CN1769434A - 一种猪圆环病毒2型重组腺病毒及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种猪圆环病毒2型重组腺病毒及其构建方法和作为预防猪的由PCV2引起的相关疾病的疫苗的应用，其构建方法步骤如下：PCV2 ORF2基因的扩增、克隆；含有ORF2基因的重组穿梭载体的构建；重组腺病毒质粒载体的构建；重组腺病毒的获得。该重组腺病毒能在体内有限生长并且不断表达ORF2蛋白，使机体持续受到ORF2蛋白的刺激，不断产生针对ORF2蛋白的中和抗体，能对猪提供持久的保护力，在PCV2的防治方面具有广阔的应用前景，可以有效预防公猪的精液质量差，母猪的流产、死胎、木乃伊及产仔数少，使猪的整齐度大大提高。

Description

一种猪圆环病毒2型重组腺病毒及其构建方法和应用

                        技术领域

本发明属于生物技术高科技领域，特别涉及一种猪圆环病毒2型(PCV2)重组腺病毒及其构建方法和应用。

                        背景技术

重组腺病毒rAdCMV-ORF2在分类上属于腺病毒科(Adenoviridae)，哺乳动物腺病毒属(Mastadenovirus)，人腺病毒种(Human adenovirus)，该重组腺病毒可以对目的蛋白进行有效的表达，用该重组腺病毒感染动物后不出现临床症状，因此可以用来表达抗原蛋白。重组腺病毒基因工程技术在人类的基因治疗面已经得到了广泛的应用，很多应用于人类基因治疗的重组腺病毒已经进入临床三期阶段。因为重组腺病毒具有感染的宿主范围大，能感染分裂和不分裂的细胞；可以表达人源和非人源蛋白，而且不会整合到宿主基因组内，不会引起基因插入突变，可以复制得到高滴度等特点。而开放阅读框架2(ORF2)所编码的蛋白(即Cap蛋白)是由猪圆环病毒2型ORF2基因编码的大约30kD的蛋白，由其诱导的抗体具有中和活性。用杆状病毒表达的ORF2蛋白具有很强的免疫原性，用表达的ORF2蛋白免疫猪和小鼠可以产生抗ORF2蛋白的特异性抗体，而且ORF2蛋白还可以诱导细胞凋亡。目前还未发现构建成猪圆环病毒(PCV2)的重组腺病毒报道。

                         发明内容

为了解决上述现有技术中存在的不足之处，本发明的首要目的在于提供一种猪圆环病毒2型(PCV2)重组腺病毒。该重组腺病毒能够有效控制猪圆环病毒2型(PCV2)，对外源蛋白表达稳定，且其效价稳定。

本发明的另一目的在于提供上述猪圆环病毒2型(PCV2)重组腺病毒的构建方法。

本发明的再一目的在于提供上述猪圆环病毒2型(PCV2)重组腺病毒在制备疫苗中的应用。该疫苗可有效预防由PCV2引起的猪的多种疾病，预防公猪的精液质量差，母猪的流产、死胎、木乃伊及产仔数少，使猪的整齐度大大提高。

本发明的猪圆环病毒2型重组腺病毒的构建方法其步骤如下：

(1)PCV2 ORF2基因的扩增、克隆：

提取猪肾细胞PK-15细胞中培养的PCV2的DNA作模板，扩增PCV2 GD毒株(国内分离株)ORF2基因，PCR产物用试剂盒回收与克隆载体pMD18-T进行连接；将连接产物转化感受态细胞大肠杆菌DH5α(将获得的重组质粒命名为pMD-ORF2)，提取重组质粒pMD-ORF2进行酶切、测序鉴定。

(2)含有ORF2基因的重组穿梭载体的构建：

用核酸限制性内切酶KpnI和核酸限制性内切酶HindIII将PCV2 GD毒株ORF2基因片段切出纯化后，克隆入腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV载体的KpnI和HindIII两酶切位点间，获得含有ORF2基因的重组穿梭载体pAdTrack-CMV-ORF2。

(3)重组腺病毒质粒载体的构建：

将含有ORF2基因的重组穿梭载体pAdTrack-CMV-ORF2、腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV用核酸限制性内切酶PmeI线性化后转化含腺病毒骨架载体Adeasier-1的BJ5183感受态细胞中，在大肠杆菌重组酶的作用下，在穿梭载体和骨架载体之间发生同源重组，将外源基因转入腺病毒骨架载体，经卡那霉素和酶切鉴定筛选获得了含有外源基因的重组腺病毒质粒pAdCMV-ORF2。

(4)重组腺病毒的获得：

将含有外源基因的重组腺病毒质粒pAdCMV-ORF2用核酸限制性内切酶Pac I酶切线性化后，经脂质体Lipofectamine^TM2000介导转染293细胞包装成重组腺病毒rAdCMV-ORF2。

所述特性引物根据GenBank中PCV2的基因序列设计，针对PCV2 GD毒株(GenBank收录号为AY613854)ORF2基因，其引物序列如下：

上游引物P1：5’-TTAGGTACCATGACGTATCCAAGGAG-3’

下游引物P2：5’-TTAAAGCTTAGGGGTTAAGTGGGG-3’

在引物的5’端分别含限制性内切酶酶位点，上述引物由上海博亚生物技术有限公司合成。

所述扩增PCV2 GD毒株ORF2基因的反应条件为：开始94℃预变性5min，然后以94℃变性1min，48℃退火1min，72℃延伸1.5min，进行30个循环，最后72℃延伸10min。

所述含腺病毒骨架载体Adeasier-1的BJ5183感受态细胞的制备方法如下：将腺病毒骨架载体质粒pAdeasy-1用电转化于大肠杆菌菌株BJ5183，用含氨苄青霉素(100μg/mL)和链霉素(25μg/mL)的LB培养基平板筛选，挑取单克隆，小量提取腺病毒骨架载体pAdeasy-1，HindIII酶切鉴定，获得转化的含质粒pAdeasy-1的BJ5183菌，然后将其制成感受态细胞。

本发明与现有技术相比，具有如下优点和效果：

1、本发明构建的PCV2重组腺病毒对外源蛋白表达稳定，且其效价稳定，种毒的毒稳定在10^4.56TCID₅₀/1.0ml。通过小鼠免疫试验和中和试验表明了该重组腺病毒产生了针对PCV2的中和抗体，该抗体在体外可以中和PCV2，其中和效价为1∶32。

2、本发明首次应用重组腺病毒载体构建PCV2重组腺病毒，该重组腺病毒突破了PCV2常规灭活疫苗的局限性。该重组疫苗使PCV2 ORF2蛋白获得了提前表达，改变了PCV2感染猪后中和抗体产生量少且慢的缺点。由于该重组腺病毒疫苗采用人腺病毒中的血清5型载体，对人、猪等动物没有致病性，已通过安全评价。

3、与现有的PCV2灭活疫苗相比，该重组腺病毒能在体内有限生长并且不断表达ORF2蛋白，使机体持续受到ORF2蛋白的刺激，不断产生针对ORF2蛋白的中和抗体，能对猪提供持久的保护力，专用于加强对猪圆环病毒2型的免疫保护作用，可减少猪场的经济损失。

4、该重组腺病毒疫苗可以有效预防由PCV2引起的猪的多种疾病，预防公猪的精液质量差，母猪的流产、死胎、木乃伊及产仔数少，有效率可以达到90％，预防猪的断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)有效率可以达到98％以上，预防猪的皮炎肾炎综合征有效率可以达到95％以上，预防中大猪的呼吸道问题和生长缓慢问题有效率达95％，可以提高猪的出栏时间达7～10天，使猪的整齐度大大提高。

                            附图说明

图1为含ORF2基因的重组腺病毒的构建示意图。

                            具体实施方式

下面通过实施例及附图对本发明作进一步具体的说明，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

一、猪圆环病毒2型重组腺病毒质粒(pAdCMV-ORF2)的构建

(1)引物

根据GenBank中猪圆环病毒2型(PCV2)的基因序列设计了一对针对PCV2GD毒株(GenBank收录号为AY613854)ORF2基因的特性引物，引物由上海博亚生物技术有限公司合成。

上游引物P1：5’-TTAGGTACCATGACGTATCCAAGGAG-3’

下游引物P2：5’-TTAAAGCTTAGGGGTTAAGTGGGG-3’

在引物的5’端分别含限制性内切酶酶位点。

(2)PCV2 ORF2基因的克隆

提取猪肾细胞PK-15细胞中培养的PCV2的DNA作模板，扩增PCV2 GD毒株(国内分离株)ORF2基因，反应条件为：开始94℃预变性5min，然后以94℃变性1min，48℃退火1min，72℃延伸1.5min，进行30个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物用试剂盒回收与pMD18-T载体进行连接；将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，提取质粒进行酶切、测序筛选出重组质粒命名为pMD-ORF2。

(3)含有ORF2基因的重组穿梭载体的构建

用核酸限制性内切酶KpnI和核酸限制性内切酶HindIII将PCV2 GD毒株ORF2基因片段切出纯化后，克隆入腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV载体的KpnI和HindIII两酶切位点间，挑取Kan(卡那霉素)抗性的单菌落培养，提取其中的质粒后，用KpnI和HindIII双酶切鉴定重组质粒，然后测序证实，将获得的重组腺病毒穿梭载体命名为pAdTrack-CMV-ORF2。

(4)含Adeasier-1的大肠杆菌E.Coli的制备

将腺病毒骨架载体pAdeasy-1用电转化于大肠杆菌菌株BJ5183菌，用氨苄青霉素(100μg/mL)和链霉素(25μg/mL)的LB培养基平板筛选，挑取单菌落培养，小量提取腺病毒骨架载体pAdeasy-1，HindIII酶切鉴定，获得转化成功的含腺病毒骨架载体Adeasie-1的大肠杆菌BJ5183菌，然后将其制成感受态细胞备用。

(5)重组腺病毒质粒载体的构建

将pAdTrack-CMV-ORF2，pAdTrack-CMV用核酸限制性内切酶PmeI线性化后转化含腺病毒骨架载体Adeasier-1的BJ5183感受态细胞，在大肠杆菌重组酶的作用下，在穿梭载体和骨架载体之间发生同源重组，把外源基因转入腺病毒骨架载体，经卡那霉素和酶切鉴定筛选获得了含有外源基因的重组腺病毒质粒pAdCMV-ORF2。同源重组后的腺病毒质粒用核酸限制性内切酶PacI酶切得到一条大小为4.5kb小片段和一条大小约为30kb的大片段，表明含有外源基因的重组腺病毒质粒pAdCMV-ORF2构建成功。

二、重组腺病毒rAdCMV-ORF2的包装及免疫实验

1、293细胞的复苏、培养与冻存

(1)将冻存的293细胞株迅速放入37℃水浴中1～2min，使之快速融化；

(2)转入10mL离心管中，加入5mL含10％(v/v)(按体积比计)小牛血清的DMEM培养液，轻轻吹打使293细胞团块分散后，2500rpm离心3min；

(3)弃上清，加入5mL含10％(v/v)小牛血清的DMEM，轻轻吹打混匀后，转入25mL培养瓶，置37℃，5％的CO2培养箱培养；

(4)18～24h后在倒置显微镜下观察，如见细胞贴壁，表明复苏成功，并予常规更换培养液一次；

(5)每天在倒置显微镜下观察293细胞生长情况，每3天传代一次；

(6)把健康生长处于对数期的293细胞完全消化下来，离心，沉淀293细胞，用尽少量10％(v/v)血清的DMEM重悬细胞，用血细胞计数器进行记数；

(7)用含5％(v/v)血清的DMEM+10％(v/v)DMSO(二甲基亚砜)+40％(v/v)新生牛血清使每毫升细胞密度达到1×10⁶个，在1.8mL的冻存管分装1.0mL的293细胞，把冻存管放在泡沫盒内置低温冰箱24h，24h后迅速把低温冰箱的293细胞转入液氮中。

2、猪圆环病毒2型重组腺病毒的获得与鉴定、重组腺病毒表达ORF2基因的鉴定

将重组腺病毒质粒pAdCMV-ORF2用Pac I酶切线性化后，经脂质体Lipofectamine^TM2000介导转染293细胞包装成重组腺病毒粒子rAdCMV-ORF2和AdCMV(不含PCV2 ORF2基因的重组腺病毒粒子)，转染组细胞发生明显病变。将有病变的细胞直接放在荧光显微镜下，可观察到大量呈粗颗粒状或团块状的绿色荧光的细胞，重组病毒液用P1、P2为引物作PCR鉴定，扩增出了约700bp的片段，未转染的293细胞和AdCMV细胞培养液结果为阴性，与预期结果相符。将感染rAdCMV-ORF2的293细胞离心收集细胞，加入2×SDS(十二烷基硫酸钠)上样缓冲液，煮沸5min，用12％的聚丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE电泳分析。同时以不含ORF2基因感染AdCMV的293细胞系做对照。Western blot检测结果表明重组腺病毒在293细胞系中表达出一条分子量大小约为30kD的蛋白条带，大小与预期的蛋白质分子量一致。这一条蛋白带为PCV2 ORF2基因表达的产物。进一步从分子水平上表明表达的重组蛋白能被PCV2阳性猪血清所识别，具有良好的抗原性。

3、猪圆环病毒2型重组腺病毒的噬斑纯化

在6孔细胞板的每一个孔接种3.0×10⁵个293细胞，5％(v/v)的二氧化碳温箱中静止培养；待细胞完全长成单层后，把重组病毒液原液按6孔板所加营养液量的1/5体积(600μl)接种重组腺病毒，37℃吸附1.5h；加入2.0mL2％(v/v)新生牛血清的DMEM2.0h；完全弃去上清，用37℃预热的无菌PBS洗涤两次；高压后的2％(v/v)琼脂糖放在50℃水浴锅中；含1％(v/v)青霉素、1％(v/v)链霉素和4％(v/v)血清的2×DMEM预热到37℃；在一无菌的100.0mL的玻璃瓶中加入10.0mL的2×DMEM和10.0mL的2％(v/v)琼脂糖，充分混匀后置37℃水浴锅中；按6孔板的每一孔加3.0mL覆盖琼脂，铺板，观察噬斑；用灭菌枪头挑取包含噬斑的琼脂糖块放入无菌离心管中，加入200.0μL的无菌PBS，将琼脂块捣碎后，反复冻融三次；12000rpm离心5min；收获的重组腺病毒接种于一新的24孔细胞板中。

4、猪圆环病毒2型重组腺病毒的TCID₅₀的测定

按病毒学操作手册介绍之方法，用含2％(v/v)血清、1％(v/v)青霉素和1％(v/v)链霉素的维持液将重组腺病毒作10倍梯度稀释。然后分别接种于长满293细胞单层的96孔细胞培养板，每个稀释度接种8个孔，每孔接种100μL。同时设定两排孔用含2％(v/v)血清、1％(v/v)青霉素和1％(v/v)链霉素的维持液作对照。37℃，5％的CO₂温箱培养，逐日观察细胞病变。并按Reed-Mucch法计算病毒TCID₅₀。效价值为10^4.56TCID₅₀/1.0mL。

5、猪圆环病毒2型重组腺病毒的小白鼠免疫试验

取20只8周龄健康清洁级小白鼠随机分成4组，每组5只，一组设定为对照，其余3组分别采取口服、皮下和肌肉注射3种免疫方式。免疫剂量为10⁴TCID₅₀/0.2mL，免疫间隔时间2周，连续免疫4次后，采集小白鼠血清做病毒中和试验，3种免疫方式的中和抗体效价差异不显著，中和抗体效价为1∶32。

6、猪圆环病毒2型重组腺病毒的稳定性试验

将重组腺病毒rAdCMV-ORF2在293细胞上连续传代30代，每5代分别检测rAdCMV-ORF2中ORF2蛋白的表达，同时测定其组织细胞半数感染量。结果表明，ORF2蛋白在重组腺病毒rAdCMV-ORF2连续传代过程中表达稳定，其组织细胞半数感染量也未发生变化。

综上所述，将纯化的重组腺病毒rAdCMV-ORF2在293细胞上连续传代30次，每5代检查重组腺病毒对ORF2蛋白的表达情况，同时测定其TCID₅₀。结果证明，重组腺病毒对ORF2蛋白表达稳定，而且组织细胞半数感染量稳定，接毒后细胞出现病变明显。种毒的毒价稳定在10^4.56TCID₅₀/1.0mL。

实施例2

猪圆环病毒2型(PCV2)重组腺病毒用于制备疫苗

将纯化的猪圆环病毒2型重组腺病毒在293细胞上连续传代30次，检测其猪圆环病毒2型ORF2蛋白的表达情况，证明PCV2 ORF2蛋白表达稳定，重组腺病毒的毒价稳定在10^4.56TCID₅₀/1.0mL。

在扩大培养过程中取用纯化保存的PCV2重组腺病毒按10⁴8TCID₅₀接种长成单层293细胞。当细胞病变达70～90％时收毒，经反复冻融一次即可获得PCV2重组腺病毒疫苗。

实施例3

猪圆环病毒重组腺病毒作为疫苗免疫猪

该含有PCV2的ORF2基因的重组腺病毒经过人工培养后毒价达到10^4.56TCID₅₀/1.0mL，经过冷冻真空干燥，作为疫苗使用，对猪的多种疾病有较好的有预防效果。使用方法是母猪和公猪每年免疫3次，每次4～6毫升；小猪在7～10天肌肉注射1～3毫升，10天后再肌肉注射1～3毫升；中猪的大猪可以再加强免疫一次，每次肌肉注射3～6毫升。可以有效预防由PCV2引起的猪的多种疾病，预防公猪的精液质量差，母猪的流产、死胎、木乃伊及产仔数少，有效率可以达到90％，预防猪的断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)有效率可以达到98％以上，预防猪的皮炎肾炎综合征有效率可以达到95％以上，预防中大猪的呼吸道问题和生长缓慢问题有效率达95％，可以提高猪的出栏时间达7～10天，使猪的整齐度大大提高。

                      SEQUENCE LISTING

      一种猪圆环病毒2型重组腺病毒及其构建方法和应用

<110>广东省农业科学院兽医研究所

<120>一种猪圆环病毒2型重组腺病毒及其构建方法和应用

<130>2

<160>2

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>26

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>根据GenBank中PCV2的基因序列设计的P1

<400>1

ttaggtacca tgacgtatcc aaggag                                               26

<210>2

<211>24

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>根据GenBank中PCV2的基因序列设计的P2

<400>2

ttaaagctta ggggttaagt gggg                                                 24

Claims (6)

1、一种猪圆环病毒2型重组腺病毒的构建方法，其特征在于步骤如下：

(1)PCV2 ORF2基因的扩增、克隆：

提取猪肾细胞PK-15细胞中培养的PCV2的DNA作模板，扩增PCV2 GD毒株ORF2基因，PCR产物用试剂盒回收与克隆载体pMD18-T进行连接；将连接产物转化感受态细胞大肠杆菌DH5α，提取重组质粒pMD-ORF2进行酶切、测序鉴定；

(2)含有ORF2基因的重组穿梭载体的构建：

用核酸限制性内切酶KpnI和核酸限制性内切酶HindIII将PCV2 GD毒株ORF2基因片段切出纯化后，克隆入腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV载体的KpnI和Hind III两酶切位点间，获得含有ORF2基因的重组穿梭载体pAdTrack-CMV-ORF2；

(3)重组腺病毒质粒载体的构建：

将含有ORF2基因的重组穿梭载体pAdTrack-CMV-ORF2、腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV用核酸限制性内切酶PmeI线性化后转化含腺病毒骨架载体Adeasier-1的BJ5183感受态细胞中，在大肠杆菌重组酶的作用下，在穿梭载体和骨架载体之间发生同源重组，将外源基因转入腺病毒骨架载体，经卡那霉素和酶切鉴定筛选获得了含有外源基因的重组腺病毒质粒pAdCMV-ORF2；

(4)重组腺病毒的获得：

将含有外源基因的重组腺病毒质粒pAdCMV-ORF2用核酸限制性内切酶PacI酶切线性化后，经脂质体Lipofectamine^TM2000介导转染293细胞包装成重组腺病毒rAdCMV-ORF2。

2、根据权利要求1所述的一种猪圆环病毒2型重组腺病毒的构建方法，其特征在于，所述特性引物根据GenBank中PCV2的基因序列设计，针对PCV2GD毒株ORF2基因，其引物序列如下：

上游引物P1：5’-TTAGGTACCATGACGTATCCAAGGAG-3’

下游引物P2：5’-TTAAAGCTTAGGGGTTAAGTGGGG-3’

在引物的5’端分别含限制性内切酶酶位点。

3、根据权利要求1所述的一种猪圆环病毒2型重组腺病毒的构建方法，其特征在于，所述扩增PCV2GD毒株ORF2基因的反应条件为：开始94℃预变性5min，然后以94℃变性1min，48℃退火1min，72℃延伸1.5min，进行30个循环，最后72℃延伸10min。

4、根据权利要求1所述的一种猪圆环病毒2型重组腺病毒的构建方法，其特征在于，所述含腺病毒骨架载体Adeasier-1的大肠杆菌BJ5183感受态细胞的制备方法如下：将腺病毒骨架载体pAdeasy-1用电转化于大肠杆菌BJ5183，用含氨苄青霉素和链霉素的LB培养基平板筛选，挑取克隆，小量提取质粒，HindIII酶切鉴定，获得转化的腺病毒骨架载体pAdeasy-1菌，将其制成含腺病毒骨架载体Adeasier-1的大肠杆菌BJ5183感受态细胞。

5、根据权利要求1～5任一项所述的构建方法构建的一种猪圆环病毒2型重组腺病毒。

6、根据权利要求5所述的猪圆环病毒2型重组腺病毒在制备疫苗中的应用。