CN110257345B - 一种猪伪狂犬病双基因缺失变异突变病毒毒株及其构建方法 - Google Patents

一种猪伪狂犬病双基因缺失变异突变病毒毒株及其构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及病毒领域，特别是指一种猪伪狂犬病双基因缺失变异突变病毒毒株及其构建方法。所述病毒毒株为gE、gI双基因缺失毒株，保藏号为CCTCC NO：V201749，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，邮编：430072，本发明所构建的rPRV HN2012‑gE‑/gI‑免疫组仔猪在试验过程中没有出现任何不良反应，中和抗体水平证实了该缺失病毒保持了良好的免疫原性，并且本发明所获得的rPRV HN2012‑gE‑/gI‑双基因缺失病毒对仔猪是安全的，免疫后能有效并迅速产生PRV特异性抗体，是一株有希望应用于当前PRV流行防控工作的疫苗株。

Description

一种猪伪狂犬病双基因缺失变异突变病毒毒株及其构建方法
技术领域
本发明涉及病毒领域，特别是指一种猪伪狂犬病双基因缺失变异突变病毒毒株及其构建 方法。
背景技术
伪狂犬病(Pseudorabies,PR)，即奥耶兹氏病(Aujeszky’s disease)，其病原是伪狂犬病病 毒(Pseudorabies virus,PRV)，牛、羊、猪等多种家畜及野生动物均可患该病[i]。PR的主要症 状为发热、奇痒(猪除外)、脑脊髓炎、神经及繁殖系统障碍，是一种急性热性高度接触性传 染病[ii]。猪是该病的自然宿主和主要传染源，PRV可以感染不同年龄段的猪，主要引起妊娠 母猪流产、产死胎和木乃伊胎；哺乳仔猪出现神经症状，衰竭死亡，死亡率高达100％。迄今 尚未研发出可成功治疗PR的药物，因此在临床上只能采用给猪接种如PRVBartha-K61等弱 毒疫苗，使猪群中PR得到有效控制。然而2011年底起，我国20多个省市已免疫过猪伪狂 犬疫苗的猪群中开始出现了PR疫情的大流行。随后许多研究也陆续证实，临床上常免疫的 Bartha-K61弱毒疫苗株对当前流行的PRV变异株已不能提供100％保护，这新一轮以PRV流 行变异株引发的PR疫情使我国的养猪业面临巨大的挑战，因此一种可针对当前流行变异株 的有效疫苗急待开发。
本实验室于2012年从河南省南阳市某免疫过PRV Bartha-K61疫苗猪场病死猪体内分离 到了一株PRV野毒株，命名为PRV/HN2012株(CTCC NO.V201314)。基于gE、gB、gC基因的同源性和遗传进化分析结果显示，该毒株与国内近年分离的PRV流行变异株同源性最高，且在进化树中与国内近年来分离的PRV流行变异毒株位于一个分支，可作为疫苗开发的一个 新方向。
发明内容
本发明提出一种猪伪狂犬病双基因缺失变异突变病毒毒株及其构建方法，解决了现有 PRV流行而无高效灵敏度疫苗的问题。
本发明的技术方案是这样实现的：
一种猪伪狂犬病双基因缺失变异突变病毒毒株，所述病毒毒株为gE、gI双基因缺失毒株， 保藏名称：重组猪伪狂犬病毒rPRV HN2012-gE-/gI-，保藏号为CCTCC NO：V201749，保藏 日期：2017年10月31日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国.武汉.武 汉大学，邮编：430072。
所述的猪伪狂犬病双基因缺失变异突变病毒毒株的构建方法，步骤如下：
(1)以PRV/HN2012株为亲本毒株，分别扩增PRV/HN2012株的gE/gI基因两侧的序列作为重组同源臂克隆至pUC-19载体，构建转移质粒pUC-gE/gILR；
(2)用绿色荧光蛋白(EGFP)作为标记基因，标记步骤(1)构建的转移质粒pUC-gE/gILR， 得标记后的转移质粒pUC-gE/gILRE；
(3)设计靶向于绿色荧光蛋白的外源基因gRNA1和gRNA2的正向引物和反向引物，分别构建载体CRISPR/Cas9-PX459-gRNA1-EGFP和载体CRISPR/Cas9-EZ-gRNA2-EGFP，经 双酶切、连接后，得到双敲除载体CRISPR/Cas9-PX459-gRNA1-EGFP-EZ-gRNA2-EGFP；
(4)利用步骤(2)制备的转移质粒pUC-gE/gILRE和PRV/HN2012株的DNA共转染 ST细胞，通过空斑纯化获得表达荧光蛋白的过渡病毒rPRV HN2012-gE-/gI--EGFP+；
(5)将过渡病毒rPRVHN2012-gE-/gI--EGFP+的DNA基因组与步骤(2)的转移质粒pUC-gE/gILR以及步骤(3)的双敲除载体CRISPR/Cas9-PX459-gRNA1-EGFP-EZ-gRNA2- EGFP共转染至ST细胞，通过空斑纯化获得去除外源EGFP基因的重组病毒rPRV HN2012-gE-/gI-，即猪伪狂犬病双基因缺失变异突变病毒毒株。
所述步骤(1)中同源臂克隆所用的扩增引物包括L同源臂引物对和R同源臂引物对， 其中L同源臂引物对序列如SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2所示，R同源臂引物对序列如SEQID NO.3/SEQ ID NO.4所示。
所述步骤(3)中靶向于绿色荧光蛋白的外源基因gRNA1的正向引物序列如SEQ IDNO.5 所示、反向引物序列如SEQ ID NO.6所示；靶向于绿色荧光蛋白的外源基因gRNA2的正向 引物序列如SEQ ID NO.7所示、反向引物序列如SEQ ID NO.8所示。
所述步骤(5)中猪伪狂犬病双基因缺失变异突变病毒毒株的鉴定引物对如SEQ IDNO.11/ SEQ ID NO.12所示。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明釆用同源重组结合反向筛选及蚀斑克隆纯化的技术，成功构建了一株针对现 今PRV流行变异毒株的gE、gI双基因缺失病毒，以期望将其用于防控当前PRV变异毒株的 疫情中，为我国根除PRV创造条件。
(2)本发明所构建的rPRV HN2012-gE-/gI-免疫组仔猪在试验过程中没有出现任何不良反 应，中和抗体水平证实了该缺失病毒保持了良好的免疫原性，并且本发明所获得的rPRV HN2012-gE-/gI-双基因缺失病毒对仔猪是安全的，免疫后能有效并迅速产生PRV特异性抗体， 是一株有希望应用于当前PRV流行防控工作的疫苗株。
附图说明
图1为转移质粒构建示意图。
图2为PRV Bartha-K61株基因组缺失位置示意图。
图3为pG质粒基因结构图。
图4为同源臂的扩增；M1.DNA Marker DL2000+；1.左同源臂(gEL)；2.右同源臂(gER)； 3.阴性对照。
图5为重组质粒pMD-gEL、pMD-gER的酶切鉴定图；M1.DNA Marker DL5000；1. pMD-gEL的HindⅢ/PstⅠ酶切；2.pMD-gER的BamHⅠ/PstⅠ酶切。
图6为转移质粒的酶切鉴定图；M1.DNA Marker DL5000；1.pUC-gE/gILR的HindⅢ/Pst Ⅰ酶；2.pUC-gE/gILRE的PstⅠ酶切。
图7为pG质粒的酶切鉴定图；M1.DNA Marker DL5000、1.pG的PstⅠ酶切。
图8为菌液PCR鉴定图；M1.DNA Marker DL2000+、1-5.EGFP基因片段、6.阴性对照。
图9为CRISPR/Cas9-Px459-gRNA1-EGFP以及CRISPR/Cas9-EZ-gRNA2-EGFP菌液PCR鉴定图；M1.DNA Marker DL2000+、 1-2.CRISPR/Cas9-PX459-gRNA1-EGFP；4-5.CRISPR/Cas9-EZ-gRNA2-EGFP扩增片段、3,6阴 性对照。
图10为CRISPR/Cas9-Px459-gRNA1-EGFP-EZ-gRNA2-EGFP菌液PCR鉴定图；M1.DNAMarker DL2000+；1-4.CRISPR/Cas9-PX459-gRNA1-EGFP-EZ-gRNA2-EGFP扩增片段、5.阴性对照M1.DNA Marker DL2000+。
图11为不同光照下观察到的蚀斑照片；A：常光下rPRV HN2012-gE-/gI--EGFP+形成的蚀 斑；B：蓝光下rPRV HN2012-gE-/gI--EGFP+形成的蚀斑。
图12为gE/gI缺失部分PCR鉴定结果图，其中M1.DNAMarker DL5000；1.rPRVHN2012-gE-/gI-的缺失鉴定结果；2.rPRV HN2012-gE-/gI--EGFP+的缺失鉴定结果。
图13为不同光照下观察到的蚀斑照片；其中A：常光下rPRV HN2012-gE-/gI-形成的蚀斑； B：蓝光下rPRV HN2012-gE-/gI-形成的蚀斑。
图14为重组病毒rPRV HN2012-gE-/gI-gB基因的鉴定图。
图15为缺失病毒和亲本毒株的一步生长曲线图。
图16为PRV中和抗体效价水平(log2)。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述 的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领 域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护 的范围。
实施例1:转移质粒pUC-gE/gILR、pUC-gE/gILRE和敲除载体CRISPR/Cas9-gRNA-EGFP 的构建
一、本申请采用的微生物材料
PRV/HN2012株由郑州市猪重大疫病防控重点实验室分离、鉴定并保存；猪睾丸(ST) 细胞购自中国兽药监察所，由郑州市猪重大疫病防控重点实验室冻存；感受态细胞DH5α购 自康为世纪生物技术生物技术有限公司；PRV通用转移质粒pG以及CRISPR/Cas9敲除载体 Px459/EZ均由郑州市猪重大疫病防控重点实验室构建并保存。
二、载体的构建步骤
2.1病毒的增殖培养：将生长状态良好的ST细胞接种在底部面积为25cm2的培养瓶中， 向其中添加适量含有10％胎牛血清的DMEM培养液，随后将其置于37℃、5％CO2的条件下培养。待单层ST细胞长至培养瓶面积的80％时，用D-Hank’s液清洗细胞两次，将之前实验室已分离保存的PRV/HN2012株细胞毒用不含血清的DMEM接种至细胞瓶，100μL/瓶， 37℃吸附1h后，弃去培养瓶中的吸附液，再用D-Hank’s洗两次后，在瓶中加入3mL含有 2％血清的DMEM作为细胞维持液，置条件为37℃、5％CO2的培养箱中培养。待80％细胞 发生病变时，将其放入-80℃冰箱中冻融3次收获并保存。
2.2重组质粒pMD-gE/gIL和pMD-gE/gIR的构建：参考PRV TJ株(GenBank登录号：KJ789182)US区的基因序列，并参照经典疫苗株Bartha-K61株的基因缺失部位(图2)，设 计两对特异性引物gEIL/F和gEIL/R、gEIR/F和gEIR/R(引物信息见表1)，分别用于左右 同源臂的扩增。其中，L同源臂包括部分gD基因和部分gI基因，预计扩增片段大小为1364 bp；R同源包括部分gE基因、完整的Us9基因和部分Us2基因，预计扩增片段大小为760bp。 引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
表1同源臂扩增所需引物信息
Figure BDA0002135463240000041
注：F表示上游引物，R表示下游引物
用合成的两对特异性引物gEIL/F和gEIL/R、gEIR/F和gEIR/R分别对左右同源臂进行PCR扩增，结果经电泳后显示扩增出了一条约1 500bp大小的片段，和一条约750bp大小的片段(见图4)，符合预期结果。
2.3左右同源臂的扩增与克隆：参照生工生物工程(上海)股份有限公司UNIQ-10柱式 病毒基因组抽提试剂盒的说明书对PRV/HN2012株基因组进行提取，用于转移质粒 pUC-gE/gILR左右同源臂的PCR扩增。利用两对特异性引物gEIL/F和gEIL/R、gEIR/F和 gEIR/R，分别扩增gI和gE基因缺失部分两侧的序列作为左右同源臂，同源臂上携带各自的 酶切位点用于后续质粒的构建(见表1)。扩增用的PCR反应参数如下：95℃5min；95℃ 55s；58℃1min；72℃90s，共进行35个循环；72℃终延伸10min；4℃10min。反应结束后， 取6μLPCR产物用1％琼脂糖凝胶(含0.5mg/L EB)进行电泳检测PCR的结果。
用DNA凝胶回收试剂盒分别对PCR产物进行回收，并测定其浓度和纯度。将纯化回收 的特异性片段与pMD18-T载体连接，所需连接体系如下：5μL DNA目的片段，4μLSolution I，1μL pMD18-T Vector，共10μL。置于16℃低温连接槽中连接过夜，分别构成pMD-gE/gIL 和pMD-gE/gIR重组质粒。分别取5μL连接产物加入50μL DH5α感受态细胞中，用于 pMD-gE/gIL和pMD-gE/gIR重组质粒的转化。分别随机挑取生长于含氨苄青霉素LB+固体培 养平板上的数个白色菌落，各自接种于LB+液体培养基中，37℃条件下振荡过夜，同时设蓝 斑为阴性对照。
2.4重组质粒的酶切鉴定及序列测定：取菌液进行菌液PCR鉴定，程序同2.3。将PCR检测为阳性的菌液使用质粒小量提取试剂盒提取重组质粒pMD-gE/gIL和pMD-gE/gIR。
将获得的重组质粒pMD-gE/gIL和pMD-gE/gIR通过双酶切进行酶切鉴定，所用体系如下：
Figure BDA0002135463240000051
加样完成后置37℃水浴条件下消化30min后，进行电泳观察酶切结果。将菌液PCR和 酶切鉴定双阳性的重组质粒送往生工生物工程(上海)股份有限公司测序部进行序列测定， 测序正确后通过NCBI Blast进行比对，以进一步确定左右同源臂克隆的正确性。
将菌液PCR和酶切鉴定双阳性的重组质粒送往生工生物工程(上海)股份有限公司测序 部进行序列测定，测序正确后通过NCBI Blast进行比对，左、右同源臂与PRV TJ株相应基 因区段的同源性均可高达99.9％。
2.5转移质粒pUC-gE/gILR的构建与鉴定：将重组质粒pMD-gE/gIL和pMD-gE/gIR分别 使用Q.Cut HindⅢ和Q.Cut PstⅠ、Q.Cut BamHⅠ和Q.Cut PstⅠ进行双酶切，体系按照1.2.3.5中的酶切体系。加样完成后置37℃水浴条件下消化30min。酶切反应结束后，使用DNA凝胶回收试剂盒对左右同源臂的酶切片段进行胶回收。
将50μL真核表达载体中加入5μL 10×Q.Cut G.Buffer、10μL Q.Cut HindⅢ、10μLQ.Cut PstⅠ，加去离子水至100μL体系，之后置37℃水浴条件下消化30min。酶切反应结束后， 使用DNA凝胶回收试剂盒对目的片段进行胶回收。
取酶切回收的左同源臂片段7μL、pUC-19载体(HindⅢ-PstⅠ)片段1μL，再加入 10×ligation buffer 1μL、T4DNA连接酶1μL共同构成10μL反应体系，加样完成后置16℃ 连接槽反应过夜，构建质粒pUC-gE/gIL。
将连接产物转化并挑斑摇菌，用特异性引物gEIL/F和gEIL/R对菌液进行菌液PCR鉴定， 之后将提取阳性质粒pUC-gE/gIL用于后续试验。
将50μL pUC-gE/gIL质粒中加入5μL 10×Q.Cut G.Buffer、10μL Q.Cut BamHⅠ、10μL Q.Cut PstⅠ，加去离子水至100μL体系，之后置37℃水浴条件下消化30min。酶切反应结束后，使用DNA凝胶回收试剂盒对目的片段进行胶回收。
取酶切回收的右同源臂片段7μL、质粒pUC-gE/gIL(BamHⅠ-PstⅠ)酶切片段1μL， 再加入10×ligation buffer 1μL、T4DNA连接酶1μL共同构成10μL反应体系，加样完成后置16℃连接槽反应过夜，构建转移质粒pUC-gE/gILR。
将连接产物转化并挑斑摇菌，用特异性引物gEIR/F和gEIR/R对菌液进行菌液PCR鉴定， 并将鉴定出的阳性菌液使用OMEGAE.Z.N.A.TM Endo-Free Plasmid Mini KitⅠD6948-01B试 剂盒提取转移质粒pUC-gE/gILR。随后，将获得的转移质粒pUC-gE/gILR用HindⅢ、PstⅠ 进行酶切鉴定后(酶切体系参照2.4)，保存在-20℃条件下以供后续实验使用。
用HindⅢ和PstⅠ对pMD-gE/gIL质粒进行酶切，经电泳后出现了2条带，一条为插入的 左同源臂条带，位置约为1 500bp；另外一条为pMD18-T载体带，位置约为2.7kb；用BamHⅠ和PstⅠ对pMD-gE/gIR质粒进行酶切，经电泳后出现了2条带，1条为插入的右同源臂条 带，位置约为750bp，另外1条为pMD18-T载体带，位置约为2.7kb(见图5)。
将获得的转移质粒pUC-gE/gILR用HindⅢ、PstⅠ进行酶切鉴定，电泳结果显示出现了 2条带，一条为插入的左同源臂，位置约为1 500bp；另外一条为右同源臂与pUC-19载体通 过BamHⅠ位点相连的片段，位置约为3 500bp；结果与预期相符(见图6)。
2.6转移质粒pUC-gE/gILRE的构建与鉴定：pG质粒为本实验室构建的含绿色荧光蛋白 基因的伪狂犬病毒基因缺失转移质粒(结构见图3)，其中(PstⅠ-PstⅠ)部分含有完整的EGFP基因表达盒，具体包括CMV、EGFP、MCS、SV40PolyA尾基因片段，近2 000bp大 小。
将50μL pG质粒中加入5μL 10×Q.Cut G.Buffer、10μL Q.Cut PstⅠ，加去离子水至100μL 体系，之后置37℃水浴条件下消化30min。酶切反应结束后，使用DNA凝胶回收试剂盒对 含EGFP基因的目的片段进行胶回收。
将pG质粒用PstⅠ进行酶切鉴定，电泳结果显示出现了2条带，一条为含EGFP基因(PstⅠ-PstⅠ)片段，位置约为1 700bp；另外一条为载体片段，位置约为5 400bp；结果 与预期相符(见图7)。
将50μL pUC-gE/gILR质粒中加入5μL 10×Q.Cut G.Buffer、10μL Q.Cut PstⅠ，加去离 子水至100μL体系，之后置37℃水浴条件下消化30min。酶切反应结束后，使用DNA凝胶回收试剂盒对目的片段进行胶回收。
取回收的含EGFP基因的(PstⅠ-PstⅠ)酶切片段7μL、质粒pUC-gE/gILR(PstⅠ-PstⅠ)酶切片段1μL，再加入10×ligation buffer 1μL、T4DNA连接酶1μL共同构成10μL反 应体系，加样完成后置16℃连接槽反应过夜，构建转移质粒pUC-gE/gILR-EGFP(具体构建 技术示意图见图1)。
将连接产物转化并挑斑摇菌，用特异性引物EGFP/F和EGFP/R(EGFP/F序列为5’-CAGTGCTTCAGCCGCTACCC-3’；EGFP/R序列为5’-AGTTCACCTTGATGCCGTTC-3’)对 菌液进行菌液PCR鉴定，扩增的目的条带长度为289bp，PCR反应参数为：95℃5min；95℃ 45s；53℃45s；72℃1min，共进行35个循环；72℃终延伸10min；4℃10min。之后使用OMEGA E.Z.N.A.TMEndo-Free Plasmid Mini KitⅠD6948-01B试剂盒提取阳性质粒pUC-gE/gILRE用于 后续试验，并用PstⅠ对其进行酶切鉴定。
用合成的特异性引物EGFP/F和EGFP/R对含有重组质粒pUC-gE/gILRE的菌液进行菌液 PCR鉴定，阳性菌液经PCR扩增后经电泳跑胶可显示扩增出一条约300bp大小的片段(见图8)， 与预期结果符合。将获得的转移质粒pUC-gE/gILRE用PstⅠ进行酶切鉴定，电泳结果显示出 现了2条带，一条为插入的含EGFP基因的(PstⅠ-PstⅠ)酶切片段，位置约为1700bp；另 外一条为左、右同源臂与pUC-19载体分别通过HindⅢ、BamHⅠ位点相连的片段，位置约 为5 200bp(见图6)；结果与预期相符。
2.7CRISPR/Cas9-PX459-gRNA1-EGFP-EZ-gRNA2-EGFP双敲除载体的构建：通过在线工 具：http//crispr.mit.edu/在靶标DNA区域(EGFP)中设计2对20bp左右的oligoDNA，选择评分 最高的序列作为此次试验的gRNA。引物需要添加接头，正向引物添加CACC，反向引物添 加AAAC。靶序列的第一个碱基如果不是G，需要在靶序列前加一个碱基G。设计如下：
正向引物gRNA1F序列如SEQ ID NO:5所示：caccGTAACGCGGAACTCCATATAT
反向引物：gRN1R序列如SEQ ID NO:6所示:aaacATATATGGAGTTCCGCGTTAC
正向引物gRNA2F序列如SEQ ID NO:7所示：caccGATGTGATCGCGCCTTCTCGTT
反向引物：gRNA2R如SEQ ID NO:8所示:aaacAACGAGAAGCGCGATCACATC
将正向引物和反向引物稀释成100μM，随后各吸取1μL，加入10x T4ligase buffer1μL， T4PNK 1μL，补水至10μL，混合后，反应在PCR中进行，反应程序为：37℃，30min；95℃，5min；PCR梯度降温到25℃，每秒降低0.5℃；25℃，5min；4℃，5min。
将PX459载体和EZ载体使用BbsI进行酶切，酶切体系为:质粒6-10μg，BbsI 2μL，10x buffer 5μL，加ddH2O至50μL。加样完成后置37℃水浴条件下消化8h。酶切反应结束后，使用DNA凝胶回收试剂盒对酶切片段进行胶回收。
取PX459以及EZ酶切片段各100ng、处理的gRNA各2μL，再加入10×ligationbuffer 1 μL、T4DNA连接酶1μL，加ddH2O补至10μL反应体系，加样完成后置16℃连接槽反应过夜，构建敲除载体CRISPR/Cas9-PX459-gRNA1-EGFP以及CRISPR/Cas9-EZ-gRNA2-EGFP。将连接产物转化并挑斑摇菌，用两对特异性引物：gRNA1F如SEQ ID NO:5所示；ScreenR:GTACTGGGCACAATGCCAG以及gRNA2F:如SEQ ID NO:6所示； EZR:GTAAAACGACGGCCAGT对菌液进行菌液PCR鉴定，扩增的目的条带长度分别约为 500bp和250bp，PCR反应参数为：95℃5min；95℃45s；62℃45s；72℃1min，共进行 35个循环；72℃终延伸10min；4℃10min。之后使用OMEGA E.Z.N.A.TM Endo-Free Plasmid Mini KitⅠD6948-01B试剂盒提取阳性质粒经测序鉴定后，阳性质粒用于后续试验。利用XhoⅠ和 HindIII对CRISPR/Cas9-PX459-gRNA1-EGFP以及CRISPR/Cas9-EZ-gRNA2-EGFP载体分别 进行双酶切，酶切体系为：取敲除载体CRISPR/Cas9-PX459-gRNA1-EGFP以及 CRISPR/Cas9-EZ-gRNA2-EGFP酶切片段各5μg，XhoⅠ和HindIII各5μL，10x buffer 5μL， 加ddH2O补至50μL反应体系，加样完成后置37℃水浴条件下消化2h，酶切反应结束后， 使用DNA凝胶回收试剂盒对酶切片段进行胶回收。取PX459以及EZ酶切片段各100ng， 再加入10×ligation buffer 1μL、T4DNA连接酶1μL，加ddH2O补至10μL反应体系，加样完 成后置16℃连接槽反应过夜，构建敲除载体 CRISPR/Cas9-PX459-gRNA1-EGFP-EZ-gRNA2-EGFP，用合成的特异性引物gRNA1F和 ScreenR对含有敲除载体CRISPR/Cas9-PX459-gRNA1-EGFP以及 CRISPR/Cas9-EZ-gRNA2-EGFP菌液进行菌液PCR鉴定。之后使用OMEGA E.Z.N.A.TM Endo-Free Plasmid Mini KitⅠD6948-01B试剂盒提取阳性质粒经测序鉴定后，阳性质粒用于后 续试验。
用合成的特异性引物gRNA1F和ScreenR以及gRNA2F和EZR分别对含有敲除载体PX459-gRNA1-EGFP以及EZ-gRNA2-EGFP菌液进行菌液PCR鉴定，阳性菌液经PCR扩增 后经电泳跑胶可显示分别扩增出约500bp和250bp大小的片段(见图9)，符合预期结果。
用合成的特异性引物gRNA1F和ScreenR对含有敲除载体 CRISPR/Cas9-PX459-gRNA1-EGFP-EZ-gRNA2-EGFP菌液进行菌液PCR鉴定，阳性菌液经 PCR扩增后经电泳跑胶可显示扩增出一条约750bp大小的片段(见图10)，符合预期结果。
2.8rPRV HN2012-gE-/gI--EGFP+双基因缺失株的构建：待ST细胞融合70％时，吸弃原有 的培养基，用D-Hank’s液清洗细胞两次，换为不含胎牛血清的DMEM培养液。将PRV/HN2012 株的病毒液接种于细胞培养板中，接毒后的六孔细胞培养板置于37℃、5％CO2细胞培养箱 中2h，使病毒充分吸附到细胞表面。然后弃去细胞病毒液，用无血清、无抗生素的DMEM 培养基清洗细胞两次，再换为含有10％胎牛血清的DMEM培养液。参照宝生物工程(大连) 有限公司的XfectTM Transfection Reagent试剂说明书，将提取的转移质粒pUC-gE/gILRE转 染于PRV/HN2012株感染的ST细胞中，质粒pUC-gE/gILRE与PRV/HN2012基因组发生同 源重组，获得重组病毒rPRV HN2012-gE-/gI--EGFP+。将六孔板放置37℃、5％CO2细胞培养 箱中培养4h后，移除含有转染试剂的培养液，换为2mL新鲜的含有10％胎牛血清的DMEM培养液，放置培养箱继续培养。约48h后可冻融收取转染液，3 000rpm离心5min后取上清至-80℃保存。
用无血清和无双抗的DMEM细胞培养液对收获的上清病毒液进行10倍的倍比稀释，将 稀释好的10-2-10-7梯度的病毒液各取100μL分别接种在单层ST细胞密度达到90％的六孔细 胞培养板的各个孔中。将接种病毒的六孔板放置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养2h。 将融化的1.3％低熔点琼脂糖与含4％胎牛血清的2×DMEM等比例混合；吸弃吸附结束的含病 毒液的培养基，用D-Hank’s液清洗细胞两次，每孔覆盖2mL混合好的低熔点琼脂糖，待其 完全凝固后移至于37℃、5％CO2细胞培养箱中继续培养。每间隔12h在荧光倒置显微镜蓝 光下(波长介于420～490nm)观察并记录每个孔中的绿色荧光蚀斑产生情况。大约培养48h 后，将最大稀释倍数孔中的最大绿色荧光蚀斑在蓝光条件下进行标记，标记完成后移至无菌 操作台内，用移液枪挑取标记好的蚀斑置于含有200μL无血清、无双抗DMEM细胞培养液 的无菌Eppendorf管中并将其捣碎，在常温与-80℃反复冻融三次，每次冻融期间对其进行旋 涡振荡。收获的混合液接种ST细胞进行增殖，将可在蓝光条件下观察到绿色荧光的阳性病 毒液收获重复以上方法进入下一轮蚀斑纯化。纯化过程重复至在蓝光条件下观察到的所有病 毒蚀斑均可呈现绿色荧光(大约需进行5次蚀斑纯化)，则表明已纯化完全，将得到的病毒命 名为rPRV HN2012-gE-/gI--EGFP+。
参照生工生物工程(上海)股份有限公司UNIQ-10柱式病毒基因组抽提试剂盒的说明书 对rPRV HN2012-gE-/gI--EGFP+基因组进行提取。针对本试验中左右同源臂之间的gE、gI缺 失部分设计了一对特异性引物gEIQS/F和gEIQS/R(gEIQS/F序列为如SEQ ID NO:9所示； gEIQS/R序列如SEQ ID NO:10所示)用于重组病毒rPRV HN2012-gE-/gI--EGFP+的PCR鉴定， PCR反应参数为：95℃5min；94℃30s；53℃30s；72℃3min，共进行35个循环；72℃ 终延伸10min；4℃10min。
PRV/HN2012株基因组与转移质粒pUC-gE/gILRE进行共转染48h后收获转染液，冻融 该转染产物后经10倍稀释法进行蚀斑筛选。第一次纯化时每孔内均可观察到表达绿色荧光的 蚀斑和不表达绿色荧光的蚀斑，且不表达绿色荧光的蚀斑多于表达绿色荧光的蚀斑。每次纯 化时挑取最大稀释倍数孔中的最大绿色荧光蚀斑(见图11)，随着纯化次数的增加绿色荧光 蚀斑逐渐增加，直至第五次纯化时观察到的蚀斑均可表达绿色荧光，即成功拯救并纯化获得 了可表达绿色荧光的双基因缺失株rPRV HN2012-gE-/gI--EGFP+。
提取rPRV HN2012-gE-/gI--EGFP+基因组，通过特异性引物gEIQS/F和gEIQS/R对其左右 同源臂间的缺失部分进行鉴定，结果显示扩增出了一条约1 800bp大小的片段(见图12)， 与预期结果相符。
实施例2：重组猪伪狂犬病病毒rPRV HN2012-gE-/gI-的拯救与纯化
一、微生物材料
rPRV HN2012-gE-/gI--EGFP+株由郑州市猪重大疫病防控重点实验室分离、鉴定并保存； 猪睾丸(ST)细胞购自中国兽药监察所，由郑州市猪重大疫病防控重点实验室冻存；感受态 细胞DH5α购自康为世纪生物技术生物技术有限公司； CRISPR/Cas9-PX459-gRNA1-EGFP-EZ-gRNA2-EGFP，转移质粒pUC-gE/gILR和 pUC-gE/gILRE均由郑州市猪重大疫病防控重点实验室构建并保存。
二、rPRV HN2012-gE-/gI-双基因缺失株的构建
2.1转染细胞的准备：将胰酶消化好的形态良好、生长活力强的ST细胞用含有10％胎牛 血清的DMEM培养液吹打分散成单个细胞，并接种于6孔细胞培养板上，每孔2mL细胞混合液。将该6孔板封口后置于37℃、5％CO2细胞培养箱中过夜培养。
待细胞融合70％时吸弃原有的培养基，用D-Hank’s液清洗细胞两次，换为不含胎牛血清 的DMEM培养液，将rPRV HN2012-gE-/gI--EGFP+株的病毒液分别接种于细胞培养板中，接 毒后的六孔细胞培养板置于37℃、5％CO2细胞培养箱中2h，使病毒充分吸附到细胞表面。 然后弃去细胞病毒液，用无血清、无抗生素的DMEM培养基清洗细胞两次，再换为含有10％ 胎牛血清的DMEM培养液。参照宝生物工程(大连)有限公司的XfectTM TransfectionReagent 试剂说明书，将提取的转移质粒pUC-gE/gILR以及敲除载体 CRISPR/Cas9-PX459-gRNA1-EGFP-EZ-gRNA2-EGFP共转染于rPRV HN2012-gE-/gI--EGFP+株感染过的ST细胞中,使敲除载体CRISPR/Cas9-PX459-gRNA1-EGFP-EZ-gRNA2-EGFP对 外源基因EGFP进行切割，被切割后的rPRV HN2012-gE-/gI--EGFP-基因组与质粒pUC-gE/gILR 发生同源重组进行修复，以期获得重组病毒rPRV HN2012-gE-/gI-。将六孔板放置37℃、5％ CO2细胞培养箱中培养4h后，移除含有转染试剂的培养液，换为2mL新鲜的含有10％胎牛 血清的DMEM培养液，放置培养箱继续培养。约48h后可冻融收取转染液，3 000rpm离心 5min后取上清至-80℃保存。
2.2重组病毒rPRV HN2012-gE-/gI-的空斑纯化：按照2.1的步骤，对获取的转染液进行稀 释铺胶以完成rPRV HN2012-gE-/gI-的纯化。每次蚀斑纯化注意观察病毒蚀斑形态，挑选最大 稀释倍数孔中的在荧光倒置显微镜蓝光条件下看不到绿色荧光的蚀斑。纯化过程重复至在蓝 光条件下观察到的所有病毒蚀斑均不呈现绿色荧光(大约需进行5次蚀斑纯化)，则表明已纯 化完全，将得到的病毒命名为rPRV HN2012-gE-/gI-。
rPRV HN2012-gE-/gI--EGFP+基因组与敲除载体 CRISPR/Cas9-PX459-gRNA1-EGFP-EZ-gRNA2-EGFP以及转移质粒pUC-gE/gILR进行共转染 48h后收获转染液，冻融该转染产物后经10倍稀释法进行蚀斑筛选。在筛选过程中观察到可 产生细胞病变但并不表达绿色荧光的蚀斑(见图13)，可以初步认为是去除EGFP基因的重 组病毒rPRV HN2012-gE-/gI-。每次挑选最大稀释倍数孔中的在荧光倒置显微镜蓝光条件下看 不到绿色荧光的蚀斑，随着纯化次数的增加不表达绿色荧光蚀斑逐渐增加，直至第5次纯化 时观察到的蚀斑均不表达绿色荧光，即成功拯救并纯化获得了去除EGFP基因的双基因缺失 株rPRVHN2012-gE-/gI-。
2.3重组病毒rPRV HN2012-gE-/gI-的PCR鉴定：参照生工生物工程(上海)股份有限公 司UNIQ-10柱式病毒基因组抽提试剂盒的说明书对重组病毒rPRV HN2012-gE-/gI-基因组进行 提取。使用实施例1中2.8设计的特异性引物gEIQS/F和gEIQS/R，对重组病毒rPRVHN2012-gE-/gI-进行缺失部分的鉴定，PCR反应参数为参照实施例1中2.8。对PCR扩增出的目的条带进行回收、连接、转化以及挑斑，之后将阳性菌液送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序部进行测序，以进一步确定是否成功对PRV/HN2012株进行了gE、gI双基因的缺失。之后再通过gB全基因引物(gB/F序列如SEQ ID NO:11所示；gB/R序列如SEQ ID NO:12所示)对rPRV HN2012-gE-/gI-进行gB基因的检测。
提取rPRV HN2012-gE-/gI-基因组，通过特异性引物gEIJ/F和gEIJ/R对其左右同源臂间的 缺失部分进行鉴定，结果显示扩增出了一条约160bp大小的片段，与预期结果相符。
测序结果显示，所测序列长度为160bp，与预期结果相符。与PRV/HN2012株gE、gI基因序列进行比较，结果显示rPRV HN2012-gE-/gI-双基因缺失株成功缺失了2586bp片段(包 括gI基因3端913bp、gE基因5端1570bp及gI与gE之间的序列103bp)，并在缺失部位 留下了一个PstⅠ位点，与预期结果符合。
通过gB全基因引物对重组病毒rPRV HN2012-gE-/gI-的gB基因进行鉴定，结果显示扩增 出了约3 000bp大小的片段(见图14)，与预期结果相符。
2.4重组病毒rPRV HN2012-gE-/gI-的生长特性：将缺失病毒rPRV HN2012-gE-/gI-、弱毒 疫苗Bartha-K61株以及亲本病毒PRV/HN2012株分别以10μL(106.0TCID50/0.1mL)剂量接 种24孔板中单层的ST细胞，37℃、5％CO2条件下吸附2h后弃去病毒液，更换成含2％胎 牛血清的DMEM维持液进行培养。在接种病毒4h后开始每隔2h收取细胞及其上清培养液，并于-80℃条件下反复冻融3次后进行TCID50值的测定，根据结果绘制出病毒的一步生长曲线，并进行分析。
根据测定结果绘制处图15所示的一步生长曲线，可以看出：双基因缺失毒株rPRVHN2012-gE-/gI-、PRV弱毒疫苗Bartha-K61株与亲本病毒PRV HN2012株具有非常相似的生长动力学。在感染ST细胞后10～14h期间，亲本病毒PRV HN2012株的增殖速度极快，而双 基因缺失毒株rPRV HN2012-gE-/gI-和PRV弱毒疫苗Bartha-K61株的增值速度和病毒滴度都低于亲本株。另外，双基因缺失毒株rPRV HN2012-gE-/gI-和PRV弱毒疫苗Bartha-K61株接种ST细胞后形成的蚀斑在形态和大小上与亲本病毒PRV HN2012株上并未有明显差异。
三、结果与分析
本研究通过转移质粒pUC-gE/gILRE和pUC-gE/gILR以及敲除载体 CRISPR/Cas9-PX459-gRNA1-EGFP-EZ-gRNA2-EGFP分别与PRV基因组的两次同源重组，先 获得表达绿色荧光蛋白的rPRV HN2012-gE-/gI--EGFP+双基因缺失株，再通过反向筛选获得了 不含外源EGFP基因的rPRV HN2012-gE-/gI-双基因缺失株。进一步结合PCR鉴定及测序，我 们获得的rPRV HN2012-gE-/gI-双基因缺失株成功缺失了2 586bp片段(含gE、gI基因)，并 在缺失部位留下了一个PstⅠ位点。
EGFP基因可在真核或原核系统中表达一种在紫外光或蓝光照射下发出绿色荧光的天然 蛋白，因具有高灵敏度、易稳定表达等特点，常在研究中将其作为一种优良的筛选基因[iii]， 将其应用于重组病毒的筛选将会大大提高筛选的正确率，使筛选工作更为便捷[ivv]。但是许多 研究报道称，若外源基因导入生物体内，其在生物体的表达有可能会因为改变生物体的某些 生物学特性和生理活动从而带来许多负面影响，这样潜在的问题极有有可能会带来一系列的 生物安全问题，因此法律规定禁止含外源基因的生物制品进入市场，而仅能够用于实验室内 的研究层面，故本试验进行了第二次转染。CRSIPR/Cas9，它是继ZFN和TALEN之后出现 的更为快捷和有效的基因编辑工具，越来越多的研究利用Cas9系统提高了基因编辑在不同物 种上的可能性。本试验构建的双敲除载体，由于在一个载体上同时插入了两个gRNA，从而 减少了gRNA脱靶的可能，增加了CRSIPR/Cas9系统对外源基因EGFP的编辑效率。除此之 外，由于敲除载体CRISPR/Cas9-PX459-gRNA1-EGFP-EZ-gRNA2-EGFP对外源基因EGFP切 割后，病毒进行自我修复时引进了转移质粒pUC-gE/gILR，从而增加了转移质粒pUC-gE/gILR 与病毒的同源重组效率。本试验通过敲除载体 CRISPR/Cas9-PX459-gRNA1-EGFP-EZ-gRNA2-EGFP对外源基因EGFP进行切割，随后转移 质粒pUC-gE/gILR与rPRV HN2012-gE-/gI--EGFP+基因组发生同源重组，经反向筛选方法挑取 不含荧光蛋白的蚀斑，并结合PCR鉴定技术，成功获得了不含外源EGFP基因的rPRV HN2012-gE-/gI-双基因缺失株，从而大大提高了本缺失病毒的稳定性和生物安全性。
想要成功获得重组病毒，在进行共转染时良好的细胞状态、合适的转染试剂及转移质粒 的构建都将直接影响到病毒重组效率的高低。目前将携带外源基因的转移质粒导入真核细胞 的的技术方法有很多，例如最常用的脂质体转染法、电转化方法等，但大多转染所使用的试 剂对细胞毒性强、损伤大，会造成细胞的大量死亡。本试验进行过程中，曾尝试用脂质体法 进行转染，但是细胞的大量死亡严重影响到同源重组的效率，并未成功筛选到能表达绿色荧 光蛋白的重组病毒蚀斑，随后我们采用了一种新型的可生物降解的纳米颗粒转染试剂XfectTM Transfection Reagent进行转染操作。Xfect转染试剂是基于可降解的纳米颗粒制备的，对细胞 毒性非常低，转染效率高，且在转染过程中兼容血清，无需使用OPTI-MEM培养液，操作简 便。在共转染试验过程中，我们观察到细胞的生长始终处于较为良好的状态，为病毒的重组 提供了良好的环境。
应用效果例：
病毒的增殖：按照常规方法培养ST细胞，以1640培养液并加入10％胎牛血清作为ST 细胞的完全培养液；在细胞传代24h后接种rPRV HN2012-gE-/gI-株第15代，置于5％CO2，37℃细胞培养箱中培养，换成含2％胎牛血清的1640维持液，继续培养48h，当出现约80％的CPE时收获rPRV HN2012-gE-/gI-株第16代。将PRV细胞培养物反复冻融3次，6000rpm 离心10min去除细胞碎片，于-80℃保存备用。
病毒的测定：将消化吹散的ST细胞悬液接种到96孔板中，每孔200μL，培养24h后，取PRV rPRV HN2012-gE-/gI-株的第16代细胞培养物连续倍比稀释10-1～10-10，每孔接种100 μL，在细胞培养箱中孵育1h后，每孔加入100μL含2％胎牛血清的RPMI-1640维持液继续培养，每个稀释度各作8个重复，逐日观察细胞病变情况，并按照Reed-Muench法计算病毒滴度TCID50。
常规培养ST细胞，接毒后通过倒置显微镜观察，待细胞出现变圆、脱落，形成空泡等 明显的CPE后，统计并按Reed-Muench方法计算毒株的TCID50，结果得到rPRV HN2012-gE-/gI-株的TCID50为10-7.0。
仔猪免疫：将12头10日龄健康仔猪随机分为3组，每组4头，试验具体分组和接种情况见表2，接种途径为背部皮下分点注射。第一次免疫之前进行耳静脉采血，采血后进行免疫，每周对仔猪进行耳静脉采血，每次采血后分离血清保存至-20℃用于后续试验，采血至第 4周。免疫后每天观察并记录仔猪临床反应情况。
表2试验仔猪分组及免疫情况
Figure BDA0002135463240000141
仔猪进行免疫后，DMEM(A组)、Bartha-K61(B组)和rPRV HN2012-gE-/gI-/TK-(C组)免疫组仔猪均未出现不良症状，全部存活。
血清中和试验检测PRV抗体水平：
采用病毒中和试验(固定病毒-稀释血清法)，对每周采集的仔猪血清测定中和抗体效价， 具体操作如下：
(1)将试验中所用血清放置在56℃条件进行30min水浴灭活。
(2)将灭活后的血清用不含血清的DMEM培养液进行2倍系列稀释，每个稀释度取50μL加入96孔板孔中，每个稀释度设置四个重复。然后每个孔中加入50μL含200个TCID50/0.1mLPRV/HN2012株病毒液，充分混合，37℃作用1h后，将混合液接种到已形成单层ST细 胞的96孔板中。
(3)作用1h后，移除96孔板中混合液，每孔加入200μL含2％胎牛血清的DMEM细 胞培养维持液，放置在37℃、5％CO2环境中培养4d，每天观察记录细胞病变情况，用Karber 计算方法对结果进行判定。
免疫仔猪后每周采血，分离猪血清。采用病毒中和试验检测各组仔猪血清的PRV中和抗 体，将所得数据绘制成折线图，结果如图16所示。从图中我们看出，免疫7d后Bartha-K61 (B组)和rPRV HN2012-gE-/gI-(C组)能刺激仔猪机体产生低水平的抗PRV抗体；到21d(二免后第一周)时Bartha-K61(B组)和rPRV HN2012-gE-/gI-(C组)的抗体水平都得到 了显著提高，并持续增长。表明Bartha-K61(B组)和rPRV HN2012-gE-/gI-(C组)均能刺 激仔猪机体产生PRV中和抗体水平，且DMEM免疫组并未刺激仔猪产生PRV中和抗体。
(4)试验中还应设置以下对照组：
①病毒对照：需将0.2、2、20和200TCID50/0.1mL浓度的病毒液与等量最低稀释度的待 检血清充分混合(混合后每个接种孔病毒浓度为0.1、1、10和100TCID50)，感作之后移至铺有单层ST细胞的96孔板中；判定结果时，0.1TCID50病毒液孔中应未发生细胞病变，100TCID50应一定会发生细胞病变。
②血清毒性对照：设置一组在组织培养细胞中仅添加被检血清的最低稀释度的对照组， 用于检测血清对组织细胞无毒性作用。
③宿主对照：每个反应板中应设置一组仅含组织细胞的空白对照组，组织细胞在整个试 验中应始终保持健康状况。
④阳性和阴性血清对照：阳性血清需呈现应有的中和抗体效价，阴性血清没有中和抗体 效价。
以上各个对照组成立的条件下，才可以进行待检血清中和抗体效价的判定。
DMEM免疫组(A组)在攻PRV/HN2012株96h后，有2头仔猪最先开始出现神经症 状、拉稀、呕吐等，随后该组另外2只仔猪陆续开始发病，发病率为100％。攻毒28d内DMEM 免疫组(A组)有3头仔猪死亡，1头仔猪逐渐康复。Bartha-K61免疫组(B组)在攻PRV/HN2012 株120h后有一头仔猪开始出现神经症状、拉稀、呕吐等的PR临床症状，后来康复，其它3 头仔猪在4周观察期内均健康成长，发病率25％。rPRV HN2012-gE-/gI-免疫组(C组)在PRVHN2012株攻毒4周内未见发病。
结论：
自2011年底以来，河南、河北、吉林、广东等地大部分猪场开始爆发伪狂犬病，不管是 疫苗免疫程序不完善的中小规模猪场和疫苗免疫程序合理的大规模猪场，不管是应用进口疫 苗和国产疫苗的猪场均有发病现象，个别已经净化的猪场也重新出现野毒感染情况，gE阳性 率大部分都在50％以上，母猪产弱仔、死胎或木乃伊胎，仔猪出现神经症状、拉稀、呕吐及 死亡，10日龄内仔猪死亡率高达100％，给我国养猪业造成了巨大经济损失。
我们于2012年从河南省南阳市某免疫过PRV Bartha-K61疫苗猪场病死猪体内分离的 PRV/HN2012株与Bartha-K61株和湖北98株之间存在一定的抗原交叉性，但抗原性存在差异。 彭金美等也报道2011年新分离PRV HeN1株与Bartha k61株接种猪血清产生中和抗体水平较 低，而与HeN1分离株接种猪血清产生抗体水平高。因此以PRV/HN2012株为亲本株，进行 PRV gE/gI双基因缺失弱毒株的拯救。应用效果例中用获得的rPRV HN2012-gE-/gI-接种10日 龄仔猪，对rPRV HN2012-gE-/gI-进行了安全性和免疫效力的初步评价。试验结果表明，rPRV HN2012-gE-/gI-免疫组仔猪在试验过程中没有出现任何不良反应。中和抗体水平证实了该缺失 病毒保持了良好的免疫原性，并且用PRV/HN2012株攻毒后能保护仔猪不发生猪伪狂犬病。
总之，本研究所获得的rPRV HN2012-gE-/gI-双基因缺失病毒对仔猪是安全的，免疫后能 有效并迅速产生PRV特异性抗体，是一株有希望应用于当前PRV流行防控工作的疫苗株。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原 则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
<110>河南农业大学
<120>一种猪伪狂犬病双基因缺失变异突变病毒毒株及其构建方法
<160> 12
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<213>伪狂犬病病毒属(Pseudorabies virus)
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Claims (4)

1.一种猪伪狂犬病双基因缺失变异突变病毒毒株的构建方法，其特征在于，步骤如下：
（1）以PRV/HN2012株为亲本毒株，分别扩增PRV/HN2012株的gE/gI基因两侧的序列作为重组同源臂，克隆至pUC-19载体，构建转移质粒pUC-gE/gILR；
（2）用绿色荧光蛋白作为标记基因，标记步骤（1）构建的转移质粒pUC-gE/gILR，得标记后的转移质粒pUC-gE/gILRE；
（3）设计靶向于绿色荧光蛋白的外源基因gRNA1和gRNA2的正向引物和反向引物，分别构建载体CRISPR/Cas9-PX459-gRNA1-EGFP和载体CRISPR/Cas9-EZ-gRNA2-EGFP，经双酶切、连接后，得到双敲除载体CRISPR/Cas9-PX459-gRNA1-EGFP-EZ-gRNA2-EGFP；
（4）利用步骤（2）制备的转移质粒pUC-gE/gILRE和PRV/HN2012株的DNA共转染ST细胞，通过空斑纯化获得表达荧光蛋白的过渡病毒rPRVHN2012-gE-/gI--EGFP+；
（5）将过渡病毒rPRVHN2012-gE-/gI--EGFP+的DNA基因组与步骤（2）的转移质粒pUC-gE/gILR以及步骤（3）的双敲除载体CRISPR/Cas9-PX459-gRNA1-EGFP-EZ-gRNA2-EGFP共转染至ST细胞，通过空斑纯化获得去除外源EGFP基因的重组病毒rPRV HN2012-gE-/gI-，即猪伪狂犬病双基因缺失变异突变病毒毒株；
所述病毒毒株为gE、gI双基因缺失毒株，保藏名称：重组猪伪狂犬病毒rPRV HN2012-gE-/gI-，保藏号为CCTCC NO：V201749，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国. 武汉. 武汉大学，邮编：430072。
2.根据权利要求1所述的猪伪狂犬病双基因缺失变异突变病毒毒株的构建方法，其特征在于：所述步骤（1）中同源臂克隆所用的扩增引物包括L同源臂引物对和R同源臂引物对，其中L同源臂引物对序列如SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2所示，R同源臂引物对序列如SEQ IDNO.3/SEQ ID NO.4所示。
3.根据权利要求1所述的猪伪狂犬病双基因缺失变异突变病毒毒株的构建方法，其特征在于：所述步骤（3）中靶向于绿色荧光蛋白的外源基因gRNA1的正向引物序列如SEQ IDNO.5所示、反向引物序列如SEQ ID NO.6所示；靶向于绿色荧光蛋白的外源基因gRNA2的正向引物序列如SEQ ID NO.7所示、反向引物序列如SEQ ID NO.8所示。
4.根据权利要求1所述的猪伪狂犬病双基因缺失变异突变病毒毒株的构建方法，其特征在于：所述步骤（5）中猪伪狂犬病双基因缺失变异突变病毒毒株的鉴定引物对如SEQ IDNO.11、SEQ ID NO.12所示。
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