CN116769965A - 用于鸡传染性支气管炎病毒基因分型检测的引物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一组用于鸡传染性支气管炎病毒基因分型检测的引物及其应用，属于分子生物学检测技术领域。所述引物包括鸡传染性支气管炎病毒H120型、QX型、LDT3型、4/91型、GVI‑1型的扩增引物。所述H120型的引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；所述QX型的引物序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；所述LDT3型的引物序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；所述4/91型的引物序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示；所述GVI‑1型的引物序列如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。利用本发明引物进行鸡传染性支气管炎病毒不同基因型毒株的RT‑PCR分型检测，能快速、准确的进行鸡传染性支气管炎的五种病毒分型，为鸡传染性支气管病毒的鉴别诊断和分子流行病学调查提供技术支撑。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学检测技术领域，具体涉及一组用于鸡传染性支气管炎病毒基因分型检测的引物及其应用。
背景技术
鸡传染性支气管炎是一种由冠状病毒科冠状病毒属中的传染性支气管炎病毒(IBV)引发的。病毒主要通过侵害鸡的呼吸道和泌尿生殖系统以及消化器官，从而引发鸡的生长发育缓慢及产蛋率、产蛋质量的下降，临床上多以呼吸道、肾脏病变为主。病毒可通过呼吸道传播，亦可通过带病鸡的粪便传播。
冠状病毒由于其复制高度依赖RNA聚合酶，而RNA聚合酶其本身缺乏校正修复功能，因此病毒复制时易发生突变与重组，这种插入缺失、点突变、重组在IBV疫苗选择的压力下往往会产生一些新的基因型毒株和重组毒株，导致不同IBV毒株之间出现临床症状的差异，以及伴随众多血清型的产生IBV毒株交叉保护效果差甚至完全丧失保护能力。有报道称目前全球已超过50种不同血清型IBV，且国内外流行毒株不一，变异程度不同，这些都给IBV防控带来了严峻的挑战。由于IBV血清型呈不断增多的态势，使得血清型分型方法在实际应用中受限。因此，通过对病毒S1基因来进行基因分型的方法显得更为直接，这种方法可以让我们快速、准确的了解IBV不同地区的流行情况，从而更有针对性的制定相应的防控策略。
各个国家对IBV均有一些特定的地方分型方法，大部分的IBV基因型自1931年从美国首次发现后陆续在全世界被发现。虽然到目前为止，疫苗接种被认为是针对IBV最为有效的控制措施。然而，由于新型毒株的持续变异，目前的疫苗已被发现对于部分新型毒株无免疫反应。因此，能够快速、精准的鉴定出IBV的基因型对于该病的防控显得尤为重要，本领域急需开发一种能够更加快速、准确检测鸡传染性支气管炎病毒不同基因型毒株的RT-PCR分型的方法。本发明充分克服了现有技术手段的不足，提供了一种检测鸡传染性支气管炎病毒基因分型的扩增引物组，为IBV防控提供技术支持。
专利CN 115323075 A公开了一种检测鸡传染性支气管炎病毒及基因分型的RT-RAA引物探针组、试剂盒及其应用，该方法使用了重组酶介导等温核酸扩增技术，相较于RT-PCR具有检测时间短、特异性强的优势。本发明相较而言，补充了IBV主要流行毒株共5个基因型的全部扩增引物组，覆盖范围更广，且具有很强的特异性、成本较低的优势，可以适用于大批量样本的监测；专利CN 105463136 A公开了一种用于鸡传染性支气管炎病毒RT-PCR分型检测的试剂盒，该方法首次使用一次性RT-PCR的方法实现对肾型、4/91类型、呼吸型三种类型IBV毒株的鉴别检测，与本发明所涉及检测的IBV基因型分类不同。本发明相较而言，更进一步的可以快速、准确的区分肾型及呼吸型IBV的毒株基因型，也是目前国内首次公开的涉及到GVI-1型IBV检测的扩增引物组。
发明内容
本发明克服了现有技术中的不足，提供了一组用于鸡传染性支气管炎病毒基因分型检测的引物及其应用。
本发明的目的通过下述技术方案予以实现。
本发明第一方面，提供了一组用于鸡传染性支气管炎病毒基因分型检测的引物，所述引物包括鸡传染性支气管炎病毒H120型、QX型、LDT3型、4/91型、GVI-1型的扩增引物。
所述H120型的引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
所述QX型的引物序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
所述LDT3型的引物序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。
所述4/91型的引物序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。
所述GVI-1型的引物序列如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。
所述引物序列如下：
所述引物是通过对GenBank中公布的IBV的H120、QX、LDT3、4/91、GVI-1等分型的多个毒株S1基因序列进行比较分析，找出相对保守区和特异区设计而成，是型特异性的引物，不会对其他基因型鸡传染性支气管炎病毒产生交叉反应。
本发明的第二方面，提供了一组用于鸡传染性支气管炎病毒基因分型检测的引物在制备鸡传染性支气管炎病毒检测试剂中的应用。
本发明的第三方面，提供了一种含有所述用于鸡传染性支气管炎病毒基因分型检测的引物的检测试剂盒。
本发明的第四方面，提供了一种鸡传染性支气管炎病毒不同基因型毒株的RT-PCR分型检测方法，包括以下步骤：
(1)提取待检样品的RNA；
(2)使用所述的用于鸡传染性支气管炎病毒基因分型检测的引物对步骤(1)中所得RNA进行RT-PCR扩增；
(3)对扩增产物进行电泳检测。
进一步地，步骤(2)中所述的RT-PCR扩增体系为：
采用一步法RT-PCR反应体系，体系总体积为25μl，反应体系的组成为：5.5μl的灭菌水、12.5μl的2xTransTaq PCR Supermix、1μl浓度为10μM的上游引物、1μL浓度为10μM的下游引物、5μl的样品RNA提取液。
进一步地，步骤(2)中所述的RT-PCR扩增反应程序为：
第一步，反转录50℃、时间30min；
第二步，预扩增94℃、时间5min；
第三步，扩增94℃、时间30s；
第四步，退火54-60℃(H120/QX为55℃、LDT3为54℃、4/91为57℃、GVI-1为60℃)、时间30s；
第五步，扩增72℃、时间42s；
进行所述第一步至所述第五步35个循环后，再扩增72℃延伸5min。
进一步地，步骤(3)中所述的电泳检测方法为琼脂糖凝胶电泳，具体步骤为：取步骤(3)中RT-PCR扩增产物8μl，在1.5％琼脂糖凝胶上进行电泳，5V/cm电泳30min，在紫外检测仪观察到不同大小的核酸片段。
进一步地，步骤(3)中电泳检测结果为：所述H120型的引物扩增获得的产物片段大小为653bp，所述QX型的引物扩增获得的产物片段大小为339bp，所述LDT3型的引物扩增获得的PCR产物片段大小为519bp，所述4/91型的引物扩增获得的PCR产物片段大小为727bp，所述GVI-1型的引物扩增获得的产物片段大小为411bp。
本发明的有益效果为：
1、我国传染性支气管炎病毒IBV主要流行毒株及疫苗株主要包含H120、QX、LDT3、4/91、GVI-1型。现行的国家标准、农业标准中并没有应用于以上几种不同鸡传染性支气管炎病毒基因型毒株的特异性RT-PCR分型检测方法，由于IBV血清型复杂多样，血清学试验鉴定难以实现，本发明使用不同基因型的IBV鉴定特异性引物组，仅通过一步法RT-PCR进行分型检测，通过电泳观察产物片段大小，即可判定待测样本中是否含有H120、QX、LDT3、4/91、GVI-1等五种基因型毒株。
2、本发明方法是对于现有检测方法的有效补充，也是现行最有效的快速、准确的进行鸡传染性支气管炎病毒分型的检测方法，适用于常见鸡传染性支气管炎病毒野毒株、疫苗毒株的分型鉴定，对IBV防控具有重大意义。
附图说明
图1为实施例2中引物对一至五各基因型阳性模板PCR扩增的电泳结果图；其中，MK、1000bp Marker；1、H120型；2、QX型；3、LDT3型；4、4/91型；5、GVI-1型。
图2为实施例3中引物对一对五种基因型阳性模板PCR扩增的电泳结果图；其中，MK、1000bp Marker；1、H120型；2、QX型；3、LDT3型；4、4/91型；5、GVI-1型。
图3为实施例3中引物对二对五种基因型阳性模板PCR扩增的电泳结果图；其中，MK、1000bp Marker；1、H120型；2、QX型；3、LDT3型；4、4/91型；5、GVI-1型。
图4为实施例3中引物对三对五种基因型阳性模板PCR扩增的电泳结果图；其中，MK、1000bp Marker；1、H120型；2、QX型；3、LDT3型；4、4/91型；5、GVI-1型。
图5为实施例3中引物对四对五种基因型阳性模板PCR扩增的电泳结果图；其中，MK、1000bp Marker；1、H120型；2、QX型；3、LDT3型；4、4/91型；5、GVI-1型。
图6为实施例3中引物对五对五种基因型阳性模板PCR扩增的电泳结果图；其中，MK、1000bp Marker；1、H120型；2、QX型；3、LDT3型；4、4/91型；5、GVI-1型。
图7为实施例4中引物对五对15份临床样本PCR扩增的电泳结果图；其中，MK、1000bp Marker；1-15为临床样本；水、空白对照。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步的说明。
实施例1一组用于鸡传染性支气管炎病毒基因分型检测的引物
本发明提供了一组用于鸡传染性支气管炎病毒基因分型检测的引物，可用于鸡传染性支气管炎病毒鉴定的特异性分型，包括5对特异性PCR引物，分别为鸡传染性支气管炎病毒H120型、QX型、LDT3型、4/91型、GVI-1型的扩增引物。鸡传染性支气管炎病毒鉴定特异性分型引物序列，具体见表1所示：
表1RT-PCR扩增引物序列
实施例2一种鸡传染性支气管炎病毒不同基因型毒株的RT-PCR分型检测方法
按以下步骤进行：
1、样品RNA提取
1)向1.5ml EP管中加入20μl蛋白酶K；
2)吸取200μl样品加至步骤1)的1.5ml EP管中，如果样品量不足，可以添加PBS补足体积；
3)吸取200μl Buffer AL加至步骤2)所得样本中，混匀后涡旋振荡15s；56℃孵育10min；
4)吸取200μl无水乙醇加至步骤3)所得样品中，充分混匀使得管壁上的液体沉到管底；
5)吸取步骤4)获得的液体加至核酸纯化柱上(置于2ml收集管上)，1000rpm离心1min。弃去废液后，将核酸纯化柱放置在新的收集管上；
6)吸取500μl Buffer AW1加至步骤5)的核酸纯化柱中，8000rpm离心1min。弃去废液后，将核酸纯化柱放置在新的收集管上；
7)吸取500μl Buffer AW2加至步骤6)的核酸纯化柱中，12000rpm离心3min；
8)弃去废液后，将核酸纯化柱放置在新的收集管上，12000rpm离心1min；
9)将核酸纯化柱放置于新的1.5ml收集管上，打开层析柱管口，添加50μl RNasefree灭菌水，室温静置1min。然后8000rpm离心1min，收集管中即为提取的RNA样本。
2、RT-PCR扩增
利用鸡传染性支气管炎病毒鉴定特异性分型引物对一至五进行RT-PCR扩增；
2.1RT-PCR扩增的特异性引物序列为实施例1表1中引物对一至五所示；
2.2所述的RT-PCR扩增体系为：
采用一步法RT-PCR反应体系的总体积为25μl，反应体系组成为：5.5μl的灭菌水、12.5μl的2xTransTaq PCR Supermix、1μl浓度为10μM的上游引物、1μL浓度为10μM的下游引物、5μl的样品RNA提取液；
2.3所述的RT-PCR扩增反应程序为：
第一步，反转录50℃、时间30min；
第二步，预扩增94℃、时间5min；
第三步，扩增94℃、时间30s；
第四步，退火54-60℃(H120/QX为55℃、LDT3为54℃、4/91为57℃、GVI为60℃)、时间30s；
第五步，扩增72℃、时间42s；
进行所述第一步至所述第五步35个循环后，再扩增72℃延伸5min。
3、琼脂糖凝胶电泳
用TAE电泳缓冲液配置1.5％琼脂糖平台(每配制10ml电泳液需1μlGelRed原液)，将平板放入水平电泳仪，使电泳缓冲液刚好没过胶面，取8μl PCR扩增产物加入样品孔。在电泳时设立RNA标准分子量作为对照。5V/cm电泳约30min，当溴酚蓝达到底部时停止，在紫外检测仪观察结果。
4、结果判定
在鸡传染性支气管炎病毒阴性对照、阳性对照成立的条件下，结果可信。H120型的引物扩增获得的产物片段大小为653bp，QX型的引物扩增获得的产物片段大小为339bp，LDT3型的引物扩增获得的产物片段大小为519bp，4/91型的引物扩增获得的产物片段大小为727bp，GVI-1型的引物扩增获得的产物片段大小为411bp。
实施例3一种检测鸡传染性支气管炎病毒基因分型的扩增引物组特异性验证
按以下步骤进行：
1、样品RNA提取：对H120型毒株、QX型毒株、LDT3型毒株、4/91型毒株、GVI-1型毒株阳性对照进行RNA提取。
2、RT-PCR扩增
利用实施例1中的鸡传染性支气管炎病毒鉴定特异性分型引物对一至五对5个阳性对照进行RT-PCR扩增；
2.1所述的RT-PCR扩增体系为：
采用一步法RT-PCR反应体系的总体积为25μl，反应体系组成为：5.5μl的灭菌水、12.5μl的2xTransTaq PCR Supermix、1μl浓度为10μM的上游引物、1μL浓度为10μM的下游引物、5μl的样品RNA提取液；
2.2所述的RT-PCR扩增反应程序为：
第一步，反转录50℃、时间30min；
第二步，预扩增94℃、时间5min；
第三步，扩增94℃、时间30s；
第四步，退火54-60℃(H120/QX为55℃、LDT3为54℃、4/91为57℃、GVI为60℃)、时间30s；
第五步，扩增72℃、时间42s；
进行所述第一步至所述第五步35个循环后，再扩增72℃延伸5min。
3、琼脂糖凝胶电泳
用TAE电泳缓冲液配置1.5％琼脂糖平台(每配制10ml电泳液需1μlGelRed原液)，将平板放入水平电泳仪，使电泳缓冲液刚好没过胶面，取8μl PCR扩增产物加入样品孔。在电泳时设立RNA标准分子量作为对照。5V/cm电泳约30min，当溴酚蓝达到底部时停止，在紫外检测仪观察结果。
4、结果判定
在鸡传染性支气管炎病毒阴性对照、阳性对照成立的条件下，结果可信。结果显示，各个基因型检测引物特异性极高。引物对一仅H120型毒株阳性对照扩增获得的产物片段大小为653bp为阳性，其余4个阳性对照均为阴性，说明引物对一特异性好，仅对H120型毒株扩增出相应目的条带，与其它亚型毒株均无交叉反应；引物对二仅QX型毒株阳性对照扩增获得的产物片段大小为339bp为阳性，其余4个阳性对照均为阴性，说明引物对二特异性好，仅对QX型毒株扩增出相应目的条带，与其它亚型毒株均无交叉反应；引物对三仅LDT3型毒株阳性对照扩增获得的产物片段大小为519bp为阳性，其余4个阳性对照均为阴性，说明引物对三特异性好，仅对LDT3型毒株扩增出相应目的条带，与其它亚型毒株均无交叉反应；引物对四仅4/91型毒株阳性对照扩增获得的产物片段大小为727bp为阳性，其余4个阳性对照均为阴性，说明引物对四特异性好，仅对4/91型毒株扩增出相应目的条带，与其它亚型毒株均无交叉反应；引物对五仅GVI-1型毒株阳性对照扩增获得的产物片段大小为411bp为阳性，其余4个阳性对照均为阴性，说明引物对五特异性好，仅对GVI-1型毒株扩增出相应目的条带，与其它亚型毒株均无交叉反应。
实施例4对临床样品的检测
采用实施例2中的检测方法，利用实施例1中的鸡传染性支气管炎病毒鉴定特异性分型引物对一至五对采集自山东部分地区规模化养殖场疑似鸡传染性支气管炎病毒或其它病毒阳性样本共15份进行检测。最终15份检测结果如电泳图7所示，其中1-15为临床样本，结果显示，采用引物对一H120型引物扩增时，样本10、11获得653bp的产物，为H120型毒株阳性；采用引物对二QX型引物扩增时，样本2、4获得339bp的产物，为QX型毒株阳性；采用引物对三LDT3型引物扩增时，样本13获得519bp的产物，为LDT3型毒株阳性；采用引物对四4/91型引物扩增时，样本9获得727bp的产物，为4/91型毒株阳性；采用引物对五GVI-1型引物扩增时，样本1、6获得411bp的产物，为GVI-1型毒株阳性；另外，样本3、5、7、8、12、14、15采用引物对一至五引物扩增时均未发现阳性。
临床结果表明，H120型、QX型、LDT3型、4/91型、GVI-1型IBV毒株普遍存在于本次送检山东部分地区规模化养殖场中，本发明所提供的用于检测鸡传染性支气管炎病毒基因分型的扩增引物组，特异性良好，可以有效检测出阳性结果。
以上对本发明的一个实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。
Claims (10)
1.一组用于鸡传染性支气管炎病毒基因分型检测的引物，其特征在于，所述引物包括鸡传染性支气管炎病毒H120型、QX型、LDT3型、4/91型、GVI-1型的扩增引物；其中，所述H120型的引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；所述QX型的引物序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；所述LDT3型的引物序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；所述4/91型的引物序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示；所述GVI-1型的引物序列如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。
2.如权利要求1所述的一组用于鸡传染性支气管炎病毒基因分型检测的引物在制备检测鸡传染性支气管炎病毒检测试剂中的应用。
3.含有如权利要求1所述的一组用于鸡传染性支气管炎病毒基因分型检测的引物的检测试剂盒。
4.一种鸡传染性支气管炎病毒不同基因型毒株的RT-PCR分型检测方法，包括以下步骤：(1)提取待检样品的RNA；(2)使用权利要求1中所述的用于鸡传染性支气管炎病毒基因分型检测的引物对步骤(1)中所得RNA进行RT-PCR扩增；(3)对扩增产物进行电泳检测。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中所述的RT-PCR扩增体系为一步法RT-PCR反应体系，反应体系总体积为25μL；所述反应体系的组成为：5.5μL的灭菌水、12.5μL的2xTransTaqPCRSupermix、1μL浓度为10μM的上游引物、1μL浓度为10μM的下游引物、5μL的样品RNA提取液。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中所述的RT-PCR扩增反应程序设定为：50℃反转录30min，94℃预扩增5min，94℃扩增30s，54-60℃退火30s，72℃扩增42s，35个循环后，72℃扩增延伸5min。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述退火温度为55℃时用于扩增H120型与QX型的引物；所述退火温度为54℃时用于扩增LDT3型的引物；所述退火温度为60℃时用于扩增GVI-1型的引物。
8.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，步骤(3)中所述的电泳检测方法为琼脂糖凝胶电泳。
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述琼脂糖凝胶电泳的步骤为：取步骤(3)中RT-PCR扩增产物的上样量为8μL，在1.5％琼脂糖凝胶上进行电泳，设置电泳电压为5V/cm，电泳时间为30min，电泳结束后观察核酸片段；所述电泳检测结果为：所述H120型的引物扩增获得的产物片段大小为653bp，QX型的引物扩增获得的产物片段大小为339bp，LDT3型的引物扩增获得的产物片段大小为519bp，4/91型的引物扩增获得的产物片段大小为727bp，GVI-1型的引物扩增获得的产物片段大小为411bp。
10.如权利要求4所述的一种鸡传染性支气管炎病毒不同基因型毒株的RT-PCR分型检测方法在鸡传染性支气管炎病毒检测中的应用。
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
| CN117737298A (zh) * | 2023-09-22 | 2024-03-22 | 江苏农牧科技职业学院 | 同时鉴别不同基因型禽传染性支气管炎病毒的多重pcr引物、检测试剂、方法及应用 |
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