CN109750007A - 双表达gC基因的伪狂犬病毒gE/gI缺失突变株及其构建和应用 - Google Patents
双表达gC基因的伪狂犬病毒gE/gI缺失突变株及其构建和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种双表达gC基因的伪狂犬病毒gE/gI缺失突变株rPRV‑AH‑gI‑/gE‑/gC+，是在伪狂犬重组病毒rPRV‑AH‑gI‑/gE‑缺失gE/gI基因位置处，通过插入gC基因构建得到的；所述gI/gE基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述gC基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明所构建的伪狂犬重组病毒rPRV‑AH‑gI‑/gE‑/gC+与其他PRV基因缺失突变株相比，在缺失gI/gE的基础上，创新性插入gC基因，gC作为PRV主要免疫原性蛋白之一，可诱导机体产生中和抗体及细胞免疫应答。本发明进一步提供rPRV‑AH‑gI‑/gE‑/gC+的灭活疫苗，具有较好的安全性且相比现有PRV突变毒株良好更好的免疫原性，中和抗体水平更高，免疫保护效果更好，并可用现有的PRV gE鉴别诊断方法区分野毒感染动物与疫苗免疫动物，有望作为基因工程灭活疫苗应用于对猪伪狂犬病毒新型流行株的防治。
Description
技术领域
本发明涉及动物病毒学及基因工程学技术领域，更具体地，涉及一株双表达gC基因的伪狂犬病毒gE/gI缺失突变株及其构建和应用。
背景技术
伪狂犬病是由伪狂犬病病毒(PRV)引起的一种急性传染病，主要临床症状有发热、神经系统症状、呼吸道症状等。猪是PRV唯一的天然宿主。PRV具有高潜伏感染的特点，在许多国家广泛流行。伪狂犬病的控制正在使用广泛有效的灭活和减毒活疫苗。自上世纪70年代以来，Bartha-K61疫苗被引入中国，伪狂犬病在中国得到了有效的控制。但自2011年以来，许多使用PRV活疫苗免疫的规模化猪场出现了母猪流产、产死胎、木乃伊胎的情况，仔猪出现神经症状及死亡等临床症状，且从部分猪场已分离出变异毒株。这表明，目前国内使用的商品化疫苗对PRV变异毒株的免疫效果不佳，导致了我国猪场伪狂犬发病率的抬头趋势。因此，为了有效控制PRV新型变异株的流行，需要开发高效针对PRV新型变异株的疫苗。
专利CN201710590388.9公开了伪狂犬病毒流行株gI/gE基因缺失突变株及构建和应用，所述的伪狂犬病毒流行株gI/gE基因缺失突变株是由伪狂犬病毒强毒株PRV AH-China-2013株进行毒力基因gE和gI的部分缺失制成，并进一步以该毒株为基础，制得猪伪狂犬病毒基因缺失灭活疫苗，虽然该疫苗对昆明系小鼠具有良好的免疫保护效果，但其免疫效果有待提高；因此，一方面研制针对PRV变异毒株的候选疫苗株；另一方面，候选疫苗株的应用要与相应的DIVA(能区分感染与免疫动物)战略相匹配，所以以PRV变异毒株为亲本构建基因缺失病毒是必要的。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有市场中猪伪狂犬病毒疫苗不能有效抵抗流行强毒变异株感染的缺陷，提供双拷贝gC伪狂犬病毒突变株灭活疫苗，作为防御当前流行伪狂犬病毒的有效候选疫苗。
本发明的第一个目的是提供一种双表达gC基因的伪狂犬病毒gE/gI缺失突变株。
本发明的第二个目的是提供所述双表达gC基因的伪狂犬病毒gE/gI缺失突变株的制备方法。
本发明的第三目的是提供所述双表达gC基因的伪狂犬病毒gE/gI缺失突变株的应用。
本发明的第四目的是供一种猪伪狂犬病毒灭活疫苗。
本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
一种双表达gC基因的伪狂犬病毒gE/gI缺失突变株，是在伪狂犬重组病毒rPRV-AH-gI-/gE-缺失gE/gI基因位置处，通过插入gC基因构建得到的；所述gI/gE基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述gC基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。包含外源的CMV启动子和终止序列的gC基因核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
所述伪狂犬重组病毒rPRV-AH-gI-/gE-可根据专利CN201710590388.9或文献(潘慧，李艳华，向柯宇等.猪伪狂犬病病毒流行毒株gE/gI缺失突变株的构建及生物学特性研究[J].华南农业大学学报,2018.)的方法制备得到。
本发明所构建的伪狂犬重组病毒rPRV-AH-gI-/gE-/gC+与其他PRV基因缺失突变株相比，在缺失gI/gE的基础上，创新性插入gC基因，实现双表达gC基因，gC作为PRV主要免疫原性蛋白之一，可诱导机体产生中和抗体及细胞免疫应答，与伪狂犬重组病毒rPRV-AH-gI-/gE-相比，具有更好的免疫效果。
本发明所述的双表达gC基因的伪狂犬病毒gE/gI缺失突变株1的制备方法，包括如下步骤：
S1.以狂犬病毒变异株PRV-AH株为模板，gC-F/gC-R为引物，扩增gC目的片段；以pEGFP-N1线性化质粒为模板，以FW-F/FW-R为引物，扩增pEGFP-N1骨架；
S2.将纯化得到的gC片段与pEGFP-N1骨架分别用HindIII和BamHI进行双酶切，连接转化，筛选得到重组质粒pgC-N1；以重组质粒pgC-N1为模板，EGFP-F1/EGFP-R1为引物扩增PCMV-gC-SV40polyA表达盒；将质粒pMD-LA-RA和纯化的PCMV-gC-SV40polyA分别用EcoRV酶切，连接转化，筛选得到重组质粒pMD-LA-RA-gC；
S3.将重组质粒pMD-LA-RA-gC与重组病毒rPRV-AH-gI-/gE-/EGFP+进行同源重组及空斑纯化，以EGFP为筛选标记，通过空斑纯化筛选不出现绿色荧光的空斑即可获得重组病毒rPRV-AH-gI-/gE-/gC+，即双表达gC基因的伪狂犬病毒gE/gI缺失突变株；
所述引物gC-F、gC-R、FW-F、FW-R、EGFP-F1和EGFP-R1的核苷酸序列依次如SEQ IDNO：4～9所示：
gC-F：5’-CCAAGCTTTTAAATCCGTTTCCTG-3’(SEQ ID NO：4)
gC-R：5’-CGGGATCCTCAATGATGATGATGATGATGCAGCGCGGAC-3’(SEQ ID NO：5)；
FW-F：5’-CGGGATCCCCGCGACTCTAGA-3’(SEQ ID NO：6)；
FW-R：5’-CCAAGCTTGAGCTCG-3’(SEQ ID NO：7)；
EGFP-F1：5’-AACGATATCGTTTAAACGTTCTTTCCTGCGTTATCC-3’(SEQ ID NO：8)；
EGFP-R1：5’-AACGATATCAACCCTATCTCGGTCTATTCT-3’(SEQ ID NO：9)。
优选地，S2所述质粒pMD-LA-RA的制备方法包括如下步骤：
S1.以伪狂犬病毒变异株PRV-AH株为模板，LA-F/LA-R与RA-F/RA-R为引物，分别扩增位于gI基因和gE基因两侧的用于同源重组的左臂片LA和右臂RA；
S2.将LA片段与pMD18-T载体连接，得到重组质粒pMD-LA；将重组质粒pMD-LA与RA片段分别用限制性内切酶HindШ和PstI进行双酶切，酶切产物连接转化，得到重组质粒pMD-LA-RA；
所述引物LA-F、LA-R、RA-F和RA-R的核苷酸序列依次如SEQ ID NO：10～13所示。
LA-F：5’-CCGACCAGCACCGCACGTACAAGTT-3’(SEQ ID NO：10)
LA-R：5’-CAGCAGCGTCCCGTCTATCGT-3’(SEQ ID NO：11)；
RA-F：5’-AAACTGCAGGATATCCGGAAGTGACGAATGG-3’(SEQ ID NO：12)；
RA-R：5’-CTCGGTGGTGATGTAGAAAAGCTTGGG-3’(SEQ ID NO：13)。
优选地，S3所述重组病毒rPRV-AH-gI-/gE-/EGFP+的制备方法包括如下步骤：
S1.以pEGFP-N1为模板，EGFP-F1/EGFP-R1为引物，扩增得到EGFP完整表达盒；将重组质粒pMD-LA-RA和EGFP回收产物分别用限制性内切酶EcoRV进行单酶切，对线性化的质粒pMD-LA-RA进行去磷酸化处理，将去磷酸化后的质粒pMD-LA-RA与EGFP连接转化，得到重组质粒pMD-LA-RA-EGFP；
S2.重组质粒pMD-LA-RA-EGFP转染BHK-21细胞，然后再以伪狂犬病毒变异株PRV-AH株感染已转染的BHK-21细胞，使重组质粒pMD-LA-RA-EGFP与PRV-AH株基因组在细胞内发生同源重组，以EGFP为筛选标记，通过空斑纯化筛选出现绿色荧光的空斑即可获得重组病毒rPRV-AH-gI-/gE-/EGFP+；
所述EGFP-F1和EGFP-R1的核苷酸序列依次如SEQ ID NO：8～9所示。
本发明还请求保护所述的双表达gC基因的伪狂犬病毒gE/gI缺失突变株在制备伪狂犬病毒灭活疫苗中的应用。
一种猪伪狂犬病毒基因缺失灭活疫苗，所述疫苗包含上述的双表达gC基因的伪狂犬病毒gE/gI缺失突变株。
优选地，所述猪伪狂犬病毒基因缺失灭活疫苗还包含佐剂和灭活剂。
优选地，所述的灭活剂为β-丙内酯。
优选地，所述的双表达gC基因的伪狂犬病毒gE/gI缺失突变株的TCID50为10-7.57/100μL，灭活剂与双表达gC基因的伪狂犬病毒gE/gI缺失突变株的体积比为1:2000。
优选地，所述佐剂为Montanide gel佐剂。
优选地，根据收获病毒液的毒价，将灭活后的病毒液进行稀释，稀释后的病毒液与Montanide gel佐剂的体积比为9:1混合，使病毒最终含量为106.0TCID50/mL～107.0TCID50/mL；磁力搅拌30min以上，短期内4℃保存。
本发明所述的猪伪狂犬病毒基因缺失灭活疫苗的制备方法，具体包含如下步骤：
(1)rPRV-AH-gI-/gE-/gC+病毒以1MOI感染复数接种细胞，当细胞病变达90％时收获病毒，反复冻融3次，测定病毒液的TCID50为10-7.57/100μL。；
(2)灭活剂β-丙内酯和步骤(1)制得的病毒液按照体积比1:2000混合均匀，4℃放置24h，期间，要不定时摇匀，以确保病毒能完全灭活；然后37℃水浴放置2h，终止灭活；
(3)将灭活后的病毒液进行稀释，稀释后的病毒液与Montanide gel佐剂按照体积比9:1混合，搅拌30min以上，得到猪伪狂犬病毒基因缺失灭活疫苗。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明所构建的伪狂犬重组病毒rPRV-AH-gI-/gE-/gC+与其他PRV基因缺失突变株相比，在缺失gI/gE的基础上，创新性插入gC基因，实现双表达gC基因，gC作为PRV主要免疫原性蛋白之一，可诱导机体产生中和抗体及细胞免疫应答。本发明提供rPRV-AH-gI-/gE-/gC+的灭活疫苗，具有较好的安全性且相比现有PRV突变毒株良好更好的免疫原性，中和抗体水平更高，免疫保护效果更好，并可用现有的PRV gE鉴别诊断方法区分野毒感染动物与疫苗免疫动物，有望作为基因工程灭活疫苗应用于对猪伪狂犬病毒新型流行株的防治。
附图说明
图1为重组病毒rPRV-AH-gI-/gE-/EGFP+构建策略。
图2为重组病毒rPRV-AH-gI-/gE-构建策略。
图3为重组病毒rPRV-AH-gI-/gE-/gC+构建策略。
图4为重组病毒rPRV-AH-gI-/gE/-EGFP+，rPRV-AH-gI-/gE-，rPRV-AH-gI-/gE-/gC+筛选结果。
图5为重组病毒rPRV-AH-gI-/gE-/EGFP+PCR鉴定结果。
图6为重组病毒rPRV-AH-gI-/gE-PCR鉴定结果。
图7为重组病毒rPRV-AH-gI-/gE-/gC+PCR鉴定结果。
图8为重组病毒一步生长曲线。
图9为gC基因mRNA表达情况。
图10为外源gC基因蛋白表达情况。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
以下实例所用材料：亲本毒株伪狂犬病毒变异株PRV-AH株由华南农业大学兽医学院微生物教研室于2013年分离自我国安徽某发病猪群的流产仔猪；伪狂犬病毒经典毒株PRV鄂A株(PRV-Ea)(陈焕春,方六荣.猪伪狂犬病病毒鄂A株的分离鉴定[J].畜牧兽医学报,1998,28(xm):156-161.)由华南农业大学兽医学院微生物教研室保存，BHK-21细胞购自ATCC细胞库；E.coli DH5α工程菌购自TaKaRa公司；pEGFP-N1荧光质粒购自美Clontech公司；pMDTM18-T Vector Cloning Kit购自TaKaRa公司。
实验动物为6周龄SPF级雌性昆明小鼠，购自南方医科大学实验动物中心。
实施例1同源重组载体的构建(pMD-LA-RA；pMD-LA-RA-EGFP；pMD-LA-gC-RA)
1、根据GenBank登录的PRVZJ01株基因序列(登录号：KM061380.1)，以伪狂犬病毒变异株PRV-AH株为模板，设计2对引物LA-F/LA-R与RA-F/RA-R(表1)，分别用来扩增位于gI基因和gE基因两侧(含部分gI和gE基因)的同源重组臂片段，其中左臂片段简称LA，右臂片段简称RA。
2、将LA片段与pMD18-T载体通过TA克隆连接，然后进行转化筛选，得到重组质粒pMD-LA；将重组质粒pMD-LA与RA片段分别用限制性内切酶HindШ和PstI进行双酶切，酶切产物进行连接转化，筛选得到重组质粒pMD-LA-RA，纯化的重组质粒再次用限制性内切酶HindШ和PstI进行双酶切鉴定。
3、以荧光质粒pEGFP-N1为模板，设计引物EGFP-F1/EGFP-R1(表1)，在其上下游引物的5’端各引入1个EcoRV酶切位点，扩增区域包含完整表达盒的荧光基因序列，作为筛选标记，纯化获得EGFP目的片段。将重组质粒pMD-LA-RA和EGFP回收产物分别用限制性内切酶EcoRV进行单酶切，进一步对线性化的质粒pMD-LA-RA进行去磷酸化处理；将去磷酸化后的质粒pMD-LA-RA与EGFP目的片段的单酶切产物进行连接转化，筛选，用限制性内切酶EcoRV酶切鉴定，得到pMD-LA-RA-EGFP质粒。
4、根据PRV ZJ01株基因序列(登录号：KM061380.1)，以伪狂犬病毒变异株PRVAH株为模板，设计引物gC-F/gC-R，扩增gC编码区，引入BamH I和Hind III酶切位点及His标签序列，获得gC目的片段；
gC目的片段的核苷酸序列如下所示：
CCAAGCTTTTAAATCCGTTTCCTGATTCACGCCCACGCCCGTGTCGTTTTTAAAACCGCGATGGGGTGACGGGGGGGCCATTCGCACGCGCCATGGCCTCGCTCGCGCGTGCGATGCTCGCGCTGCTGGCGCTCTACACGGCGGCCATCGCCGCGGCGCCGTCGTCCACGACGGCGCTCGGCACGACGCCCAACGGGGGCGGGGGCGGCAACAGCAGCGCGGGCGAGCTCTCGCCCTCGCCGCCCTCGACGCCCGAGCCCGTCTCGGGGACGACGGGGGCCGCGGCCTCCACGCCCGCCGCCGTCTCGACGCCCCGGGTCCCGCCGCCCTCGGTCTCGCGCCGGAAGCCCCAGCGGAACGGCAACAGGACGCGCGTCCACGGCGACAAGGCCACCTCGCACGGGCGCAAGCGCATCGTGTGCCGCGAGCGGCTGTTCTCGGCGAGGGTGGGGGACGCGGTCAGCTTCGGGTGCGCCGTCGTCCCGCGCGCCGGGGAGACCTTCGAGGTCCGCTTCTGCCGCCGCGGGCGCTTCCGCTCGCCCGACGCCGACCCCGAGTACTTTGACGAGCCCCCGCGCCCGGAGCTCCCGCGGGAGCGGCTCCTCTTCAGCTCCGCCAACGCCTCCCTCGCCCACGCGGACGCGCTCGCCTCCGCCGTCGTCGTCGAGGGCGAGCGCGCGACCGTCGCCAACGTCTCGGGCGAGGTGTCCGTGCGCGTGGCCGCGGCGGACGCCGAGACCGAGGGCGTCTACACGTGGCGCGTGCTGTCCGCCAACGGCACCGAGGTCCGCAGCGCCAACGTCTCGCTCGTCCTGTACCACCAGCCCGAGTTCGGCCTGAGCGCGCCGCCCGTCCTCTTCGGCGAGCCCTTCCGGGCGGTGTGCGTCGTCCGCGACTACTACCCGCGGCGCAGCGTGCGCCTGCGCTGGTTCGCGGACGAGCACCCGGTGGACGCCGCCTTCGTGACCAACAGCACCGTGGCCGACGAGCTCGGGCGCCGCACGCGCGTCTCCGTGGTGAACGTGACGCGCGCGGACGTCCCGGGCCTCGCGGCCGCGGACGACGCGGACGCGCTCGCGCCGAGCCTGCGCTGCGAGGCCGTGTGGTACCGCGACAGCGTGGCCTCGCAGCGCTTCTCCGAGGCCCTGCGCCCCCACGTCTACCACCCGGCGGCGGTCTCGGTGCGCTTCGTCGAGGGCTTCGCCGTCTGCGACGGCCTCTGCGTGCCCCCGGAGGCGCGCCTCGCCTGGTCCGACCACGCCGCCGACACCGTCTACCACCTCGGCGCCTGCGCCGAGCACCCCGGCCTGCTCAACGTGCGGAGCGCCCGCCCGCTGTCGGACCTCGACGGGCCCGTCGACTACACCTGCCGCCTCGAGGGCATGCCCTCGCAGCTGCCCATCTTCGAGGACACGCAGCGCTACGACGCCTCCCCCACGTCCGTGAGCTGGCCCGTCGTGACCAGCATGATCACCGTCATCGCCGGCATCGCCATCCTAGCCATCGTGCTGGTCATCATGGCGACGTGCGTCTACTACCGCCGGTCCGCGCTGCATCATCATCATCATCATTGAGGATCCCG
进一步以pEGFP-N1线性化质粒为模板，以FW-F/FW-R(表1)为引物扩增pEGFP-N1骨架(不含EGFP编码序列)，同时引入Hind III和BamH I酶切位点，将纯化得到的gC片段与pEGFP-N1骨架分别利用限制性核酸内切酶Hind III和BamH I进行双酶切，连接转化，筛选得到重组质粒pgC-N1，并用Hind III和BamH I进行酶切鉴定；进一步以重组质粒pgC-N1为模板，用EGFP-F1/EGFP-R1为引物扩增PCMV-gC-SV40polyA表达盒，引入EcoR V酶切位点。将质粒pMD-LA-RA和纯化的PCMV-gC-SV40polyA分别利用限制性核酸内切酶EcoRV酶切，连接转化，筛选得到重组质粒pMD-LA-RA-gC。
表1引物序列表
实施例2重组病毒的构建及纯化
1、重组病毒rPRV-AH-gI-/gE-/EGFP+的获得
(1)将0.1MOI伪狂犬病毒变异株PRV-AH接种单层BHK-21细胞，待70％～80％的细胞都产生病变时，将其反复冻融3次，收获PRV-AH病毒液；
(2)转染在24孔细胞培养板上进行，待BHK-21细胞长至80％时进行转染。参照2000Reagent转染试剂说明书，如图1所示构建策略，将重组质粒pMD-LA-RA-EGFP转染BHK-21细胞，转染4h后，接入0.1MOI的PRV-AH病毒液，使质粒与病毒基因组在细胞内发生同源重组，同时设仅含重组质粒pMD-LA-RA-EGFP的转染对照组；
(3)PRV-AH与pMD-LA-RA-EGFP同源重组48h后，观察转染细胞病变情况及荧光蛋白表达情况。待转染细胞完全病变后经反复冻融后，收取病毒液，接种到长满BHK-21细胞的60mm细胞培养板中，扩大培养并冻融，收集病毒液；
(4)将步骤(3)制得的病毒液适当稀释后，接种单层的BHK-21细胞。吸附1h后，弃去病毒液，PBS洗3遍，在细胞上铺加含2％琼脂糖和2％FBS的DMEM培养基。4℃放置5min，待其凝固后，将接种细胞移入37℃5％CO2培养箱中培养。每天观察细胞病变情况，2～3d后，在荧光显微镜下可观察到病毒感染细胞形成的空斑，标记并挑取出现绿色荧光的空斑，置于DMEM中，反复冻融3次；将反复冻融后的病毒液做适当稀释后，接种BHK-21细胞，进行下一轮的空斑纯化，挑取出现绿色荧光的空斑；如此反复，经过数轮空斑纯化，直到所有病变细胞均带有绿色荧光，初步证明获得纯化重组病毒rPRV-AH-gI-/gE-/EGFG+(图4)，多次传代后，通过PCR鉴定，引物为EGFP-F1/EGFP-R1，目的大小为1809bp，结果表明获得纯化重组病毒rPRV-AH-gI-/gE-/EGFP+(图5)
2、重组病毒rPRV-AH-gI-/gE-的获得
将重组质粒pMD-LA-RA与步骤1制得的重组病毒rPRV-AH-gI-/gE-/EGFP+参照步骤1，根据图2构建策略进行同源重组及空斑纯化。在利用空斑纯化方法筛选重组病毒rPRV-AH-gI-/gE-时，应在荧光显微镜下标记并挑取不出现绿色荧光的空斑，进行下一轮空斑纯化，如此反复纯化病毒，直至所有病毒空斑均不出现绿色荧光(图4)。提取rPRV-AH-gI-/gE-基因组DNA，用引物gE-F/gE-R(表1)对该基因缺失病毒rPRV-AH-gI-/gE-进行PCR鉴定(图6)，目的大小为292bp，结果表明基因缺失病毒rPRV-AH-gI-/gE-纯化完全。其中，缺失毒株rPRV-AH-gI-/gE-的gI/gE基因的核苷酸序列为：
5’-GACGGCTCCGCGGGCTCCTCCTCGCCGCCCTGACCCTGGCCGCCCTGACCCCGCGCGTCGGGGGCGTCCTCTTCAGGGGCGCCGGCGTCAGCGTGCACGTCGCCGGCAGCGCCGTCCTCGTGCCCGGCGACGCGCCCAACCTGACGATAGACGGGACGCTGCTGAATCGTCGACCTGCAGGATATCCGGAAGTGACGAATGGACCCAACTATGGCGTGACCGCCAACCGCCTGTTGATGTCCCGCCCCGCTTAAATACCGGGAGAACCGGTCCGCCCGCATTCCGACATGCCCGGCGCCGCCTCCGTCGACATGGAACGGTTTGACCT-3’。
3、重组病毒rPRV-AH-gI-/gE-/gC+的获得
将重组质粒pMD-LA-RA-gC与步骤1制得的重组病毒rPRV-AH-gI-/gE-/EGFP+参照步骤1，根据图3构建策略进行同源重组及空斑纯化。在利用空斑纯化方法筛选重组病毒rPRV-AH-gI-/gE-/gC+时，应在荧光显微镜下标记并挑取不出现绿色荧光的空斑，进行下一轮空斑纯化，如此反复的纯化病毒，直至所有病毒空斑均不出现绿色荧光(图4)。提取rPRV-AH-gI-/gE-/gC+基因组DNA，用引物EGFP-F1/EGFP-R1对病毒rPRV-AH-gI-/gE-/gC+进行PCR鉴定(图7)，目的大小2697bp，结果表明基因缺失病毒rPRV-AH-gI-/gE-/gC+纯化完全。
实施例3重组病毒一步生长曲线的绘制
1、病毒一步生长曲线绘制
将重组病毒rPRV-AH-gI-/gE-/gC+、rPRV-AH-gI-/gE-和PRV-AH株分别以1MOI的量接种在长有BHK-21细胞的培养板中，在37℃、5％CO2的细胞培养箱中孵育1h后弃液，PBS洗两遍弃液，补加含2％胎牛血清的DMEM细胞维持液。接毒1h后第一次收取病毒。4～72h之间每隔4h收毒一次，收取的病毒于﹣80℃保存。将所有时间段收取的病毒反复冻融三次后进行病毒滴度的测定，绘制72h内三种病毒的生长曲线图。
2、结论
如图8所示，PRV-AH、rPRV-AH-gI-/gE-、rPRV-AH-gI-/gE-/gC+三个病毒具有类似的生长动力学，病毒的最高滴度分别为10-7.58TCID50/mL、10-7.00TCID50/mL和10-7.36TCID50/mL。与亲本毒PRV-AH相比，接毒后1～12h重组病毒rPRV-AH-gI-/gE-/gC+的增殖速度较慢，20～48h病毒滴度与亲本毒相近，略低于亲本毒，表明gI、gE基因的缺失对病毒的增殖有一定的影响，这与gI、gE基因的功能相符。三个病毒在20～72h病毒滴度变化不大，在48h左右滴度达到最高。
实例4实时定量PCR分析rPRV-AH-gI-/gE-/gC+外源gC基因的表达
1、制备cDNA
将重组病毒rPRV-AH-gI-/gE-/gC+与rPRV-AH-gI-/gE-分别以1MOI接种于BHK-21细胞上，分别在接毒后6h、12h和24h三个时间点收集病毒，抽提病毒总RNA。用TOYOBO公司的反转录试剂ReverTraAce qPCR RT Master Mix with gDNARemover进行基因组DNA的去除(Code No.FSQ-301)及RNA的反转录，获得cDNA。
2、PCR标准曲线的绘制
根据gC编码区保守序列，设计引物qgC-F1/qgC-R1，用于构建gC阳性质粒作为标准品，按照公式：拷贝数＝6.02×1023×(质粒浓度/质粒平均分子量)计算标准品pMD-qgC的拷贝数，其中质粒浓度单位为g/μL。将pMD-qgC做10倍连续稀释，从1.0×1010copies/μL稀释至1.0×104copies/μL并分别做好标记，选取1.0×108copies/μL、1.0×107copies/μL、1.0×106copies/μL、1.0×105copies/μL、1.0×104copies/μL 5个浓度的样品分别标记为1、2、3、4、5作为模板，以纯水为阴性对照，每个浓度样品做3个平行，用Bio-Rad公司PCR扩增仪进行实时荧光定量PCR并绘制标准曲线。
引物qgC-F1/qgC-R1(扩增片段为171bp)如下所示：
qgC-F1：5’-GTCCTGTACCACCAGCCCGAGTT-3’(SEQIDNO：14)；
qgC-R1：5’-CACGGTGCTGTTGGTCACGAAGG-3’(SEQIDNO：15)。
3、PCR反应参数：95℃预变性1min；95℃变性10s，60℃退火15s，72℃延伸15s，循环40次(72℃采集荧光信号)；95℃变性10s，65℃退火5s，95℃延伸5s(65℃采集荧光信号)。循环完成后通过软件Bio-Rad CFX Manager观察并计算结果。
4、PCR检测
以cDNA为模板，按照SYBgreen操作说明，以qgC-F1/qgC-R1为引物，采用绘制标准曲线反应参数进行实时荧光定量PCR扩增，根据标准曲线计算出模板中gC基因cDNA的拷贝数。
5、结论
实时荧光定量PCR标准曲线显示各标准质粒样品浓度的对数和Cq值之间有良好的线性关系，线性方程为Cq＝-3.638x+43.042，未知样品拷贝数＝10x copies，加样操作重复相关系数R2＝1.00，符合荧光定量PCR数据有效性标准。图9显示rPRV-AH-gI-/gE-/gC+株在接毒后6h时1μL模板中gC mRNA的拷贝数是rPRV-AH-gI-/gE-株的1.85倍(P<0.01)，两者拷贝数分别为889.58和479.72；在12h时1μL模板中gC mRNA的拷贝数是rPRV-AH-gI-/gE-株的35.93倍(P<0.01)，两者拷贝数分别为25286.67和703.70；在24h时1μL模板中gC mRNA的拷贝数是rPRV-AH-gI-/gE-株的40.64倍(P<0.01)，两者拷贝数分别为541311.11和13319.78。说明重组病毒rPRV-AH-gI-/gE-/gC+在插入gC基因后，gCmRNA转录水平与rPRV-AH-gI-/gE-相比有显著提高。
实施例5免疫印迹法分析rPRV-AH-gI-/gE-/gC+外源gC基因的表达
1、Westernblot
His标签单抗(CWBIO，CHN)用于检测外源gC基因在rPRV-AH-gI-/gE-/gC+中的表达，外源gC基因3’末端已引入His-Tag标签序列。将重组病毒rPRV-AH，rPRV-AH-gI-/gE-/gC+与rPRV-AH-gI-/gE-分别以0.01MOI接种于BHK-21细胞上，在接毒后48h三个时间点收集病毒液。通过RIPA裂解液裂解细胞提取病毒总蛋白质。用Bio-Rad公司Bradford测定蛋白浓度，按1:4比例加入5x SDS上样缓冲液，100℃,5min蛋白变性；每个泳道加入50μg蛋白样进行SDS电泳，然后将蛋白质电转至PVDF膜上，5％脱脂奶粉常温封闭2h；TBST洗膜3次，每次5min，His标签抗体4℃孵育过夜；TBST洗膜3次，每次5min，按1:5000比例稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗(山羊抗小鼠)，室温孵育滤膜1h后，TBST洗膜3次，每次5min，进行ECL化学发光，Fine-do曝光，检查膜上条带。
2、结果
结果如图10所示，表明外源gC基因在rPRV-AH-gI-/gE-/gC+病毒中高效表达，与目的大小72KD一致。
实施例6伪狂犬病毒rPRV-AH-gI-/gE-/gC+灭活疫苗的制备及应用
1、灭活疫苗的制备
BHK-21细胞按常规方法培养，rPRV-AH-gI-/gE-/gC+，rPRV-AH-gI-/gE-病毒以1MOI感染复数接种细胞，当细胞病变达90％时收获病毒，反复冻融3次，测定病毒液的TCID50为10-7.57/100μL，10-7.41/100μL。
灭活剂β-丙内酯:病毒液＝1:2000(体积比)混合均匀，4℃放置24h，期间，要不定时摇匀，以确保病毒能完全灭活，37℃水浴锅放置2h，终止灭活，进行病毒灭活效果检测及无菌检测：
(1)病毒灭活效果检测：按常规接毒方法，将灭活病毒在BHK-21细胞上连续传代3次，观察细胞有无病变。结果均未出现病变，病毒灭活完全。
(2)无菌检测：将500μL灭活病毒加入到5mL不含任何抗生素的LB固体培养基中，置于37℃恒温培养48h，培养基无菌落生长。
根据收获病毒液的毒价，将灭活后的病毒液进行稀释，稀释后的病毒液与Montanide gel佐剂的体积比为9:1混合，使病毒最终含量分别为106.0TCID50/mL、107.0TCID50/mL。磁力搅拌30min以上，短期内4℃保存。
2、灭活疫苗rPRV-AH-gI-/gE-/gC+的免疫效力评价
(1)病毒LD50的测定
①6周龄昆明系雌鼠78只，随机分成13组，每组6只，分别命名为A1、A2、A3、A4组；B1、B2、B3、B4组；C1、C2、C3、C4组和D组。
②用DMEM将基因缺失毒株rPRV-AH-gI-/gE-/gC+、亲本毒株PRV-AH株和PRV经典毒株鄂A株(PRV-Ea株)分别依次作10、102、103、104倍稀释。
③A1～A4组分别接种基因缺失毒株rPRV-AH-gI-/gE-/gC+稀释后病毒液；B1～B4组分别接种亲本毒株PRV-AH株稀释后的病毒液；C1～C4组分别接种PRV-Ea稀释后的病毒液；D组每只接种DMEM，作为阴性对照；以上各组接种量均为100μL/只。
④不同攻毒组小鼠做好隔离措施。
⑤接种后，每天观察小鼠的临床症状和死亡情况，并做详细记录。
根据试验结果，采用改良寇氏法计算出病毒的LD50，PRV-Ea株、PRV-AH株和rPRV-AH-gI-/gE-/gC+的LD50分别是102.8TCID50、103.5TCID50、104.6TCID50。
(2)动物免疫及攻毒实验
①4周龄昆明雌鼠88只，随机分成A1、A2、B1、B2、C1、C2、D1、D2、E、F、G 7组，每组8只。
②A1、B1组每只肌肉注射100μL病毒含量为105.0TCID50的rPRV-AH-gI-/gE-/gC+灭活疫苗，A2、B2每只肌肉注射100μL病毒含量为105.0TCID50的rPRV-AH-gI-/gE-灭活疫苗；C1、D1组每只肌肉注射100μL病毒含量为106.0TCID50的rPRV-AH-gI-/gE-/gC+灭活疫苗，C2、D2每只肌肉注射100μL病毒含量为106.0TCID50的rPRV-AH-gI-/gE-灭活疫苗；E、F组作为攻毒对照组，同时攻毒；G组作为空白对照组。
③首免后4周，各组用首免时的相同剂量进行二次免疫。
④于首免前，首免后2周、4周，二免后每隔1周，各采血一次，检测血清的PRV中和抗体水平。
⑤二免后4周，A1、A2、C1、C2、E组肌肉注射100μL含100LD50的PRV-AH株病毒液，B1、B2、D1、D2、F组肌肉注射100μL含100LD50的PRV-Ea病毒液，G组不做任何注射。
⑥攻毒后，每天观察小鼠的活动状态及攻毒后的症状和死亡情况，并作详细记录。
(3)结果
如表2示，在针对流行毒株PRV-AH的免疫效果上，106TCID50/100μL免疫组与105TCID50/100μL免疫组中和抗体水平差异极显著(P<0.01)，105TCID50免疫剂量的免疫效果不佳，抗体水体整体低，但rPRV-AH-gI-/gE-/gC+灭活疫苗的免疫效果明显优于rPRV-AH-gI-/gE-灭活疫苗(P<0.01)；106TCID50免疫剂量效果良好，小鼠首免后14d、28d抗体水平均不高，各组之间中和抗体水平差异性不显著(P>0.05)。加强免疫后各组抗体水平显著提高，在二免后21d(首免后49d)抗体水达到最高，其中rPRV-AH-gI-/gE-/gC+免疫组中和抗体效价均达到1:35.93以上，rPRV-AH-gI-/gE-免疫组中和效价为1:15.67，差异极显著(P<0.01)；同时在针对经典毒株PRV-Ea的免疫实验，结果一致，106TCID50/100μL免疫组明显优于105TCID50/100μL免疫组(P<0.01)，106TCID50免疫剂量的rPRV-AH-gI-/gE-/gC+灭活疫苗实验组中和抗体在首免后49d达1:30.53，rPRV-AH-gI-/gE-/gC+灭活疫苗实验组中和效价为1:16.34；阴性对照组抗体水平均为阴性值。
表2免疫后不同时间小鼠体内的PRV中和抗体效价
二次免疫后第28d分别用100LD50PRV-Ea和PRV-AH株对小鼠进行攻毒，持续观察14d。如表3所示，106TCID50/100μL免疫组对两种PRV强毒的攻击都能100％保护；105TCID50/100μL免疫组,rPRV-AH-gI-/gE-/gC+灭活疫苗对小鼠保护率均稍高于PRV-AH-gI-/gE灭活疫苗。PRV-Ea和PRV-AH株攻毒对照组小鼠均在攻毒后10d内死亡，死前均有伪狂犬病典型神经症状和奇痒症状。其余小鼠14d后均存活，无任何不适症状。
表3免疫小鼠攻毒后存活率
综上所述，本实验中106TCID50/100μL免疫组免疫效果优于105TCID50/100μL免疫组，为优选免疫剂量；在106TCID50/100μL免疫剂量下，rPRV-AH-gI-/gE-/gC+灭活疫苗针对流行毒株PRV-AH和经典毒株PRV-Ea的免疫效果均明显优于rPRV-AH-gI-/gE-灭活疫苗。
实验结果表明，基因缺失毒株rPRV-AH-gI-/gE-/gC+灭活疫苗对流行毒株和经典毒株均具有良好的免疫原性，有望作为一种新的疫苗候选株用于PRV流行株的防控。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> 双表达gC基因的伪狂犬病毒gE/gI缺失突变株及其构建和应用
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 327
<212> DNA
<213> 伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus)
<400> 1
gacggctccg cgggctcctc ctcgccgccc tgaccctggc cgccctgacc ccgcgcgtcg 60
ggggcgtcct cttcaggggc gccggcgtca gcgtgcacgt cgccggcagc gccgtcctcg 120
tgcccggcga cgcgcccaac ctgacgatag acgggacgct gctgaatcgt cgacctgcag 180
gatatccgga agtgacgaat ggacccaact atggcgtgac cgccaaccgc ctgttgatgt 240
cccgccccgc ttaaataccg ggagaaccgg tccgcccgca ttccgacatg cccggcgccg 300
ctccgtcgac atggaacggt ttgacct 327
<210> 2
<211> 1582
<212> DNA
<213> 伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus)
<400> 2
ccaagctttt aaatccgttt cctgattcac gcccacgccc gtgtcgtttt taaaaccgcg 60
atggggtgac gggggggcca ttcgcacgcg ccatggcctc gctcgcgcgt gcgatgctcg 120
cgctgctggc gctctacacg gcggccatcg ccgcggcgcc gtcgtccacg acggcgctcg 180
gcacgacgcc caacgggggc gggggcggca acagcagcgc gggcgagctc tcgccctcgc 240
cgccctcgac gcccgagccc gtctcgggga cgacgggggc cgcggcctcc acgcccgccg 300
ccgtctcgac gccccgggtc ccgccgccct cggtctcgcg ccggaagccc cagcggaacg 360
gcaacaggac gcgcgtccac ggcgacaagg ccacctcgca cgggcgcaag cgcatcgtgt 420
gccgcgagcg gctgttctcg gcgagggtgg gggacgcggt cagcttcggg tgcgccgtcg 480
tcccgcgcgc cggggagacc ttcgaggtcc gcttctgccg ccgcgggcgc ttccgctcgc 540
ccgacgccga ccccgagtac tttgacgagc ccccgcgccc ggagctcccg cgggagcggc 600
tcctcttcag ctccgccaac gcctccctcg cccacgcgga cgcgctcgcc tccgccgtcg 660
tcgtcgaggg cgagcgcgcg accgtcgcca acgtctcggg cgaggtgtcc gtgcgcgtgg 720
ccgcggcgga cgccgagacc gagggcgtct acacgtggcg cgtgctgtcc gccaacggca 780
ccgaggtccg cagcgccaac gtctcgctcg tcctgtacca ccagcccgag ttcggcctga 840
gcgcgccgcc cgtcctcttc ggcgagccct tccgggcggt gtgcgtcgtc cgcgactact 900
acccgcggcg cagcgtgcgc ctgcgctggt tcgcggacga gcacccggtg gacgccgcct 960
tcgtgaccaa cagcaccgtg gccgacgagc tcgggcgccg cacgcgcgtc tccgtggtga 1020
acgtgacgcg cgcggacgtc ccgggcctcg cggccgcgga cgacgcggac gcgctcgcgc 1080
cgagcctgcg ctgcgaggcc gtgtggtacc gcgacagcgt ggcctcgcag cgcttctccg 1140
aggccctgcg cccccacgtc taccacccgg cggcggtctc ggtgcgcttc gtcgagggct 1200
tcgccgtctg cgacggcctc tgcgtgcccc cggaggcgcg cctcgcctgg tccgaccacg 1260
ccgccgacac cgtctaccac ctcggcgcct gcgccgagca ccccggcctg ctcaacgtgc 1320
ggagcgcccg cccgctgtcg gacctcgacg ggcccgtcga ctacacctgc cgcctcgagg 1380
gcatgccctc gcagctgccc atcttcgagg acacgcagcg ctacgacgcc tcccccacgt 1440
ccgtgagctg gcccgtcgtg accagcatga tcaccgtcat cgccggcatc gccatcctag 1500
ccatcgtgct ggtcatcatg gcgacgtgcg tctactaccg ccggtccgcg ctgcatcatc 1560
atcatcatca ttgaggatcc cg 1582
<210> 3
<211> 2662
<212> DNA
<213> 伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus)
<400> 3
gatatcgttt aaacgttctt tcctgcgtta tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc 60
gccatgcatt agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata gcccatatat 120
ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc 180
ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag ggactttcca 240
ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta 300
tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg cctggcatta 360
tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg tattagtcat 420
cgctattacc atggtgatgc ggttttggca gtacatcaat gggcgtggat agcggtttga 480
ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt tttggcacca 540
aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa caactccgcc ccattgacgc aaatgggcgg 600
taggcgtgta cggtgggagg tctatataag cagagctggt ttagtgaacc gtcagatccg 660
ctagcgctac cggactcaga tctcgagctc aagcttccaa gcttttaaat ccgtttcctg 720
attcacgccc acgcccgtgt cgtttttaaa accgcgatgg ggtgacgggg gggccattcg 780
cacgcgccat ggcctcgctc gcgcgtgcga tgctcgcgct gctggcgctc tacacggcgg 840
ccatcgccgc ggcgccgtcg tccacgacgg cgctcggcac gacgcccaac gggggcgggg 900
gcggcaacag cagcgcgggc gagctctcgc cctcgccgcc ctcgacgccc gagcccgtct 960
cggggacgac gggggccgcg gcctccacgc ccgccgccgt ctcgacgccc cgggtcccgc 1020
cgccctcggt ctcgcgccgg aagccccagc ggaacggcaa caggacgcgc gtccacggcg 1080
acaaggccac ctcgcacggg cgcaagcgca tcgtgtgccg cgagcggctg ttctcggcga 1140
gggtggggga cgcggtcagc ttcgggtgcg ccgtcgtccc gcgcgccggg gagaccttcg 1200
aggtccgctt ctgccgccgc gggcgcttcc gctcgcccga cgccgacccc gagtactttg 1260
acgagccccc gcgcccggag ctcccgcggg agcggctcct cttcagctcc gccaacgcct 1320
ccctcgccca cgcggacgcg ctcgcctccg ccgtcgtcgt cgagggcgag cgcgcgaccg 1380
tcgccaacgt ctcgggcgag gtgtccgtgc gcgtggccgc ggcggacgcc gagaccgagg 1440
gcgtctacac gtggcgcgtg ctgtccgcca acggcaccga ggtccgcagc gccaacgtct 1500
cgctcgtcct gtaccaccag cccgagttcg gcctgagcgc gccgcccgtc ctcttcggcg 1560
agcccttccg ggcggtgtgc gtcgtccgcg actactaccc gcggcgcagc gtgcgcctgc 1620
gctggttcgc ggacgagcac ccggtggacg ccgccttcgt gaccaacagc accgtggccg 1680
acgagctcgg gcgccgcacg cgcgtctccg tggtgaacgt gacgcgcgcg gacgtcccgg 1740
gcctcgcggc cgcggacgac gcggacgcgc tcgcgccgag cctgcgctgc gaggccgtgt 1800
ggtaccgcga cagcgtggcc tcgcagcgct tctccgaggc cctgcgcccc cacgtctacc 1860
acccggcggc ggtctcggtg cgcttcgtcg agggcttcgc cgtctgcgac ggcctctgcg 1920
tgcccccgga ggcgcgcctc gcctggtccg accacgccgc cgacaccgtc taccacctcg 1980
gcgcctgcgc cgagcacccc ggcctgctca acgtgcggag cgcccgcccg ctgtcggacc 2040
tcgacgggcc cgtcgactac acctgccgcc tcgagggcat gccctcgcag ctgcccatct 2100
tcgaggacac gcagcgctac gacgcctccc ccacgtccgt gagctggccc gtcgtgacca 2160
gcatgatcac cgtcatcgcc ggcatcgcca tcctagccat cgtgctggtc atcatggcga 2220
cgtgcgtcta ctaccgccgg tccgcgctgc atcatcatca tcatcattga ggatcccggg 2280
atccccgcga ctctagatca taatcagcca taccacattt gtagaggttt tacttgcttt 2340
aaaaaacctc ccacacctcc ccctgaacct gaaacataaa atgaatgcaa ttgttgttgt 2400
taacttgttt attgcagctt ataatggtta caaataaagc aatagcatca caaatttcac 2460
aaataaagca tttttttcac tgcattctag ttgtggtttg tccaaactca tcaatgtatc 2520
ttaaggcgta aattgtaagc gttaatattt tgttaaaatt cgcgttaaat ttttgttaaa 2580
tcagctcatt ttttaaccaa taggccgaaa tcggcaaaat cccttataaa tcaaaagaat 2640
agaccgagat agggttgata tc 2662
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus)
<400> 4
ccaagctttt aaatccgttt cctg 24
<210> 5
<211> 39
<212> DNA
<213> 伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus)
<400> 5
cgggatcctc aatgatgatg atgatgatgc agcgcggac 39
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus)
<400> 6
cgggatcccc gcgactctag a 21
<210> 7
<211> 15
<212> DNA
<213> 伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus)
<400> 7
ccaagcttga gctcg 15
<210> 8
<211> 36
<212> DNA
<213> 伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus)
<400> 8
aacgatatcg tttaaacgtt ctttcctgcg ttatcc 36
<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> 伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus)
<400> 9
aacgatatca accctatctc ggtctattct 30
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus)
<400> 10
ccgaccagca ccgcacgtac aagtt 25
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus)
<400> 11
cagcagcgtc ccgtctatcg t 21
<210> 12
<211> 31
<212> DNA
<213> 伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus)
<400> 12
aaactgcagg atatccggaa gtgacgaatg g 31
<210> 13
<211> 27
<212> DNA
<213> 伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus)
<400> 13
ctcggtggtg atgtagaaaa gcttggg 27
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> 伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus)
<400> 14
gtcctgtacc accagcccga gtt 23
<210> 15
<211> 23
<212> DNA
<213> 伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus)
<400> 15
cacggtgctg ttggtcacga agg 23
Claims (10)
1.一种双表达gC基因的伪狂犬病毒gE/gI缺失突变株，其特征在于，是在伪狂犬重组病毒rPRV-AH-gI-/gE-缺失gE/gI基因位置处，通过插入gC基因构建得到的；所述gI/gE基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述gC基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
2.权利要求1所述的双表达gC基因的伪狂犬病毒gE/gI缺失突变株1的制备方法，特征在于，包括如下步骤：
S1.以狂犬病毒变异株PRV-AH株为模板，gC-F/gC-R为引物，扩增gC目的片段；以pEGFP-N1线性化质粒为模板，以FW-F/FW-R为引物，扩增pEGFP-N1骨架；
S2.将纯化得到的gC片段与pEGFP-N1骨架分别用Hind III和BamH I进行双酶切，连接转化，筛选得到重组质粒pgC-N1；以重组质粒pgC-N1为模板，EGFP-F1/EGFP-R1为引物扩增PCMV-gC-SV40polyA表达盒；将质粒pMD-LA-RA和纯化的PCMV-gC-SV40 polyA分别用EcoRV酶切，连接转化，筛选得到重组质粒pMD-LA-RA-gC；
S3.将重组质粒pMD-LA-RA-gC与重组病毒rPRV-AH-gI-/gE-/EGFP+进行同源重组及空斑纯化，以EGFP为筛选标记，通过空斑纯化筛选不出现绿色荧光的空斑即可获得重组病毒rPRV-AH-gI-/gE-/gC+，即双表达gC基因的伪狂犬病毒gE/gI缺失突变株；
所述引物gC-F、gC-R、FW-F、FW-R、EGFP-F1和EGFP-R1的核苷酸序列依次如SEQ ID NO：4～9所示。
3.根据权利要求2所述的制备方法，特征在于，S2所述质粒pMD-LA-RA的制备方法包括如下步骤：
S1.以伪狂犬病毒变异株PRV-AH株为模板，LA-F/LA-R与RA-F/RA-R为引物，分别扩增位于gI基因和gE基因两侧的用于同源重组的左臂LA和右臂RA；
S2.将LA片段与pMD18-T载体连接，得到重组质粒pMD-LA；将重组质粒pMD-LA与RA片段分别用限制性内切酶Hind Ш和PstІ进行双酶切，酶切产物连接转化，得到重组质粒pMD-LA-RA；
所述引物LA-F、LA-R、RA-F和RA-R的核苷酸序列依次如SEQ ID NO：10～13所示。
4.根据权利要求2所述的制备方法，特征在于，S3所述重组病毒rPRV-AH-gI-/gE-/EGFP+的制备方法包括如下步骤：
S1.以pEGFP-N1为模板，EGFP-F1/EGFP-R1为引物，扩增得到EGFP完整表达盒；将重组质粒pMD-LA-RA和EGFP回收产物分别用限制性内切酶EcoR V进行单酶切，对线性化的质粒pMD-LA-RA进行去磷酸化处理，将去磷酸化后的质粒pMD-LA-RA与EGFP连接转化，得到重组质粒pMD-LA-RA-EGFP；
S2.重组质粒pMD-LA-RA-EGFP转染BHK-21细胞，然后再以伪狂犬病毒变异株PRV-AH株感染已转染的BHK-21细胞，使重组质粒pMD-LA-RA-EGFP与PRV-AH株基因组在细胞内发生同源重组，以EGFP为筛选标记，通过空斑纯化筛选出现绿色荧光的空斑即可获得重组病毒rPRV-AH-gI-/gE-/EGFP+；
所述EGFP-F1和EGFP-R1的核苷酸序列依次如SEQ ID NO：8～9所示。
5.权利要求1所述的双表达gC基因的伪狂犬病毒gE/gI缺失突变株在制备伪狂犬病毒灭活疫苗中的应用。
6.一种猪伪狂犬病毒基因缺失灭活疫苗，其特征在于，包含权利要求1所述的双表达gC基因的伪狂犬病毒gE/gI缺失突变株。
7.根据权利要求6所述的猪伪狂犬病毒基因缺失灭活疫苗，其特征在于，还包含佐剂和灭活剂。
8.根据权利要求7所述的猪伪狂犬病毒基因缺失灭活疫苗，其特征在于，所述的灭活剂为β-丙内酯。
9.根据权利要求8所述的猪伪狂犬病毒基因缺失灭活疫苗，其特征在于，所述的双表达gC基因的伪狂犬病毒gE/gI缺失突变株的TCID50为10-7.57/100μL，灭活剂与双表达gC基因的伪狂犬病毒gE/gI缺失突变株的体积比为1:2000。
10.根据权利要求6～9任一项所述的猪伪狂犬病毒基因缺失灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包含如下步骤：
S1.将，rPRV-AH-gI-/gE-/gC+病毒以1MOI感染复数接种细胞，当细胞病变达90%时收获病毒，反复冻融3次，测定病毒液的TCID50为10-7.57/100µL；
S2.灭活剂β-丙内酯和步骤S1制得的病毒液按照体积比1:2000混合均匀，4℃放置24h，期间，要不定时摇匀，以确保病毒能完全灭活；然后37℃水浴放置2h，终止灭活；
S3.将灭活后的病毒液进行稀释，稀释后的病毒液与Montanide gel佐剂按照体积比9:1混合，搅拌30min以上，得到猪伪狂犬病毒基因缺失灭活疫苗。
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