.11×10⁶copies/μL；

10^-4稀梯度的IBDV弱毒疫苗株B87标准品质粒溶液浓度为6.75×10⁶copies/μL；

10^-5稀梯度的IBDV超强毒株NN1172标准品质粒溶液浓度为6.12×10⁵copies/μL；

10^-5稀梯度的IBDV新型变异株QZ191002标准品质粒溶液浓度为6.11×10⁵copies/μL；

10^-5稀梯度的IBDV弱毒疫苗株B87标准品质粒溶液浓度为6.75×10⁵copies/μL；

10^-6稀梯度的IBDV超强毒株NN1172标准品质粒溶液浓度为6.12×10⁴copies/μL；

10^-6稀梯度的IBDV新型变异株QZ191002标准品质粒溶液浓度为6.11×10⁴copies/μL；

10^-6稀梯度的IBDV弱毒疫苗株B87标准品质粒溶液浓度为6.75×10⁴copies/μL；

10^-7稀梯度的IBDV超强毒株NN1172标准品质粒溶液浓度为6.12×10³copies/μL；

10^-7稀梯度的IBDV新型变异株QZ191002标准品质粒溶液浓度为6.11×10³copies/μL；

10^-7稀梯度的IBDV弱毒疫苗株B87标准品质粒溶液浓度为6.75×10³copies/μL；

10^-8稀梯度的IBDV超强毒株NN1172标准品质粒溶液浓度为6.12×10²copies/μL；

10^-8稀梯度的IBDV新型变异株QZ191002标准品质粒溶液浓度为6.11×10²copies/μL；

10^-8稀梯度的IBDV弱毒疫苗株B87标准品质粒溶液浓度为6.75×10²copies/μL；

10^-9稀梯度的IBDV超强毒株NN1172标准品质粒溶液浓度为6.12×10¹copies/μL；

10^-9稀梯度的IBDV新型变异株QZ191002标准品质粒溶液浓度为6.11×10¹copies/μL；

10^-9稀梯度的IBDV弱毒疫苗株B87标准品质粒溶液浓度为6.75×10¹copies/μL；

10^-10稀梯度的IBDV超强毒株NN1172标准品质粒溶液浓度为6.12copies/μL；

10^-10稀梯度的IBDV新型变异株QZ191002标准品质粒溶液浓度为6.11copies/μL；

10^-10稀梯度的IBDV弱毒疫苗株B87标准品质粒溶液浓度为6.75copies/μL。

采用实施例1步骤二中的RT-qPCR-HRM方法对供试样品进行检测，以验证该方法的灵敏度。

结果如图4所示。结果发现：三种不同致病型IBDV从10^-1稀释至10^-9均出现了特异性的熔解峰；相比于常规传统PCR检测至少需要100copies/μL以上，本发明方法中超强毒株NN1172、新型变异株QZ191002和弱毒疫苗株B87的最低检测限分别为61.2copies/μL、61.1copies/μL和67.5copies/μL。说明本发明方法的灵敏度较高，大大优于常规传统PCR检测方法。

实施例4、IBDV超强毒株、新型变异株和弱毒疫苗株标准曲线的建立

供试样品：实施例3中的10^-2稀梯度的不同毒株标准品质粒溶液、10^-3稀梯度的不同毒株标准品质粒溶液、10^-4稀梯度的不同毒株标准品质粒溶液、10^-5稀梯度的不同毒株标准品质粒溶液、10^-6稀梯度的不同毒株标准品质粒溶液。

采用实施例1步骤二中的RT-qPCR-HRM方法对供试样品进行检测。每个稀释度三个重复。然后以标准品质粒拷贝数的对数值为横坐标，以HRM分析仪器(Roche，LightCycier96)测得的Cq值为纵坐标分别建立IBDV超强毒株、新型变异株和弱毒疫苗株的标准曲线。

结果如图5所示。结果显示：本发明选取扩增曲线结果比较稳定的10^-2～10^-6这五个稀释度分别建立得到三种不同致病型IBDV的标准曲线方程，可分别对三种不同致病型IBDV进行准确的定量分析。

实施例5、快速鉴别IBDV超强毒株、新型变异株和弱毒疫苗株的高分辨率熔解曲线试剂盒的重复性检测

供试样品：选取不同批次(批内和批间)的实施例3中的10^-2稀梯度的不同毒株标准品质粒溶液、10^-3稀梯度的不同毒株标准品质粒溶液、10^-4稀梯度的不同毒株标准品质粒溶液、10^-5稀梯度的不同毒株标准品质粒溶液、10^-6稀梯度的不同毒株标准品质粒溶液。

采用实施例1步骤二中的RT-qPCR-HRM方法对供试样品在相同反应条件下分别进行重复性试验。

结果如表1-表3所示。结果显示：IBDV超强毒株NN1172、新型变异株QZ191002和弱毒疫苗株B87的批内重复的变异系数均不超过1％，批间重复变异系数均不超过1.5％。说明本发明建立的针对三种不同致病型IBDV的RT-qPCR-HRM方法重复性好。

表1、pMD18-T-NN1172批内和批间重复性试验

注：1-5分别代表为10^-2-10^-6稀梯度的IBDV超强毒株NN1172标准品质粒溶液。

表2、pMD18-T-QZ191002批内和批间重复性试验

注：1-5分别代表为10^-2-10^-6稀梯度的IBDV新型变异株QZ191002标准品质粒溶液。

表3、pMD18-T-B87批内和批间重复性试验

注：1-5分别代表为10^-2-10^-6稀梯度的IBDV弱毒疫苗株B87标准品质粒溶液。

实施例6、快速鉴别IBDV超强毒株、新型变异株和弱毒疫苗株的高分辨率熔解曲线试剂盒对混合样品的检测效果

一、供试样品

1、混合质粒样品

B87+NN1172：将浓度为50ng/μL的IBDV弱毒疫苗株B87标准品质粒溶液与浓度为50ng/μL的IBDV超强毒株NN1172标准品质粒溶液等体积混匀，得到B87+NN1172样品。

QZ191002+NN1172：将浓度为50ng/μL的IBDV新型变异株QZ191002标准品质粒溶液与浓度为50ng/μL的IBDV超强毒株NN1172标准品质粒溶液等体积混匀，得到QZ191002+NN1172样品。

B87+QZ191002：将浓度为50ng/μL的IBDV弱毒疫苗株B87标准品质粒溶液与浓度为50ng/μL的IBDV新型变异株QZ191002标准品质粒溶液等体积混匀，得到B87+QZ191002样品。

B87+QZ191002+NN1172：将浓度为50ng/μL的IBDV弱毒疫苗株B87标准品质粒溶液、浓度为50ng/μL的IBDV新型变异株QZ191002标准品质粒溶液与浓度为50ng/μL的IBDV超强毒株NN1172标准品质粒溶液等体积混匀，得到B87+QZ191002+NN1172样品。

2、人工混合感染模型样品

1日龄未经免疫的三黄鸡40只，饲养至28日龄并经抗体检测为阴性时，用IBDV毒株对各组试验鸡以10⁵TCID₅₀/0.5mL剂量经口途径进行攻毒，每组5只三黄鸡，共分为八组，每组处理方法如下：

A组(NN1172单独感染组)：采用IBDV超强毒株NN1172进行攻毒；

B组(B87单独感染组)：采用IBDV弱毒疫苗株B87进行攻毒；

C组(QZ191002单独感染组)：采用IBDV新型变异株QZ191002进行攻毒；

D组(NN1172+B87二重混合感染组)：采用IBDV超强毒株NN1172和弱毒疫苗株B87进行攻毒；

E组(NN1172+QZ191002二重混合感染组)：采用IBDV超强毒株NN1172和新型变异株QZ191002进行攻毒；

F组(B87+QZ191002二重混合感染组)：采用IBDV弱毒疫苗株B87和新型变异株QZ191002进行攻毒；

G组(NN1172+B87+QZ191002三重混合感染组)：采用IBDV超强毒株NN1172、弱毒疫苗株B87和新型变异株QZ191002进行攻毒；

H组(空白对照组)：口服0.5mL PBS；

上述各混合感染组中，每组中各毒株的攻毒剂量均为10⁵TCID₅₀/0.5mL。

对上述各试验组鸡只在35日龄(即攻毒后7天)全部剖杀，采集法氏囊组织进行匀浆，得到感染不同毒株的样品。

二、RT-qPCR-HRM方法进行检测

采用实施例1步骤二中的RT-qPCR-HRM方法对步骤一中的供试样品进行检测。

混合质粒样品的检测结果如图6所示。结果显示，混合样品均可表现出与其中阳性样品相对应的熔解峰，二重或三重混合样品经RT-qPCR-HRM反应后分别呈现出双峰或者三个峰的熔解曲线。

人工混合感染模型样品的检测结果如图7所示。结果显示：本发明试剂盒均能很好的对不同单独毒株及混合毒株的感染样品进行鉴别，检出率及准确率均为100％。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (10)

1.用于鉴别IBDV超强毒株、IBDV新型变异株和IBDV弱毒疫苗株的特异性引物对，所述特异性引物对由引物HRM-F和引物HRM-R组成；

所述引物HRM-F为如下a1)或a2)：

a1)序列表中序列1所示的单链DNA分子；

a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的单链DNA分子；

所述HRM-R为如下a3)或a4)：

a3)序列表中序列2所示的单链DNA分子；

a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的单链DNA分子。

2.根据权利要求1所述的特异性引物对，其特征在于：所述引物HRM-F和所述引物HRM-R的摩尔比为1:1。

3.权利要求1或2所述的特异性引物对在如下b1)-b10)中任一种中的应用：

b1)鉴别或辅助鉴别IBDV超强毒株、IBDV新型变异株和IBDV弱毒疫苗株；

b2)区分或辅助区分IBDV超强毒株、IBDV新型变异株和IBDV弱毒疫苗株；

b3)鉴定或辅助鉴定待测毒株为IBDV超强毒株、IBDV新型变异株还是IBDV弱毒疫苗株；

b4)检测或辅助检测待测样品是否感染IBDV超强毒株、IBDV新型变异株和/或IBDV弱毒疫苗株；

b5)检测或辅助检测待测样品中IBDV超强毒株、IBDV新型变异株或IBDV弱毒疫苗株的含量；

b6)制备鉴别或辅助鉴别IBDV超强毒株、IBDV新型变异株和IBDV弱毒疫苗株的产品；

b7)制备区分或辅助区分IBDV超强毒株、IBDV新型变异株和IBDV弱毒疫苗株的产品；

b8)制备鉴定或辅助鉴定待测毒株为IBDV超强毒株、IBDV新型变异株还是IBDV弱毒疫苗株的产品；

b9)制备检测或辅助检测待测样品是否感染IBDV超强毒株、IBDV新型变异株和/或IBDV弱毒疫苗株的产品；

b10)制备检测或辅助检测待测样品中IBDV超强毒株、IBDV新型变异株或IBDV弱毒疫苗株的含量的产品。

4.含有权利要求1或2所述特异性引物对的试剂盒；

所述试剂盒的功能为如下c1)-c5)中任一种：

c1)鉴定或辅助鉴定IBDV超强毒株、IBDV新型变异株和IBDV弱毒疫苗株；

c2)区分或辅助区分IBDV超强毒株、IBDV新型变异株和IBDV弱毒疫苗株；

c3)检测或辅助检测待测毒株为IBDV超强毒株、IBDV新型变异株还是IBDV弱毒疫苗株；

c4)检测或辅助检测待测样品是否感染IBDV超强毒株、IBDV新型变异株和/或IBDV弱毒疫苗株；

c5)检测或辅助检测待测样品中IBDV超强毒株、IBDV新型变异株或IBDV弱毒疫苗株的含量。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括IBDV超强毒株标准品质粒、IBDV新型变异株标准品质粒和IBDV弱毒疫苗株标准品质粒。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述IBDV超强毒株标准品质粒的核苷酸序列如序列表中序列3所示；

所述IBDV新型变异株标准品质粒的核苷酸序列如序列表中序列4所示；

所述IBDV弱毒疫苗株标准品质粒的核苷酸序列如序列表中序列5所示。

7.一种检测或辅助检测待测毒株为IBDV超强毒株、IBDV新型变异株还是IBDV弱毒疫苗株的方法，包括如下步骤：提取待测毒株的RNA，然后将所述RNA反转录为cDNA，再以cDNA为模板，采用权利要求1所述的特异性引物对进行PCR扩增，同时以IBDV超强毒株、IBDV新型变异株和IBDV弱毒疫苗株标准品质粒分别作为IBDV超强毒株、IBDV新型变异株和IBDV弱毒疫苗株的对照样品在相同条件下进行PCR扩增；最后根据待测毒株与对照样品的高分辨率熔解曲线判断待测毒株为IBDV超强毒株、IBDV新型变异株还是IBDV弱毒疫苗株：

若待测毒株的高分辨率熔解曲线与IBDV超强毒株对照样品的高分辨率熔解曲线一致，则待测毒株为IBDV超强毒株；

若待测毒株的高分辨率熔解曲线与IBDV新型变异株对照样品的高分辨率熔解曲线一致，则待测毒株为IBDV新型变异株；

若待测毒株的高分辨率熔解曲线与IBDV弱毒疫苗株对照样品的高分辨率熔解曲线一致，则待测毒株为IBDV弱毒疫苗株。

8.一种检测或辅助检测待测样品是否感染IBDV超强毒株、IBDV新型变异株和/或IBDV弱毒疫苗株的方法，包括如下步骤：提取待测样品的RNA，然后将所述RNA反转录为cDNA，再以cDNA为模板，采用权利要求1所述的特异性引物对进行PCR扩增，同时以IBDV超强毒株、IBDV新型变异株和IBDV弱毒疫苗株标准品质粒分别作为IBDV超强毒株、IBDV新型变异株和IBDV弱毒疫苗株的对照样品在相同条件下进行PCR扩增；最后根据待测样品与对照样品的高分辨率熔解曲线判断待测样品是否感染IBDV超强毒株、IBDV新型变异株和/或IBDV弱毒疫苗株：

若待测样品的高分辨率熔解曲线与IBDV超强毒株对照样品的高分辨率熔解曲线一致，则待测样品感染IBDV超强毒株，否则待测样品未感染IBDV超强毒株；

若待测样品的高分辨率熔解曲线与IBDV新型变异株对照样品的高分辨率熔解曲线一致，则待测样品感染IBDV新型变异株，否则待测样品未感染IBDV新型变异株；

若待测样品的高分辨率熔解曲线与IBDV弱毒疫苗株对照样品的高分辨率熔解曲线一致，则待测样品感染IBDV弱毒疫苗株，否则待测样品未感染IBDV弱毒疫苗株。

9.一种检测或辅助检测待测样品中IBDV超强毒株、IBDV新型变异株或IBDV弱毒疫苗株的含量的方法，包括如下步骤：提取待测样品的RNA，然后将所述RNA反转录为cDNA，再以cDNA为模板，采用权利要求1所述的特异性引物对进行PCR扩增，得到待测样品的Cq值，将所述待测样品的Cq值代入IBDV超强毒株、IBDV新型变异株或IBDV弱毒疫苗株的标准曲线方程，即可得到待测样品中IBDV超强毒株、IBDV新型变异株或IBDV弱毒疫苗株的含量；

所述标准曲线方程按照如下方法获得：采用权利要求1所述的特异性引物对对系列已知浓度的IBDV超强毒株、IBDV新型变异株和IBDV弱毒疫苗株标准品质粒溶液进行PCR扩增，测定各浓度的IBDV超强毒株、IBDV新型变异株和IBDV弱毒疫苗株标准品溶液对应的Cq值，从而获得IBDV超强毒株、IBDV新型变异株和IBDV弱毒疫苗株标准品质粒溶液浓度与Cq值之间的标准曲线方程。

10.根据权利要求1或2所述的特异性引物对或权利要求3所述的应用或权利要求4-6任一所述的试剂盒或权利要求7-9任一所述的方法，其特征在于：

所述IBDV超强毒株为IBDV超强毒株NN1172；

所述IBDV新型变异株为IBDV新型变异株QZ191002；

所述IBDV弱毒疫苗株为IBDV弱毒疫苗株B87。

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