CN102703505A - 共表达布鲁氏菌重组腺病毒及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种布鲁氏菌重组腺病毒、该重组腺病毒的制备方法，以及这种重组腺病毒在布鲁氏菌基因工程疫苗中的用途。本发明的共表达布鲁氏菌重组腺病毒活载体中包括有布鲁氏菌L7/L12和BCSP31基因，其序列为SEQ№1，并以复制缺陷型Ad5腺病毒为载体。

Description

共表达布鲁氏菌重组腺病毒及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种重组病毒及这种重组病毒的制备及用途，特别是涉及一种布鲁氏菌重组腺病毒、该重组腺病毒的制备方法，以及这种重组腺病毒在布鲁氏菌基因工程疫苗中的用途。

背景技术

布鲁氏菌病(Brucellosis)是由布鲁氏菌(Brucella spp.)引起的一种人畜共患传染病，又称为马耳他热或波状热，简称布病。世界动物卫生组织(OIE)将其列为B类动物疫病，我国也将其列为二类动物疫病，直接影响畜牧业发展，严重威胁着人类健康，造成巨大经济损失(蔡宝祥，2001)。布鲁氏菌病因其独特的致病机制及胞内寄生感染后难以根治的特点，除了大规模扑杀，应用疫苗预防一直是动物布鲁氏菌病防控最有效且经济的手段(Ko et al.，2003)。虽然布鲁氏菌疫苗种类较多，也为世界布病的免疫防控发挥了重要作用，但至今还没有一种布鲁氏菌传统疫苗在国际上获得普遍或持久应用，原因是现有的各类型疫苗在保护效果、安全性和制作成本等方面均存在着不同程度相互矛盾而又难以克服的缺点。

随着现代基因工程技术、分子生物学和免疫学的快速发展，新一代布鲁氏菌分子疫苗可以兼顾免疫保护性抗原的多价性、表达载体的高效性、疫苗佐剂的靶向性、接种途径的简便性、安全有效性等特点，能有效激发机体产生免疫应答和免疫保护效果(Ko et al.，2003)。L7/L12核蛋白(Ribosome protein)是布鲁氏菌重要的T细胞优势抗原，在核糖体亚单位中以四个拷贝的形式存在，能够诱导细胞免疫应答的产生，在各菌株中具有高度的保守性(Bachrach et al.，1994)。L7/L12蛋白能特异性地刺激感染动物的单核细胞，并上调IFN-γ的表达，从而起到保护作用(Winter et al.，1996)。外膜蛋白BCSP31也是抗布鲁氏菌感染重要的抗原分子。Yu等(2007)制备了包含BCSP31的基因疫苗，免疫BALB/c小鼠肌肉或腹腔内产生了CTL效应和特异性抗体应答，但在整体免疫应答和免疫保护效果上还存在着诸多问题。

客服现有疫苗技术的不足，寻找一种可以长期使用而不产生毒力返强，培养生产更为容易的布鲁氏菌疫苗对保证食品和公共卫生安全，保护人民健康，维护社会稳定，促进养殖业可持续发展等具有重要意义。

发明内容

本发明提供一种共表达布鲁氏菌重组腺病毒，以及这种病毒的制备方法和用途。

本发明的共表达布鲁氏菌重组腺病毒活载体中包括有布鲁氏菌L7/L12和BCSP31基因，其序列为SEQ№1，并以复制缺陷型Ad5腺病毒为载体。

本发明的含有布鲁氏菌L7/L12和BCSP31基因的共表达重组腺病毒制备方法是：

a.从流产布鲁氏菌2型CVCC 12株提取细菌总DNA，以此为模板，分别以SEQ2、SEQ3和SEQ4、SEQ5为引物进行聚合酶链式反应，得到L7/L12和BCSP31目的蛋白基因；

b.将阳性pMD-LL和pQCXIX Retroviral Vector质粒，用Not I和BamH I内切酶分别进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定并用胶回收试剂盒进行切胶纯化，再将回收后的L7/L12目的基因用T4DNA连接酶连入pQCXIX载体的MCS I位点中，同法用Mlu I和Xho I内切酶将BCSP31基因定向克隆于pQCXIX载体的MCS II位点；

c.将b步骤得到的带有外源性目的基因的pQCXIX转化JM109感受态细胞，获得阳性质粒pQC-LL/BP；

e.将pQC-LL/BP和pShuttle-CMV质粒，用Not I和Xho I内切酶分别进行双酶切，纯化回收L7/L12-IRES-BCSP31目的片段和线性化的pShuttle-CMV载体片段，再将两种回收产物用T4DNA连接酶进行定向连接，然后转化E.coliJM109感受态细胞，在含kan抗性的琼脂平板上挑取单克隆，并于LB液体抗性培养基中增菌后，得到阳性质粒pSh-LL/BP；

f.将pSh-LL/BP阳性质粒，进行Pme I单酶切后，用乙醇沉淀法收获线性化的重组腺病毒穿梭载体pSh-LL/BP；

g.将pAdEasy-1空腺病毒骨架载体常规CaCl₂法转化BJ5183感受态细胞，得到BJ5183-AD-1细菌；

h.挑选有氨苄抗性的BJ5183-AD-1单克隆菌落，接种于无抗生素LB培养基，37℃，220rpm摇床培养12～14h，制成宿主液；

i.将经线性化的重组腺病毒穿梭载体pSh-LL/BP和含有骨架载体pAdEasy-1的BJ5183细菌感受态细胞转移到冰预电转移杯中进行电转化处理，得到含有SEQ1序列的重组腺病毒阳性质粒pAd-LL/BP，再用阳性pAd-LL/BP转化DH10B感受态细胞；

j.纯化h步骤得到的DH10B感受态细胞，并进行线性化处理，将线性化的重组腺病毒骨架质粒转染293AD细胞，得到含有布鲁氏菌L7/L12和BCSP31基因的共表达重组腺病毒Ad-LL/BP。

本发明的共表达布鲁氏菌重组腺病毒活载体可在制备布鲁氏菌疫苗中的应用。

本发明的共表达布鲁氏菌重组腺病毒可为动物布鲁氏菌提供一种更为安全的分子疫苗或免疫制剂，可刺激机体产生特异性抗体，有效诱导以细胞免疫为主的免疫应答反应。

本发明的腺病毒活载体制备的疫苗不存在毒力返强的安全隐患，还具有外源基因容量大，宿主范围广，可获得较高滴度的抗原，并容易浓缩和纯化，疫苗免疫方便等优点。

相关实验表明，本发明具有如下优点：(1)采用人腺病毒血清5型载体为表达载体，可对目的蛋白进行有效表达，而且有效诱导以细胞免疫为主的免疫应答反应，具有良好的免疫原性；(2)本发明采用第三代腺病毒载体，仅保留了两端非编码基因倒置重复序列与包装信号，不存在毒力返强危险，这也在实践中得到了证实，如用该载体制备的其它腺病毒疫苗或表达载体已在人和动物上多有应用，实施例3结果也表明本发明所构建的共表达重组腺病毒对小鼠没有致病性，感染后不出现临床征状，没有毒性反应，安全性良好；(3)本发明实现了布鲁氏菌L7/L12和BCSP31双基因重组腺病毒共表达，并获得了较高的滴度，滴度可达10^9.68TCID₅₀/mL。(4)腺病毒颗粒相对稳定，容易浓缩和纯化(具体见实施例2中PCR稳定性鉴定及重组腺病毒TCID₅₀测定)。

附图说明

图1为重组腺病毒在293AD细胞上引起的细胞病变；A：转染后7天的CPE；B：接度感染后48h的CPE；C：正常对照细胞。

图2为重组腺病毒Ad-LL/BP的PCR鉴定；M：DL2000分子量标准；N：阴性对照；1，2，3和8：分别为第5、10、15和20代腺病毒L7/L12基因PCR产物；4～7：分别为第5、10、15和20代腺病毒BCSP31基因PCR产物。

图3为间接免疫荧光法检测重组腺病毒L7/L12及BCSP31基因表达；A：重组腺病毒Ad-LL/BP感染的293AD细胞；B：空载体Ad-CMV感染的293AD细胞。

图4为Western blot检测重组腺病毒L7/L12及BCSP31蛋白的表达；M：蛋白质分子量标准；N：空载体Ad-CMV感染的293AD细胞；1和2：重组腺病毒Ad-LL/BP感染的293AD细胞。

图5为ELISA检测免疫小鼠血清IgG特异性抗体。

图6为末次免疫后2周小鼠血清IgG1和IgG2a抗体比较。

具体实施方式

以下结合实施例来进一步详细描述本发明。这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。可在不偏离本发明的精神和范围下对本发明技术方案细节进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围内。

本发明主要实验材料：

菌株、细胞和载体：流产布鲁氏菌2型CVCC 12株购自中国兽医药品监察所；人胚肾细胞293AD引进自美国Cell Biolabs，Inc.；腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV购自美国Stratagene公司；通用腺病毒骨架载体pAdEasy-1、大肠杆菌BJ5183、DH10B购自上海杰美基因医药科技有限公司；pQCXIX RetroviralVector购自Clontech Laboratories，Inc.；pMD 18-T simple vector、E.coli JM 109和其感受态细胞由宝生物工程公司提供。

主要试剂和工具酶：Premix Ex Taq DNA聚合酶，T4 DNA Ligase，DL2000分子量标准，Not I、BamH I、Mlu I、Xho I，以及质粒小量提取试剂盒和DNA凝胶回收试剂盒均为TaKaRa公司产品；限制性内切酶Pac I、Pme I购自NEB公司；电转感受态细菌制备试剂盒(GMS60001)购自上海杰美公司；Lipofectamine^TM 2000为Invitrogen产品；DMEM培养基、无血清培养基OPTI-MEM、胎牛血清均为Invitrogen GIBCO产品；布鲁氏菌阴阳性血清为青岛易邦生物工程公司产品；HRP-羊抗兔IgG、FITC-羊抗兔IgG购自北京博奥森生物公司；预染Blue Plus II Protein Marker为南京百斯凯公司产品；Genomic DNA Purification Kit为Promega产品。生物素化抗小鼠IgG1、IgG2a单抗均为BD公司产品；碱性磷酸酶标记的链酶亲和素Streptavidin/AP购自Sigma公司；底物PNPP为Amresco公司产品。

实验动物：4～6周龄BALB/c雌性小鼠购自兰州生物制品研究所。

实施例1共表达布鲁氏菌重组腺病毒Ad-LL/BP的构建

1.布鲁氏菌L7/L12和BCSP31目的基因的克隆

用

Genomic DNA Purification Kit，从流产布鲁氏菌2型CVCC 12株提取细菌总DNA，以此为模板通过聚合酶链式反应，扩增到375bp的L7/L12和990bp的BCSP31目的蛋白基因；扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，用TaKaRa公司凝胶回收试剂盒进行DNA目的基因片段回收纯化，并分别将L7/L12和BCSP31基因克隆到pMD18-T载体，获得的阳性质粒分别命名为pMD-LL和pMD-BP。本实验所用的引物由宝生物工程公司合成，序列如下：

2.重组pQC-LL/BP载体的构建

将阳性pMD-LL和pQCXIX Retroviral Vector质粒，用Not I和BamH I内切酶分别进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定并用胶回收试剂盒进行切胶纯化，将回收后的L7/L12目的基因用T4DNA连接酶连入pQCXIX载体的MCS I位点中；同理用Mlu I和Xho I内切酶将BCSP31基因定向克隆于pQCXIX载体的MCS II位点；转化JM109感受态细胞，经PCR和酶切鉴定阳性质粒命名为pQC-LL/BP。

3.重组腺病毒穿梭载体pSh-LL/BP的构建

将pQC-LL/BP和pShuttle-CMV质粒，用Not I和Xho I内切酶分别进行37℃过夜双酶切，纯化回收L7/L12-IRES-BCSP31目的片段和线性化的pShuttle-CMV载体片段。两种回收产物即可用T4 DNA连接酶进行定向连接，然后转化E.coliJM109感受态细胞，在含kan抗性的琼脂平板上挑取单克隆，并于LB液体抗性培养基中增菌后，提取质粒经测序鉴定，其阳性质粒命名为pSh-LL/BP。测序结果见SEQ 1：L7/L12-IRES-BCSP31序列长1967bp，和预期大小一致，其中1～375bp为L7/L12序列，后376～977bp为IRES序列，978～1967bp为BCSP31序列。

4.同源重组用线性化重组腺病毒穿梭载体的获得

提取pSh-LL/BP阳性质粒，进行Pme I单酶切，酶切总体系为100μL，其中pSh-LL/BP质粒(0.1μg/μL)58μL，10×NE Buffer 10μL，Pme I酶2μL，100×BSA 1μL，双蒸水29μL；经37℃过夜酶切后，进行琼脂糖凝胶电泳分析，酶切完全后，乙醇沉淀法收获线性化的重组腺病毒穿梭载体pSh-LL/BP。

5.腺病毒骨架载体工程菌BJ5183-AD-1的制备

(1)将1μL pAdEasy-1质粒，无菌条件加入到制备好的200μL BJ5183感受态细胞中，温和摇匀，冰浴30min。

(2)42℃水浴热激90s，快速冰浴3min使之冷却。

(3)加入37℃预热的800μL LB培养液，37℃，200rpm培养1h，使细胞恢复抗药性。

(4)4℃，4000rpm离心5min，弃上清使剩余200μL。

(5)悬浮后，均匀涂布于含50μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂板上，37℃温箱过夜培养。

(6)将菌液抽提质粒，进行琼脂糖凝胶电泳鉴定为阳性者，命名为BJ5183-AD-1细菌。

6.电转BJ5183-AD-1感受态细胞的制备

挑选有氨苄抗性的BJ5183-AD-1单克隆菌落，接种6mL无抗生素LB培养基，37℃，220rpm摇床培养12～14h，制成宿主液(Reagent B)。然后使用上海杰美公司电转感受态细菌制备试剂盒(GMS60001)进行BJ5183-AD-1电转感受态细胞的制备。

7.电转化BJ5183-AD-1细菌感受态细胞及在DH10B菌中扩增

(1)将直径为2.0mm的电转杯冰浴20min。

(2)取Pme I线性化，酚氯仿抽提，乙醇沉淀纯化回收的重组穿梭质粒10μL(1μg)以及含有骨架载体pAdEasy-1的BJ5183细菌感受态细胞40μL，转移到冰预电转移杯中，混匀，轻轻敲击台面，使内容物沉底，避免气泡，冰上放置10min。

(3)将电转杯放在电击仪上电击一次：电压2500V，电阻200Ω，电容25μF，时间5ms。

(4)电击结束，移入到1.5mL离心管，加入盛有650μL 37℃预热的LB培养液，混匀。

(5)37℃，220rpm震荡培养40min。

(6)分别按100μL、200μL、400μL涂布卡那霉素抗性LB平板，37℃恒温培养20h。

(7)挑选同一平板上比正常菌落小三分之一的菌落，接种于含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基里，37℃，220rpm震荡培养15h。

(8)抽提质粒，并进行PCR、酶切鉴定，阳性质粒命名为pAd-LL/BP。

(9)将阳性pAd-LL/BP转化DH10B感受态细胞，获得大量高质量质粒。

8.复制缺陷型重组腺病毒的包装与传代

(1)用质粒纯化试剂盒从由上述(9)步骤得到的阳性pAd-LL/BP转化的DH10B菌中纯化重组腺病毒质粒，用限制性内切酶Pac I进行阳性重组质粒的线性化，以完全切去ori和卡那霉素抗性基因等质粒构件，并暴露其反转末端重复序列ITR；酶切总体系为100μL，其中10×NE Buffer 10μL，pAd-LL/BP质粒(0.1μg/μL)60μL，Pac I酶3μL，100×BSA 1μL，双蒸水26μL；37℃过夜酶切后，进行0.7％的琼脂糖凝胶电泳，证实酶切完全后，用乙醇沉淀法回收DNA酶切产物。最后用紫外分光光度计测定其OD260和OD280，计算其含量与纯度。

(2)将线性化的重组腺病毒骨架质粒转染至293AD细胞，同时将空载穿梭质粒pShuttle-CMV制备成非重组腺病毒Ad-CMV作为阴性对照。具体操作按LipofectamineTM 2000产品说明书进行。

(3)转染细胞培养7～12d，每2～3d可半量换液，逐日观察细胞，待有较明显的蚀斑形成或细胞快要脱落时，振荡细胞瓶将所有细胞一起收集于离心管中，2000rpm，离心8min，吸去上清，细胞沉淀用PBS液重悬(1mL/孔)，然后-70℃/37℃反复冻融3次，收集冻融液于10mL离心管中，12000rpm离心10min，收集上清即为收获的病毒液，命名为Ad-LL/BP1，置于-70℃冻存备用。

(4)将25cm²细胞培养瓶中接毒前24h无抗生素传代的融合度达90％的293AD细胞，用无血清培养基Opti-MEM轻轻洗涤细胞2次，每次5mL；吸去细胞中的无血清培养基后，取Ad-LL/BP1病毒液轻轻接于细胞瓶，3mL/25cm²细胞瓶，温柔晃动使液体铺满瓶底，置37℃，5％ CO₂培养箱静置培养。2h后吸去病毒液，加入10mL含10％FCS而无抗生素的DMEM完全培养基，37℃，5％CO₂培养箱继续培养并观察细胞状态，48～72h后，当有50％CPE出现时，将细胞冻融后收集病毒上清，命名为Ad-LL/BP2，-70℃冻存备用。同样的方法可获得更多代次的重组腺病毒液。

结果显示，pAd-LL/BP经Pac I酶切回收后转染293AD细胞，7d后细胞出现肿胀、变圆、脱落等典型的CPE(图1A)。将细胞收集、冻融、PBS重悬，收集病毒原液，将其继续传代感染3次293AD细胞，均在3～8d出现不同程度CPE，F5代以上病毒的培养细胞均在感染后48h左右出现典型的CPE(图1B)，而使用对照腺病毒液Ad-CMV感染的对照细胞则没有CPE出现(图1C)。表明重组腺病毒Ad-LL/BP包装成功。

实施例2共表达布鲁氏菌重组腺病毒Ad-LL/BP的鉴定

1、PCR鉴定

取100μL Ad-LL/BP4病毒上清液，加入10μL蛋白酶K，56℃消化蛋白1h，煮沸10min使蛋白酶K失活，12000rpm离心6min，取上清即为病毒DNA模板。进行PCR扩增，反应后，取10μL PCR产物，进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。结果在第5、10、15和20代重组腺病毒中均扩增到了375bp的L7/L12和990bp的BCSP31(如图2所示)，证明所构建的重组腺病毒具有良好的稳定性。

2、间接免疫荧光检测重组腺病毒的表达

分别取第10代重组腺病毒Ad-LL/BP和对照Ad-CMV，按每孔400吐病毒液于加有盖玻片的6孔细胞板中感染293AD细胞，2h后吸去病毒液，加入10mL含10％FCS的DMEM完全培养基，37℃，5％CO2培养箱继续培养1～2d按如下步骤进行间接免疫荧光检测：

(1)先吸去6孔板中培养液，PBS洗涤两次，3min/次；待PBS基本挥发后，-20℃预冷的甲醇固定细胞20min；PBS洗涤两次，3min/次。

(2)自然干燥，加入0.1％Tritonx 100作用20min，PBS洗三次，3min/次；加入2％BSA封闭10min后，吸去封闭液，PBS洗三次，3min/次。

(3)加1∶50稀释的布鲁氏菌兔血清，2mL/孔，37℃孵育2h，PBS洗涤3次，3min/次；再加1∶50稀释的FITC-羊抗兔IgG二抗，2mL/孔，室温避光作用1h；PBS洗涤3次后，滴加甘油水溶液封片，荧光显微镜下观察。

间接免疫荧光实验结果显示，重组腺病毒Ad-LL/BP感染的293AD细胞可产生绿色荧光(图3A)，而空载体Ad-CMV感染的293AD细胞则不产生绿色荧光(图3B)，说明转染细胞表达了目的抗原。

3.Western Blot鉴定

将293AD细胞分别感染第10代重组腺病毒Ad-LL/BP和对照Ad-CMV，出现CPE，待细胞脱落超过50％后离心收集细胞，细胞沉淀溶于2×SDS上样缓冲液中，煮沸、离心后取上清进行12％的SDS-PAGE电泳；然后转移至硝酸纤维素膜，取出硝酸纤维素膜，剪下预染蛋白Marker，将转印上蛋白的硝酸纤维素膜进行封闭后，分别与1∶100稀释的一抗布鲁氏菌阳性兔血清和1∶600稀释的HRP-羊抗兔IgG二抗作用，于DAB底物中显色，进行蛋白表达分析。结果发现重组腺病毒Ad-LL/BP有两条大小分别约36.3KD和13.8KD的特异性蛋白条带(如图4泳道1和2)，与预期大小一致，而对照Ad-CMV无目的蛋白条带产生，说明构建的重组腺病毒可以共表达目的蛋白，且具有良好的反应原性。

4.重组腺病毒TCID₅₀测定

收集200mL第10代以后的Ad-LL/BP感染细胞裂解上清，经CsCl密度梯度离心纯化后，用DMEM维持液将CsCl密度梯度离心纯化的病毒液从1∶10起作10倍梯度稀释，然后分别接种于293AD细胞融合度达95％的96孔培养板，每个稀释度接种5孔，每孔100μL，同时设对照孔。5％ CO₂ 37℃饱和湿度静置培养3～5d，观察病变，记录每个稀释度出现细胞病变的孔数，按Read-Muenels法，计算病毒TCID₅₀(参考《动物病毒学》第二版)。

重组腺病毒10倍比稀释后接种293细胞，培养4d，观察CPE，结果如下表1：

表1重组腺病毒各稀释度的CPE数

距离比＝(高于50％的百分数-50％)/(高于50％的百分数-低于50％的百分数)＝(85.7-50)/(85.7-33.3)＝0.68

lgTCID50＝高于50％的病毒稀释度的对数+距离比×稀释系数的对数＝-8+0.68×(-1)＝-8.68

即TCID50＝10^-8.68/0.1mL

因此，重组腺病毒Ad-LL/BP的TCID₅₀为10^-8.68/0.1mL

实施例3共表达布鲁氏菌重组腺病毒Ad-LL/BP免疫效果初步研究

1、小鼠免疫接种

以空腺病毒Ad-CMV为对照，选择滴度为10^9.68TCID₅₀/mL的第14代重组腺病毒Ad-LL/BP作为疫苗对其免疫效果进行初步评价。6～8周龄的BALB/c小鼠随机分为3组(实验组、阴性对照组和空白对照组)，每组5只小鼠。试验组用重组腺病毒Ad-LL/BP免疫，阴性对照组用空腺病毒Ad-CMV免疫，空白对照组不进行任何免疫。0.25％盐酸布比卡因肌肉预处理24h后，在盐酸布比卡因预处理的相同部位，实验组每只小鼠左右腓肠肌部位各分别注射50μL重组腺病毒Ad-LL/BP(即共注射100μL/只，含2.4×10⁸TCID₅₀)，阴性对照组则注射相同剂量的空腺病毒Ad-CMV。实验组和阴性对照组每间隔15d加强免疫一次，共免疫三次。

2、样品采集

实验中每只小鼠每次免疫前2d及最后一次免疫后15d断尾，用枪吸取全血于1.5mL Eppendorf管中，37℃数小时后，2500rpm离心10min分离血清，ELISA方法进行特异性抗体检测。待全程免疫结束后15d，采血并处死实验小鼠。

3.血清特异性抗体检测

采用ELISA方法对小鼠血清中特异性抗体IgG、IgG1、IgG2a分别进行检测。

(1)将牛布鲁氏菌A19疫苗株冻干粉取少许，接种于LB培养基，37℃摇床内增菌40h。离心收获菌体，用PBS洗涤2遍，以PBS悬浮，超声破碎20min，以碳酸盐缓冲液稀释后包被酶标板，50μL/孔，包被量1μg/孔。包被后37℃孵育1h，放于4℃过夜。

(2)次日弃去包被液，以PBST洗板3次，甩干。每孔加入50μL含1％牛血清白蛋白(BSA)的PBST，37℃封闭40min。

(3)弃去封闭液，甩干，不用洗板。以封闭液将样品血清作100倍稀释(检测IgG、IgG1、IgG2a)，50μL/孔；阳性对照孔加入1∶500稀释的A19免疫血清抗体。37℃孵育2h。

(4)弃去血清，洗板3次。以PBST将生物素化的羊抗鼠IgG、IgG1、IgG2a的单克隆抗体分别作1∶1000倍稀释，加入酶标板，50μL/孔，37℃孵育2h。

(5)弃去单抗，洗板3次。以PBST将碱性磷酸酶(AP)标记的链霉亲和素作1∶2000倍稀释，加入酶标板，50μL/孔，37℃孵育1h。

(6)弃去AP标记的链霉亲和素，以PBST洗板3次。加入PNPP底物溶液，50μL/孔，37℃避光显色30min，用酶标仪检测405nm处的吸光值(A)。

检测IgG、IgG2a和IgG1抗体水平的高低可以用来推断机体所激发的免疫应答水平，以及免疫反应所偏向的类型；若IgG2a的水平高于IgG1，则以Th1型的细胞免疫反应为主；反之，若IgG1的水平高于IgG2a，则以Th2型的体液免疫反应为主。本实验结果表明(如图5和图6)，空载体对照组和空白对照组IgG、IgG1、IgG2a水平均无显著差异(p＞0.05)，实验组可产生较高水平的IgG抗体，血清IgG、IgG1、IgG2a特异性抗体水平总体上随免疫次数增加和免疫时间延长而逐渐升高，但IgG2a较IgG1升高更快，主要为细胞免疫反应，其次为体液免疫。可见，布鲁氏菌双基因共表达重组腺病毒Ad-LL/BP作为疫苗，对小鼠没有致病性，感染后不出现临床征状，具有良好的免疫原性，可作为疫苗或免疫制剂用于布鲁氏菌病的防制。

Claims (3)

1.共表达布鲁氏菌重组腺病毒活载体，其特征在于共表达布鲁氏菌重组腺病毒活载体中包括有布鲁氏菌L7/L12和BCSP31基因，其序列为SEQ№1，并以复制缺陷型Ad5腺病毒为载体。

2.权利要求1所述的含有布鲁氏菌L7/L12和BCSP31基因的共表达重组腺病毒制备方法，其特征在于：a.从流产布鲁氏菌2型CVCC 12株提取细菌总DNA，以此为模板，分别以SEQ2、SEQ3和SEQ4、SEQ5为引物进行聚合酶链式反应，得到L7/L12和BCSP31目的蛋白基因；

b.将阳性pMD-LL和pQCXIX Retroviral Vector质粒，用Not I和BamH I内切酶分别进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定并用胶回收试剂盒进行切胶纯化，再将回收后的L7/L12目的基因用T4 DNA连接酶连入pQCXIX载体的MCS I位点中，同法用Mlu I和Xho I内切酶将BCSP31基因定向克隆于pQCXIX载体的MCS II位点；

c.将b步骤得到的带有外源性目的基因的pQCXIX转化JM109感受态细胞，获得阳性质粒pQC-LL/BP；

e.将pQC-LL/BP和pShuttle-CMV质粒，用Not I和Xho I内切酶分别进行双酶切，纯化回收L7/L12-IRES-BCSP31目的片段和线性化的pShuttle-CMV载体片段，再将两种回收产物用T4 DNA连接酶进行定向连接，然后转化E.coliJM109感受态细胞，在含kan抗性的琼脂平板上挑取单克隆，并于LB液体抗性培养基中增菌后，得到阳性质粒pSh-LL/BP；

f.将pSh-LL/BP阳性质粒，进行Pme I单酶切后，用乙醇沉淀法收获线性化的重组腺病毒穿梭载体pSh-LL/BP；

g.将pAdEasy-1空腺病毒骨架载体常规CaCl₂法转化BJ5183感受态细胞，得到BJ5183-AD-1细菌；

h.挑选有氨苄抗性的BJ5183-AD-1单克隆菌落，接种于无抗生素LB培养基，37℃，220rpm摇床培养12～14h，制成宿主液；

i.将经线性化的重组腺病毒穿梭载体pSh-LL/BP和含有骨架载体pAdEasy-1的BJ5183细菌感受态细胞转移到冰预电转移杯中进行电转化处理，得到含有SEQ1序列的重组腺病毒阳性质粒pAd-LL/BP，再用阳性pAd-LL/BP转化DH10B感受态细胞；

j.纯化h步骤得到的DH10B感受态细胞，并进行线性化处理，将线性化的重组腺病毒骨架质粒转染293AD细胞，得到含有布鲁氏菌L7/L12和BCSP31基因的共表达重组腺病毒Ad-LL/BP。

3.权利要求1所述的共表达布鲁氏菌重组腺病毒活载体在制备布鲁氏菌疫苗中的应用。

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