CN111154917B

CN111154917B - 鉴别猪伪狂犬病毒变异毒株的pcr引物及方法

Info

Publication number: CN111154917B
Application number: CN202010109705.2A
Authority: CN
Inventors: 白娟; 吕林; 姜平; 王先炜
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2020-02-22
Filing date: 2020-02-22
Publication date: 2022-12-27
Anticipated expiration: 2040-02-22
Also published as: CN111154917A; WO2021164186A1

Abstract

本发明涉及生物毒株鉴别技术领域，具体公开了鉴别猪伪狂犬病毒变异毒株的PCR引物及方法，提取待鉴别病毒DNA，采用本发明设计的引物进行第一步扩增，扩增出两条条带的为变异株或HB98疫苗毒株，扩增出1条条带的为经典毒株；扩增出两条条带的病毒DNA再进行第二步扩增，扩增产物分子量大小为211bp的为变异株,扩增产物分子量大小为293bp的为HB98疫苗毒株。第一步PCR的敏感度可以达到10TCID₅₀病毒量或0.01ng/ml质粒量，而第二步PCR敏感度达到10TCID₅₀病毒量或者0.1ng/ml质粒量。该敏感度可以有效的检测出临床病料中是否有伪狂犬病毒感染，并区分出伪狂犬病毒经典毒株或者变异毒株感染，并且准确率高。

Description

鉴别猪伪狂犬病毒变异毒株的PCR引物及方法

技术领域

本发明涉及生物毒株鉴别技术领域，特别涉及鉴别猪伪狂犬病毒变异毒株的PCR引物及检测方法。

背景技术

伪狂犬病毒(Pseudorabies Virus,PRV)是疱疹病毒科，α疱疹病毒亚科的双股DNA病毒，基因组在140kd左右，编码69个开放阅读框。该病毒主要引起母猪流产、死胎及呼吸系统症状，仔猪出现神经症状和腹泻，给养猪业造成了巨大的经济损失。目前，欧美洲很多国家通过免疫接种和净化技术已经根除该病。我国近十多年内通过采用强化免疫和净化技术，该病也得到有效控制。但是，2011年末，我国PRV疫苗免疫猪场再次暴发该病。全基因组分析结果也表明，此次新发的伪狂犬病病毒与之前的经典伪狂犬病毒属于不同的亚群，其抗原性发生了变化，变异毒株位于一个新的基因分支。因此建立PRV变异毒株和经典毒株鉴别方法十分必要。

目前现有的检测伪狂犬病毒感染的PCR方法有很多，其中最常用的两种是国标法与伪狂犬gE基因检测法。国标法主要针对伪狂犬病毒gD基因，可以特异的扩增出220bp的片段。因为gD基因是伪狂犬病毒感染过程中一个重要的囊膜蛋白，包括疫苗毒与野毒在内的各种类型的伪狂犬病毒(gD缺失的伪狂犬病毒除外)都存在该基因，所以该方法可以用于鉴别伪狂犬病毒的感染与否，但不能够区分疫苗毒与野毒株。而伪狂犬病毒gE基因检测法主要用于鉴别疫苗毒与野毒株，野毒株可以扩增出632bp的片段，而疫苗毒由于缺失了gE基因，所以不能扩增出相应的片段。因为现阶段猪场都有Bartha-K61等疫苗免疫，所以国标方法不再适合进行鉴别，而用于区分疫苗毒与野毒的伪狂犬病毒gE基因检测法得到了很好的应用，但是由于伪狂犬病毒变异毒株的出现，使这一方法受到了局限。该方法不能够区分出变异毒株与经典毒株，而变异毒株与经典毒株的区分在免疫与监测上又至关重要，所以需要一种可以有效区分伪狂犬病毒经典毒株与变异毒株的PCR诊断方法。

发明内容

为了有效的预控伪狂犬病的发生，区分出经典毒株与变异毒株的感染及其流行的区域至关重要。本研究通过不同毒力毒株全基因组序列比对，找到了经典毒株与变异毒株的基因差异区域UL44和UL36，设计PCR引物，建立了两步法PCR，具有较高特异性和敏感性，可用于鉴别PRV经典毒株与变异毒株，为该病诊断提供了有效方法。

本发明的技术方案包括以下内容：

用于鉴别猪伪狂犬病毒变异毒株的PCR引物组，该PCR引物组包括引物1F-C、1F-V、1R、2F和2R，其中各引物的序列如下：

1F-C：5’-ACGCCGACCCCGAGTACTTTGACG-3’，

1F-V：5’-GAGCCCGTCTCGGGGACGAC-3’，

1R：5’-GGCCACGCGCACGGACACC-3’，

2F:5’-GATGCGGTCACCGTCGGGTTT-3’，

2R:5’-CCGCCGCTCAGCCCCCATCGT-3’。

上述的PCR引物组在鉴别猪伪狂犬病毒变异毒株中的应用，包括以下步骤：提取待鉴别病毒DNA，使用所述PCR引物组中的引物1F-C、1F-V、1R进行第一步扩增，扩增出两条条带的为变异株或HB98疫苗毒株，扩增出1条条带(178bp)的为经典毒株；扩增出两条条带(178bp、467bp)的病毒DNA再使用所述PCR引物组中的引物2F和2R进行第二步扩增，扩增产物分子量大小为211bp的为变异株，扩增产物分子量大小为293bp的为HB98疫苗毒株。

通过对中国新流行伪狂犬病毒变异毒株与国内外经典毒株全基因组序列比对发现，在UL44区域内，变异毒株比经典毒株多插入了21个碱基的序列。鉴此，首先设计了3条引物的PCR方法，一条下游引物，两条上游引物。理论上，经典毒株只能与一条上游引物和下游引物结合，产生一条约178bp的条带；而变异毒株(包括HB98毒株，序列近似EA毒株)可以与两条上游引物和下游引物结合，产生一条约467bp的条带和一条178bp左右的条带。由此可以区分出伪狂犬病毒经典毒株与变异毒株。但是，我们在检测疫苗毒株时发现，HB98毒株也出现两条条带，基因序列测定结果显示，HB98毒株UL44也存在着21个碱基的插入。我们在UL36区域内又设计了一对引物，通过第二次PCR，HB98扩增出293bp条带，变异毒株扩增出211bp的条带，从而可以有效区分HB98与变异毒株，结果证明，通过以上两次PCR可以有效地区分伪狂犬变异毒株与经典毒株。

上述的PCR引物组在制备用于鉴别猪伪狂犬病毒变异毒株的试剂盒中的应用。

一种用于鉴别猪伪狂犬病毒变异毒株的试剂盒，该试剂盒中包含上述的PCR引物组。

一种鉴别猪伪狂犬病毒变异毒株的方法，提取待鉴别病毒DNA，使用上述PCR引物组中的引物1F-C、1F-V、1R进行第一步扩增，扩增出两条条带的为变异株或HB98疫苗毒株，扩增出1条条带的为经典毒株；扩增出两条条带的病毒DNA再使用上述PCR引物组中的引物2F和2R进行第二步扩增，扩增产物分子量大小为211bp的为变异株，扩增产物分子量大小为293bp的为HB98疫苗毒株。

上述的方法，优选的，第一步扩增的反应体系：Taqmix 12.5μl，蒸馏水7.5μl，DMSO1μl，10uM的上游引物1F-C、下游引物1F-V、鉴别引物1R各1μl，DNA模板1μl。

上述的方法，优选的，第一步扩增的反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，最后72℃终延伸10min。

上述的方法，优选的，第二步扩增的反应体系：Taqmix 12.5μl，蒸馏水8.5μl，DMSO1μl，10uM上游引物F’、下游引物R’分别为1μl、1μl，DNA模板1μl。

上述的方法，优选的，第二步扩增的反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；最后72℃终延伸10min。

上述的方法，第一次扩增的敏感度达到10TCID₅₀病毒量或0.01ng/ml质粒量；第二次扩增的敏感度达到10TCID₅₀病毒量或者0.1ng/ml质粒量。

本发明PCR鉴别方法，准确率达到90％到100％。

区分经典毒株与变异毒株的原则是：第一次PCR，如果扩增产物只有178bp一个条带，则为经典PRV毒株，如果扩增产物含有467bp和178bp两个条带，则为变异毒株或HB98疫苗毒株。如果出现两个条带，则需要进行第二步PCR。如果第二次PCR扩增产物大小为211bp，则为变异毒株，如果扩增产物大小为293bp，则为HB98疫苗毒株。该判断方法简便易行。

本发明的有益效果：

1)第一步PCR的敏感度可以达到10TCID₅₀病毒量或0.01ng/ml质粒量，而第二步PCR敏感度达到10TCID₅₀病毒量或者0.1ng/ml质粒量。该敏感度可以有效的检测出临床病料中是否有伪狂犬病毒感染，并区分出伪狂犬病毒经典毒株或者变异毒株感染；

2)通过与国标检测方法和常规的PCR方法进行比较发现，在30份病料中，国标方法可以检测出21份阳性，常规PCR方法可以检测出19份阳性，本方法可以检测出21份阳性，其中20份属于变异毒株，与国标方法符合率为100％，且很好的区分出变异毒株与经典毒株。所以该方法可以广泛用于临床病原的检测、监控与流行病学调查。

附图说明

图1为经典毒株与变异毒株UL44区段的扩增。1F-C1引物：M，DL2000 DNA marker；1，变异毒株ZJ01；2，经典疫苗毒株HB98；3，经典野毒株LA；4，经典疫苗毒株Bartha-K61；5经典疫苗毒株Bucharest；6，阴性对照。1F-C2引物：M，DL2000 DNA marker；1，经典野毒株LA变异毒株ZJ01；2，经典疫苗毒株Bartha-K61；3，变异毒株ZJ01；4，经典疫苗毒株HB98；5，阴性对照；

图2为HB98与伪狂犬变异毒株ZJ01的区分，M，DL2000 DNA marker；1，阴性对照；2，ZJ01株；3，HB98株；

图3为第一步PCR特异性试验，M，DL2000 DNA Marker；1，猪圆环病毒2型；2，猪繁殖与呼吸综合征病毒；3，猪瘟病毒；4，猪日本乙型脑炎病毒；5，猪脑心肌炎病毒；6，猪流行性腹泻病毒；7，猪塞尼卡病毒；8，阴性对照；9，猪伪狂犬病毒ZJ01株；10，猪伪狂犬病毒LA株；

图4第二步PCR特异性试验，M，DL2000 DNA Marker；1，猪圆环病毒2型；2，猪繁殖与呼吸综合征病毒；3，猪瘟病毒；4，猪日本乙型脑炎病毒；5，猪脑心肌炎病毒；6，猪流行性腹泻病毒；7，猪塞尼卡病毒；8.阴性对照；9，猪伪狂犬病毒ZJ01株；10，猪伪狂犬病毒HB98株；

图5第一步PCR鉴别PRV经典毒株(LA株)与变异毒株(ZJ01株)的敏感性试验。M：DL5000 DNA marker；1，100000TCID₅₀；2，10000TCID₅₀；3，1000TCID₅₀；4，100TCID₅₀；5，10TCID₅₀；6，阴性对照；

图6第二步PCR方法鉴别PRV变异株和HB98的敏感性试验，M，DL5000；1，100000TCID₅₀；2，10000TCID₅₀；3，1000TCID₅₀；4，100TCID₅₀；5，10TCID₅₀；6，阴性对照；

图7含UL44基因的重组质粒DNA敏感性试验，M，DL5000 DNA marker；1，100000ng/ml；2，10000ng/ml；3，1000ng/ml；4，100ng/ml；5，10ng/ml；6，1ng/ml；7，0.1ng/ml；8，0.01ng/ml；9，阴性对照；

图8含UL36基因的重组质粒DNA敏感性试验，M，DL5000 DNA marker；1，100000ng/ml；2，10000ng/ml；3，1000ng/ml；4，100ng/ml；5，10ng/ml；6，1ng/ml；7，0.1ng/ml；8，0.01ng/ml；9，阴性对照。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明：

实施例1

1材料和方法

1.1试剂和仪器

TaqMix购自诺唯赞公司，DMSO购自Sigma公司。引物合成自南京金斯瑞公司。PCR仪购自eppendorf公司。病毒DNA提取试剂盒购自Omega公司。

1.2病毒和病料

病毒：PRV变异毒株ZJ01株(本实验室于2011年分离鉴定),PRV传统毒株LA株(中国动物疫病卫生中心范伟兴研究员提供)(Dong et al.,Virology 2018)，HB98疫苗毒株(武汉科前公司PRV商品疫苗)，Bartha-K61毒株(梅里亚公司PRV商品疫苗)，Bucharest毒株(硕腾公司PRV商品疫苗)。

临床病料：来自华东地区发病猪群，脑或肺脏组织悬液共30份，于-20℃保存备用。

1.3引物设计与合成

根据Genebank PRV基因组序列(ZJ01、TJ、Bartha-K61、Becker、Kaplan)与本实验室伪狂犬经典毒株LA基因序列，采用DNAstar和BioEdit软件比对分析，设计5条引物(表1)，第一步PCR，如果采用引物1F-C1、1F-V和1R，变异株和HB98株预期扩增出两条条带(835bp、467bp)，经典毒株预期扩增出1条条带(738bp或813bp)。如果采用引物1F-C2、1F-V和1R，变异株和HB98株预期扩增出两条条带(467bp、178bp)，经典毒株预期扩增出1条条带(178bp)。第二步PCR采用引物2F和2R。变异株和HB98疫苗毒株的扩增产物分子量大小分别为211bp、293bp。引物由南京金斯瑞公司合成。

表1 PCR引物及其预期扩增产物

Table1 PCR primers and expected productions

注：2R引物与HB98毒株(EA毒株)完全匹配，而与ZJ01毒株5’端有个别碱基错配，不影响扩增效率。

1.4病毒DNA提取

取250μl伪狂犬病毒液，使用Omega公司的病毒DNA试剂盒，按说明书操作，提取病毒基因组，用30μl双蒸水溶解，-20℃保存备用，作为DNA模板。

1.5两步法PCR

第一步PCR：PCR反应体系：Taqmix 12.5μl，蒸馏水7.5μl，DMSOμl，10uM上游引物1F-C、下游引物1F-V、鉴别引物1R各1μl，DNA模板1μl。PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，最后72℃终延伸10min。取10ul PCR产物于1.5％琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定。

结果见图1，

1F-C1套引物：ZJ01变异毒株扩增出两个条带，分子量大约为835bp和467bp，经典毒株LA、经典疫苗毒株Bucharest和Bartha-K61均只扩增出1条条带，大小约813bp，与预测一致。但经典疫苗毒株HB98中也扩增出两个条带，分子量与ZJ01变异毒株扩增结果一致。PCR产物分别克隆至pMD19-T载体，基因测序结果正确。经典毒株LA扩增条带783bp，经典毒株Bucharest、Bartha-K61疫苗毒株扩增条带813bp，与设计一致。

1F-C2套引物：ZJ01变异毒株扩增出两个条带，分子量大约为178bp和467bp，LA经典毒株、Bartha-K61疫苗毒株均只扩增出1条条带，大小约178bp，与预测一致。但经典疫苗毒株HB98中也扩增出两个条带，分子量与ZJ01变异毒株扩增结果一致。PCR产物分别克隆至pMD19-T载体，基因测序结果正确。

上述结果显示，1F-C2套引物条带更加清晰，变异毒株与经典毒株的区分度更佳。因此，选择1F-C2套引物作为该方法的第一步PCR，用于以下所有试验研究。

第二步PCR：PCR反应体系：Taqmix 12.5μl，蒸馏水8.5μl，DMSO 1μl，10uM上游引物F’、下游引物R’各1μl，DNA模板1μl。PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；最后72℃终延伸10min。取10ul PCR产物于1.5％琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定。

取变异毒株ZJ01和经典疫苗毒株HB98，进行第二步PCR，结果见图2，ZJ01毒株和HB98毒株扩增产物大小为211bp和293bp。PCR产物分别克隆至pMD19-T载体，基因测序结果正确。

1.6特异性试验

将ZJ01、LA和HB98毒株的PCR产物分别克隆至pMD19-T载体，挑选阳性重组质粒送往南京金斯瑞公司测序验证。同时，用该方法检测猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、脑心肌炎病毒(EMCV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、流行性乙型脑炎病毒(JEV)，猪塞尼卡病毒(SVV)观察是否能扩增出特异的条带。

以猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、日本乙型脑炎病毒、脑心肌炎病毒、塞尼卡病毒和猪流行性腹泻病毒的DNA(或反转录cDNA)为模板，第一步和第二步PCR结果均为阴性，表明该PCR的特异性良好。见图3和4。

1.7敏感性试验

1.7.1检测病毒液

第一步PCR：将PRV ZJ01株、LA株分别接种于BHK21细胞上，待完全出现病变后收取病毒，测定半数组织细胞感染量(TCID₅₀)。将两种病毒株病毒液稀释成每毫升40TCID₅₀、400TCID₅₀、4×10³TCID₅₀、4×10⁴TCID₅₀和4×10⁵TCID₅₀病毒，取250μl通过Omega公司的病毒DNA提取试剂盒提取后得到模板，每个稀释度提取得到DNA 30μl。通过PCR发现，本方法敏感度为10TCID₅₀(见图5)。

第二步PCR：将伪狂犬病毒HB98株病毒原液稀释成每毫升含有40TCID₅₀、400TCID₅₀、4×10³TCID₅₀、4×10⁴TCID₅₀、4×10⁵TCID₅₀的病毒液，取250μl通过Omega试剂盒提取后得到模板DNA 30μl。通过PCR发现，本方法敏感度可以达到10TCID₅₀(见图6)。

1.7.2检测重组质粒DNA模板

第一步PCR：取含UL44基因的pMD19T-ZJ01/UL44、pMD19T-LA/UL44重组质粒DNA为模板，10倍梯度稀释后进行PCR，测定PCR方法的敏感性，结果敏感度可以达到0.01ng/ml(见图7)。

第二步PCR：取含UL36基因的pMD19T-ZJ01/UL36、pMD19T-HB98/UL36重组质粒DNA为模板，10倍梯度稀释后进行PCR，测定PCR方法的敏感性，结果敏感度可以达到0.1ng/ml(见图8)。

1.8常规gE-PCR检测方法

按文献报道方法，PCR引物序列为：3F:5’-TCCACTCGCAGCTCTTCT-3’3R：5’-GCACGTCATCACGAAGGA-3’。PCR反应体系：Taqmix 12.5μl，蒸馏水8.5μl，DMSO 1μl，10uM上游引物F(gD)、下游引物R(gD)分别为1μl、1μl，DNA模板1μl。PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸45s，共35个循环；最后72℃终延伸10min。

1.9国家标准gD-PCR检测方法

按国标法进行。PCR引物序列为：4F:5’-CAGGAGGACGAGCTGGGGCT-3’4R:5’-GTCCACGCCCCGCTTGAAGCT-3’。PCR反应体系：Taqmix 12.5μl，蒸馏水8.5μl，DMSO 1μl，10uM上游引物F(gD)、下游引物R(gD)分别为1μl、1μl，DNA模板1μl。PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；最后72℃终延伸10min。

1.10临床样品检测结果

取58份临床样品，采用本方法检测PRV，阳性率为55.17％(32/58)，其中变异株32份，经典毒株0份；伪狂犬病毒gE基因PCR方法检测，阳性率55.17％(32/58)；PRV国标方法检测，阳性率50.0(29/58)。本方法与gE基因PCR方法、国标方法的符合率达到了100％和94.8％。

2.4重复性试验

取3份病毒样品，重复检测3次。第一步PCR扩增出178bp与467bp左右的条带，第二步PCR扩增出211bp左右的条带，三次结果一致，表明检测样品为伪狂犬病毒变异毒株。

我们也看到，该方法只是基于全基因组序列比对以及部分参考文献做出的，虽然通过临床检测样品初步的验证了该方法的可靠性，但是基于更多流行毒株分子生物学方面的证据仍然不足，需要进一步进行研究和探索。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 鉴别猪伪狂犬病毒变异毒株的PCR引物及方法

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

acgccgaccc cgagtacttt gacg 24

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gagcccgtct cggggacgac 20

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggccacgcgc acggacacc 19

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gatgcggtca ccgtcgggtt t 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ccgccgctca gcccccatcg t 21

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gctgctcgag gcggaccacg tc 22

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tccactcgca gctcttct 18

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gcacgtcatc acgaagga 18

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

caggaggacg agctggggct 20

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gtccacgccc cgcttgaagc t 21

Claims

1.用于鉴别猪伪狂犬病毒变异毒株的PCR引物组，其特征在于，该PCR引物组包括引物1F-C、1F-V、1R、2F和2R，其中各引物的序列如下：

1F-C：5’- ACGCCGACCCCGAGTACTTTGACG -3’，

1F-V：5’- GAGCCCGTCTCGGGGACGAC -3’，

1R：5’- GGCCACGCGCACGGACACC -3’，

2F: 5’-GATGCGGTCACCGTCGGGTTT-3’，

2R: 5’-CCGCCGCTCAGCCCCCATCGT-3’；

提取待鉴别病毒DNA，使用所述PCR引物组中的引物1F-C、1F-V、1R进行第一步扩增，扩增出两条条带的为变异株或HB98疫苗毒株，扩增出1条178bp条带的为经典毒株；扩增出两条178bp和467bp条带的病毒DNA再使用所述PCR引物组中的引物2F和2R进行第二步扩增，扩增产物分子量大小为211bp的为变异株，扩增产物分子量大小为293bp的为HB98疫苗毒株。

2.权利要求1所述的PCR引物组在制备用于鉴别猪伪狂犬病毒变异毒株的试剂盒中的应用。

3.一种用于鉴别猪伪狂犬病毒变异毒株的试剂盒，其特征在于，该试剂盒中包含权利要求1所述的PCR引物组。