CN101020064A - 一种布鲁氏杆菌核酸疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种布鲁氏杆菌核酸疫苗。该布鲁氏杆菌核酸疫苗，它的活性成分是下述任一种混合物：1)将BCSP31、sodC和L7/L12基因分别克隆到真核细胞表达载体中，得到含有BCSP31基因的重组表达载体、含有sodC基因的重组表达载体和含有L7/L12基因的重组表达载体，将所述至少两种重组表达载体进行混合得到的混合物；2)将BCSP31、sodC和L7/L12三种基因分别与其它核酸序列融合或缺失部分序列或部分核苷酸突变后的且可编码与BCSP31、sodC和L7/L12具有相同活性蛋白的核苷酸序列，分别克隆到真核细胞表达载体中，将得到的至少两种重组表达载体进行混合得到的混合物。本发明的布鲁氏杆菌核酸疫苗可用于人畜布鲁氏病的预防。

Description

一种布鲁氏杆菌核酸疫苗

技术领域

本发明涉及一种布鲁氏杆菌核酸疫苗。

背景技术

布鲁氏病是全球范围的一种人畜共患的慢性消耗性传染病，由一种名为布鲁氏杆菌的革兰氏阴性兼性胞内寄生菌所致，在人类，牛，羊，啮齿类，猪等哺乳动物中有广泛传播。在畜牧重要的物种中，此病可极大的导致动物生殖能力的丧失；对于人类，则会出现间断性的发热等临床症状，故而又被称为波热症。疫苗免疫对于防治布鲁氏病至关重要。S19减毒活菌疫苗是最早并且最为广泛的在牛群中应用的一种疫苗。尽管此疫苗能产生一定的保护力，但是它持续的血清学反应致使人们不能区分免疫与感染的牛。另外此疫苗对人类是致病的，且可致使孕期牛流产。类似的疫苗诸如Rev1或RB51都存在稳定性及有效性方面的缺陷。

DNA疫苗可在很多疾病的动物模型上被证实可诱导体液及细胞免疫应答；因此，DNA疫苗在为新的布鲁氏杆菌的替代疫苗创造了一个新的机会。目前，人们已研究了一些转载了编码L7/L12、SOD、P39或喋啶合成酶等基因的真核表达体系在模式动物中的保护作用。最近，编码羊布鲁氏杆菌31kDa膜蛋白的单价DNA疫苗被证实可激发特异的细胞杀伤作用。然而，以上所述的疫苗中没有一个保护作用比目前使用的S19或H38疫苗效果更好。

发明内容

本发明的目的是提供一种布鲁氏杆菌核酸疫苗。

本发明所提供的布鲁氏杆菌核酸疫苗，它的活性成分是下述任一种混合物：

1)将BCSP31、sodC(Copper/Zinc superoxide dismutase)和L7/L12基因分别克隆到真核细胞表达载体中，得到含有BCSP31基因的重组表达载体、含有sodC基因的重组表达载体和含有L7/L12基因的重组表达载体，将所述至少两种重组表达载体进行混合得到的混合物；

2)将BCSP31、sodC(Copper/Zinc superoxide dismutase)和L7/L12三种基因分别与其它核酸序列融合或缺失部分序列或部分核苷酸突变后的且可编码与BCSP31、sodC(Copper/Zinc superoxide dismutase)和L7/L12具有相同活性蛋白的核苷酸序列，分别克隆到真核细胞表达载体中，将得到的至少两种重组表达载体进行混合得到的混合物。

所述布鲁氏杆菌核酸疫苗的活性成分优选为将BCSP31、sodC和L7/L12基因分别克隆到真核细胞表达载体中，得到含有BCSP31基因的重组表达载体、含有sodC基因的重组表达载体和含有L7/L12基因的重组表达载体，将所述三种重组表达载体进行混合得到的混合物。

所述BCSP31的氨基酸序列如GenBank Accession Number M20404；sodC(Copper/Zinc superoxide dismutase)的氨基酸序列如GenBank Accession NumberYP_418725；L7/L12的氨基酸序列如GenBank Accession Number L19101。

所述BCSP31基因的核苷酸序列如GenBank Accession Number M20404；sodC基因的核苷酸序列如GenBank Accession Number NC_007624；L7/L12的核苷酸序列如GenBank Accession Number L19101。

所述三种重组表达载体的重量份数比可为1∶1∶1。

所述真核表达载体可为带有真核表达启动子的表达载体，如巨细胞病毒(CMV)早期基因启动子，老鼠看家基因的启动子等，优选为哺乳动物细胞表达载体，如pJW4303。

动物表达载体pJW4303，其物理图谱如图7所示，其序列如序列表中序列1所示。带有巨细胞病毒(CMV)早期基因启动子，是保证目的基因在肌肉细胞中高效转录的强启动子。该载体还带有组织血纤维蛋白溶酶原激活剂的胞外分泌信号序列，定向克隆在这一信号序列下游的外源基因产物能被成功地分泌到胞外，增加了抗原与巨噬细胞的接触机会，加速了依赖于蛋白酶体的内源性合成抗原的降解，导致体内诱导的细胞介导的应答增强。此外，pJW4303含有11个CpG序列，在DNA疫苗诱发机体产生免疫应答中起重要作用，可在无T细胞存在的情况下直接激活B细胞，刺激分泌免疫球蛋白及白细胞介素6，也可直接激活单核细胞、巨噬细胞及树突状细胞，上调共刺激分子的表达，有利于产生多种Th1型细胞因子，提高了保护性免疫力。

所述哺乳动物细胞表达载体包括质粒载体和病毒载体两大类。如不带真核复制起始序列的质粒型表达载体pTK2、pHyg和pRSVneo等，带真核病毒调控序列元件的质粒表达载体、SV40衍生的表达载体pMSG、pSVT7和pMT2等，牛乳头瘤病毒(BPV)衍生载体，人疱疹病毒(EBV)衍生的表达载体，人腺病毒衍生的表达载体，反转录病毒衍生的表达载体。

所述布鲁氏杆菌核酸疫苗的活性成分优选为pJBCSP31、pJsodC和pJL7/L12。

上述布鲁氏杆菌核酸疫苗中还含有佐剂IL-12、IL-15、DDA(双十八烷基二甲基溴化铵)，MPL(单磷酰脂质体A)，Quil-A(皂素的纯化物)，RIBI adjuvant(美国RIBI ImmunoChem研究股份有限公司生产)和/或其它佐剂(铝佐剂，弗氏佐剂等)。该疫苗中，活性成分与DDA或MPL的重量份数比可为5∶6，与其它佐剂的重量份数比可为3∶1；活性成分在saline中的浓度可为1mg/ml。

本发明的布鲁氏杆菌核酸疫苗可用于预防和/或治疗动物布鲁氏病，特别是预防和/或治疗人、牛、羊布鲁氏病。使用时，可分三次或更多次免疫，每次免疫剂量可为50-100mg活性成分/50kg体重。

本发明的布鲁氏杆菌核酸疫苗诱导机体产生的BCSP31、sodC和L7/L12的特异性IgG抗体反应水平显著高于S19疫苗。布鲁氏杆菌核酸疫苗免疫过的小鼠能够产生对布鲁氏杆菌有效而长期的免疫性并激发显著的Th1 cytokine反应。布鲁氏杆菌核酸疫苗诱导的BCSP31、sodC、L7/L12及Brucella(Brucella全蛋白提取物)特异性的IFN-γ细胞数量明显高于S19疫苗。布鲁氏杆菌核酸疫苗诱导的T细胞水平较S19疫苗高40％，其中以CD8⁺T细胞为主。布鲁氏杆菌核酸疫苗对小鼠的保护效率明显高于S19疫苗。表明本发明的布鲁氏杆菌核酸疫苗可以取代传统的S19疫苗用于布鲁氏病的预防。

本发明的布鲁氏杆菌核酸疫苗不仅增强了免疫动物的机体体液应答反应，同时增强了细胞介导的免疫反应，而后者是提高DNA疫苗效率的重要前提条件，更重要的是本发明的布鲁氏杆菌核酸疫苗极大增强了特异杀伤布鲁氏杆菌的细胞水平。如果加上佐剂IL-12或IL-15不仅可提高TH1型细胞反应，更可延长核酸疫苗的保护期。

本发明使用编码BCSP31、sodC、L7/L12的联合DNA疫苗策略来提高DNA疫苗对布鲁氏病的效用。BCSP31蛋白是免疫主导蛋白，而sodC和L7/L12也已被证实可以引起一定的免疫反应。

本发明的布鲁氏杆菌核酸疫苗容易生产，稳定性强，较安全，不会感染人或牛。本发明的布鲁氏杆菌疫苗与现有的布鲁氏杆菌核酸疫苗的不同之处在于本发明的布鲁氏杆菌核酸疫苗免疫动物后，由于载体高效的表达水平，确保了抗原高效持续表达并分泌到胞外。本发明可使用佐剂DDA等提高疫苗的保护效率。本发明的布鲁氏杆菌疫苗目前已在大型动物牛上进行试验，取得了非常明显保护效率。如果用该布鲁氏杆菌疫苗免疫牛，必将大大减少牛患结核的机率，保证牛肉及牛奶的产量和质量。如果用该布鲁氏杆菌核酸疫苗免疫人，不但能让人体产生对布鲁氏杆菌的免疫力，而且不会有被感染可能，增强了疫苗的安全性。总之，本发明的布鲁氏杆菌核酸疫苗对提高动物及人类对布鲁氏杆菌的免疫力，更有效地控制布鲁氏病的传播和流行，繁荣畜牧业及增强人类体质具有重要的理论意义和应用价值。

附图说明

图1A为RT-PCR鉴定布鲁氏杆菌核酸疫苗免疫小鼠中BCSP31、sodC和L7/L12基因的表达结果

图1B为pJBCSP31GFP、pJsodCGFP或pJL7/L12GFP免疫小鼠中BCSP31、sodC和L7/L12的表达结果

图2A为初次免疫后0、3、6和9周的特异性IgG水平

图2B为初次免疫后9周的特异性IgG水平

图2C为初次免疫后9周的特异性IgG1和IgG2a水平

图3为免疫后四周的脾脏细胞培养上清中特异性细胞因子水平柱形图

图4为IFN-γ的ELISPOT分析结果

图5为疫苗诱导产生的免疫小鼠抗原特异性杀伤性T细胞水平的柱形图

图6为免疫小鼠的颗粒酶ELISPOT鉴定结果

图7为动物表达载体pJW4303的物理图谱

具体实施方式

下述实施例中的方法如无特别说明，均为常规方法。

实施例1、布鲁氏杆菌疫苗的制备

1、真核表达载体的构建：

用PCR方法扩增布鲁氏杆菌的BCSP31、sodC和L7/L12基因并克隆到真核表达载体pJW4303上用于在真核细胞内表达。GenBank收录号分别为：BCSP31：M20404；sodC：NC_007624；L7/L12：L19101。以常规方法提取的牛布鲁氏杆菌(Brucellaabortus 2308)(购自中国药品生物制品检定所)基因组DNA为模板，用PCR扩增BCSP31、sodC和L7/L12基因并定向克隆到pJW4303载体上的组织血纤维蛋白溶酶原激活剂(TPA)信号序列下游，形成融合蛋白。扩增BCSP31所用的引物序列如下：5’-GCTAGCCATATGAAATTCGGAAGCAAAATCCGTC-3’和5’-CGGGATCCTTATTTCAGCACGCCCGCTTCC-3’；扩增sodC所用的引物序列如下：5’-GCTAGCCATATGAAAAAACGGCTT-3’和5’-CGGGATCCTTACTTTTTCTTCATATC-3’；扩增L7/L12所用的引物序列如下：：5’-GCTAGCCATATGATGGCTGATCTCGCAAAGATCG-3’和5’-CGGGATCCTTACTTGAGTTCAACCTTGGCGCCAGC-3’。5’端引物都含Nhe I位点，3’端引物都含有BamH I位点。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后按QIAquick GelExtraction Kit说明书操作回收，得到目的基因。分别用Nhe I和BamH I双酶切经凝胶纯化的目的基因产物及pJW4303载体DNA，用T₄DNA连接酶处理16h(16℃)，取5μl连接产物(总体积20μl)转化感受态大肠杆菌DH5α菌株。挑取转化菌单菌落抽提质粒，Nhe I和BamH I双酶切鉴定后进行序列分析以证实插入片段序列是否正确。分别选取3个含有不同目的基因表达载体的菌株进行DNA序列分析，以获取带有正确读码框的表达载体，把含有BCSP31基因的表达载体命名为pJBCSP31，把含有sodC基因的表达载体命名为pJsodC，把含有L7/L12基因的表达载体命名为pJL7/L12。将pJBCSP31、pJsodC和pJL7/L12转化到TOP10大肠杆菌中，在含100μg/ml氨苄青霉素(Amp)的LB培养基中再次筛选重组菌株，用QIAGEN PlasmidMaxi Kit和Mega Kit大量制备质粒DNA，用灭菌生理盐水稀释成浓度为1-2μg/μl，紫外分光光度计定量。

2、布鲁氏杆菌疫苗的制备：将pJBCSP31、pJsodC和pJL7/L12等量混匀，用生理盐水或磷酸缓冲液(PBS)溶解，制成布鲁氏杆菌核酸疫苗。

实施例2、布鲁氏杆菌核酸疫苗在体内表达的鉴定

1、RT-PCR鉴定BCSP31、sodC和L7/L12基因的表达

将20只C57BL/6小鼠均分为2组，分别进行如下处理：第一组为非免疫组(对照)，每只肌肉注射含有150μg pJW4303的150μl生理盐水；第二组为布鲁氏杆菌核酸疫苗组，取实施例1中制备的质粒pJBCSP31、pJsodC和pJL7/L12各50μg，共同溶于150μl生理盐水中，混匀，得到布鲁氏杆菌核酸疫苗。将该布鲁氏杆菌核酸疫苗肌肉注射免疫，免疫剂量为150μl/只。免疫完成后四周，每组各取10只小鼠脾脏，使用Trizol试剂(美国Gibco公司)提取其总RNA。而后反转录成cDNA，以此作为模板，使用BCSP31、sodC和L7/L12三种抗原基因的特异性引物进行PCR扩增，以鉴定三种基因是否表达。其中，扩增BCSP31所用的引物序列如下：5’-GCTAGCCATATGAAATTCGGAAGCAAAATCCGTC-3’和5’-CGGGATCCTTATTTCAGCACGCCCGCTTCC-3’；扩增sodC所用的引物序列如下：5’-GCTAGCCATATGAAGTCCTTATTT-3’和5’-CGGGATCCTTATTCGATCACGCC-3’；扩增L7/L12所用的引物序列如下：：5’-GCTAGCCATATGATGGCTGATCTCGCAAAGATCG-3’和5’-CGGGATCCTTACTTGAGTTCAACCTTGGCGCCAGC-3’。

结果表明免疫后4周，所检测的10只免疫布鲁氏杆菌核酸疫苗的小鼠，在脾脏中均表达BCSP31、sodC和L7/L12基因；而免疫pJW4303的10只小鼠，在脾脏中无BCSP31、sodC和L7/L12基因的表达(图1A)。图1A中，“+R”表示反转录后扩增，“-R”表示没有反转录就扩增。

2、体内蛋白表达的鉴定

(1)以常规方法提取的牛布鲁氏杆菌(Brucella abortus 2308)(购自中国药品生物制品检定所)基因组DNA为模板，使用BCSP31、sodC和L7/L12三种抗原基因的特异性引物进行PCR扩增。其中，扩增BCSP31所用的引物序列如下：5’-GCTAGCCATATGAAATTCGGAAGCAAAATCCGTC-3’和5’-CGGGATCCTTATTTCAGCACGCCCGCTTCC-3’；扩增sodC所用的引物序列如下：5’-GCTAGCCATATGAAGTCCTTATTT-3’和5’-CGGGATCCTTATTCGATCACGCC-3’；扩增L7/L12所用的引物序列如下：：5’-GCTAGCCATATGATGGCTGATCTCGCAAAGATCG-3’和5’-CGGGATCCTTACTTGAGTTCAACCTTGGCGCCAGC-3’。将PCR得到的BCSP31、sodC和L7/L12三种抗原基因分别克隆到哺乳动物真核表达载体pEGFP-N1中(购自美国Clontech Laboratories公司)的限制性内切酶NheI和BamH I位点间，得到含有GFP蛋白基因与BCSP31融合基因的重组表达载体pJBCSP31GFP、含有GFP蛋白基因与sodC融合基因的重组表达载体pJsodCGFP、含有GFP蛋白基因与L7/L12融合基因的重组表达载体pJL7/L12GFP。

(2)免疫小鼠

按照文献Cai et al.，2005，Vaccine 23，4167-4174中的方法，将50μgpJBCSP31GFP、50μg pJsodCGFP或50μg pJL7/L12GFP分别与150μl印度墨水混合后，分别注射于C57BL/6小鼠小腿中部。同时将50μg pJW4303与150μl印度墨水混合后，注射于C57BL/6小鼠小腿中部，作为对照。每种处理各10只小鼠。两周后，将注射部位肌肉分离出来，固定后，切片厚约10μm，于荧光显微镜下观察，结果表明免疫后2周，所检测的10只免疫pJBCSP31GFP的小鼠肌肉组织中，均表达BCSP31；所检测的10只免疫pJsodCGFP的小鼠肌肉组织中，均表达sodC；所检测的10只免疫pJ L7/L12GFP的小鼠肌肉组织中，均表达L7/L12；所检测的10只免疫pJW4303的小鼠肌肉组织中，均无BCSP31、sodC和L7/L12表达(图1B)。图1B中，DNA表示注射pJBCSP31GFP、pJsodCGFP或pJL7/L12GFP的小鼠肌肉组织，Vector表示注射pJW4303的小鼠肌肉组织。

实施例3、布鲁氏杆菌核酸疫苗的免疫效果实验：

将60只C57BL/6小鼠均分为4组，分别进行如下处理：第一组为布鲁氏杆菌核酸疫苗组，实施例1中制备的质粒pJBCSP31、pJsodC和pJL7/L12各50μg，共同溶于150μl生理盐水中，混匀，得到布鲁氏杆菌核酸疫苗。对小鼠进行三次肌肉注射免疫，免疫剂量为150μl/只/次，时间点为第0周，第3周，第6周。第二组为S19疫苗组，1×10⁹CFU S19冻干蛋白(购自中国药品生物制品检定所，编号040611，批准文号：新生药字(2001)287710)用150μl生理盐水溶解，得到S19疫苗；对小鼠进行三次肌肉注射免疫，免疫剂量为150μl/只/次，时间点为第0周，第3周，第6周。第三组为空载体组，将50μg pJW4303溶于150μl生理盐水中，得到空载体疫苗；对小鼠进行三次肌肉注射免疫，免疫剂量为150μl/只/次，时间点为第0周，第3周，第6周。第四组为生理盐水组，每只于第0周注射150μl生理盐水。对这四组免疫处理的小鼠进行如下实验。

1、免疫后体液免疫反应的鉴定：

(1)L7/L12、sodC、BCSP31抗原的制备

以常规方法提取的牛布鲁氏杆菌(Brucella abortus 2308)(购自中国药品生物制品检定所)基因组DNA为模板，用PCR扩增BCSP31、sodC和L7/L12基因。其中，扩增BCSP31所用的引物序列如下：5’-GCTAGCCATATGAAATTCGGAAGCAAAATCCGTC-3’和5’-CAGCTCGAGTTTCAGCACGCCCGCTTCCTTGTAAAAGC-3’(XhoI位点)；扩增sodC所用的引物序列如下：5’-CAGCTCGAGTTACTTTTTCTTCATATC-3’(XhoI位点)和5’-CGGGATCCTTACTTTTTCTTCATATC-3’；扩增L7/L12所用的引物序列如下：：5’-GCTAGCCATATGATGGCTGATCTCGCAAAGATCG-3’和5’-CAGCTCGAGCTTGAGTTCAACCTTGGCGCCAGCAGC-3’(Xho I位点)。

将PCR扩增BCSP31、sodC和L7/L12基因分别克隆到pET22b(+)(购自Novagen公司)中的限制性内切酶NdeI和XhoI位点间，得到含有BCSP31的重组载体pET-BCSP31，含有sodC的重组载体pET-sodC，含有L7/L12的重组载体pET-L7/L12。将重组载体pET-BCSP31、pET-sodC或pET-L7/L12转入大肠杆菌DE3BL21(plySs)后，表达用0.6μM IPTG 37℃诱导4小时。按照pET22b(+)使用说明书纯化得到L7/L12、sodC、BCSP31抗原。

(2)免疫后体液免疫反应的鉴定：

小鼠各次免疫后血清中BCSP31、sodC、L7/L12和布氏杆菌全蛋白特异的IgG及其亚型IgG1、IgG2a的测定，使用间接ELISA的方法进行测定。免疫小鼠的血清分别从1∶100开始2倍系列稀释后用于检测，L7/L12、sodC、BCSP31抗原以及PPD抗原(牛布鲁氏杆菌(Brucella abortus 2308)的总蛋白)用包被液(0.05mol/LpH9.6碳酸盐缓冲液)稀释至10μg/ml，分别加入96孔酶标板(NUNC)，100μl/每孔，4℃过夜，用洗涤液(PBS/Tween0.05％)洗涤3次。每孔加入200μl封闭液(5％脱脂奶粉PBS-Tween 0.05％)，置37℃恒温箱封闭60min，按上法洗涤3次。加待测血清，置37℃恒温箱2h，反复洗涤3次。加1∶2000稀释的抗抗体-酶标抗体HRP标记的兔抗鼠IgG，IgG1或IgG2a(购自英国Serotec公司)每孔加100μl，置37℃温育2h，洗涤3次，用TMB(四甲基联苯胺二盐酸)显色后，测波长450nm吸光度(A)。以正常血清相对应稀释度作为阴性对照，吸光度值0.05以上、实验组吸光度A值/第四组样品吸光度A值≥2.0为阳性。

结果如图2A、图2B和图2C所示，图2A表明抗原特异性的抗体在布鲁氏杆菌核酸疫苗中被诱导，且以初免后9周，抗BCSP31的抗体为最高。图2A为每组5只小鼠的平均值，Brucella表示PPD抗原。

图2B表明，与S19疫苗组比较，三种抗原的特异抗体均存在显著到极显著水平的差异。图2B为每组5只小鼠的平均值，五个实心圆点表示该5只小鼠，Brucella表示PPD抗原。

图2C表明，布鲁氏杆菌核酸疫苗组诱导了高水平的IgG2a，其与IgG1的平均抗体滴度比值达8倍，使得小鼠体内免疫反应具有明显的TH1型倾向性。图2C为每组5只小鼠的平均值，五个实心圆点表示该5只小鼠，Brucella表示PPD抗原。

2、免疫后各种细胞因子的鉴定：末次免疫后四周，每组取5只小鼠脾脏细胞，用5μg/ml的L7/L12、sodC或BCSP31抗原来刺激，同时以10⁸CFU/ml的HKBA(热灭活的牛布鲁氏杆菌(Brucella abortus 2308)作为阳性对照来刺激。刺激后孵育3天。取细胞培养上清，用TH1/TH2型细胞因子磁珠试剂盒(CBA，美国BD公司)来测定包括IFN-γ、IL-4、IL-5、IL-2及TNF-α在内的五种细胞因子。该检测方法的灵敏度为7μg/ml。另外IL-10的测定则以anti-mouse IL-10为抗体(美国eBioscience公司)使用夹心ELISA方法进行。

结果如图3中A至D所示，表明布鲁氏杆菌核酸疫苗组诱导了高水平的IFN-γ，IL-2和TNF-α，这些作为TH1型免疫反应的细胞因子都达到了纳克级水平，显著高于其他免疫组；而TH2型的细胞因子如IL-4和IL-10则只在100pg左右，与生理盐水及空载体组没有明显差异。图3中，A为BCSP31刺激的脾脏细胞培养上清中特异性细胞因子水平柱形图，B为sodC刺激的脾脏细胞培养上清中特异性细胞因子水平柱形图，C为L7/L12刺激的脾脏细胞培养上清中特异性细胞因子水平柱形图，D为HKBA刺激的脾脏细胞培养上清中特异性细胞因子水平柱形图；Saline表示生理盐水组，Vector DNA表示空载体组，S19 Vaccine表示S19疫苗组，DNA Vaccine表示布鲁氏杆菌核酸疫苗组。

3、IFN-γ的ELISPOT分析：将步骤2中分离出来的部分脾细胞铺布于ELISPOT板上，用特异性的抗原L7/L12、sodC或BCSP31(终浓度5μg/ml)或HKBA(10⁸CFU/ml)刺激细胞后，于37℃孵育48小时，去除反应的细胞后，用生物素偶联的IFN-γ抗体(购自美国eBioscience公司)结合并进一步显色。孔中点数即为所铺布脾细胞中分泌干扰素细胞的频率。结果如图4所示，布鲁氏杆菌核酸疫苗组诱导了BCSP31、sodC、L7/L12及Brucella全蛋白(牛布鲁氏杆菌(Brucella abortus2308)超声破碎后，所提的总蛋白)特异性的IFN-γ细胞，实验测得其斑点量一般在90个左右/2×10⁵个脾细胞。而S19疫苗组则一般在40个左右，显著低于布鲁氏杆菌核酸疫苗组。图4中，数值为2×10⁵个脾细胞中的斑点数，单位是个；rBCSP31表示BCSP31刺激的结果、rSOD表示sodC刺激的结果、rL7/L12表示L7/L12刺激的结果、HKBA表示HKBA刺激的结果；Medium表示不加抗原仅用培养基刺激的结果，作为阴性对照。

4、淋巴细胞亚型的鉴定：在末免疫后的6周时间内，外周血单核细胞用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法进行分离，而后使用含有5μg/ml的BCSP31、5μg/mlsodC和5μg/ml L7/L12的抗原溶液来刺激这些细胞。从白细胞中分离的淋巴细胞与大鼠抗小鼠CD3-RPE、CD19-FITC、CD4-FITC、CD8-RPE(购自美国eBioscience公司)共同孵育后，在流式细胞仪上测定，从而分别各种细胞亚型在免疫后的变化情况。

结果如图5所示，A中显示其以CD3和CD19为标记的T和B细胞亚群在免疫后六周中的变化情况及其在第四周时的相对比例(小图)。B中则显示以CD4和CD8为表面分子标记的T4和T8细胞亚群的比例在免疫后六周中的变化。总体看来，免疫后，布鲁氏杆菌核酸疫苗组组诱导了更为强烈的T细胞水平，总体较S19疫苗组高40％，其中以CD8⁺T细胞为主，布鲁氏杆菌核酸疫苗诱导了此类杀伤性细胞的显著升高。图5为每组5只小鼠的平均结果。

5、颗粒酶ELISPOT鉴定：颗粒酶ELISPOT的鉴定用美国Millipore公司的R&D公司的小鼠颗粒酶ELISPOT检测试剂盒来鉴定。先将特异针对颗粒酶B的单克隆抗体(美国Millipore公司的R&D公司的小鼠颗粒酶ELISPOT检测试剂盒自带)包被到PVDF膜上。

在末次免疫后的第6周，各组小鼠外周血单核细胞用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法进行分离，而后分别用5μg/ml的BCSP31、5μg/ml sodC或5μg/ml L7/L12的抗原溶液来刺激这些细胞。刺激后与大鼠抗小鼠CD8-RPE(购自美国eBioscience公司)共同孵育后，用流式细胞仪分离CD8⁺细胞。

将分离的各组CD8⁺细胞和预先转染了pJBCSP31、pJsodC和pJL7/L12的EL4细胞(美国sigma-aldrich公司，产品编号：85023105)一起孵育20h。用没有转染的EL4细胞作为空白对照。靶细胞和EL4相互作用后，会产生颗粒酶，进而与膜上抗体反应，用显色剂显色后即可见其在膜上留下斑点。

结果如图6所示，免疫S19疫苗的小鼠有较为微弱的斑点显示，约40个/2×10⁴个CD8⁺细胞，相比免疫了本发明的布鲁氏杆菌核酸疫苗的小鼠所产生的100个左右/2×10⁴个CD8⁺细胞的斑点来讲具有显著的差异。该实验也验证了细胞杀伤作用是细胞清除布鲁氏杆菌的一个重要途径。图6中，rBCSP31表示BCSP31刺激的结果、rSOD表示sodC刺激的结果、rL7/L12表示L7/L12刺激的结果、Medium表示没有转染的EL4细胞，作为阴性对照。图6为每组5只小鼠的平均实验结果。

6、攻毒实验

末次免疫后第六周，以5×10⁶CFU牛布鲁氏杆菌(Brucella abortus 2308)/只的剂量对各免疫组小鼠实施静脉攻毒，感染后四周小鼠麻醉处死，取脾脏，研磨后涂布于培养基上，37度培养三天后，细菌计数。

结果如表1所示，表明本发明的布鲁氏杆菌核酸疫苗对小鼠取得了高达3.58个单位的保护，明显高于生理盐水及空载体组。而S19疫苗组中S19疫苗对小鼠的保护则只有2.87个单位，明显低于布鲁氏杆菌核酸疫苗组。也就是说，布鲁氏杆菌核酸疫苗组的减菌量是S19疫苗组的5倍，对小鼠有明显的保护作用。

表1.布鲁氏杆菌核酸疫苗对C57BL/6小鼠感染布鲁氏杆菌后的保护作用。

组别	脾脏的细菌计数a
			Log10CFU±SD	保护单位
	第一组：布鲁氏杆菌核酸疫苗组	2.85±0.22**			3.58
第二组：S19疫苗组			3.56±0.31*	2.87
	第三组：空载体组	6.42±0.79			0.01
第四组：盐水组			6.43±0.68

表1中数据由各组10只小鼠平均后取方差而得，实验重复两次进行。

*P＜0.01，**P＜0.001，差异显著性统计依据one-way ANOVA方法，继之以Tukey’s检验进行比较。

                  序列表

<160>1

<210>1

<211>5130

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

gacgtcgcgg ccgctctagg cctccaaaaa agcctcctca ctacttctgg aatagctcag      60

aggccgaggc ggcctcggcc tctgcataaa taaaaaaaat tagtcagcca tgcatggggc     120

ggagaatggg cggaactggg cggagttagg ggcgggatgg gcggagttag gggcgggact     180

atggttgctg actaattgag atgcatgctt tgcatacttc tgcctgctgg ggagcctggg     240

gactttccac acctggttgc tgactaattg agatgcatgc tttgcatact tctgcctgct     300

ggggagcctg gggactttcc acaccctaac tgacacacat tccacagaat taattcccgg     360

ggatcgatcc ggtcgacaat attggctatt ggccattgca tacgttgtat ctatatcata     420

atatgtacat ttatattggc tcatgtccaa tatgaccgcc atgttgacat tgattattga     480

ctagttatta atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc     540

gcgttacata acttacggta aatggcccgc ctcgtgaccg cccaacgacc cccgcccatt     600

gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca     660

atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc     720

aagtccggcc ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt     780

acatgacctt acgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta     840

ccatggtgat gcggttttgg cagtacacca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg     900

gatttccaag tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac     960

gggactttcc aaaatgtcgt aataaccccg ccccgttgac gcaaatgggc ggtaggcgtg    1020

tacggtggga ggtctatata agcagagctc gtttagtgaa ccgtcagatc gcctggagac    1080

gccatccacg ctgttttgac ctccatagaa gacaccggga ccgatccagc ctccgcggcc    1140

gggaacggtg cattggaacg cggattcccc gtgccaagag tgacgtaagt accgcctata    1200

gactctatag gcacacccct ttggctctta tgcatgctat actgtttttg gcttggggcc    1260

tatacacccc cgctccttat gctataggtg atggtatagc ttagcctata ggtgtgggtt    1320

attgaccatt attgaccact cccctattgg tgacgatact ttccattact aatccataac    1380

atggctcttt gccacaacta tctctattgg ctatatgcca atactctgtc cttcagagac    1440

tgacacggac tctgtatttt tacaggatgg ggtcccattt attatttaca aattcacata    1500

tacaacaacg ccgtcccccg tgcccgcagt ttttattaaa catagcgtgg gatctccacg    1560

cgaatctcgg gtacgtgttc cggacatggg ctcttctccg gtagcggcgg agcttccaca    1620

tccgagccct ggtcccatgc ctccagcggc tcatggtcgc tcggcagctc cttgctccta    1680

acagtggagg ccagacttag gcacagcaca atgcccacca ccaccagtgt gccgcacaag    1740

gccgtggcgg tagggtatgt gtctgaaaat gagctcggag attgggctcg caccgtgacg    1800

cagatggaag acttaaggca gcggcagaag aagatgcagg cagctgagtt gttgtattct    1860

gataagagtc agaggtaact cccgttgcgg tgctgttaac ggtggagggc agtgtagtct    1920

gagcagtact cgttgctgcc gcgcgcgcca ccagacataa tagctgacag actaacagac    1980

tgttcctttc catgggtctt ttctgcagtc accgtccaag cttgcaatca tggatgcaat    2040

gaagagaggg ctctgctgtg tgctgctgct gtgtggagca gtcttcgttt cggctagccc    2100

gggacgcgtg gatcctcgca atccctagga ggattaggca agggcttgag ctcacgctct    2160

tgtgagggac agaaatacaa tcaggggcag tatatgaata ctccatggag aaacccagat    2220

ctacgtatga tcagcctcga ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc    2280

ccccgtgcct tccttgaccc tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga    2340

ggaaattgca tcgcattgtc tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca    2400

ggacagcaag ggggaggatt gggaagacaa tagcaggcat gctggggatg cggtgggctc    2460

tatggaacca gctggggctc gacaggaccg ctatcaggac atagcgttgg ctacccgtga    2520

tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc tgaccgcttc ctcgtgcttt acggtatcgc    2580

cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt gacgagttct tctgagcggg    2640

actctggggt tcgaaatgac cgaccaagcg acgcccaacc tgccatcacg agatttcgat    2700

tccaccgccg ccttctatga aaggttgggc ttcggaatcg ttttccggga cgccggctgg    2760

atgatcctcc agcgcgggga tctcatgctg gagttcttcg cccaccccaa cttgtttatt    2820

gcagcttata atggttacaa ataaagcaat agcatcacaa atttcacaaa taaagcattt    2880

ttttcactgc attctagttg tggtttgtcc aaactcatca atgtatctta tcatgtctgg    2940

atcgcggccg cgatcccgtc gagagcttgg cgtaatcatg gtcatagctg tttcctgtgt    3000

gaaattgtta tccgctcaca attccacaca acatacgagc cggaagcata aagtgtaaag    3060

cctggggtgc ctaatgagtg agctaactca cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt    3120

tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc attaatgaat cggccaacgc gcggggagag    3180

gcggtttgcg tattgggcgc tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg    3240

ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat    3300

caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta    3360

aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa    3420

atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc    3480

cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt    3540

ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcaatg ctcacgctgt aggtatctca    3600

gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg    3660

accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat    3720

cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta    3780

cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aaggacagta tttggtatct    3840

gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac    3900

aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa    3960

aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa    4020

actcacgtta agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt    4080

taaattaaaa atgaagtttt aatcagcgat ctagtatata tgagtaaact tggtctgaca    4140

gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca    4200

tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc    4260

ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac gctcaccggc tccagattta tcagcaataa    4320

accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc    4380

agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc gccagttaat agtttgcgca    4440

acgttgttgc cattgctaca ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat    4500

tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag    4560

cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac    4620

tcatggttat ggcagcactg cataattctc ttactgtcat gccatccgta agatgctttt    4680

ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt    4740

gctcttgccc ggcgtcaata cgggataata ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc    4800

tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat    4860

ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt actttcacca    4920

gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga    4980

cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc tttttcaata ttattgaagc atttatcagg    5040

gttattgtct catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg    5100

ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac                                     5130

Claims (10)

1、一种布鲁氏杆菌核酸疫苗，它的活性成分是下述任一种混合物：

1)将BCSP31、sodC和L7/L12基因分别克隆到真核细胞表达载体中，得到含有BCSP31基因的重组表达载体、含有sodC基因的重组表达载体和含有L7/L12基因的重组表达载体，将所述至少两种重组表达载体进行混合得到的混合物；

2)将BCSP31、sodC和L7/L12三种基因分别与其它核酸序列融合或缺失部分序列或部分核苷酸突变后的且可编码与BCSP31、sodC和L7/L12具有相同活性蛋白的核苷酸序列，分别克隆到真核细胞表达载体中，将得到的至少两种重组表达载体进行混合得到的混合物。

2、根据权利要求1所述的核酸疫苗，其特征在于：所述布鲁氏杆菌核酸疫苗的活性成分是将BCSP31、sodC和L7/L12基因分别克隆到真核细胞表达载体中，得到含有BCSP31基因的重组表达载体、含有sodC基因的重组表达载体和含有L7/L12基因的重组表达载体，将所述三种重组表达载体进行混合得到的混合物。

3、根据权利要求1所述的核酸疫苗，其特征在于：所述BCSP31的氨基酸序列如GenBank Accession Number M20404；sodC的氨基酸序列如YP_418725；L7/L12的氨基酸序列如GenBank Accession Number L19101。

4、根据权利要求3所述的核酸疫苗，其特征在于：所述BCSP31基因的核苷酸序列如GenBank Accession Number M20404；sodC基因的核苷酸序列如NC_007624；L7/L12的核苷酸序列如GenBank Accession Number L19101。

5、根据权利要求2所述的核酸疫苗，其特征在于：所述三种重组表达载体的重量份数比为1∶1∶1。

6、根据权利要求2所述的核酸疫苗，其特征在于：所述真核细胞表达载体为哺乳动物细胞表达载体。

7、根据权利要求6所述的核酸疫苗，其特征在于：所述哺乳动物细胞表达载体为pJW4303。

8、根据权利要求7所述的核酸疫苗，其特征在于：所述布鲁氏杆菌核酸疫苗的活性成分是pJBCSP31、pJsodC和pJL7/L12。

9、根据权利要求1所述的核酸疫苗，其特征在于：所述布鲁氏杆菌核酸疫苗中还含有佐剂IL-12、IL-15、DDA、MPL、Quil-A、RIBI adjuvant、铝佐剂、和/或弗氏佐剂。

10、根据权利要求9所述的核酸疫苗，其特征在于：所述布鲁氏杆菌核酸疫苗中，所述活性成分与DDA或MPL的重量份数比为5∶6，所述活性成分与IL-2、IFN-γ、IL-12或IL-15的重量份数比为3∶1。

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