CN103756977A - 猪伪狂犬病变异株gE和gI基因缺失病毒株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及猪伪狂犬病毒技术领域，特别涉及一种猪伪狂犬病变异株gE和gI基因缺失病毒株PRV-ZJ011G，保藏号为CGMCCNo.7957。其在制备疫苗中的应用。将10^6.0TCID₅₀重组病毒接种新西兰大白兔，未引起瘙痒等临床症状。制成水包油型灭活疫苗，仔猪免疫后4周gBELISA抗体阳性，但gE抗体阴性，免疫保护效率100%；母猪免疫后其后代可以获得免疫保护，对PRV变异毒和传统毒免疫保护效率100%；证明ZJ011G重组病毒具有较好免疫原性，可用于疫苗制备。

Description

猪伪狂犬病变异株gE和gI基因缺失病毒株及其应用

技术领域    

本发明涉及猪伪狂犬病毒技术领域，特别涉及一种猪伪狂犬病变异株gE和gI基因缺失病毒株，还涉及所述病毒株的应用。

背景技术   

猪伪狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）属于疱疹病毒科甲型疱疹病毒亚科成员，可引起新生仔猪中枢神经系统紊乱，生长猪呼吸道症状，并能导致妊娠母猪流产、死胎与弱仔。美国与部分欧洲国家已宣布消灭和根除该病。我国广泛使用该病基因缺失弱毒疫苗有效控制并逐步净化。

华中农业大学在2005年申请了一个公开号为CN1940063A，名称为“一种伪狂犬病E^-/gI^-基因缺失毒株、含有该毒株的灭活疫苗及应用”，公开了保藏号为CCTCC-V200511的伪狂犬病毒基因工程株WKQ-001，该毒株缺失了PrV的糖蛋白基因gI、gE，作为标志基因，用于鉴别和诊断人工免疫猪及自然感染猪，还可用于制备灭活疫苗，其疫苗的免疫保护效果，尚待提高。 

发明内容   

为了解决以上现有技术中猪伪狂犬病毒疫苗不能抵抗高毒力抗原变异流行毒株感染等问题，本发明提供了一种可用于制备免疫效率高的疫苗的猪伪狂犬病gE和gI基因缺失病毒株。

本发明还提供了所述的猪伪狂犬病gE和gI基因缺失病毒株在制备免疫力高的疫苗中的应用。 

本发明是通过以下措施实现的： 

一种猪伪狂犬病高毒力抗原变异株gE和gI基因缺失病毒株（Pseudorabies virus）PRV-ZJ011G，其保藏号为CGMCC No.7957。

所述的猪伪狂犬病gE和gI基因缺失病毒株PRV-ZJ011G在制备疫苗中的应用。 

所述的应用中，疫苗为水包油型灭活疫苗。 

所述的应用中，疫苗的制备过程为：取含有PRV-ZJ011G病毒的病毒液，甲醛灭活，加入佐剂乳化即得。 

所述的应用中，病毒液与佐剂的重量比为4:1。 

所述的应用，病毒液中病毒含量为10^7.0TCID₅₀/mL。 

所述的应用，疫苗中病毒抗原含量大于10^6.0TCID₅₀/mL。 

本发明的有益效果： 

从我国发病猪群分离的猪伪狂犬病毒（PRV）毒株PRV-ZJ01，通过DNA同源重组将携带细菌人工染色体（BAC）载体和gfp表达盒pHA2质粒插入到ZJ01毒株的US7与US8基因内，获得了gE与gI基因缺失的重组病毒PRV-ZJ011G（以下也简称为ZJ011G）。提取该重组病毒的环状基因组DNA，电转化至大肠杆菌DH10B，筛选获得病毒感染性克隆PRV BAC（pZJ01/G-7）。将pZJ01/G-7转染BHK-21细胞可以重新启动病毒的生产性感染。重组病毒PRV-ZJ011G引起的细胞病变、病毒生长曲线和体外增殖特性与ZJ01毒株一致。

将10^6.0 TCID₅₀重组病毒接种新西兰大白兔，未引起瘙痒等临床症状。采用PRV-ZJ011G株病毒液（10^6.0TCID₅₀/mL）灭活处理制成水包油型灭活疫苗，与Bartha-K61活疫苗进行猪体免疫保护试验，结果表明，PRV-ZJ011G毒株灭活疫苗安全性较好，免疫后4周可产生gB抗体，但gE抗体阴性。采用ZJ01病毒液（10^6.0TCID₅₀）攻击，PRV-ZJ011G灭活疫苗组免疫保护效率100%，Bartha-K61活疫苗组保护效率40%，证明PRV-ZJ011G重组病毒具有较好免疫原性，可用于疫苗制备。 

菌株保藏信息

保藏时间：2013年9月18日，

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），

保藏编号：CGMCC No.7957，

保藏单位地址：中国科学院微生物研究所，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，

分类命名：猪伪狂犬病毒（Pseudorabies virus）。

附图说明   

图1. pHA2质粒经同源重组插入PRV-ZJ01病毒基因组示意图，其中（A）PRV-ZJ01基因组示意图（大小为145Kb）及US7与US8所在区域；（B）转移载体构建示意图；（C）重组病毒PRV-ZJ01/G基因组构成的示意图；

图2. 转移载体的构建与鉴定；其中（A）.中间载体pUC19-H1-H2质粒经PacⅠ线性化；（B）.转移载体pUC19-H1-H2/HA转染BHK-21细胞后16h在荧光显微镜下可见gfp表达；

图3. 重组病毒PRV-ZJ011G的噬斑纯化；

图4. 病毒rZJ01/G的基因组DNA与pZJ01/G-7质粒RFLP指纹图谱；其中泳道1：病毒rZJ01/G的基因组DNA RFLP指纹图谱；泳道2：pZJ01/G-7质粒DNA RFLP指纹图谱；M：Quick-load 1Kb Extend DNA Ladder Marker；

图5. 荧光显微镜下ZJ011G（A）与rZJ01/G（B）的噬斑（48h，100×）；

图6.  ZJ011G在BHK-21细胞上的一步生长曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明： 

实施例1：重组病毒的获得

1.1   病毒与细胞

PRV-ZJ01株病毒（经鉴定属于高毒力抗原变异株），由本实验室于2011年分离自我国某发病猪群患病仔猪，为BHK-21细胞F5代适应毒；BHK-21细胞由本实验室保存，细胞生长液为含10%胎牛血清（Gibco）的DMEM（Gibco），维持液为含2%胎牛血清的DMEM。

质粒与菌株

pHA2质粒（包含BAC载体序列、真核细胞中表达gfp表达盒、大肠杆菌中表达氯霉素抗性基因与大肠杆菌F质粒）由国家兽用生物制品工程技术研究中心王继春博士惠赠；pUC19载体购自Invitrogen公司；大肠杆菌TOPO10感受态细胞（由本实验室保存）；电转化感受态细胞ElectroMax DH 10B T1购自Invitrogen公司。

工具酶与试剂

本研究中所用的限制性内切酶，T4 DNA连接酶购自NEB公司；AccuPrime^TM pfx DNA Polymerase购自Invitrogen公司；AxyPrep DNA片段回收试剂盒购自AxyGEN公司；平末端克隆载体pEASY ^TM -Blunt Zero购自TransGen公司；质粒提取试剂盒Miniprep购自Qiagen公司；AxyPrep DNA Gel Extraction Kit；酚氯仿、蛋白酶K、RNase与低熔点琼脂糖购自Sigma公司；转染试剂Lipofactamine 2000购自Invitrogen公司；DMEM细胞营养液与胎牛血清购自Gibco公司。

引物设计与同源重组臂的PCR扩增

根据GeneBank公布的PRV-Becker株基因组序列（GenBank收录号为JF797219），在US7(gI)与US8(gE)位置设计2对引物PRV BAC H1 F/R与PRV BAC H2 F/R，引物序列见表1，斜体划线部分为酶切位点，引物由Invitrogen公司合成。

表1：本研究所用引物（Table 1: Primers used in this research） 

 

 转移载体的构建

准备1L PRV-ZJ01 F5代病毒液，反复冻融3次，8000rpm离心30min除去细胞碎片，40000rpm超速离心2h，所得沉淀经适量灭菌PBS重悬，用酚氯仿法在重悬液中提取PRV-ZJ01 gDNA。

分别以PRV BAC H1 F/R与PRV BAC H2 F/R，PRV-ZJ01 gDNA为模板，PCR扩增同源臂H1与H2，PCR反应体系：1 U AccuPrimeTM pfx DNA Polymerase 与2.5μL 10×AccuPrime^TM pfx Mix (Invitrogen)，上下游引物各10 pmol，PRV-ZJ01 gDNA模板100ng，灭菌双蒸水补足50μL。PCR反应条件：95℃预变性5 min；95℃变性45s，62℃退火45s，68℃延伸90s，上述3步骤进行32个循环；68℃后延伸7 min。PCR产物经1%琼脂糖电泳分析，按AxyPrep DNA Gel Extraction Kit说明书回收目的片段。回收PCR扩增产物连接pEASY ^TM -Blunt Zero载体，挑取阳性菌株进行测序分析。提取测序正确的重组H1与H2质粒分别用EcoRⅠ/SacⅠ与PstⅠ/HindⅢ酶切，回收酶切H1片段与pUC19线性化片段连接，构建重组质粒pUC19-H1，回收酶切H2片段与pUC19-H1酶切线性化片段连接构建重组质粒pUC19-H1-H2。pHA2与pUC19-H1-H2均以PacⅠ线性化，线性化片段经碱性磷酸酶处理后用T4连接酶连接。连接产物转化TOPO10感受态细胞，最后在含氨苄与氯霉素抗性的平板上筛选。挑取的单克隆经引物PRV BAC H1 F/R与PRV BAC H2 F/R鉴定，选取阳性克隆Miniprep方法提取质粒，获得转移载体pUC19-H1-H2/HA。图1显示了携有大肠杆菌F（Mini-F）质粒的BAC载体pHA2通过同源重组插入PRV-ZJ01 US7与US8（gI与gE）基因内的示意图。   

取2ug转移载体，采用Lipofactamine 2000（按说明说方法操作）转染BHK-21细胞，转染16小时后在荧光显微镜下观察所构建的转移载体中gfp表达盒是否表达。中间载体pUC19-H1-H2质粒经PacⅠ线性化大小约为5Kb（图2A），构建的重组病毒转移载体经PCR与测序鉴定，结果表明：发挥同源重组的两个同源臂H1与H2的核苷酸组成与参考序列一致，即转移载体构建成功。用Miniprep方法提取转移载体pUC19-H1-H2/HA的质粒DNA，以Lipofactamine 2000介导转染BHK-21细胞，16小时后在荧光显微镜下可见转染细胞表达gfp（图2B），转染效率可达50%以上。故pUC19-H1-H2/HA作为转移载体可以进行下一步重组病毒的构建。

重组病毒的构建与噬斑纯化

取转移载体pUC19-H1-H2/HA与PRV-ZJ01 gDNA各1.5微克采用Lipofactamine 2000（按Invitrogen公司提供的说明书操作）共转染BHK-21细胞，共转染48小时后，弃去维持液，覆盖含有1%低熔点琼脂糖、10%胎牛血清的DMEM，37℃，5%CO₂继续培养24小时，在荧光显微镜下可见绿色荧光的蚀斑（为重组病毒噬斑），挑取显示绿色荧光的单个噬斑，在BHK-21细胞上进行噬斑纯化。经6轮纯化后，获得重组病毒命名为PRV-ZJ011G（以下也简称为ZJ011G）（图3）。

重组病毒PRV-ZJ01/G株BAC的克隆与拯救

PRV-ZJ011G病毒以10^3.0 TCID₅₀/mL接种25cm² BHK-21细胞，37℃培养12小时后，在荧光显微镜下观察病变达到70%左右用预冷的PBS洗涤1次，4000rpm离心5 min，沉淀以100微升 TE分散重悬后，经酚氯仿法提取重组病毒基因组环状中间体。取2微升PRV-ZJ011G株病毒基因组DNA与50微升E.coli DH 10B感受态细胞混合后置于预冷的0.1 cm电转化杯中，在1500V 200Ω 25uF的条件下进行电击。电击后迅速加入1 mL预热至37℃的SOC液体培养基，置于37℃摇床复苏3小时后，涂布于含34 微克/毫升氯霉素的LB平板，37℃培养72小时，挑取单菌落至液体培养基后培养48小时，用引物PRV BAC H1 F/R与PRV BAC H2 F/R进行PCR鉴定。选取10个PCR阳性的克隆，Miniprep方法提取质粒命名为pZJ01/G1-10，提取的质粒DNA用BamHⅠ酶切以进行RFLP分析，获得的阳性克隆采用Lipofactamine 2000转染BHK-21细胞，待细胞病变达到80%时，将细胞培养物冻融3次以收获重组病毒，即为拯救的重组毒，命名为rZJ01/G。

PRV-ZJ01的感染性BAC克隆命名为pZJ01/G-7。提取病毒rZJ01/G的基因组DNA与pZJ01/G-7质粒DNA，经限制性内切酶BamHⅠ酶切，其脉冲场凝胶电泳图谱见图4。 

重组病毒噬斑形态观察

将重组病毒PRV-ZJ011G与拯救的重组病毒rZJ01/G分别接种BHK-21单层细胞，病毒经吸附1h、PBS（pH7.2）洗涤后，覆盖含有1%低熔点琼脂糖、10%胎牛血清的DMEM，37℃，5%CO2继续培养48小时，比较病变细胞形态，并在荧光显微镜下拍摄各100个噬斑，测量噬斑面积取其平均值。重组病毒ZJ011G与rZJ01/G的噬斑形成时间相同、噬斑形态相似且噬斑面积相近（图5）。

重组病毒体外增殖特征

按照常规病毒学方法测定wtPRV-ZJ01、ZJ011G与rZJ01/G病毒的体外增殖特征。BHK-21细胞单层接种0.1 MOI病毒后，吸附90 min，PBS（pH7.2）洗涤2次，加入2%DMEM培养液。在接种后0、4、8、12、16、24、36、48与72h收集培养物，于-70℃冻存，每个时间点设置三个重复。收集完全后，将上述病毒培养物以10倍比梯度稀释后，接种于刚长满BHK-21细胞单层的24孔板，每个稀释度设置四个重复，计算上述各时间点收获病毒培养物的TCID₅₀，绘制病毒在体外培养条件下的一步生长曲线。

测定野生型ZJ01（wtPRV-ZJ01）、ZJ011G与rZJ01/G三个毒株在BHK-21细胞上的一步生长曲线，结果见图6。wtPRV-ZJ01接毒后36h滴度达10^7.90 TCID₅₀/mL，ZJ011G接种后48h滴度达10^7.53 TCID₅₀/mL。 

实施例2

2.1 兔体试验

取9只新西兰大白兔（江苏省农科院实验动物中心），随机分为3组，每组3只，隔离饲养，第1、2组分别接种F5 PRV-ZJ01和ZJ011G，背部皮下接种，10^6.0TCID₅₀/mL，第3组作空白对照，每隔8h观察是否出现瘙痒等临床症状。PRV-ZJ01接种后3-5天，3只兔均出现明显瘙痒症状并死亡，脑组织检测均存在PRV，而ZJ011G和空白对照组兔没有明显症状，证明ZJ011G毒力明显降低。

灭活疫苗制备与猪免疫保护试验

2.2.1 疫苗制备  

取ZJ011G病毒液（10^7.0TCID₅₀/mL），采用0.1%甲醛37℃灭活24h，加入ISA15A佐剂（法国Seppic公司），病毒液与佐剂重量比为4:1，乳化呈水包油剂型，无菌检验合格；3000rpm离心10min，不发生分层，剂型稳定。4℃保存。

2.2.2 免疫保护试验1 

取15头45日龄健康仔猪（PRV、PRRSV和PRV抗原与抗体检测阴性），随机分为3组，每组5头，隔离饲养，第1组接种ZJ011G灭活疫苗，肌肉注射，1mL/头，第2组接种Bartha-K61活疫苗，肌肉注射10^6.0TCID₅₀/头。接种后4周，采血分离血清，采用IDEXX PRV gB-ELISA和gE-ELISA抗体检测试剂盒检测gB和gE抗体，并采用PRV-ZJ01细胞毒（10^6.0 TCID₅₀/mL）攻击，滴鼻1mL/头。攻毒后观察临床表现，死亡猪和明显发病猪采集脑组织冷冻保存，用PCR方法检测PRV核酸，判定疫苗免疫保护效率。

ZJ011G灭活疫苗和Bartha-K61活疫苗免疫后4周，PRV gB-ELISA抗体均为阳性，而gE-ELISA抗体均为阴性，PRV-ZJ01攻击后3-5天，对照组逐渐发病，至第14天全部死亡，Bartha-K61活疫苗免疫组3头猪出现精神沉郁，不吃，而ZJ011G灭活疫苗组均无明显临床症状，发病猪和病死猪脑组织用PCR方法检测PRV均为阳性（表2），证明ZJ011G灭活疫苗具有较好免疫保护作用，免疫效力明显高于Bartha-K61活疫苗。 

表2  ZJ011G灭活疫苗仔猪免疫保护试验结果 

2.2.3 免疫保护试验2

取6头怀孕80~90天母猪（PRVgB和gE抗体阴性），分成3组，每组2头，每组2头，第1组接种ZJ011G灭活疫苗，肌肉注射，2mL/头，间隔3周后相同方法加强免疫一次，第2组接种Bartha-K61活疫苗，肌肉注射10^6.0TCID₅₀/头，第3组不免疫对照，隔离饲养，观察母猪健康和产仔情况。取各组母猪后代21~28日龄健康仔猪10头，采血分离血清，采用IDEXX PRV gB-ELISA和gE-ELISA抗体检测试剂盒检测gB和gE抗体，并将各组仔猪10头再随机分为2组，共计6个组，即ZJ011G灭活疫苗免疫组1-1和1-2、Bartha-K61活疫苗组2-1和2-2，非免疫对照组3-1和3-2，每组5头，隔离饲养，第1-1、2-1和3-1组采用PRV变异株 ZJ01细胞毒（10^6.0 TCID₅₀/mL）攻击，滴鼻1mL/头。第1-2、2-2和3-2组采用PRV传统株LA细胞毒（10^6.0 TCID₅₀/mL）攻击，滴鼻1mL/头。攻毒后观察临床表现，死亡猪和明显发病猪采集脑组织冷冻保存，用PCR方法检测PRV核酸，判定疫苗免疫保护效率。

结果为：母猪接种ZJ011G灭活疫苗和Bartha-K61活疫苗后，没有任何异常反应，产仔正常，健仔数与非免疫母猪组相似，分别为21/23、22/24和22/24（健仔数/总仔数）。两种疫苗免疫母猪的后代21~28日龄时PRV gB抗体均为阳性，gE抗体均为阴性。PRV-ZJ01攻击后3-10天，对照组出现呕吐和神经症状等明显临床症状，并全部死亡，Bartha-K61活疫苗免疫组3头猪出现精神沉郁、呕吐和神经症状，ZJ011G灭活疫苗组无明显临床症状。PRV传统毒株LA攻击后4-14天，对照组均出现明显临床症状，死亡2头，Bartha-K61活疫苗和ZJ011G灭活疫苗免疫组仔猪均无明显异常。所有发病猪和病死猪脑组织用PCR方法检测PRV均为阳性（表3），证明ZJ011G灭活疫苗对PRV变异株和传统毒株均有较好免疫保护作用。 

表3  ZJ011G灭活疫苗对PRV传统毒株攻毒保护试验结果 

本专利中灭活疫苗免疫保护效率试验中，采用PRV ZJ01株攻击73日龄猪，非免疫对照猪全部发病死亡，证明PRV ZJ01变异株毒力明显强于传统的PRV毒株（传统的PRV毒株不会引起60日龄以上猪死亡）；PRV Bartha-K61疫苗免疫猪不能完全抵抗PRV ZJ01株攻击，而以PRV ZJ01株为基础构建的gE和gI基因缺失毒株PRV ZJ011G株灭活疫苗免疫组猪可以完全抵抗PRV ZJ01株攻击，也再次证明PRV ZJ01株抗原性相比传统的PRV毒株发生了较大变化。本研究以PRV高毒力抗原变异株ZJ01为基础，首次构建成功PRV高毒力抗原变异株ZJ01的gE和gI基因缺失毒株PRV ZJ011G株，并可用于该病疫苗研制，经过试验验证，其对两种PRV强毒株免疫保护率都能达到100%，是一种通用性极强的免疫疫苗。

<110>姜平

<120>猪伪狂犬病变异株gE和gI基因缺失病毒株及其应用

<160>4

<210>1

<211>29

<212>DNA

<213>人工合成

 

<220>

<223>

 

<400>1

ATTGA ATTCG TACCC GTACA CCGAG TCGT  29

<210>2

<211>39

<212>DNA

<213>人工合成

 

<220>

<223>

 

<400>2

ACTGA GCTCG GTTAA TTAAT CATCA TCGAC GCCGG TACT  39

<210>3

<211>39

<212>DNA

<213>人工合成

 

<220>

<223>

 

<400>3

CAACT GCAGC GTTAA TTAAG CCGAC ATGGA CACGT TCGA  39

<210>4

<211>27

<212>DNA

<213>人工合成

 

<220>

<223>

 

<400>4

TCGAA GCTTT TGTGG ACCCG CGAAC AT  27

Claims (7)

1.一种猪伪狂犬病高毒力抗原变异株gE和gI基因缺失病毒株PRV-ZJ011G，其保藏号为CGMCC No.7957。

2.一种权利要求1所述的猪伪狂犬病gE和gI基因缺失病毒株PRV-ZJ011G在制备疫苗中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于疫苗为水包油型灭活疫苗。

4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于疫苗的制备过程为：取含有PRV-ZJ011G病毒的病毒液，甲醛灭活，加入佐剂乳化即得。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于病毒液与佐剂的重量比为4:1。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于病毒液中病毒含量为10^7.0TCID₅₀/mL。

7.根据权利要求2-5中任一项所述的应用，其特征在于疫苗中病毒抗原含量大于10^6.0TCID₅₀/mL。

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