CN107384874A - 伪狂犬病毒流行株gI/gE基因缺失突变株及构建和应用 - Google Patents

伪狂犬病毒流行株gI/gE基因缺失突变株及构建和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于动物病毒学及基因工程学技术领域，具体涉及一种伪狂犬病毒流行株gI/gE基因缺失突变株及构建和应用。所述的伪狂犬病毒流行株gI/gE基因缺失突变株是由伪狂犬病毒强毒株PRV AH‑China‑2013株进行毒力基因gE和gI的部分缺失制成。本发明在上述伪狂犬病毒流行株gI/gE基因缺失突变株PRV AH gI‑/gE‑的基础上，进一步制得猪伪狂犬病毒基因缺失灭活疫苗，该疫苗对昆明系小鼠具有良好的免疫保护效果，有望作为基因工程灭活疫苗应用于对猪伪狂犬病毒变异株的防制。

Description

伪狂犬病毒流行株gI/gE基因缺失突变株及构建和应用
技术领域
本发明属于动物病毒学及基因工程学技术领域，具体涉及一种伪狂犬病毒流行株gI/gE基因缺失突变株及构建和应用。
背景技术
伪狂犬病(Pseudorabies Virus，PRV)是由伪狂犬病毒引起的多种家畜和野生动物均可感染的一种急性传染病。在自然条件下，本病最常见于猪及其他易感动物，对猪主要表现为神经症状、繁殖障碍、生长停滞及高死亡率。哺乳仔猪感染后主要临床表现为神经症状，死亡率几乎高达100％；一般情况下成猪感染不发病，多呈隐形经过；妊娠母猪感染后可引起流产、死胎和木乃伊胎。
免疫接种是防控PRV的最有效方法。为了控制PRV，我国猪场自上世纪末开始广泛使用PRV弱毒活疫苗，如PRV Bartha-K61株活疫苗，猪伪狂犬发病率明显下降。但自2011年以来，许多使用PRV活疫苗免疫的规模化猪场出现了母猪流产、产死胎、木乃伊胎的情况，仔猪出现神经症状及死亡等临床症状，且从部分猪场已分离出变异毒株。这表明，目前使用的商品化疫苗对变异株的保护效果不佳，导致了我国猪场伪狂犬发病率的抬头趋势。因此，为了有效控制PRV变异株的流行，需要开发更为高效的针对PRV变异株的疫苗。
发明内容
为了克服现有技术中猪伪狂犬病毒疫苗不能完全抵抗强毒变异株感染等不足和缺点，本发明的首要目的在于提供一种伪狂犬病毒流行株gI/gE基因缺失突变株。
本发明的另一目的在于提供上述伪狂犬病毒流行株gI/gE基因缺失突变株的构建方法。
本发明的再一目的在于提供上述伪狂犬病毒流行株gI/gE基因缺失突变株的应用。
本发明的第四个目的在于提供一种猪伪狂犬病毒基因缺失灭活疫苗，该灭活疫苗由上述伪狂犬病毒流行株gI/gE基因缺失突变株制备得到。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种伪狂犬病毒流行株gI/gE基因缺失突变株，为将伪狂犬病毒变异株的gI基因的后半部分、gI和gE之间的连接序列以及gE基因的前半部共计三部分敲除后得到；
所述突变株的gI/gE基因的核苷酸序列为：
5’-GACGGCTCCGCGGGCTCCTCCTCGCCGCCCTGACCCTGGCCGCCCTGACCCCGCGCGTCGGGGGCGTCCTCTTCAGGGGCGCCGGCGTCAGCGTGCACGTCGCCGGCAGCGCCGTCCTCGTGCCCGGCGACGCGCCCAACCTGACGATAGACGGGACGCTGCTGAATCGTCGACCTGCAGGATATCCGGAAGTGACGAATGGACCCAACTATGGCGTGACCGCCAACCGCCTGTTGATGTCCCGCCCCGCTTAAATACCGGGAGAACCGGTCCGCCCGCATTCCGACATGCCCGGCGCCGCCTCCGTCGACATGGAACGGTTTGACCT-3’
所述的伪狂犬病毒变异株优选为伪狂犬病毒变异株PRV AH-China-2013株；
所述的伪狂犬病毒流行株gI/gE基因缺失突变株的构建方法，包含如下步骤：
(1)根据PRV ZJ01株基因序列(登录号：KM061380.1)，以伪狂犬病毒变异株PRVAH-China-2013株为模板，设计2对引物，LA-F/LA-R与RA-F/RA-R，分别扩增位于gI基因和gE基因两侧(含部分gI和gE基因)的可用于同源重组的左臂片段LA和右臂片段RA；其中，LA包括部分gD基因和部分gI基因，RA包括部分gE基因、全部的US9基因和部分US2基因；
(2)将步骤(1)扩增得到的LA片段与pMD18-T载体连接，得到重组质粒pMD-LA；将重组质粒pMD-LA与步骤(1)扩增得到的RA片段分别用限制性内切酶HindШ和Pst I进行双酶切，将酶切后的pMD-LA与酶切后的RA片段进行连接，得到重组质粒pMD-LA-RA；
(3)以质粒pEGFP-N1为模板，设计引物EGFP-F1和EGFP-R1，扩增得到EGFP完整表达盒；
(4)将步骤(2)制得的重组质粒pMD-LA-RA和步骤(3)扩增得到的EGFP完整表达盒分别用限制性内切酶EcoR V进行单酶切，对酶切后的pMD-LA-RA进行去磷酸化处理，将去磷酸化后的pMD-LA-RA与酶切后的EGFP完整表达盒连接，得到重组质粒pMD-LA-EGFP-RA；
(5)将步骤(4)制得的重组质粒pMD-LA-EGFP-RA转染BHK-21细胞，然后再以伪狂犬病毒变异株PRV AH-China-2013株感染已转染的BHK-21细胞，使重组质粒pMD-LA-EGFP-RA与PRV AH-China-2013株基因组在细胞内发生同源重组，以EGFP为筛选标记，通过空斑纯化筛选出现绿色荧光的空斑即可获得重组病毒PRV AH gI-/gE-/EGFP+；
(6)将步骤(2)制得的重组质粒pMD-LA-RA转染BHK-21细胞，然后再以步骤(5)制得的重组病毒PRV AH gI-/gE-/EGFP+感染已转染的BHK-21细胞，使重组质粒pMD-LA-RA与PRVAH gI-/gE-/EGFP+基因组在细胞内发生同源重组，以EGFP为筛选标记，通过空斑纯化筛选不出现绿色荧光的空斑即可获得重组病毒PRV AH gI-/gE-，此即为伪狂犬病毒流行株gI/gE基因缺失突变株；
其中，引物LA-F、LA-R、RA-F、RA-R、EGFP-F1和EGFP-R1序列如下所示：
LA-F：5’-CCGACCAGCACCGCACGTACAAGTT-3’；
LA-R：5’-CAGCAGCGTCCCGTCTATCGT-3’；
RA-F：5’-AAACTGCAGGATATCCGGAAGTGACGAATGG-3’；
RA-R：5’-CTCGGTGGTGATGTAGAAAAGCTTGGG-3’；
EGFP-F1：5’-AACGATATCGTTTAAACGTTCTTTCCTGCGTTATCC-3’；
EGFP-R1：5’-AACGATATCAACCCTATCTCGGTCTATTCT-3’；
所述的伪狂犬病毒流行株gI/gE基因缺失突变株在制备伪狂犬病毒灭活疫苗中的应用；
一种猪伪狂犬病毒基因缺失灭活疫苗，包含上述伪狂犬病毒流行株gI/gE基因缺失突变株；
所述的猪伪狂犬病毒基因缺失灭活疫苗，优选包含上述伪狂犬病毒流行株gI/gE基因缺失突变株、佐剂和灭活剂；
所述的灭活剂优选为β-丙内酯；
所述的伪狂犬病毒流行株gI/gE基因缺失突变株的TCID50优选为10-7.25/100μL，灭活剂与伪狂犬病毒流行株gI/gE基因缺失突变株的体积比优选为1:2000；
所述的佐剂优选为Montanide gel佐剂；
所述的伪狂犬病毒流行株gI/gE基因缺失突变株与灭活剂混合灭活后，将灭活后的病毒液进行稀释，稀释后的病毒液与Montanide gel佐剂的体积比优选为9:1，病毒最终含量优选为106.0TCID50～107.0TCID50/mL；
所述的猪伪狂犬病毒基因缺失灭活疫苗的制备方法，包含如下步骤：
(1)以1MOI的伪狂犬病毒流行株gI/gE基因缺失突变株(PRV AH gI-/gE-)感染BHK-21细胞，当细胞病变达90％时收获病毒，反复冻融3次，收集病毒液，12000r/min离心10min，取上清，以除去细胞碎片，测定病毒液的TCID50为10-7.25/100μL；
(2)灭活剂β-丙内酯和步骤(1)制得的病毒液按照体积比1:2000混合均匀，4℃放置24h，期间，要不定时摇匀，以确保病毒能完全灭活；然后37℃水浴放置2h，终止灭活；
(3)将灭活后的病毒液进行稀释，稀释后的病毒液与Montanide gel佐剂按照体积比9:1混合，搅拌30min以上，得到猪伪狂犬病毒基因缺失灭活疫苗；
本发明的原理：
由于现有的猪伪狂犬病疫苗不能对目前流行的伪狂犬病毒变异毒株提供完全的免疫保护，因此有必要研制针对PRV变异株的新型疫苗。本发明通过将伪狂犬病毒变异株PRV AH-China-2013株的gI和gE的部分基因进行缺失，获得毒力致弱的伪狂犬病毒流行株gI/gE基因缺失突变株PRV AH gI-/gE-。
本发明在上述伪狂犬病毒流行株gI/gE基因缺失突变株PRV AH gI-/gE-的基础上，进一步制得猪伪狂犬病毒基因缺失灭活疫苗，该疫苗对昆明系小鼠具有良好的免疫保护效果，有望作为基因工程灭活疫苗应用于对猪伪狂犬病毒变异株的防治。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明在构建伪狂犬病毒流行株gI/gE基因缺失突变株过程中，以线性化的重组质粒先转染BHK-21细胞，然后以PRV感染已转染细胞，使质粒与PRV病毒基因组在细胞内发生同源重组，而以往在进行同源重组时多采用重组质粒与病毒基因组共转染细胞的方法，这样增加了提取病毒基因组的繁琐步骤，且病毒基因组的纯度及完整性对同源重组效率影响较大。
(2)本发明所构建的伪狂犬病毒流行株gI/gE基因缺失突变株与其他流行株gI/gE基因缺失突变株相比，缺失区域更大，达2683nt，可以更大限度地接近Bartha-K61株的缺失区域，以提高对猪的安全性，有望作为一种新的弱毒疫苗候选株用于猪伪狂犬病毒变异株的防控。
(3)本发明提供了一种猪伪狂犬病毒gI/gE基因缺失灭活疫苗，该疫苗具有较好的安全性和良好的免疫原性，并可用现有的PRV gE鉴别诊断方法区分野毒感染动物与疫苗免疫动物，有望作为基因工程灭活疫苗应用于对猪伪狂犬病毒变异株的防制。
附图说明
图1是重组质粒pMD-LA-RA的酶切鉴定结果图；其中，M：DL 5000DNAMarker，1：pMD-LA-RA/Pst I+HindШ。
图2是EGFP基因表达盒的PCR扩增结果图；其中，M：DL5000DNA Marker，1：阴性对照，2：EGFP基因表达盒。
图3是重组质粒pMD-LA-EGFP-RA的EcoR V单酶切鉴定结果图；其中，M：1kb DNALadder(Dye Plus)，1：pMD-LA-EGFP-RA/EcoR V。
图4是重组质粒pMD-LA-EGFP-RA转染BHK-21细胞后的绿色荧光图(200×)。
图5是EGFP基因表达盒的PCR鉴定结果图；其中，M：DL 5000DNA Marker，1：pEGFP-N1，2：阴性对照。
图6是重组病毒PRV AH gI-/gE-基因组DNA的gE缺失片段检测结果图；其中，M：DL5000DNA Marker，1～3：PRV AH gI-/gE-基因组DNA，4：伪狂犬病毒变异株PRV AH-China-2013株阳性对照，5：阴性对照。
图7是重组病毒PRV AH gI-/gE-的纯化分析图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例中，
病毒与细胞：亲本毒株伪狂犬病毒变异株PRV AH-China-2013株(经鉴定属于高毒力抗原变异株)(向柯宇.伪狂犬病病毒新流行株主要糖蛋白的分子特征分析及gE缺失转移质粒的构建[D].华南农业大学,2016.)，由华南农业大学兽医学院微生物教研室于2013年分离自我国安徽某发病猪群的流产仔猪；伪狂犬病毒经典毒株PRV鄂A株(陈焕春,方六荣.猪伪狂犬病病毒鄂A株的分离鉴定[J].畜牧兽医学报,1998,28(xm):156-161.)由华南农业大学兽医学院微生物教研室保存，BHK-21细胞购自ATCC细胞库。
菌株和质粒：E.coli DH5α工程菌购自TaKaRa公司；pEGFP-N1荧光质粒购自美Clontech公司；pMDTM18-T Vector Cloning Kit购自TaKaRa公司。
动物：4周龄和6周龄SPF级雌性昆明小鼠，均购自南方医科大学实验动物中心。
工具酶与试剂：限制性内切酶HindШ、Pst I、EcoR V均购自TaKaRa公司；DNAMarker均购自Tsingke公司；2000Reagent购自Invitrogen公司；低熔点琼脂糖购自Sigma公司；质粒抽提试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒购自OMEGA公司；DMEM细胞营养液与胎牛血清购自Gibco公司；所用引物均由生工生物(上海)有限公司合成。
实施例1 重组载体的构建
(1)重组转移质粒pMD-LA-RA和pMD-LA-EGFP-RA的构建
①根据GenBank登录的PRV ZJ01株基因序列(登录号：KM061380.1)，以伪狂犬病毒变异株PRV AH-China-2013株为模板，设计2对引物LA-F/LA-R与RA-F/RA-R(表1)，分别用来扩增位于gI基因和gE基因两侧(含部分gI和gE基因)的可用于同源重组的左臂片段(简称LA)和右臂片段(简称RA)。其中LA包括部分gD基因和部分gI基因，RA包括部分gE基因、全部的US9基因和部分US2基因；
②将LA片段与pMD18-T载体连接，然后进行转化、筛选、抽提质粒，得到重组质粒pMD-LA，将重组质粒pMD-LA与RA片段分别用限制性内切酶HindШ和Pst I进行双酶切，将两种双酶切产物进行连接、转化、筛选、抽提质粒，得到重组质粒pMD-LA-RA，抽提的重组质粒再次用限制性内切酶HindШ和Pst I进行双酶切鉴定(图1)，以确保重组质粒pMD-LA-RA连接的准确性；
③以荧光质粒pEGFP-N1为模板，设计引物EGFP-F1/EGFP-R1(表1)，在其上下游引物的5＇端各引入1个EcoR V酶切位点，扩增区域包含完整表达盒的荧光基因序列，作为筛选标记，并进行胶回收，获得EGFP目的片段(图2)。将重组质粒pMD-LA-RA和EGFP回收产物分别用限制性内切酶EcoR V进行单酶切并做胶回收，进一步对线性化的质粒pMD-LA-RA进行去磷酸化处理；将去磷酸化后的质粒pMD-LA-RA与EGFP目的片段的单酶切产物进行连接、转化、筛选、抽提质粒，并用限制性内切酶EcoR V再次对抽提质粒进行单酶切鉴定，并进行1.0％(w/v)琼脂糖凝胶电泳检测(图3)，得到重组质粒pMD-LA-EGFP-RA。
(2)重组质粒pMD-LA-EGFP-RA的基因表达检测
使用2000Reagent转染试剂，将重组质粒pMD-LA-EGFP-RA转染BHK-21细胞，转染后48h，在荧光显微镜下可见转染细胞表达EGFP绿色荧光蛋白(图4)，故重组质粒pMD-LA-EGFP-RA可以用于下一步重组病毒PRV AH gI-/gE-/EGFP+的构建。
表1 引物序列表
实施例2 重组病毒PRV AH gI-/gE-/EGFP+的构建及纯化
(1)重组病毒PRV AH gI-/gE-/EGFP+的构建
①将伪狂犬病毒变异株PRV AH-China-2013株接种单层的BHK-21细胞，待70％～80％的细胞都产生病变时，将其反复冻融3次，取上清，以除去细胞碎片，得到PRV AH-China-2013株病毒液；
②转染在24孔细胞培养板上进行，待BHK-21细胞长至80％时进行转染。参照2000Reagent转染试剂说明书，将重组质粒pMD-LA-EGFP-RA转染BHK-21细胞，转染4h后，接入不同稀释倍数的步骤①制得的PRV AH-China-2013株病毒液，使质粒与病毒基因组在细胞内发生同源重组，同时设仅含重组质粒pMD-LA-EGFP-RA的对照组；
③PRV AH-China-2013株与pMD-LA-EGFP-RA同源重组48h后，观察转染细胞病变情况及荧光蛋白表达情况。转染细胞经3次冻融后，收取上清，接种到长满BHK-21细胞的60mm细胞培养板中，扩大培养并冻融，收集病毒液，12000r/min离心10min，收取上清；
④将步骤③制得的病毒液稀释后，接种单层的BHK-21细胞。吸附1h后，弃去病毒液，PBS洗3遍，在细胞上铺加含2％琼脂糖和2％FBS的DMEM培养基。4℃放置5min，待其凝固后，将接种细胞移入37℃5％CO2培养箱中培养。每天观察细胞病变情况，2～3d后，在荧光显微镜下可观察到病毒感染细胞形成的空斑，标记并挑取出现绿色荧光的空斑，置于DMEM中，反复冻融3次；将反复冻融后的病毒液做适当稀释后，接种BHK-21细胞，进行下一轮的空斑纯化，挑取出现绿色荧光的空斑；如此反复，经过5轮空斑纯化，所有病变细胞均带有绿色荧光。经PCR鉴定(图5)(鉴定引物为EGFP-F2/EGFP-R2，表1)，表明，获得了重组病毒PRV AHgI-/gE-/EGFP+。
(2)重组病毒PRV AH gI-/gE-的获得
将重组质粒pMD-LA-RA与步骤(1)制得的重组病毒PRV AH gI-/gE-/EGFP+参照步骤(1)进行同源重组及空斑纯化。在利用空斑纯化方法筛选重组病毒PRV AH gI-/gE-时，应在荧光显微镜下标记并挑取不出现绿色荧光的空斑，进行下一轮空斑纯化，如此反复的纯化病毒，直至所有病毒空斑均不出现绿色荧光。提取PRV AH gI-/gE-基因组DNA，用引物EGFP-F2/EGFP-R2和gE-F/gE-R(表1)对该基因缺失病毒PRV AH gI-/gE-进行PCR鉴定(图6)，结果表明基因缺失病毒PRV AH gI-/gE-纯化完全。经荧光显微镜观察，缺失毒株PRV AH gI-/gE-不发绿色荧光，进一步证实重组病毒PRV AH gI-/gE-成功获得(图7)，其中，缺失毒株PRV AHgI-/gE-的gI/gE基因的核苷酸序列为：
5’-GACGGCTCCGCGGGCTCCTCCTCGCCGCCCTGACCCTGGCCGCCCTGACCCCGCGCGTCGGGGGCGTCCTCTTCAGGGGCGCCGGCGTCAGCGTGCACGTCGCCGGCAGCGCCGTCCTCGTGCCCGGCGACGCGCCCAACCTGACGATAGACGGGACGCTGCTGAATCGTCGACCTGCAGGATATCCGGAAGTGACGAATGGACCCAACTATGGCGTGACCGCCAACCGCCTGTTGATGTCCCGCCCCGCTTAAATACCGGGAGAACCGGTCCGCCCGCATTCCGACATGCCCGGCGCCGCCTCCGTCGACATGGAACGGTTTGACCT-3’。
实施例3 猪伪狂犬病毒基因缺失灭活疫苗的制备及应用
1.灭活疫苗的制备
BHK-21细胞按常规方法培养，以1MOI PRV AH gI-/gE-病毒感染细胞，当细胞病变达90％时收获病毒，反复冻融3次，测定病毒液的TCID50为10-7.25/100μL。
灭活剂β-丙内酯:病毒液＝1:2000(体积比)混合均匀，4℃放置24h，期间，要不定时摇匀，以确保病毒能完全灭活，37℃水浴锅放置2h，终止灭活，进行病毒灭活效果检测及无菌检测：
(1)病毒灭活效果检测：按常规接毒方法，将灭活病毒在BHK-21细胞上盲传3代，观察细胞有无病变。结果均未出现病变，则病毒灭活完全。
(2)无菌检测：将500μL灭活病毒加入到5mL不含任何抗生素的LB液体培养基中，置于37℃恒温摇床过夜，观察培养基有无浑浊变化。试验结果表明，培养基未出现任何肉眼可见的浑浊现象。
根据收获病毒液的毒价，将灭活后的病毒液进行稀释，稀释后的病毒液与Montanide gel佐剂的体积比为9:1，使病毒最终含量分别为106.0TCID50/mL、107.0TCID50/mL。佐剂装入干净玻璃瓶内，121℃高压30min，待其冷却至室温后，在超净台内，将灭活后的病毒倒入佐剂瓶内，封口，磁力搅拌30min以上。分装，短期内4℃保存。
2.灭活疫苗PRV AH gI-/gE-的免疫效力评价
(1)病毒LD50的测定
①6周龄昆明系雌鼠98只，随机分成13组，每组6只，分别命名为A1、A2、A3、A4组；B1、B2、B3、B4组；C1、C2、C3、C4组和D组。
②用DMEM溶液将基因缺失毒株PRV AH gI-/gE-、亲本毒株PRV AH-China-2013株和PRV经典毒株鄂A株(PRV Ea株)分别依次作10、102、103、104倍稀释。
③A1～A4组分别接种基因缺失毒株PRV AH gI-/gE-稀释后病毒液；B1～B4组分别接种亲本毒株PRV AH-China-2013株稀释后的病毒液；C1～C4组分别接种PRV经典毒株鄂A株稀释后的病毒液；D组每只接种DMEM，作为阴性对照；以上各组接种量均为100μL/只。
④不同攻毒组小鼠做好隔离措施。
⑤接种后，每天观察小鼠的临床症状和死亡情况，并做详细记录。
根据试验结果，采用改良寇氏法计算出病毒的LD50，PRV鄂A株、PRV AH-China-2013株和基因缺失毒株PRV AH gI-/gE-的LD50分别是102.5TCID50、103.0TCID50、104.3TCID50。与亲本毒株PRV AH-China-2013株相比，重组病毒PRV AH gI-/gE-株的LD50明显升高，说明基因缺失毒株PRV AH gI-/gE-的毒力明显降低(表2)。
(2)动物免疫及攻毒实验
①4周龄昆明雌鼠56只，随机分成A、B、C、D、E、F、G 7组，每组8只。
②A、B组每只肌肉注射100μL病毒含量为105.0TCID50的PRV AH gI-/gE-灭活疫苗；C、D组每只肌肉注射100μL病毒含量为106.0TCID50的PRV AH gI-/gE-灭活疫苗；E、F组作为攻毒对照组，与A、B、C、D组同时攻毒；G组作为空白对照组。
③首免后4周，各组用首免时的相同剂量进行二次免疫。
④于首免前，首免后2周、4周，二免后每隔1周，各采血一次，检测血清的PRV中和抗体水平。
⑤二免后4周，A、C、E组肌肉注射100μL含100LD50的PRV AH-China-2013株病毒液，B、D、F组肌肉注射100μL含100LD50的伪狂犬经典株PRV鄂A株病毒液，G组不做任何注射。
⑥攻毒后，每天观察小鼠的活动状态及攻毒后的症状和死亡情况，并作详细记录。
二免后3周，105.0TCID50、106.0TCID50PRV AH gI-/gE-免疫组血清中和抗体水平最高可达7.35±2.70、19.13±13.08。二免攻毒后，免疫剂量为105.0TCID50/只的小鼠经PRV AH-China-2013株攻毒后保护率为62.5％(5/8)，经PRV经典株鄂A株攻毒后保护率为50％(4/8)；免疫剂量为106.0TCID50/只的小鼠经PRV AH-China-2013株、PRV经典株鄂A株攻毒后全部存活，保护率均为100％(8/8)，表明106.0TCID50的PRV AH gI-/gE-灭活疫苗免疫小鼠对致死剂量PRV AH-China-2013株、PRV经典株鄂A株均可获得完全保护，结果见表3。
实验结果表明，基因缺失毒株PRV AH gI-/gE-灭活疫苗具有良好的免疫原性，有望作为一种新的疫苗候选株用于PRV流行株的防控。
表2 不同毒株攻毒后小鼠死亡情况
“-”表示无小鼠死亡
表3 二免攻毒后各组小鼠存活情况
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 华南农业大学
<120> 伪狂犬病毒流行株gI/gE基因缺失突变株及构建和应用
<130> 1
<160> 11
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 328
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 突变株的gI/gE基因的核苷酸序列
<400> 1
gacggctccg cgggctcctc ctcgccgccc tgaccctggc cgccctgacc ccgcgcgtcg 60
ggggcgtcct cttcaggggc gccggcgtca gcgtgcacgt cgccggcagc gccgtcctcg 120
tgcccggcga cgcgcccaac ctgacgatag acgggacgct gctgaatcgt cgacctgcag 180
gatatccgga agtgacgaat ggacccaact atggcgtgac cgccaaccgc ctgttgatgt 240
cccgccccgc ttaaataccg ggagaaccgg tccgcccgca ttccgacatg cccggcgccg 300
cctccgtcga catggaacgg tttgacct 328
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物LA-F
<400> 2
ccgaccagca ccgcacgtac aagtt 25
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物LA-R
<400> 3
cagcagcgtc ccgtctatcg t 21
<210> 4
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物RA-F
<400> 4
aaactgcagg atatccggaa gtgacgaatg g 31
<210> 5
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物RA-R
<400> 5
ctcggtggtg atgtagaaaa gcttggg 27
<210> 6
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物EGFP-F1
<400> 6
aacgatatcg tttaaacgtt ctttcctgcg ttatcc 36
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物EGFP-R1
<400> 7
aacgatatca accctatctc ggtctattct 30
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物EGFP-F2
<400> 8
gtggatagcg gtttgactc 19
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物EGFP-R2
<400> 9
caccttgatg ccgttctt 18
<210> 10
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物gE-F
<400> 10
gtgatgaccc acaacgg 17
<210> 11
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物gE-R
<400> 11
gcacgcagag ccagat 16

Claims (10)

1.一种伪狂犬病毒流行株gI/gE基因缺失突变株，其特征在于：为将伪狂犬病毒变异株的gI基因的后半部分、gI和gE之间的连接序列以及gE基因的前半部共计三部分敲除后得到；
所述突变株的gI/gE基因的核苷酸序列为：
5’-GACGGCTCCGCGGGCTCCTCCTCGCCGCCCTGACCCTGGCCGCCCTGACCCCGCGCGTCGGGGGCGTCCTCTTCAGGGGCGCCGGCGTCAGCGTGCACGTCGCCGGCAGCGCCGTCCTCGTGCCCGGCGACGCGCCCAACCTGACGATAGACGGGACGCTGCTGAATCGTCGACCTGCAGGATATCCGGAAGTGACGAATGGACCCAACTATGGCGTGACCGCCAACCGCCTGTTGATGTCCCGCCCCGCTTAAATACCGGGAGAACCGGTCCGCCCGCATTCCGACATGCCCGGCGCCGCCTCCGTCGACATGGAACGGTTTGACCT-3’；
所述的伪狂犬病毒变异株为伪狂犬病毒变异株PRV AH-China-2013株。
2.权利要求1所述的伪狂犬病毒流行株gI/gE基因缺失突变株的构建方法，其特征在于包含如下步骤：
(1)根据PRV ZJ01株基因序列，以伪狂犬病毒变异株PRV AH-China-2013株为模板，设计2对引物，LA-F/LA-R与RA-F/RA-R，分别扩增位于gI基因和gE基因两侧的可用于同源重组的左臂片段LA和右臂片段RA；其中，LA包括部分gD基因和部分gI基因，RA包括部分gE基因、全部的US9基因和部分US2基因；
(2)将步骤(1)扩增得到的LA片段与pMD18-T载体连接，得到重组质粒pMD-LA；将重组质粒pMD-LA与步骤(1)扩增得到的RA片段分别用限制性内切酶HindШ和PstI进行双酶切，将酶切后的pMD-LA与酶切后的RA片段进行连接，得到重组质粒pMD-LA-RA；
(3)以质粒pEGFP-N1为模板，设计引物EGFP-F1和EGFP-R1，扩增得到EGFP完整表达盒；
(4)将步骤(2)制得的重组质粒pMD-LA-RA和步骤(3)扩增得到的EGFP完整表达盒分别用限制性内切酶EcoR V进行单酶切，对酶切后的pMD-LA-RA进行去磷酸化处理，将去磷酸化后的pMD-LA-RA与酶切后的EGFP完整表达盒连接，得到重组质粒pMD-LA-EGFP-RA；
(5)将步骤(4)制得的重组质粒pMD-LA-EGFP-RA转染BHK-21细胞，然后再以伪狂犬病毒变异株PRV AH-China-2013株感染已转染的BHK-21细胞，使重组质粒pMD-LA-EGFP-RA与PRVAH-China-2013株基因组在细胞内发生同源重组，以EGFP为筛选标记，通过空斑纯化筛选出现绿色荧光的空斑即可获得重组病毒PRV AH gI-/gE-/EGFP+；
(6)将步骤(2)制得的重组质粒pMD-LA-RA转染BHK-21细胞，然后再以步骤(5)制得的重组病毒PRV AH gI-/gE-/EGFP+感染已转染的BHK-21细胞，使重组质粒pMD-LA-RA与PRV AHgI-/gE-/EGFP+基因组在细胞内发生同源重组，以EGFP为筛选标记，通过空斑纯化筛选不出现绿色荧光的空斑即可获得重组病毒PRV AH gI-/gE-，此即为伪狂犬病毒流行株gI/gE基因缺失突变株；
其中，引物LA-F、LA-R、RA-F、RA-R、EGFP-F1和EGFP-R1序列如下所示：
3.权利要求1所述的伪狂犬病毒流行株gI/gE基因缺失突变株在制备伪狂犬病毒灭活疫苗中的应用。
4.一种猪伪狂犬病毒基因缺失灭活疫苗，其特征在于：包含权利要求1所述的伪狂犬病毒流行株gI/gE基因缺失突变株。
5.根据权利要求4所述的猪伪狂犬病毒基因缺失灭活疫苗，其特征在于：包含权利要求1所述的伪狂犬病毒流行株gI/gE基因缺失突变株、佐剂和灭活剂。
6.根据权利要求5所述的猪伪狂犬病毒基因缺失灭活疫苗，其特征在于：
所述的灭活剂为β-丙内酯。
7.根据权利要求6所述的猪伪狂犬病毒基因缺失灭活疫苗，其特征在于：
所述的伪狂犬病毒流行株gI/gE基因缺失突变株的TCID50为10-7.25/100μL，灭活剂与伪狂犬病毒流行株gI/gE基因缺失突变株的体积比为1:2000。
8.根据权利要求5所述的猪伪狂犬病毒基因缺失灭活疫苗，其特征在于：
所述的佐剂为Montanide gel佐剂。
9.根据权利要求8所述的猪伪狂犬病毒基因缺失灭活疫苗，其特征在于：
所述的伪狂犬病毒流行株gI/gE基因缺失突变株与灭活剂混合灭活后，将灭活后的病毒液进行稀释，稀释后的病毒液与Montanide gel佐剂的体积比为9:1，病毒最终含量为106.0TCID50～107.0TCID50/mL。
10.权利要求4～9任一项所述的的猪伪狂犬病毒基因缺失灭活疫苗的制备方法，其特征在于包含如下步骤：
(1)以1MOI的权利要求1所述的伪狂犬病毒流行株gI/gE基因缺失突变株感染BHK-21细胞，当细胞病变达90％时收获病毒，反复冻融3次，收集病毒液，12000r/min离心10min，取上清，以除去细胞碎片，测定病毒液的TCID50为10-7.25/100μL；
(2)灭活剂β-丙内酯和步骤(1)制得的病毒液按照体积比1:2000混合均匀，4℃放置24h，期间，要不定时摇匀，以确保病毒能完全灭活；然后37℃水浴放置2h，终止灭活；
(3)将灭活后的病毒液进行稀释，稀释后的病毒液与Montanide gel佐剂按照体积比9:1混合，搅拌30min以上，得到猪伪狂犬病毒基因缺失灭活疫苗。
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