CN103981153B - 伪狂犬病病毒双荧光标记缺失病毒的构建 - Google Patents

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本发明涉及一种伪狂犬病病毒双荧光标记缺失病毒的构建。该病毒以自行分离的一株伪狂犬病病毒(SX株)为母本，通过分子生物学、细胞生物学等手段，缺失gE基因、gI基因、US9基因和TK基因，并以绿色荧光蛋白(GFP)和红色荧光蛋白(RFP)作为标记蛋白代替缺失的基因，获得双荧光标记的缺失病毒rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/TKˉ/GFP+/RFP+；以该双荧光标记缺失病毒作为活载体的成功构建，为研制重组伪狂犬病基因工程疫苗奠定了基础。

Description

伪狂犬病病毒双荧光标记缺失病毒的构建
技术领域
本发明涉及一种伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)双荧光标记基因缺失病毒(rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/TKˉ/GFP+/RFP+)的构建，属于生物技术和动物病毒学领域。
背景技术
伪狂犬病(Pseudorabies，PR；又名Aujeszky’s disease，AD)是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)引起的一种急性传染病，可感染多种家畜、伴侣动物及野生动物。猪是感染后可以存活的唯一物种，也是贮存宿主。感染猪主要表现为神经症状、流涎、呼吸困难、母猪繁殖障碍、仔猪高死亡率等，给养猪业造成巨大的经济损失。
PRV是疱疹病毒科、α疱疹病毒亚科、水痘病毒属的成员，与其同属的还有I型牛疱疹病毒(BHV-1)、马疱疹病毒(EHV)以及水痘带状疱疹病毒(VSV)。PRV基因组为线性双股DNA，约145Kb，由长独特区(UL)和短独特区(US)及US两侧的末端倒转重复(TR)与内部重复(IR)组成，可编码70-100种蛋白质，成熟的病毒粒子约有50种蛋白。在上述基因产物中，UL区段中的gC、TK及US区段中的PK、gG、gI、gE、11K和28K为病毒增殖的非必需成份，一般认为，TK、gC、gE、PK和CP(衣壳蛋白)等与PRV毒力相关。
疫苗免疫接种是防制伪狂犬病的主要策略。伪狂犬疫苗主要分为三种：一是常规疫苗，即灭活疫苗和弱毒活疫苗，如目前应用较多的Bartha-K61株活疫苗；二是基因缺失疫苗，即通过分子生物学方法，人工缺失某些基因，使其毒力减弱的同时又保留其免疫原性。目前构建的伪狂犬病病毒基因工程疫苗大多为TK、gI、gE、gG基因的单基因缺失或多基因缺失突变株。目前在我国批准生产使用的有TK和gG双基因缺失株(HB98株)活疫苗。PRV作为基因工程载体具备相当的优势：(1)PRV不感染人，具有很好的安全性。现有的活疫苗株Bartha-K61或‘783’等在世界上已应用了几十年，未发生重大的安全事故。(2)基因组容量大：在PRV长达145Kb的基因组中，约一半基因被认为是非必需的，如gI、gE、gM、TK、PK、gC和dUTPase等，在这些区域可先后或同时插入和表达多种外源基因而不显著影响其繁殖及免疫原性。(3)生产原材料来源方便，生产成本低：PRV疫苗可以接种SPF鸡胚成纤维细胞及PK15、ST等传代细胞生产，原材料充足，生产工艺成熟，且PRV病毒滴度很容易达到免疫要求，大大降低了生产成本。(4)免疫期长：PRV以细胞免疫为主，病毒可以较长时间感染，外源基因可以在体内持续表达。(5)宿主范围广，多种家畜、经济动物(如狐和貂)、伴侣动物及野生动物均可感染PRV，可研制针对不同动物的活载体疫苗。
发明内容
本发明的目的是将自行分离并经鉴定命名为SX株的伪狂犬病病毒作为母本，经基因工程方法构建缺失gE、gI、US9和TK基因并插入GFP和RFP标记的重组病毒；并以该重组病毒作为伪狂犬活病毒载体系统，用于基因工程疫苗的开发和应用。
本发明的技术方案
1.一种伪狂犬病病毒双荧光标记缺失病毒(rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/TKˉ/GFP+/RFP+)，其特征在于，所表述的毒株同时缺失了gE基因、gI基因、US9基因和TK基因四种伪狂犬病病毒基因，在基因缺失的部位通过同源重组分别插入绿色荧光蛋白(GFP)基因和红色荧光蛋白(RFP)基因作为标记物，命名为伪狂犬病病毒双荧光标记缺失病毒rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/TKˉ/GFP+/RFP+株，该毒株已于2014年05月06日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.8879。
2.如权利要求1所述的双荧光标记的伪狂犬缺失病毒的构建方法，其特征在于该毒株构建的步骤为：
(1)分离和鉴定亲本毒株，命名为PRV SX株；
(2)转移载体的构建，以pMD-18T克隆载体为骨架载体，构建两种转移载体：第一种转移载体为pMD-US6-GFP-US2，插入伪狂犬病病毒gI、gE和US9两端的US6和US2部分基因序列作为同源臂，左右同源臂间插入GFP基因；第二种转移载体为pMD-UL24-RFP-UL22，插入伪狂犬病病毒TK基因两端的UL24和UL22部分基因序列作为同源臂，左右同源臂间插入RFP基因；
(3)双荧光标记缺失病毒的构建，pMD-US6-GFP-US2转移载体与亲本株PRVSX株共转染PK15细胞，通过克隆筛选，获得含GFP标记蛋白的缺失病毒rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/GFP+；进而，再与pMD-UL24-RFP-UL22转移载体共转染PK15细胞，通过克隆筛选获得双荧光标记缺失病毒rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/TKˉ/GFP+/RFP+株。
3.权利要求包含如权利要求1所述的伪狂犬病病毒双荧光标记缺失病毒在基因工程疫苗研制方面的应用，其特征在于rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/TKˉ/GFP+/RFP+株作为活载体病毒可插入一种和/或多种动物病原抗原基因，以获得表达外源基因的重组病毒，制备基因工程活载体疫苗，达到同时防制多种疾病的目的。
本发明技术路线如下：
1.从我国山西疑似PRV感染的病死猪中采集脑组织，提取DNA，利用PRV特异性引物进行PCR鉴定。将阳性脑组织进行冻融、离心、过滤等处理后接种PK15细胞进行病毒分离，并通过PCR方法、序列测定、特异性血清中和试验等手段进行鉴定。试验结果表明成功分离到一株PRV毒株，命名为SX株，PCR鉴定为PRV阳性，基因序列测定结果与GenBank上发表的PRV序列同源性在95％以上。该毒株能被PRV特异性阳性血清中和。
2.通过基因克隆技术以PRV(SX株)部分US6和US2基因序列作为同源臂，以及绿色荧光蛋白基因GFP作为筛选标记构建转移载体pMD-US6-GFP-US2，将PRV(SX株)病毒和转移载体共转染PK15细胞获得缺失gE、gI和US9基因，同时插入GFP标记的重组病毒rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/GFP+。
3.以TK基因两测的UL24和UL22部分基因序列为同源臂，以红色荧光蛋白基因(RFP)作为筛选标记构建转移载体pMD-UL24-RFP-UL22，将其与rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/GFP+病毒共转染PK15细胞获得缺失TK基因同时插入RFP标记的重组病毒rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/TKˉ/GFP+/RFP+。
4.对重组病毒rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/TKˉ/GFP+/RFP+进行生物特性分析，试验结果表明该重组病毒能在PK15细胞上稳定遗传，对小鼠安全。
具体实施方式
一、伪狂犬病病毒(SX株)的分离与鉴定
1.病料处理无菌取PRV阳性脑组织(采自我国山西某猪场，经PRV特异性引物gI-F/gI-R(序列1/序列2)鉴定为PRV阳性，与PBS以1:10(V/V)比例匀浆，反复冻融3次，5000r/min离心30min，加入青链霉素各1000U/ml，4℃作用过夜，经0.45μm滤膜过滤除菌，-70℃保存备用，引物序列如下：
gI-F5’-CGGCTGCTGTTCGTCTCG-3’(序列1)，
gI-R5’-TCGTCGCCGTTGAGGTCGC-3’(序列2)。
2.细胞培养取经以上过滤除菌的病料滤液接种PK15细胞(中国兽医微生物菌种保藏管理中心提供)，37℃培养，连续传代观察，盲传2代后接种细胞开始出现细胞圆缩，逐步空泡化的典型细胞病变。当细胞病变达80％时收获感染的细胞培养液(分离物)并连续传代以适应细胞生长。
3.分离物的鉴定
(1)病毒含量测定将分离毒株做10倍系列稀释，取10-1～10-10接种于已长成良好细胞单层的PK15细胞(由中国兽医微生物菌种保藏管理中心提供)96孔细胞板，每个稀释度接种6孔，每孔接种0.1ml，同时设正常细胞对照。置37℃，含5％CO2培养箱中培养，连续观察3～5日，记录每个稀释度CPE数，按Reed-Muench法计算分离毒株TCID50，该毒株在PK15细胞中繁殖滴度可达106.5TCID50/0.1ml。
(2)中和试验将分离毒株病毒液(分离物)稀释至200TCID50/0.1ml，与等体积的PRV阴性血清或阳性血清(来自中国兽医菌种保藏中心)混合，37℃作用1小时后接种已长成良好PK15细胞单层的96孔细胞板，每个中和样品接种6孔，每孔0.1ml，同时设立正常细胞对照。培养观察5日，记录每个处理样品的CPE数。结果分离物与阳性血清混合液接种细胞未出现特异性细胞病变，分离物与阴性血清混合液接种细胞出现特异性细胞病变，表明该分离物能被PRV特异性阳性血清中和。
(3)分离毒株PCR鉴定及主要基因的序列测定
根据GenBank上PRV序列，自行设计PRV gE、gI、TK基因扩增引物，PCR扩增分离毒株的相应片段并进行序列测定。经序列测定分析证实，该毒株与GenBank上登录的PRV各主要基因片段的同源性均在95％以上，以上引物序列如下：
gE-F5’-AGACCATGCGGCCCTTTCTG-3’(序列3)
gE-R5’-CGACAGCGAGCAGATGACCAG-3’(序列4)
TK-F5’-GACACGGTGGCCGGTATTTACG-3’(序列5)
TK-R5’-GGTGACGGGCACGGCAAACT-3’(序列6)
二、伪狂犬病病毒双荧光标记缺失病毒(rPRV/gE-/gI-/US9-/TK-/GPF+/RFP+)的构建
1.载体
pMD-18T载体，用于克隆测序及转移载体的构建，购自宝生物工程(大连)有限公司。含有GFP基因的载体pU-EGFP和含有RFP基因的载体pU-ERFP，均由本实验室保存。
2.引物设计
根据GenBank上发表的PRV序列设计合成以下引物：
扩增gI基因左同源臂：
US6F：5’-GACTTAAGGATCTCCGACCCGCAGGTGG-3’(序列7)
US6R：5’-GACTTAAGGGAGCCGGGTCACGTCGCGC G-3’(序列8)
US9基因右同源臂：
US2F：5’-GACTAGTATGGGGGTGACGGCCATCAC-3’(序列9)
US2R：5’-GACTAGTCGGAGAGATCCTGCCGTCTAGG-3’(序列10)
GFP基因：
EGFP-F：5’-GGTATACGGATCCAAGGAGATATAACA-3’(序列11)
EGFP-R：5’-GACTAGTGAGCTCTTAAAGCTCATCAT-3’(序列12)
US9基因：
PUS9-F：5’-AGAAACCGGAAGTGACGAATGG-3’(序列13)
PUS9-R：5’-AGGAGCACCTGGTCGCAGAG-3’(序列14)
TK基因左同源臂：
UL24F：5’-GGTATACCCGTGGTCGTCACGCCCATGAA-3’(序列15)
UL24R：5’-G GTATACATGCGCATCCCGGCGCGCTTC-3’(序列16)
TK基因右同源臂：
UL22F：5’-GACTAGTATGCCCGCGTCGTCCGTGCGC-3’(序列17)
UL22R：5’-GACTAGTGCGGTACGCCTCGGCGACGGT-3’(序列18)
RFP基因：
RFP-F：5’-GGTATACATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3’(序列19)
RFP-R：5’-GACTAGTTTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3’(序列20)
3.含GFP标记的伪狂犬缺失病毒(rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/GFP+)的构建
(1)转移载体pMD-US6-GFP-US2的构建
以PRV(SX株)基因组为模板，采用引物US6F/R和US2F/R分别扩增gE、gI、US9缺失的同源重组左同源臂和右同源臂；以pU-EGFP为模板，用引物EGFP-F/EGFP-R扩增GFP基因。扩增目的片段分别连接pMD-18T载体，构建相应的重组质粒。以SbfI/AflII双酶切左臂，以SpeI/EcoRI双酶切右臂，回收相应片段后依次与pMD-GFP质粒相应酶切后的片段连接，获得转移载体pMD-US6-GFP-US2。
(2)同源重组
将转移载体pMD-US6-GFP-US2与PRV(SX株)亲本株共转染PK15细胞，按照LipofectamineTM2000转染试剂盒说明书(见附件1)进行转染。转染24小时后，观察细胞病变及荧光蛋白表达情况。转染细胞裂解后盲传两代，仍有绿色荧光表达，初步判断重组病毒拯救成功。
(3)重组病毒的蚀斑纯化
将初步获得的重组病毒接种已长成良好细胞单层的PK15细胞6孔细胞板，吸附1小时后，弃去吸附液，铺上1％的低熔点琼脂糖，继续培养。接种48小时后在荧光显微镜下观察绿色荧光，挑选单个荧光蚀斑于1mlDMEM营养液中，冻融1次后，如此进行蚀斑纯化3～4次，将获得的重组病毒命名为rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/GFP+。
(4)重组病毒rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/GFP+的鉴定
采用gE、gI、US9和GFP基因特异性引物进行PCR扩增鉴定，结果发现未扩增出gE、gI和US9片段，扩增出GFP片段。经测序证实，重组病毒缺失了gE、gI和US9三段基因，并成功插入了GFP标记基因。
2.伪狂犬病病毒双荧光标记缺失病毒(rPRV/gE-/gI-/US9-/TK-/GFP+/RFP+)的构建
(1)转移载体的构建
以PRV(SX株)基因组为模板，采用引物UL24F/R和UL22F/R分别扩增TK缺失的同源重组左同源臂和右同源臂；以pU-RFP为模板，用引物RFP-F/RFP-R扩增RFP基因。扩增目的片段分别连接pMD-18T载体，构建相应的重组质粒。以SbfI/BstZ17I双酶切左臂，以SpeI/EcoRI双酶切右臂，回收相应片段后依次与pMD-RFP质粒相应酶切后的片段连接，获得转移载体pMD-UL24-RFP-UL22。
(2)同源重组
将转移载体pMD-UL24-RFP-UL22与rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/GFP+共转染PK15细胞，按照LipofectamineTM2000转染试剂盒说明书(见附件1)进行转染。转染24小时后，观察细胞病变及荧光蛋白表达情况。转染细胞裂解后盲传两代，仍有绿色和红色双色荧光表达，初步判断重组病毒拯救成功。
(3)重组病毒的蚀斑纯化
将初步获得的重组病毒接种已长成良好细胞单层的PK15细胞6孔细胞板，吸附1小时后，弃去吸附液，铺上1％的低熔点琼脂糖，继续培养。接种48小时后在荧光显微镜下观察荧光，挑选同时表达了绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白的单个荧光蚀斑于1mlDMEM营养液中，冻融1次后，如此进行蚀斑纯化4次，将获得的重组病毒命名为伪狂犬病病毒(Pseudorabiesvirus，PRV)双荧光标记缺失株(rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/TKˉ/GFP+/RFP+)，该株病毒已于2014年05月06日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.8879。
(4)重组病毒rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/TKˉ/GFP+/RFP+的鉴定
采用gE、gI、US9、GFP、TK和RFP基因特异性引物进行PCR扩增鉴定，结果发现未扩增出gE、gI、US9、TK基因片段，扩增出GFP、RFP基因片段。经测序证实，重组病毒缺失了gE、gI、US9、TK基因，并成功插入了GFP、RFP标记基因(见附图3，序列21/序列22)。
(5)重组病毒rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/TKˉ/GFP+/RFP+生物学特性
1)病毒含量测定对重组病毒rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/TKˉ/GFP+/RFP+株病毒进行病毒含量测定。结果发现重组病毒含量可达107.0TCID50/ml。
2)遗传稳定性试验重组病毒rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/TKˉ/GFP+/RFP+株病毒在PK15细胞上传代10代，绿色和红色荧光蛋白均能稳定表达(附图4)，通过PCR鉴定每个代次的病毒液，可检测到插入的GFP基因和RFP基因及插入点两侧的病毒基因序列，表明所获得的重组病毒rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/TKˉ/GFP+/RFP+株病毒能稳定遗传。
3)对小鼠安全性试验将rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/TKˉ/GFP+/RFP+及亲本株SX株分别以106.0TCID50病毒量接种Balb/c小鼠，每组6只，观察14天，结果rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/TKˉ/GFP+/RFP+株病毒接种的小鼠在14天均表现正常，而接种SX株PRV的小鼠全部死亡，取两组小鼠脑组织，病料处理后接种PK15细胞，rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/TKˉ/GFP+/RFP+株病毒组小鼠的脑组织中均能检测到红色荧光和绿色荧光。由此说明，重组病毒rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/TKˉ/GFP+/RFP+毒力较亲本株明显下降，且高剂量攻击小鼠，对小鼠是安全的。
附图说明：
图1发病猪脑组织样品gI基因PCR鉴定结果图中：M：DNAMarker2000；1、脑组织样品；2、阳性对照(PRV疫苗)；3、灭菌水阴性对照
图2分离病毒在PK15细胞上的病变情况图中：A图为用分离病毒接种PK15细胞20小时后细胞开始脱落，出现空泡；B图为正常细胞对照。
图3重组病毒rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/TKˉ/GFP+/RFP+PCR鉴定电泳图中：M：DNAMarkerIV；1、2、3、4分别为重组病毒gE、gI、US9、GFP扩增结果；5、6、7、8分别为亲本毒PRVSX株gE、gI、US9、GFP扩增结果；9、10分别为重组病毒TK、RFP扩增结果；11、12分别为亲本毒SX株TK、RFP扩增结果。
图4rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/TKˉ/GFP+/RFP+感染PK15细胞荧光观察图中：A图为重组病毒接种PK15细胞后在蓝色激发光下观察到的绿色荧光蚀斑；B图为重组病毒接种PK15细胞后在绿色激发光下观察到的与绿色荧光位置相同的红色荧光蚀斑；C图为相同位置绿色和红色两种荧光重叠效果。
本发明涉及的微生物资源信息
本发明涉及的微生物为：伪狂犬病病毒(SX株)，系本申请人自行由山西某猪场采集的病死猪脑组织病料中分离、鉴定而获得；并对此分离病毒经分子生物技术，缺失gE基因、gI基因、US9基因和TK基因，并以绿色荧光蛋白(GFP)和红色荧光蛋白(RFP)作为标记蛋白代替缺失的基因，获得双荧光标记的缺失病毒，命名为伪狂犬病病毒(Pseudorabiesvirus，PRV)双荧光标记缺失病毒(rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/TKˉ/GFP+/RFP+)，该株病毒已于2014年05月06日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.8879。
本发明的积极意义
本发明涉及一种伪狂犬病病毒双荧光标记缺失病毒的构建。该病毒以自行分离的一株伪狂犬病病毒(SX株)为母本，通过分子生物学、细胞生物学等手段，缺失gE基因、gI基因、US9基因和TK基因，并以绿色荧光蛋白(GFP)和红色荧光蛋白(RFP)作为标记蛋白代替缺失的基因，获得双荧光标记的缺失病毒株(rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/TKˉ/GFP+/RFP+)。本发明建立了一套伪狂犬活病毒载体系统；双荧光蛋白标记便于今后基因工程操作的筛选和鉴定；可同时插入多种外源基因，较一般活载体系统更加高效。该双荧光标记缺失病毒作为活载体的成功构建，为研制重组伪狂犬病基因工程疫苗奠定了基础。
实施例
以下实施例为更好说明本发明的技术方案，但不对本发明技术方案构成限制。
实施例1
——伪狂犬病病毒(SX株)的分离与鉴定
1.材料病死猪脑组织，采自我国山西某猪场，经PRV特异性引物gI-F/gI-R(序列1和序列2)，鉴定为PRV阳性(见附图1)。PRV阴性血清、PRV阳性血清、PK15细胞，由中国兽医微生物菌种保藏管理中心提供，本实验室保存；PRV特异性引物gI-F/gI-R的序列如下：
gI-F 5’-CGGCTGCTGTTCGTCTCG-3’(序列1)，
gI-R 5’-TCGTCGCCGTTGAGGTCGC-3’(序列2)。
2.病料处理无菌取PRV阳性脑组织，与PBS以1:10(V/V)比例匀浆，反复冻融3次，5000r/min离心30min，加入青链霉素各1000U/ml，4℃作用过夜，经0.45μm滤膜过滤除菌，-70℃保存备用。
3.细胞培养取经以上过滤除菌的病料滤液接种PK15细胞(中国兽医微生物菌种保藏管理中心提供)，37℃培养，连续传代观察，盲传2代后接种细胞开始出现细胞圆缩，逐步空泡化的典型细胞病变(见附图2)。当细胞病变达80％时收获感染的细胞培养液(分离物)并连续传代以适应细胞生长。
4.分离物的鉴定
(1)病毒含量测定将分离毒株做10倍系列稀释，取10-1～10-10接种于已长成良好细胞单层的PK15细胞96孔细胞板，每个稀释度接种6孔，每孔接种0.1ml，同时设正常细胞对照。置37℃，含5％CO2培养箱中培养，连续观察3～5日，记录每个稀释度CPE数，按Reed-Muench法计算分离毒株TCID50，该毒株在PK15细胞中繁殖滴度可达106.5TCID50/0.1ml。
(2)中和试验将分离毒株病毒液(分离物)稀释至200TCID50/0.1ml，与等体积的PRV阴性血清或阳性血清(来自中国兽医菌种保藏中心)混合，37℃作用1小时后接种已长成良好PK15细胞单层的96孔细胞板，每个中和样品接种6孔，每孔0.1ml，同时设立正常细胞对照。培养观察5日，记录每个处理样品的CPE数。结果分离物与阳性血清混合液接种细胞未出现特异性细胞病变，分离物与阴性血清混合液接种细胞出现特异性细胞病变，表明该分离物能被PRV特异性阳性血清中和。
(3)分离毒株PCR鉴定及主要基因的序列测定
根据GenBank上PRV序列，自行设计PRV gE、gI、TK基因扩增引物(序列3/序列4、序列1/序列2和序列5/序列6)，PCR扩增分离毒株的相应片段并进行序列测定。经序列测定分析证实，该毒株与GenBank上登录的PRV各主要基因片段的同源性均在95％以上，以上引物序列如下：
gI-F 5’-CGGCTGCTGTTCGTCTCG-3’(序列1)，
gI-R 5’-TCGTCGCCGTTGAGGTCGC-3’(序列2)
gE-F5’-AGACCATGCGGCCCTTTCTG-3’(序列3)
gE-R5’-CGACAGCGAGCAGATGACCAG-3’(序列4)
TK-F5’-GACACGGTGGCCGGTATTTACG-3’(序列5)
TK-R5’-GGTGACGGGCACGGCAAACT-3’(序列6)。
实施例2
——伪狂犬病病毒双荧光标记缺失病毒(rPRV/gE-/gI-/US9-/TK-/GPF+/RFP+)的构建
1.载体
pMD-18T载体，用于克隆测序及转移载体的构建，购自宝生物工程(大连)有限公司。含有GFP基因的载体pU-EGFP和含有RFP基因的载体pU-ERFP，均由本实验室保存。
2.引物设计
根据GenBank上发表的PRV序列设计合成以下引物(见表1)：
表1本发明构建所涉及的相关引物信息
3.含GFP标记的伪狂犬缺失病毒(rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/GFP+)的构建
(1)转移载体pMD-US6-GFP-US2的构建
以PRV(SX株)基因组为模板，采用引物US6F/R和US2F/R(序列7/序列8和序列9/序列10)分别扩增gE、gI、US9缺失的同源重组左同源臂和右同源臂；以pU-EGFP为模板，用引物EGFP-F/EGFP-R(序列11/序列12)扩增GFP基因。扩增目的片段分别连接pMD-18T载体，构建相应的重组质粒。以SbfI/AflII双酶切左臂，以SpeI/EcoRI双酶切右臂，回收相应片段后依次与pMD-GFP质粒相应酶切后的片段连接，获得转移载体pMD-US6-GFP-US2。
(2)同源重组
将转移载体pMD-US6-GFP-US2与PRV(SX株)亲本株共转染PK15细胞，按照LipofectamineTM2000转染试剂盒说明书(见附件1)进行转染。操作步骤：
(以6孔板一个孔的用量为例，其他细胞板各试剂用量配比及对应步骤见附件1附表)
1)细胞培养至长成70-90％细胞单层；
2)取适宜体积的2000脂质体(6、9、12或15μl)加入到营养液中，混合均匀；
3)取14μg待转染的质粒(DNA含量应达到0.5～5μg/μl)加入到营养液中，混合均匀；
4)将稀释好的质粒分别与步骤2中稀释好的2000脂质体各150μl等量混合；
5)室温作用5分钟；
6)取250μl混合液加入到准备好的细胞6孔板中，应保证每孔DNA最终含量达到2500ng，每孔脂质体的用量在5～12.5μl。
7)37℃培养箱中培养1～3天后，对转染细胞进行检测。
转染24小时后，观察细胞病变及荧光蛋白表达情况。转染细胞裂解后盲传两代，仍有绿色荧光表达，初步判断重组病毒拯救成功。
(3)重组病毒的蚀斑纯化
将初步获得的重组病毒接种已长成良好细胞单层的PK15细胞6孔细胞板，吸附1小时后，弃去吸附液，铺上1％的低熔点琼脂糖，继续培养。接种48小时后在荧光显微镜下观察绿色荧光，挑选单个荧光蚀斑于1mlDMEM营养液中，冻融1次后，如此进行蚀斑纯化3～4次，将获得的重组病毒命名为rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/GFP+。
(4)重组病毒rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/GFP+的鉴定
采用gE、gI、US9和GFP特异性引物(序列3/序列4，序列1/序列2、序列13/序列14和序列11/序列12)进行PCR扩增鉴定，结果发现未扩增出gE、gI和US9片段，扩增出GFP片段。经测序证实，重组病毒缺失了gE、gI和US9三段基因，并成功插入了GFP标记基因。
2.伪狂犬病病毒双荧光标记缺失病毒(rPRV/gE-/gI-/US9-/TK-/GFP+/RFP+)的构建
(1)转移载体的构建
以PRV(SX株)基因组为模板，采用引物UL24F/R(序列15/序列16)和UL22F/R(序列17/序列18)分别扩增TK缺失的同源重组左同源臂和右同源臂；以pU-RFP为模板，用引物RFP-F/RFP-R(序列19/序列20)扩增RFP基因。扩增目的片段分别连接pMD-18T载体，构建相应的重组质粒。以SbfI/BstZ17I双酶切左臂，以SpeI/EcoRI双酶切右臂，回收相应片段后依次与pMD-RFP质粒相应酶切后的片段连接，获得转移载体pMD-UL24-RFP-UL22。
(2)同源重组
将转移载体pMD-UL24-RFP-UL22与rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/GFP+共转染PK15细胞，按照LipofectamineTM2000转染试剂盒说明书(见附件1)进行转染。操作步骤：
(以6孔板一个孔的用量为例，其他细胞板各试剂用量配比及对应步骤见附件1附表)
1)细胞培养至长成70-90％细胞单层；
2)取适宜体积的2000脂质体(6、9、12或15μl)加入到营养液中，混合均匀；
3)取14μg待转染的质粒(DNA含量应达到0.5～5μg/μl)加入到营养液中，混合均匀；
4)将稀释好的质粒分别与步骤2中稀释好的2000脂质体各150μl等量混合；
5)室温作用5分钟；
6)取250μl混合液加入到准备好的细胞6孔板中，应保证每孔DNA最终含量达到2500ng，每孔脂质体的用量在5～12.5μl。
7)37℃培养箱中培养1～3天后，对转染细胞进行检测。
转染24小时后，观察细胞病变及荧光蛋白表达情况。转染细胞裂解后盲传两代，仍有绿色和红色双色荧光表达，初步判断重组病毒拯救成功。
(3)重组病毒的蚀斑纯化
将初步获得的重组病毒接种已长成良好细胞单层的PK15细胞6孔细胞板，吸附1小时后，弃去吸附液，铺上1％的低熔点琼脂糖，继续培养。接种48小时后在荧光显微镜下观察荧光，挑选同时表达了绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白的单个荧光蚀斑于1mlDMEM营养液中，冻融1次后，如此进行蚀斑纯化4次，将获得的重组病毒命名为伪狂犬病病毒(Pseudorabiesvirus，PRV)双荧光标记缺失株(rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/TKˉ/GFP+/RFP+)，该株病毒已于2014年05月06日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.8879。
(4)重组病毒rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/TKˉ/GFP+/RFP+的鉴定
采用gE、gI、US9、GFP、TK和RFP特异性引物(序列3/序列4、序列1/序列2、序列13/序列14、序列11/序列12、序列5/序列6和序列19/序列20)进行PCR扩增鉴定，结果发现未扩增出gE、gI、US9、TK基因片段，扩增出GFP、RFP基因片段。经测序证实，重组病毒缺失了gE、gI、US9、TK基因，并成功插入了GFP、RFP标记基因(见附图3，序列21/序列22)。
实施例3
——重组病毒rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/TKˉ/GFP+/RFP+生物学特性测定
1.病毒含量测定对重组病毒rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/TKˉ/GFP+/RFP+株病毒进行病毒含量测定。结果发现重组病毒含量可达107.0TCID50/ml。
2.遗传稳定性试验重组病毒rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/TKˉ/GFP+/RFP+株病毒在PK15细胞上传代10代，绿色和红色荧光蛋白均能稳定表达(附图4)，通过PCR鉴定每个代次的病毒液，可检测到插入的GFP基因和RFP基因及插入点两侧的病毒基因序列，表明所获得的重组病毒rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/TKˉ/GFP+/RFP+株病毒能稳定遗传。
3.对小鼠安全性试验将rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/TKˉ/GFP+/RFP+及亲本株SX株分别以106.0TCID50病毒量接种Balb/c小鼠，每组6只，观察14天，结果rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/TKˉ/GFP+/RFP+株病毒接种的小鼠在14天均表现正常，而接种SX株PRV的小鼠全部死亡，取两组小鼠脑组织，病料处理后接种PK15细胞，rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/TKˉ/GFP+/RFP+株病毒组小鼠的脑组织中均能检测到红色荧光和绿色荧光(见表2)。由此说明，重组病毒rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/TKˉ/GFP+/RFP+毒力较亲本株明显下降，且高剂量攻击小鼠，对小鼠是安全的。
表2rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/TKˉ/GFP+/RFP+株对小鼠安全性试验结果
组别 动物数 死亡数 平均死亡时间
亲本株SX株 6 6 96h
rPRV-gEˉ/gIˉ/US9ˉ/TKˉ/GFP+/RFP+株 6 0 /
空白对照组 6 0 /
附件1
LipofectamineTM2000转染试剂盒说明书
操作步骤：
(以6孔板一个孔的用量为例，其他细胞板各试剂用量配比及对应步骤见附表)
1.细胞培养至长成70-90％细胞单层；
2.取适宜体积的2000脂质体(6、9、12或15μl)加入到营养液中，混合均匀；
3.取14μg待转染的质粒(DNA含量应达到0.5～5μg/μl)加入到营养液中，混合均匀；
4.将稀释好的质粒分别与步骤2中稀释好的2000脂质体各150μl等量混合；
5.室温作用5分钟；
6.取250μl混合液加入到准备好的细胞6孔板中，应保证每孔DNA最终含量达到2500ng，每孔脂质体的用量在5～12.5μl。
7.37℃培养箱中培养1～3天后，对转染细胞进行检测。
附表不同细胞板各试剂用量配比及对应步骤

Claims (2)

1.一种伪狂犬病病毒双荧光标记缺失病毒，其特征在于，所表述的伪狂犬病病毒同时缺失了gE基因、gI基因、US9基因和TK基因四种伪狂犬病病毒基因，在基因缺失的部位通过同源重组分别插入GFP基因和RFP基因作为标记物，该毒株被命名为伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus)双荧光标记缺失病毒rPRV/gE-/gI-/US9-/TK-/GFP+/RFP+株，该毒株已于2014年05月06日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.8879。
2.如权利要求1所述伪狂犬病病毒双荧光标记缺失病毒的构建方法，其特征在于该毒株的构建步骤为：
(1)分离和鉴定亲本毒株，命名为PRVSX株；
(2)转移载体的构建，以pMD-18T克隆载体为骨架载体，构建两种转移载体：第一种转移载体为pMD-US6-GFP-US2，插入伪狂犬病病毒gI、gE和US9两端的US6和US2部分基因序列作为同源臂，左右同源臂间插入GFP基因；第二种转移载体为pMD-UL24-RFP-UL22，插入伪狂犬病病毒TK基因两端的UL24和UL22部分基因序列作为同源臂，左右同源臂间插入RFP基因；
(3)双荧光标记缺失病毒的构建，pMD-US6-GFP-US2转移载体与亲本株PRVSX株共转染PK15细胞，通过克隆筛选，获得含GFP标记蛋白的缺失病毒rPRV/gE-/gI-/US9-/GFP+；进而，再与pMD-UL24-RFP-UL22转移载体共转染PK15细胞，通过克隆筛选获得伪狂犬病病毒双荧光标记缺失病毒rPRV/gE-/gI-/US9-/TK-/GFP+/RFP+株。
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