CN1523103A - 一种伪狂犬病TK-/gE-/gI-基因缺失标志活疫苗及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种三基因缺失的重组伪狂犬病毒(Pseudorabies virus，PrV)毒株的构建、用该毒株制备的疫苗、构建该毒株的方法以及制备该疫苗方法，所说的重组伪狂犬病毒株缺失了TK、gE、gI基因，且不含外源基因。所说的疫苗属于含有本发明的病毒液和明胶制成的冻干活疫苗。本发明的重组突变株遗传稳定，不会返强。本发明还包括将所说的活疫苗接种于仔猪、育肥猪、妊娠母猪上，获得了明显的免疫效果。所述疫苗的生物安全性好，适用于伪狂犬病的防制。

Description

一种伪狂犬病TK-/gE-/gI-基因缺失标志活疫苗及制备方法

                                  技术领域

本发明属于动物病毒学技术领域，具体涉及一种人工构建的伪狂犬病毒(Pseudorabies virus，PrV)基因缺失突变株(PrV TK^-/gE^-/gI^-)，利用基因工程方法和DNA重组方法将PrV的主要毒力基因TK和糖蛋白基因gI、gE编码区删除，导致PrV毒力下降，这种基因缺失突变株可以预防伪狂犬病。

本发明还涉及所述的重组伪狂犬病毒基因工程疫苗以及制备该疫苗的方法与应用。

                                  背景技术

伪狂犬病病毒(PrV)属疱疹病毒科a疱疹病毒亚科，具有在细胞培养物上快速生长，强烈的神经嗜性与潜伏感染性等特性(Roizmorn B，Desrosiers R，Flecbenstein B，Lopez C，Minson Ad and studdertMJ.The family Herpesviridae；an update.Arch Virol.1992，123：425-449)。该病可感染猪、牛、羊、犬、猫、家兔、小白鼠、水貂、狐等各种家畜和野生动物。该病在猪呈爆发流行，引起母猪繁殖障碍和仔猪大量死亡，给养猪业造成巨大的经济损失；而在其它动物呈散发形式，但往往呈致死性感染。

疫苗免疫是防制伪狂犬病的根本措施，在伪狂犬病防疫史上首先是灭活疫苗和弱毒疫苗。弱毒疫苗有返强的危险；灭活疫苗剂量大，有副作用，最大的缺点还在于传统的灭活疫苗免疫不能提供血清学标志进行鉴别诊断。随着分子生物学和基因工程技术的发展，人们研制出了基因缺失疫苗。PrV BUK d13突变株是第一次用酶切方法得到的TK基因缺失突变株可保护仔猪免受强毒的攻击，并且免疫猪在攻毒后很少往外排毒(Kit S，Kit M，Pirtle EC.Attenuated properties of thymidine kinase-negative deletionmutant of pseudorabies virus.Am J Vet Res，1985，46：1359-1367)。糖蛋白基因如gE、gG、gC缺失后(Moormann R J M，De Rover T，Briaire J，et al.Inactivation of the thymidine kinase gene ofa gI deletion mutant of pseudorabies virus generates a safe but still highly immunogenic vaccinstrain.J Gen Virol，1990，71：1591-1595)，疫苗免疫猪不产生针对所缺失基因的抗体，结合ELSIA试验可区为疫苗免疫猪和野毒感染猪，从而淘汰野毒感染猪，世界许多国家正是以此原理制定伪狂犬病的根除计划。我国在20世纪90年代末，曾先后研制了伪狂犬病油乳剂灭活疫苗和伪犬病TK-/gG-双基因缺失活疫苗，对伪狂犬病的防制发挥了重要作用(陈焕春等，伪狂犬病病毒鄂A株TK^-/gG^-/LacZ⁺突变株的构建，病毒学报，2001，17(1)，69-74)。除了TK基因外，与伪狂犬病毒毒力有关的基因还有gE、gI等。由于gG基因不是毒力基因，为了进一步降低该毒株的毒力，提高安全性，我们在TK基因缺失的基础上，又缺失了gE、gI基因。郭万柱等(郭万柱等，新型伪狂犬病病毒基因缺失株的构建及生物学特征研究(初报)，四川农业大学学报，2000，18(1)：1-3)以来自发病牛的PrV闽A株为材料，采用外切除缺失法获得的数株PrV TK/g1/gp63/LacZ三基因缺失株。其方法为对已克隆入pBR322中包含伪狂犬病病毒(PrV)胸苷激酶(TK)基因的BamHI-11片段进行改造，经筛选获得4株TK基因缺失重组质粒(PDTK)。用Ncol消化含有伪狂犬病病毒Fa株BamH I-7片段的质粒PBB7。回收目的的片段，经连接并转化E coli DH5a，获得缺失了gI和部分gE基因的重组质粒ppB7-1。将PrV Fa与PPB7-1 DNA共同转染PK15单层细胞，以蚀斑法得到纯化重组病毒株，命名为PFDI-D63基因的重组质粒ppB7-1DNA后，回收大小约6.0kb片段，得到含gI片段的质粒pp63。其转移载体质粒pp63LacZ与PRV基因组DNA一道经同源重组，获得PrV Fag1/gp63/LacZ基因缺失株。以TK缺失重组质粒Pdtk3-6，pDtk5-6DNA与Fa g1/gp63/LacZ株(1-3、3-2、3-3)DNA通过TK143细胞同源重组，获得的数株PrV TK/g1/gp63/LacZ三基因缺失株，分别命名为PrV-SA3214、215、3132、3153、3155。其中SA215TK缺失约200bp、SA214、3132、3135 TK缺失约1100bp。对家兔、猪、山羊、绵羊、黄牛、水牛和犬等动物接种后经临床观察，结果除犬在接种后3天内连续出现39.8℃体温反应外其余畜种均无明显临床反应。采用SPA-ELISA进行抗体水平检测所有动物在第7d后均检测到伪狂犬病抗体且均达到1∶64以上。仔猪在免疫接种后经10⁷PFU伪狂犬病毒鄂A株攻击，百分之百得到保护；在此研究的基础上，研制了狂犬病基因缺失疫苗SA215。其主要过程是先研制g1/gp63/LacZ基因缺失株，再研制TK/g1/gp63/LacZ；其缺陷在于g1/gp63系插入失活而非序列缺失，并且LacZ基因是菌源基因，不是伪狂犬病毒本身的基因，对动物体是否有副作用尚不清楚。

                               发明内容

本发明的任务在于克服现有技术存在的缺陷，利用基因重组方法提供一种TK、gE、gI基因缺失的，不含外源基因的伪狂犬病重组病毒。

本发明的其中一个目的是制备所述病毒的方法。

本发明的其中另一个目的是利用该重组的伪狂犬病病毒制备疫苗及其制备方法。

本发明另一个发明目的是该重组的伪狂犬病病毒疫苗在防制伪狂犬病上特别是在防制猪伪狂犬病病上的应用

本发明通过以下技术方案实现：

一种重组的伪狂犬病毒(Pseudorabies virus)毒株HzauAVL-PrVdTKdgEdg I(CGMCC，保藏日期：2003年7月17日，保藏编号：No.0907)。

所说的重组伪狂犬病毒毒株缺失了TK、gE、gI基因并且不含外源基因。

含有重组的伪狂犬病毒毒株的基因缺失疫苗，其毒株来源于一种重组的伪狂犬病毒(Pseudorabiesvirus)毒株HzauAVL-PrVdTKdgEdgI(CGMCC，No.：CGMCC：0979，保藏日期：2003年7月17日，保藏编号：0907)。所说的的疫苗是活疫苗，其组分按7份伪狂犬病毒毒株：1份明胶比例配制。

制备所述的重组的伪狂犬病毒基因缺失疫苗的方法，其步骤包括：

1)毒株的制备：用gE转移质粒pSPFZ与PrV TK-基因组DNA共转染猪肾传代细胞IBRS-2，在X-gal存在下进行蓝斑筛选，挑取蓝斑进行空斑纯化，空斑纯化三次后获得重组病毒PrV TK^-/gE^-/LacZ⁺突变株；对含有完整gE、gI基因的质粒pSKFB用Stu I和BamH I进行酶切，回收5753bp的片段连接，得到gE/gI缺失转移质粒pFBBS；将质粒pFBBS与EcoR I线性化的PrV TK^-/gE^-/LacZ⁺突变株基因组DNA共转染IBRS-2细胞；经过空斑筛选获得PrV TK^-/gE^-/gI^-突变株。

2)疫苗的制备：用步骤1)得到的突变株在原代鸡胚成纤维细胞上增殖，待转瓶中原代鸡胚成纤维细胞长成单层后，接种所说的PrV TK^-/gE^-/gI^-病毒，37℃吸附1h后，加入含100U/mL的青链霉素的维持液，37℃培养至出现细胞病变，细胞病变后收毒，按病毒液：明胶为7∶1的比例加入明胶，于灭菌冻干瓶中分装，置冷冻干燥机中冻干，冻干36h后压盖，置-20℃保存备用即为所说的疫苗。，其特征在于能够用于防制伪狂犬病。

依据本发明，所说一种缺失了TK、gE、gI基因的重组的伪狂犬病毒疫苗，能够防制伪狂犬病，特别是用于仔猪、育肥猪、妊娠母猪上的伪狂犬病的防制。

本发明的详细技术方案如以下所述：

一、引物设计

根据已发表的LacZ基因序列(周复春等，伪狂犬病病毒鄂A株gG^-/LacZ⁺突变株的构建，畜牧兽医学报，2001，32(2)：134-138)设计合成一对特异性引物P1、P2，扩增片段大小为433bp；根据已发表的TK基因序列(基因登录号为gI：18766872)设计合成一对特异性引物P3、P4，扩增片段大小为948bp；根据已发表的gE基因序列(基因登录号为gI：5764547)设计合成一对特异性引物P5、P6，扩增片段大小为804bp；根据已发表的gI基因序列(基因登录号为gI：12382273)设计合成一对特异性引物P7、P8，扩增gI、gE

P3：5’-TCTGTTCGACACGGGACAG-3’      P4：5’-GGGATGACATACAGATGGC-3’

P5：5’-TTTGGATCCATGCGGCCCTTTCT-3’  P6：5’-TTTGAATTCTTAGTACCAGTCAGCGT-3

P7：5’-TGCTACACGCGCGAGTAC-3’       P8：5’-TTTGAATTCTTAGTACCAGTCAGCGT-3’

            表1 LacZ、TK^-、gE、gE^-/gI^-基因的PCR扩增条件

引物        PCR反应条件               PCR反应条件体系

                                      Template 5.0μL，10×buffer 5.0μL，

            95℃5min，95℃1min，      25mmol/L MgCl₂ 3.0μL，

LacZ        50℃1min，72℃lmin，      2 mmol/L dNTP 1.0μL，

            35cycles，72℃10min       40mmol/L P₃ 0.5μL，40mmol/L P₄ 0.5μL

                                      TaqE 0.5μL，DMSO 2.5μL，H₂O 33μL

                                      Template 5.0μL，10×buffer 5.0μL，

            95℃5min，95℃1min，      25mmol/L MgCl₂ 3.0μL，

TK^-        50℃1min，72℃1min，      2 mmol/L dNTP1.0μL，

            35cycles，72℃10min       40mmol/L P₁ 0.5μL，40mmol/L P₂ 0.5μL

                                      TaqE 0.5μL，DMSO 2.5μL，H₂O 33μL

                                      Template 5.0μL，10×buffer 5.0μL，

                                      25mmol/L MgCl₂ 3.0μL，

            94℃4min，94℃1min

                                      2mmol/LdNTP 1.0μL，

gE          50℃1min，72℃1min

                                      40mmol/L P5 0.5μL，40mmol/L P6 0.5

            35cycles，72℃10min

                                      μL，

                                      TaqE 0.5μL，DMSO 2.5μl，H₂O 33μl

                                      Template 5.0μL，10×buffer 5.0μL，

                                      25mmol/L MgCl₂ 3.0μL，

            94℃4min，94℃1min

                                      2mmol/LdNTP 1.0μL，

gE^-/gI^-  50℃1min，72℃1min        40mmol/L P7 0.5μL，40mmol/L P8 0.5

            35cycles，72℃10min

                                      μL，

                                      TaqE 0.5μL，DMSO 2.5μL，H₂O 33μL

二、伪狂犬病病毒gE、gI双基因缺失转移载体pFBBS的构建

用BstE II和Stu I双酶切质粒pSKFB，弃去1247bp的片断，回收大小为5.7kb的片断，用Klenow酶补平，T4 DNA连接酶连接，得到重组质粒。该质粒包含部分gD基因，部分gI基因，部分gE基因，全部11K基因及部分28K基因，命名为pFBBS。以pFBBS为模版，P7、P8为引物作PCR，得到大小约500bp的片断。回收PCR产物，连入pBluescript IISK(+)中，测序鉴定缺失序列，结果缺失碱基1247个(刘正飞、陈焕春、何启盖等，伪狂犬病病毒Ea株TK-/gE-/gP63-突变株的构建及其生物学特性研究。微生物学报，2002，42(3)：370-374。)。

三、伪狂犬病病毒TK-/gE-/gI-突变株的构建

将质粒pFBBS与EcoR I线性化的伪狂犬病毒鄂A株TK-/gE-/LacZ+突变株基因组DNA共转染IBRS-2细胞。经过空斑筛选获得伪狂犬病毒鄂A株TK^-/gE^-/gI^-突变株。Southern杂交结果显示，伪狂犬病毒鄂A株BamHI-7片断约6.6kb，而伪狂犬病毒鄂A株TK^-/gE^-/gI^-BamHI-7片断约5.5kb，证实gE/gI基因已经缺失。将接毒细胞冻融液进行蛋白质斑点杂交试验，以鼠抗gE单克隆抗体为一抗，以羊抗鼠IgG为二抗，结果伪狂犬病毒鄂A株TK^-/gE^-/gI^-及细胞对照均为阴性，而伪狂犬病毒鄂A株为阳性，证实gE/gI缺失后，突变株不能产生相应的糖蛋白。

四、重组伪狂犬病毒株HzauAVL-PrVdTKdgEdgI的生物学特性

在获得伪狂犬病毒鄂A株TK^-/gE^-/gI^-突变株后，申请人对其生物学特性进行了系统的研究。空斑试验表明，TK、gE及gI缺失后，突变株所形成的空斑小于野毒株伪狂犬病毒鄂A株所形成的空斑。变变株接种猪肾传代细胞PK-15，在连续接种10代时，仍可扩出大小约500bp的gE^-/gI^-片段，表明该突变株遗传稳定，不会返强。

该毒株保藏在中国微生物菌种管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期：2003年7月17日，保藏编号：0907。该毒株的生物学特性如下所述：

该毒株属疱疹病毒科a疱疹病毒亚科猪疱疹病毒I型，病毒粒子呈圆形或椭圆形外观，分子量约9.5×10⁶道尔顿，其核蕊直径为75nm，衣壳壳粒的长度约12nm，宽9nm；位于细胞核内无囊膜的病毒粒子直径约110-150nm，位于胞浆内带囊膜的成熟病毒粒子的直径约180nm。伪狂犬病毒进入宿主细胞的过程可分为三个阶段，即吸附、膜融合、核衣壳释放等，以增殖方式传代。伪狂犬病毒可在猪肾传代细胞上增殖，常用培养基为含有新生牛血清的DMEM(pH7.0)生长液。该病毒可在4℃短期保存，冷冻干燥后可在-70℃下长期保存而不丧失活性。

五、重组伪狂犬病毒疫苗的制备

将伪狂犬病毒鄂A株TK^-/gE^-/gI^-突变株在猪肾传代细胞PK-15上活化一次，待一万毫升转瓶中原代鸡胚成纤维细胞长成单层后，接种病毒40mL/瓶，37℃吸附1h后，加入含100U/mL的青链霉素的维持液，37℃培养至出现细胞病变，细胞病变后收毒，按病毒液∶明胶为1∶1.5的比例加入明胶，于灭菌冻干瓶中按2.5mL/瓶分装，置冷冻干燥机中冻干，冻干36h后压盖，置-20℃保存备用。

六、疫苗的安全性、免疫效力与保护力试验

用该突变株制成的冻干活疫苗接种仔猪、育肥猪、妊娠母猪，用gE-ELISA进行检测。在母源抗体为gE阳性的背景下，免疫仔猪为gE阳性；在母源抗体为gE阴性情况下，仔猪仍为gE阴性。表明gE缺失后，免疫猪血清中不产生针对gE的抗体。普通ELISA试验表明，免疫仔猪的抗体水平显著高于对照组。用几种gE缺失疫苗同时对新生仔猪进行滴鼻接种。结果，伪狂犬病毒鄂A株TK^-/gE^-/gI^-对仔猪较为安全。育肥猪二次免疫后中和抗体水平显著高于一次免疫。用冻干苗接种妊娠二个月的母猪，4周后用10⁷1TCID₅₀的强毒伪狂犬病毒鄂A株攻毒，结果未免疫母猪出现死胎、木乃胎和弱仔，而10⁵TCID₅₀和10⁶TCID₅₀疫苗毒剂量免疫的妊娠母猪产仔正常；未免疫组母猪窝产活仔数平均为10头，免疫组窝产活仔数平均为13头以上，免疫组母猪产仔数显著高于未免疫组。用冻干苗接种小鼠、家兔、猫、狗、山羊、奶山羊，接种剂量分别为10⁵TCID₅₀和10⁶TCID₅₀。疫苗接种动物在试验期内均未出现精神异常或死亡现象，表明该疫苗具有极高的生物安全性。

                                  附图说明

图1显示了pSKFB质粒物理图谱，质粒pSKFB为含有完整gE基因和gI基因的转移质粒

图2显示了伪狂犬病病毒gE、gI双基因缺失转移载体pFBBS鉴定的电泳图谱，1：Stu I酶切质粒pSKFB2：Stu I和BstEII双酶切质粒pSKFB  3：BstEII酶切质粒pFBBS

图3显示了重组病毒PrV TK^-/gE^-/gI^-构建流程

图4显示了重组病毒PrV TK^-/gE^-/gI^- PCR鉴定的电泳图谱，

上排：1，5：PK-15细胞对照  2：质粒pSKFB对照  3，6：重组病毒伪狂犬病毒鄂A株TK^-/gE^-/gI^-4：DL2000 DNA分子量对照  7：pFBBS

下排：1，5：PK-15细胞对照  2：质粒pSPFZ对照  3，6：重组病毒伪狂犬病毒鄂A株TK^-/gE^-/gI^-4：DL2000 DNA分子量对照  7：质粒pUCPB4对照

图5显示了重组病毒PrV TK^-/gE^-/gI^-的Southern杂交鉴定图谱，1：用BamH I酶切重组病毒伪狂犬病毒鄂A株TK^-/gE^-/gI^-DNA后杂交条带  2：用BamH I酶切伪狂犬病毒鄂A株DNA后杂交条带

图6显示了重组病毒TK^-/gE^-/gI^-的蛋白质斑点杂交鉴定图谱，1：PK-15细胞对照，2：伪狂犬病毒鄂A株亲本病毒对照，3：重组病毒PrV TK^-/gE^-/gI^-杂交结果。

图7显示了重组病毒PrV TK^-/gE^-/gI^-的遗传稳定性电泳图谱，1，2，3，4，5，6，7：不同代次重组病毒PrVTK^-/gE^-/gI^-的PCR扩增产物8：阴性对照。

图8显示了重组病毒PrV TK^-/gE^-/gI^-接种细胞后的毒价变化。，

图9显示了PrV TK^-/gE^-/gI^-冻干活疫苗对育肥猪的免疫效力。

以下结合图表和实施例对本发明作进一步的说明。

                          具体实施方式

实施例1

1、伪狂犬病病毒gE、gI双基因缺失转移载体pFBBS的构建：

用BstE II和Stu I双酶切质粒pSKFB，弃去1247bp的片断，回收大小为5.7kb的片断，用Klenow酶补平，T4DNA连接酶连接，得到重组质粒。该质粒包含部分gD基因，部分gI基因，部分gE基因，全部11K基因及部分28K基因，命名为pFBBS。以pFBBS为模版，P7、P8为引物作PCR，得到大小约500bp的片断。回收PCR产物，连入pBluescript IISK(+)中，用双脱氧终止法测序鉴定缺失序列。见附图1、附图2。

2、伪狂犬病病毒鄂A株TK^-/gE^-/gI^-突变株的构建：

将质粒pFBBS与EcoR I线性化的PrV TK^-/gE^-/LacZ⁺突变株基因组DNA共转染IBRS-2细胞。经过空斑筛选获得PrV TK^-/gE^-/gI^-突变株。Southern杂交结果显示，伪狂犬病毒鄂A株BamHI-7片断约6.6kb，而PrV TK^-/gE^-/gI^- BamHI-7片断约5.5kb，证实gE/gI基因已经缺失。将接毒细胞冻融液进行蛋白质斑点杂交试验，以鼠抗gE单克隆抗体为一抗，以羊抗鼠IgG为二抗，结果PrV TK^-/gE^-/gI^-及细胞对照均为阴性，而伪狂犬病毒鄂A株为阳性，证实gE/gI缺失后，突变株不能产生相应的糖蛋白。见附图5、附图6所示。

3、伪狂犬病病毒鄂A株TK^-/gE^-/gI^-突变株生物学特性描述：

(1)遗传稳定性测定：

将PrV TK^-/gE^-/gI^-在PK-15细胞上连续接种10代，用PCR鉴定，结果均能扩出gE^-/gI^-500bp的条带，不能扩出gI/gE 1.8Kb的条带。表明PrV TK^-/gE^-/gI^-在PK-15细胞上稳定遗传而不发生返强。见附图9。

(2)PrV TK^-/gE^-/gI^-增殖特性测定：

测定PrV TK^-/gE^-/gI^-传代细胞冻融液毒价，结果为10^-6.3/0.1ml(1.81×10⁶PFU)。以100μL、10μL、1μL、0.1μL、0.01μL、0.001μL分别接种于长满PK-15细胞的六孔细胞培养板，待出现细胞病变(CPE)后收获上清，分别测定毒价，结果如表1。表1显示，取原液1μL或0.1μL毒价较高。

        表2  接种不同体积PrV TK^-/gE^-/gI^-病毒原液后的毒价变化

病毒原液

             100       10        1         0.1       0.01       0.001

(μL)

TCID₅₀/0.1mL   10^-5.05   10^-6.37   10^-6.81   10^-6.77    10^-6.73     10

-6.68

(3)空斑大小的比较：

将PrV TK^-/gE^-/gI^-与伪狂犬病毒鄂A株分别接毒于长满PK-15细胞的6孔细胞培养板，进行空斑试验，比较二者在48h空斑大小，结果为：PrV TK^-/gE^-/gI^-空斑为0.3-0.7mm；伪狂犬病毒鄂A株空斑为0.6-1.2mm；这表明，gE/gI的缺失，显著影响了伪狂犬病毒鄂A株在细胞上的增殖能力。

4、PrV TK^-/gE^-/gI^-冻干苗制备工艺流程：

冻干苗制备工艺流程：疫苗株的增殖、配苗、冻干、疫苗毒毒价测定。

具体为：疫苗株在猪肾传代细胞上的增殖滴度达到10^6.7TCID₅₀，经过筛选，采用鸡胚成纤维细胞(CEF)增殖疫苗病毒，其增殖滴度达到10^6.3TCID₅₀。将疫苗种毒按1/10的比例接种鸡胚成纤维细胞，细胞病变后收集合格的病毒液，加入明胶保护剂(每100ml去离子水中加蔗糖40g，明胶8g，充分融化后，置高压蒸气灭菌)，冻干制成疫苗，冻干后疫苗毒价不低于10^6.0TCID₅₀/ml。

5、PrV TK^-/gE^-/gI^-冻干苗生物学活性

(1)PrV TK^-/gE^-/gI^-冻干苗保存期试验：

将PrV TK^-/gE^-/gI^-冻干苗分别存放于4℃和-20℃，每隔2个月取出3瓶检测，在PK-15细胞上测定毒价，计算平均值，结果如下。

         表3 PrV TK^-/gE^-/gI^-冻干苗的保存期试验

                病毒滴度(TCID₅₀/0.1ml)保存温度

             0         2月        4月        8月

-20℃       10^-5.22    10^-5.22    10^-5.21    10^-5.19

4℃         10^-5.22    10^-4.17    10^-2.73    0

保存期试验表明，PrV TK^-/gE^-/gI^-冻干苗在-20℃至少可存放8个月，但在4℃存放时间稍短，故在实际应用中以-20℃存放为宜。

(2)PrV TK^-/gE^-/gI^-冻干苗对妊娠母猪的安全性与保护力测定：

妊娠2个月左右伪狂犬病阴性的中国地方猪种太湖母猪分为2组，即对照组与试验组，其中对照组2头，试验组4头。在试验组中以10⁶TCID₅₀的TK^-/gE^-/gI^-冻干苗剂量免疫2头，以10⁵TCID₅₀冻干苗剂量免疫2头。每天观察对照组与试验组猪精神状况，测量体温变化。

             表4 PrV TK^-/gE^-/gI^-冻干苗免疫前后妊娠母猪体温变化统计

                                  体温(℃)

分组

             0d           2d           2d          3d           4d           5d

对照         39.2±0.3    39.2±0.3    39.2±2     39.0±0.3    39.0±0.1    39.1±0.2

10⁵TCID₅₀  39.3±0.1    39.4±0.2    39.3±0.3   38.8±0.2    39.0±0.2    39.2±0.4

10⁶TCID₅₀  39.2±0.1    39.4±0.2    39.3±0.2   39.3±0.1    38.6±0.2    38.7±0.3

在疫苗免疫后，母猪体温、精神状态、饮食及粪便均正常。

妊娠母猪用PrV TK^-/gE^-/gI^-冻干苗免疫4周后，以10^7.1TCID₅₀伪狂犬病毒鄂A株强毒攻击，观察精神状态产仔情况。攻毒后，对照组妊娠母猪出现食欲减退，嗜睡、精神不佳；免疫试验组妊娠母猪食欲及精神状态均正常。

              表5  妊娠母猪攻毒后产仔成绩测定

                     攻毒后产仔成绩

分组

              母猪      产仔总数    活仔数  死胎   弱仔

              1号       14          11      3      1

对照

              2号       12          9       3      5

              1号       13          12      0      1

10⁵TCID₅₀

              2号       15          15      0      0

              1号       14          14      0      0

106TCID₅₀

              2号       12          12      0      0

用强毒攻毒后，未免疫母猪出现死胎、木乃伊胎和弱仔现象，而免疫母猪猪产仔正常。并且对照组猪产活仔数明显少于试验组。10⁵TCID₅₀与10⁶TCID₅₀组母猪产仔成绩差异不大。

(3)PrV TK^-/gE^-/gI^-冻干苗对仔猪的安全性评价：

对新生仔猪分别用Ea TK^-/gE^-/gI^-、Bartha、Begonia及NIA783进行滴鼻接种，接种剂量均为10⁵TCID₅₀/头，逐日观察仔猪精神状态及死亡情况。

           表6 PrV TK^-/gE^-/gI^-对新生仔猪的安全性测定

分组           空白     NIA-783   Begonia     Bartha    Ea缺失

受试仔猪       10       12        10          12        10

死亡数         0        0         1           4         0

致死时间(h)    -        -         48h         ＜24h     -

从上表可以看出尽管有母猪抗体存在，但疫苗病毒滴鼻后，Bartha株试验组及Begonia试验组均有死亡现象，Bartha组仔猪死亡时间均小于24h，并且我们还观察到，Bartha组部分存活仔猪精神不佳、拉稀，表明PrV Bartha对仔猪仍有一定毒力。

(4)仔猪免疫后鉴别gE-ELISA检测结果：

用普通伪狂犬病ELISA和gE鉴别ELISA对妊娠母猪抗体进行检测。在母源抗体为gE阳性感染背景下挑仔猪20头，以10头为空白对照猪，另外10头为注苗猪；在母源抗体为gE阴性感染背景下挑仔猪20头，以10头为空白对照猪，另外10头为注苗猪。初生仔猪滴鼻免疫后在30日龄分别用伪狂犬病毒普通ELISA和gE-ELISA测定。

                   表7  仔猪30日龄gE鉴别ELISA结果

疫苗           仔猪数               gE-ELISA OD值比值             gE阳性率(％)

                         0.9888     0.8366

                                               0.8909    0.8952   0

对照                     0.9771     0.9250

                                               0.9963    0.9015

               10                   0.8664     0.9611

                         0.8664

                                    0.9622     0.9771    0.9005

TK^-/gE^-/gI^-

               9

                         0.9846                                   0

                                    0.84310    0.9409    0.8164

                         0.9431

从上表可以看出gE缺失后，样品OD值结果均在0.7以上，为阴性。PrV TK^-/gE^-/gI^-免疫仔猪不产生针对gE的抗体，这从临床上进一步证实了PrV TK^-/gE^-/gI^-中gE已缺失，并可以将PrV TK^-/gE^-/gI^-疫苗用于鉴别诊断。

(5)PrV TK^-/gE^-/gI^-冻干苗对育肥猪免疫效力测定：

用PrV TK^-/gE^-/gI^-冻干苗免疫伪狂犬病阴性10周龄育肥猪10头，4周后加强免疫一次，免疫剂量均为10^5.0TCID₅₀/头，间隔4周采血1次；以10头猪为不注苗对照，注苗组与对照组混养，用微量血清中和试验测定中和抗体水平。

           表7育肥猪两次免疫时中和抗体变化

分组

                       中和抗体滴度

              免疫前    第一次免疫    第二次免疫

未免疫组      0         0             0

免疫组        0         2.82          11.29

伪狂犬病阴性的育肥猪在首次免疫后，中和抗体水平并不高；而在加强免疫时，中和抗体水平显著提高。将未免疫猪与免疫猪混养，结果未免疫猪在免疫组加强免疫时仍未出现中和抗体，表明PrV TK^-/gE^-/gI^-不会在畜群之间传播。

5、PrV TK^-/gE^-/gI^-冻干苗对非靶动物的生物安全性评价：

用冻干苗接种小鼠、家兔、猫、山羊，接种剂量分别为10⁵TCID₅₀和10⁶TCID₅₀。疫苗接种动物在试验期内均未出现精神异常或死亡现象，表明该疫苗具有极高的生物安全性。

           表8 PrV TK^-/gE^-/gI^-对非靶动物的安全性

动物        免疫剂量   试验数    观察时间    死亡数    精神状态

            对照       6                     0

Balb/C鼠    10⁵       6         28          0         正常

            10⁶       6                     0

            对照       3                     0

家兔        10⁵       3         28          0         正常

            10⁶       3                     0

            对照       3                     0

猫          10⁵       2         28          0         正常

            10⁶       2                     0

            对照       3                     0

山羊        10⁵       2         14          0         正常

            10⁶       2                     0

Claims (6)

1、一种重组的伪狂犬病毒(Pseudorabies virus)毒株HzauAVL-PrVdTKdgEdg I(CGMCC，保藏日期：2003年7月17日，保藏编号：No.0907)。

2、根据权利要求1所述的一种重组的伪狂犬病毒毒株，其特征在于：

1)所说的毒株缺失了TK、gE、gI基因；

2)所说的毒株不含外源基因。

3、实现权利要求1所述的含有重组的伪狂犬病毒毒株的基因缺失疫苗，其特征在于，所说的疫苗是活疫苗，其组分按7份伪狂犬病毒毒毒液：1份明胶比例配制。

4、实现权利要求1或2所述的重组的伪狂犬病毒基因缺失疫苗的制备方法，其特征在于：

1)毒株的制备：用gE转移质粒pSPFZ与PrV TK-基因组DNA共转染猪肾传代细胞IBRS-2，在X-gal存在下进行蓝斑筛选，挑取蓝斑进行空斑纯化，空斑纯化三次后获得重组病毒PrVTK^-/gE^-/LacZ⁺突变株；对含有完整gE、gI基因的质粒pSKFB用Stu I和BamH I进行酶切，回收5753bp的片段连接，得到gE/gI缺失转移质粒pFBBS；将质粒pFBBS与EcoR I线性化的PrV TK^-/gE^-/LacZ⁺突变株基因组DNA共转染IBRS-2细胞；经过空斑筛选获得PrV TK^-/gE^-/gI^-突变株。

2)疫苗的制备：用步骤1)得到的突变株在原代鸡胚成纤维细胞上增殖，待转瓶中原代鸡胚成纤维细胞长成单层后，接种所说的PrV TK^-/gE^-/gI^-病毒，37℃吸附1h后，加入含100U/mL的青链霉素的维持液，37℃培养至出现细胞病变，细胞病变后收毒，按病毒液∶明胶为7∶1的比例加入明胶，于灭菌冻干瓶中分装，置冷冻干燥机中冻干，冻干36h后压盖，置-20℃保存备用即为所说的疫苗。

5、一种缺失了TK、gE、gI基因的重组的伪狂犬病毒疫苗，其特征在于能够用于防制伪狂犬病。

6、权利要求5所说的用途，其特征在于，该疫苗在仔猪、育肥猪、妊娠母猪上的应用。

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