CN110511960A - 抗人乳头瘤病毒16 e6 t细胞受体 - Google Patents

Abstract

本发明公开了对人乳头瘤病毒(HPV)16E6，E6_29‑38的HLA‑A2‑限制性表位具有抗原特异性的T细胞受体(TCR)。还提供了相关的多肽和蛋白、以及相关的核酸、重组表达载体、宿主细胞和细胞群体。还提供了与本发明的TCR相关的抗体或其抗原结合部分以及药物组合物。还公开了检测哺乳动物中存在病况的方法以及治疗或预防哺乳动物中病况的方法，其中所述病况为癌症、HPV 16感染或HPV阳性初癌。

Description

抗人乳头瘤病毒16 E6 T细胞受体

相关申请的交叉引用

本专利申请要求于2013年7月15日提交的美国临时专利申请第61/846,167号的权益，所述临时专利申请通过引用整体并入本文。

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通过引用整体并入本文的是随本文同时提交的并且如下确定的计算机可读的核苷酸/氨基酸序列表：名称为“716827ST25.TXT”，日期为2014年5月27日的一份45,955字节ASCII(文本)文件。

关于在政府资助的研究或开发中完成的发明的权利声明

本申请是由国立卫生研究院国家癌症研究所在项目号为ZIABC011477和BC010984-5的政府资助下完成的。政府享有本申请的某些权利。

发明背景

一些癌症类型，例如宫颈癌的主要原因是人乳头瘤病毒(HPV)感染。尽管在诸如化疗的治疗中取得进展，但包括HPV相关癌症在内的许多癌症的预后可能很差。因此，存在对癌症，特别是HPV相关癌症的其他治疗的未得到满足的需求。

发明概述

本发明的实施方案提供了T细胞受体(TCR)，其对人乳头瘤病毒(HPV)16 E6具有抗原特异性并且包含人可变区和鼠恒定区。

本发明的另一实施方案提供了分离的或纯化的TCR，其对HPV 16 E6具有抗原特异性并且包含SEQ ID NO:3-8的氨基酸序列。

本发明还提供了相关的多肽和蛋白以及相关的核酸、重组表达载体、宿主细胞和细胞群体。本发明还提供了与本发明的TCR(包括其功能部分和功能变体)相关的抗体或其抗原结合部分和药物组合物。

本发明还提供了检测哺乳动物中存在病况的方法以及治疗或预防哺乳动物中病况的方法，其中病况为癌症、HPV 16感染或HPV阳性初癌。本发明的检测哺乳动物中存在病况的方法包括(i)将包含病况的细胞的样品与本文所述的本发明的任何TCR(包括其功能部分和功能变体)、多肽、蛋白、核酸、重组表达载体、宿主细胞、宿主细胞群体、抗体或其抗原结合部分或药物组合物相接触，从而形成复合物，以及(ii)检测所述复合物，其中检测到复合物指示哺乳动物中存在病况，其中所述病况为癌症、HPV 16感染或HPV阳性初癌。

本发明的治疗或预防哺乳动物中病况的方法包括以有效治疗或预防哺乳动物中病况的量向哺乳动物施用本文所述的任何TCR(包括其功能部分和功能变体)、多肽或蛋白，包含编码本文所述的任何TCR(包括其功能部分和功能变体)、多肽、蛋白的核苷酸序列的任何核酸或重组表达载体，或包含编码本文所述的任何TCR(包括其功能部分和功能变体)、多肽或蛋白的重组载体的任何宿主细胞或宿主细胞群体，其中所述病况为癌症、HPV 16感染或HPV阳性初癌。

附图中几个视图的简述

图1为显示相对于CaSki细胞、HeLa细胞、624细胞或来自肿瘤3809的细胞的甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)表达而言，HPV 16 E6(白色柱)、HPV 16 E7(色彩较暗的无阴影柱)、HPV 18 E6(色彩较明的阴影柱)或HPV 18 E7(色彩较暗的阴影柱)的表达的柱状图。

图2A和2B为显示在与自体的树突细胞(DC)共培养后由来自肿瘤3809的碎块(F)2-14(A)、肿瘤3809的碎块15-24(B)的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)或黑色素瘤TIL分泌的干扰素γ(IFN-γ)(pg/mL)的柱状图，所述树突细胞已经用单独的HPV 16 E6(白色柱)、HPV 16E6与抗1类抗体的组合(色彩较暗的无阴影柱)、单独的HPV 16 E7(色彩较明的阴影柱)、HPV16 E7与抗1类抗体的组合(色彩较暗的阴影柱)、gp100(黑色柱)或OKT3(横条纹柱)脉冲刺激。

图3为显示在与用绿色荧光蛋白(GFP)转染的293-A2细胞(稳定表达HLA-A2的HEK-293细胞)、用HPV 16 E6转染的293-A2细胞、在无肽时培养的3809淋巴样干细胞系(LCL)(已使用爱泼斯坦-巴尔病毒转化的B细胞)、与HPV 16 E6肽库共培养的3809LCL或OKT3共培养后，由扩增数目的3809 4-1BB-分泌的TIL分泌的IFN-γ(pg/mL)的柱状图。

图4A为显示在与用HPV 16 E6_29-38肽脉冲刺激的293-A2靶细胞、用HPV 16 E7_11-19肽脉冲刺激的293-A2细胞、用编码HPV 16 E6的质粒转导的293-A2细胞、用编码GFP的质粒转导的293-A2细胞、用编码HPV 16 E6的质粒转导的293细胞、用编码HPV 16 E6的质粒转导的624细胞、用编码HPV 16 E7的质粒转导的624细胞、SCC152细胞、SCC90细胞、CaSki细胞、HPV-18宫颈癌细胞、黑色素瘤对照细胞、胆道对照细胞、624细胞或SiHa细胞共培养后，未经转导(无阴影的柱)或用编码SEQ ID NO:17和18的核苷酸序列转导的(E6 TCR；有阴影的柱)外周血淋巴细胞(PBL)分泌的IFN-γ(pg/mL)的柱状图。各个靶细胞的HLA-A2和HPV-16表达显示在图4A的底部(“+”表示表达呈阳性，“–”表示表达呈阴性)。

图4B为显示在无抗体(黑色柱)、抗MHC I类抗体(灰色柱)或抗MHC II类抗体(无阴影的柱)的情况下，在与用编码HPV 16 E6的质粒转导的293-A2靶细胞，用编码HPV 16 E6的质粒转导的293细胞，SCC90细胞，CaSki细胞，624细胞，DMF/624细胞或用HPV 16 E7肽脉冲刺激的4.7.20细胞共培养后，用编码SEQ ID NO:17和18的核苷酸序列转导的PBL分泌的IFN-γ(pg/mL)的柱状图。

图5为显示在与用HPV 16 E6_29-38肽脉冲刺激的293-A2靶细胞、用HPV 16 E7_11-19肽脉冲刺激的293-A2细胞、用编码HPV 16 E6的质粒转导的293-A2细胞、用编码GFP的质粒转导的293-A2细胞、293-A2细胞、用编码HPV 16 E7的质粒转导的624细胞、用编码HPV 16 E6的质粒转导的624细胞、SCC152细胞、SCC90细胞、CaSki细胞、HPV宫颈癌细胞、黑色素瘤对照细胞、624细胞或SiHa细胞共培养后，由未转导的CD8阳性PBL(色彩较明的无阴影柱)、未转导的CD4阳性PBL(色彩较明的交叉阴影柱)或用编码SEQ ID NO:17和18的核苷酸序列转导的PBL(CD8阳性(E6 TCR；色彩较暗的无阴影柱)或CD4阳性(E6 TCR；色彩较暗的交叉阴影柱))分泌的IFN-γ(pg/mL)的柱状图。

图6A为显示在与用不同浓度的E6_29-38肽(-logM)脉冲刺激的T2靶细胞共培养后，由未转导的(UT)CD8阳性PBL(无阴影的柱)或用编码SEQ ID NO:17和18的核苷酸序列转导的CD8阳性PBL(有阴影的柱)分泌的IFN-γ(pg/mL)的柱状图。

图6B为显示在与用不同浓度的E6_29-38肽(-logM)脉冲刺激的T2靶细胞共培养后，由未转导的CD4阳性PBL(无阴影的柱)或用编码SEQ ID NO:17和18的核苷酸序列转导的CD4阳性PBL(E6 TCR，有阴影的柱)分泌的IFN-γ(pg/mL)的柱状图。

发明详述

本发明的实施方案提供了T细胞受体(TCR)及其功能部分和功能变体，其对人乳头瘤病毒(HPV)16 E6具有抗原特异性并且包含人可变区和鼠恒定区。在本发明的实施方案中，TCR对HPV 16 E6_29-38具有抗原特异性。

HPV16为最常见的与恶性肿瘤相关的HPV的亚型。不受特定理论或机制的束缚，HPV16被认为至少部分地通过癌蛋白E6的作用引起癌症，所述癌蛋白E6解除细胞周期的控制。HPV 16 E6在癌细胞中组成型表达，并且在正常未感染的人组织中不表达。HPV 16 E6在多种人类癌症中表达，所述人类癌症包含但不限于宫颈癌、口咽癌、肛门癌、肛管癌、直肠肛门癌、阴道癌、外阴癌和阴茎癌。

TCR可以对任何HPV 16 E6蛋白、多肽或肽具有抗原特异性。在本发明的实施方案中，TCR对HPV 16 E6蛋白具有抗原特异性，所述HPV 16 E6蛋白包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成或基本上由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成。在本发明的优选实施方案中，TCR对HPV 16 E6_29-38肽具有抗原特异性，所述HPV 16 E6_29-38肽包含TIHDIILECV(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列，由TIHDIILECV(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列组成，或基本上由TIHDIILECV(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列组成。

在本发明的实施方案中，本发明的TCR能够以主要组织相容性复合体(MHC)I类依赖性方式识别HPV 16 E6。如本文所用，“MHC I类依赖性方式”意指当在MHC I类分子的背景中结合于HPV 16 E6时，TCR引发免疫应答。MHC I类分子可以为本领域已知的任何MHC I类分子，例如HLA-A分子。在本发明的优选实施方案中，MHC I类分子为HLA-A2分子。

本发明的TCR(包括其功能部分和功能变体)提供许多优势，包括当由细胞表达时，用于过继性细胞转移。不受特定理论或机制的束缚，认为因为HPV 16 E6由多种癌症类型的HPV 16感染的细胞表达，所以本发明的TCR(包括其功能部分和功能变体)有利地提供破坏多种类型HPV 16相关癌症的细胞的能力，并且因此治疗或预防多种类型的HPV 16相关的癌症。另外，不受特定理论或机制的束缚，认为因为HPV 16 E6蛋白仅在癌细胞、HPV 16-感染的细胞或HPV阳性初癌细胞中表达，所以本发明的TCR(包括其功能部分和功能变体)有利地靶向癌细胞、HPV 16-感染的细胞或HPV阳性初癌细胞的破坏，同时最小化或消除正常的、非癌性的、非HPV感染的和非HPV阳性初癌细胞的破坏，从而降低毒性，例如使毒性最小化或消除毒性。此外，本发明的TCR可以有利地、成功地治疗或预防HPV阳性癌症，此类癌症不响应于其它治疗类型，诸如，例如，单独的化疗、手术或辐射。另外，本发明的TCR提供对HPV 16E6的高度亲合识别，这可以有利地提供识别未经处理的肿瘤细胞(例如，未用干扰素γ处理的、未用编码HPV 16 E6和HLA-A2中的一个或两个的载体转染的、未用E6_29-38肽脉冲刺激的或它们的组合处理的肿瘤细胞)的能力。

如本文所用，短语“抗原特异性”意指TCR可以以高亲合力特异性结合并免疫识别HPV 16 E6。例如，在与用低浓度的HPV 16 E6肽(例如，约0.05ng/mL至约5ng/mL、0.05ng/mL、0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL或5ng/mL)脉冲刺激的抗原阴性HLA-A2+靶细胞共培养后，如果表达TCR的T细胞分泌至少约200pg/mL或更多(例如，200pg/mL或更多、300pg/mL或更多、400pg/mL或更多、500pg/mL或更多、600pg/mL或更多、700pg/mL或更多、1000pg/mL或更多、5,000pg/mL或更多、7,000pg/mL或更多、10,000pg/mL或更多或20,000pg/mL或更多)的干扰素γ(IFN-γ)，TCR可以被认为对HPV 16 E6具有“抗原特异性”。可选地或另外地，在与用低浓度的HPV 16 E6肽脉冲刺激的抗原阴性HLA-A2+靶细胞共培养后，如果表达TCR的T细胞分泌的IFN-γ是未转导的外周血淋巴细胞(PBL)背景水平的IFN-γ的至少两倍，TCR可以被认为对HPV 16 E6具有“抗原特异性”。在与用较高浓度的HPV 16 E6肽脉冲刺激的抗原阴性HLA-A2+靶细胞共培养后，表达本发明的TCR(包括其功能部分和功能变体)的细胞也可以分泌IFN-γ。

本发明提供了TCR，其包含两条多肽(即，多肽链)，如TCR的α链、TCR的β链、TCR的γ链、TCR的δ链或它们的组合。本发明TCR的多肽可包含任何氨基酸序列，前提是TCR对HPV 16E6具有抗原特异性。

在本发明的实施方案中，TCR包含两条多肽链，每条多肽链包含含有TCR的互补决定区(CDR)1、CDR2和CDR3的人可变区。在本发明的实施方案中，TCR包含第一多肽链和第二多肽链，所述第一多肽链包含含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR1(α链的CDR1)、含有SEQID NO:4的氨基酸序列的CDR2(α链的CDR2)和含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CDR3(α链的CDR3)，所述第二多肽链包含含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR1(β链的CDR1)、含有SEQID NO:7的氨基酸序列的CDR2(β链的CDR2)和含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR3(β链的CDR3)。在这方面，本发明的TCR可以包含选自SEQ ID NO:3-8的任何一个或多个氨基酸序列。优选地，TCR包含SEQ ID NO:3-5或SEQ ID NO:6-8的氨基酸序列。在特别优选的实施方案中，TCR包含SEQ ID NO:3-8的氨基酸序列。

在本发明的实施方案中，TCR可以包含含有上文所示的CDR的TCR的可变区的氨基酸序列。在这方面，TCR可以包含SEQ ID NO:9(α链的可变区)、SEQ ID NO:10(β链的可变区)或SEQ ID NO:9和10两者的氨基酸序列。优选地，本发明的TCR包含SEQ ID NO:9和10两者的氨基酸序列。

本发明的TCR还可以包含来源于任何合适的物种，诸如，例如，人或小鼠的恒定区。在本发明的实施方案中，本发明的TCR还包含鼠恒定区。在这方面，TCR可以包含SEQ ID NO:15(鼠α链的恒定区)、SEQ ID NO:16(鼠β链的恒定区)或SEQ ID NO:15和16两者的氨基酸序列。在优选的实施方案中，本发明的TCR为包含人可变区和鼠恒定区两者的嵌合TCR。

在本发明的实施方案中，本发明的嵌合TCR可以包含可变区和恒定区的组合。在这方面，TCR可以包含含有SEQ ID NO:9(人α链的可变区)和SEQ ID NO:15(鼠α链的恒定区)两者的氨基酸序列的α链、含有SEQ ID NO:10(人β链的可变区)和SEQ ID NO:16(鼠β链的恒定区)两者的氨基酸序列的β链、或SEQ ID NO:9-10和15-16的所有氨基酸序列。

当提到本文所述的TCR或TCR的任何成分(例如，互补决定区(CDR)、可变区、恒定区、α链和/或β链)时，本文使用的术语“鼠”或“人”意指分别来源于小鼠或人的TCR(或其成分)，即分别源自或同时由小鼠T细胞或人T细胞表达的TCR(或其成分)。

在本发明的实施方案中，嵌合TCR可以包含TCR的α链和TCR的β链。本发明的嵌合TCR的α链和β链中的每个可以独立地包含任何氨基酸序列。优选地，α链包含如上文所示的人α链的可变区和鼠α链的恒定区。在这方面，本发明的嵌合TCR可以包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列。这种类型的α链可以与TCR的任何β链成对。优选地，本发明的嵌合TCR的β链包含如上文所示的人β链的可变区和鼠β链的恒定区。在这方面，本发明的嵌合TCR可以包含SEQID NO:18的氨基酸序列。因此，本发明的嵌合TCR可以包含SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:17和18两者的氨基酸序列。优选地，本发明的嵌合TCR包含SEQ ID NO:17和18两者的氨基酸序列。

在本发明的实施方案中，TCR为人TCR。人TCR可以包含如本文关于本发明的其它方面所述的任何CDR区。在这方面，本发明的实施方案提供了分离的或纯化的TCR，其对HPV 16E6具有抗原特异性并且包含SEQ ID NO:3-8的氨基酸序列。在本发明的另一实施方案中，人TCR可以包含本文关于本发明的其它方面所述的任何可变区。

在本发明的实施方案中，本发明的人TCR还包含人恒定区。在这方面，人TCR可以包含SEQ ID NO:13(人α链的恒定区)、SEQ ID NO:14(人β链的恒定区)或SEQ ID NO:13和14两者的氨基酸序列。

在本发明的实施方案中，本发明的人TCR可以包含可变区和恒定区的组合。在这方面，TCR可以包含含有SEQ ID NO:9(人α链的可变区)和SEQ ID NO:13(人α链的恒定区)两者的氨基酸序列的α链、含有SEQ ID NO:10(人β链的可变区)和SEQ ID NO:14(人β链的恒定区)两者的氨基酸序列的β链、或SEQ ID NO:9-10和13-14的所有氨基酸序列。

在本发明的实施方案中，人TCR可以包含TCR的α链和TCR的β链。本发明的人TCR的α链和β链中的每个可以独立地包含任何氨基酸序列。优选地，α链包含如上文所示的人α链的可变区和人α链的恒定区。在这方面，本发明的人TCR可以包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列。这种类型的α链可以与TCR的任何β链成对。优选地，本发明的人TCR的β链包含如上文所示的人β链的可变区和人β链的恒定区。在这方面，本发明的人TCR可以包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列。因此，本发明的人TCR可以包含SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:11和12两者的氨基酸序列。优选地，本发明的人TCR包含SEQ ID NO:11和12两者的氨基酸序列。

本发明还提供了包含本文所述的任何TCR(或其功能变体)的功能部分的多肽。本文使用的术语“多肽”包括寡肽并且是指通过一个或多个肽键连接的氨基酸的单链。

对于本发明的多肽，功能部分可以为包含其中产生部分的TCR(或其功能变体)的连续氨基酸的任何部分，前提是功能部分能特异性结合HPV 16 E6。当结合TCR(或其功能变体)使用时，术语“功能部分”是指本发明TCR(或其功能变体)的任何部分或片段，该部分或片段保留了其中产生部分的TCR(或其功能变体)(亲本TCR或其亲本功能变体)的生物活性。功能部分涵盖，例如，保留了能够以与亲本TCR(或其功能变体)类似的程度、以与亲本TCR(或其功能变体)相同的程度或以比亲本TCR(或其功能变体)更高的程度特异性结合HPV16E6(例如，以HLA-A2-依赖性方式)或检测、治疗或预防癌症的TCR(或其功能变体)的那些部分。就亲本TCR(或其功能变体)而言，功能部分可以包含，例如，亲本TCR(或其功能变体)的约10％、25％、30％、50％、68％、80％、90％、95％或更多。

功能部分可以在该部分的氨基端或羧基端或在两端处包含另外的氨基酸，所述另外的氨基酸不存在于亲本TCR或其功能变体的氨基酸序列。期望另外的氨基酸不干扰功能部分的生物功能，例如，特异性结合HPV 16 E6；和/或能够检测癌症、治疗或预防癌症等。更期望的是，与亲本TCR或其功能变体的生物活性相比，另外的氨基酸增强生物活性。

多肽可以包含本发明的TCR或其功能变体的α和β链中的任一个或两者的功能部分，如包含本发明的TCR或其功能变体的α链和/或β链的可变区中的CDR1、CDR2和CDR3的一个或多个的功能部分。在本发明的实施方案中，多肽可以包含含有SEQ ID NO:3(α链的CDR1)、4(α链的CDR2)、5(α链的CDR3)、6(β链的CDR1)、7(β链的CDR2)、8(β链的CDR3)或它们的组合的氨基酸序列的功能部分。优选地，本发明的多肽包含含有SEQ ID NO:3-5；6-8；或全部SEQ ID NO:3-8的氨基酸序列的功能部分。更优选地，多肽包含含有全部SEQ ID NO:3-8的氨基酸序列的功能部分。

在本发明的实施方案中，本发明的多肽可以包含，例如，含有上文所示的CDR区的组合的本发明的TCR或其功能变体的可变区。在这方面，多肽可以包含SEQ ID NO:9(α链的可变区)、SEQ ID NO:10(β链的可变区)或SEQ ID NO:9和10两者的氨基酸序列。优选地，多肽包含SEQ ID NO:9和10两者的氨基酸序列。

本发明的多肽还可以包含来源于任何合适的物种，诸如，例如，人或小鼠的恒定区。在这方面，多肽可以包含SEQ ID NO:13(人α链的恒定区)、SEQ ID NO:14(人β链的恒定区)、SEQ ID NO:15(鼠α链的恒定区)、SEQ ID NO:16(鼠β链的恒定区)、SEQ ID NO:13和14两者或SEQ ID NO:15和16两者的氨基酸序列。优选地，多肽包含SEQ ID NO:13和14两者或SEQ ID NO:15和16两者的氨基酸序列。

在本发明的实施方案中，本发明的多肽可以包含可变区和恒定区的组合。在这方面，多肽可以包含SEQ ID NO:9和15两者、SEQ ID NO:9和13两者、SEQ ID NO:10和16两者、SEQ ID NO:10和14两者、全部SEQ ID NO:9-10和15-16或全部SEQ ID NO:9-10和13-14的氨基酸序列。

在本发明的实施方案中，本发明的多肽可以包含本文所述的TCR或其功能变体之一的α或β链的整个长度。在这方面，本发明的多肽可以包含SEQ ID NO:11、12、17或18的氨基酸序列。可选地，本发明的多肽可以包含本文所述的TCR或其功能变体的α和β链。例如，本发明的多肽可以包含SEQ ID NO:11和12两者、或SEQ ID NO:17和18两者、SEQ ID NO:11和18两者、或SEQ ID NO:17和12两者的氨基酸序列。优选地，多肽包含SEQ ID NO:11和12两者或SEQ ID NO:17和18两者的氨基酸序列。

本发明还提供了包含至少一种本文所述的多肽的蛋白。“蛋白”意指包含一条或多条多肽链的分子。

在实施方案中，本发明的蛋白可以包含含有SEQ ID NO:3-5的氨基酸序列的第一多肽链以及含有SEQ ID NO:6-8的氨基酸序列的第二多肽链。可选地或另外地，本发明的蛋白可以包含含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的第一多肽链以及含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的第二多肽链。本发明的蛋白可以，例如，包含含有SEQ ID NO:9和13两者或SEQ IDNO:9和15两者的氨基酸序列的第一多肽链以及含有SEQ ID NO:10和14两者或SEQ ID NO:10和16两者的氨基酸序列的第二多肽链。本发明的蛋白可以，例如，包含含有SEQ ID NO:11或17的氨基酸序列的第一多肽链以及含有SEQ ID NO:12或18的氨基酸序列的第二多肽链。在这种情况下，本发明的蛋白可以为TCR。可选地，如果，例如，蛋白包含含有SEQ ID NO:11和12、或SEQ ID NO:17和18的氨基酸序列的单条多肽链，或如果蛋白的第一和/或第二多肽链还包含其它氨基酸序列，例如，编码免疫球蛋白或其部分的氨基酸序列，则本发明的蛋白可以为融合蛋白。在这方面，本发明还提供了包含至少一种本文所述的本发明多肽以及至少一种其它多肽的融合蛋白。其它多肽可以作为融合蛋白的单独的多肽存在，或可以以这样的多肽存在：其与本文所述的本发明多肽之一框内(串联)表达。其它多肽可以编码任何肽分子或蛋白分子或它们的部分，包括但不限于免疫球蛋白，CD3，CD4，CD8，MHC分子，CD1分子，例如，CD1a、CD1b、CD1c、CD1d等。

融合蛋白可以包含一个或多个拷贝的本发明多肽和/或一个或多个拷贝的其它多肽。例如，融合蛋白可以包含1、2、3、4、5或更多拷贝的本发明的多肽和/或其它多肽。制备融合蛋白的合适的方法为本领域熟知的并且包括，例如，重组方法。参见，例如，Choi等,Mol.Biotechnol.31:193-202(2005)。

在本发明的一些实施方案中，本发明的TCR(及其功能部分和功能变体)、多肽和蛋白可以被表达为单个蛋白，其包含连接α链和β链的接头肽。在这方面，本发明的包含SEQ IDNO:11和12、或SEQ ID NO:17和18的氨基酸序列的TCR(及其功能变体和功能部分)、多肽和蛋白还可以包含接头肽。接头肽可以有利地促进宿主细胞中重组的TCR(包括其功能部分和功能变体)、多肽和/或蛋白的表达。接头肽可以包含任何合适的氨基酸序列。例如，接头肽可以包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列。在宿主细胞表达包含接头肽的构建体后，接头肽可以被切除，从而产生分开的α和β链。

本发明的蛋白可以为包含本文所述的至少一种本发明多肽的重组抗体。如本文所用，“重组抗体”是指包含本发明的多肽和抗体的多肽链或其部分中的至少一种的重组(例如，基因工程改造的)蛋白。抗体的多肽或其部分可以是抗体的重链、轻链、重链或轻链的可变区或恒定区、单链可变片段(scFv)或Fc、Fab或F(ab)₂'片段等。抗体的多肽链或其部分可以作为重组抗体的单独的多肽存在。可选地，抗体的多肽链或其部分可以以这样的多肽存在：所述多肽与本发明的多肽框内(串联)表达。抗体的多肽或其部分可以为任何抗体或任何抗体片段(包括本文所述的任何抗体和抗体片段)的多肽。

包括在本发明范围内的是本文所述的本发明的TCR的功能变体。本文使用的术语“功能变体”是指与亲本TCR、多肽或蛋白具有大量的或显著的序列同一性或相似性的TCR、多肽或蛋白，所述功能变体保留了其中产生变体的TCR、多肽或蛋白的生物活性。功能变体涵盖，例如，保留了能够以与亲本TCR、多肽或蛋白类似的程度、以与亲本TCR、多肽或蛋白相同的程度或以比亲本TCR、多肽或蛋白更高的程度特异性结合HPV 16E6的本文所述的TCR、多肽或蛋白(亲本TCR、多肽或蛋白)的那些变体，亲本TCR对HPV 16E6具有抗原特异性或亲本多肽或蛋白特异性结合HPV 16E6。关于亲本TCR、多肽或蛋白，功能变体的氨基酸序列与亲本TCR、多肽或蛋白的氨基酸序列可以，例如，具有至少约30％、50％、75％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性。

功能变体可以，例如，包含具有至少一个保守性氨基酸置换的亲本TCR、多肽或蛋白的氨基酸序列。保守性氨基酸置换为本领域已知的，并且包括其中具有某些物理和/或化学性质的一个氨基酸被交换为具有相同化学或物理性质的另一氨基酸的氨基酸置换。例如，保守性氨基酸置换可以为酸性氨基酸置换为另一酸性氨基酸(例如，Asp或Glu)、具有非极性侧链的氨基酸置换为具有非极性侧链的另一氨基酸(例如，Ala、Gly、Val、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Trp、Val等)、碱性氨基酸置换为另一碱性氨基酸(Lys、Arg等)、具有极性侧链的氨基酸置换为具有极性侧链的另一氨基酸(Asn、Cys、Gln、Ser、Thr、Tyr等)等。

可选地或另外地，功能变体可以包含具有至少一个非保守性氨基酸置换的亲本TCR、多肽或蛋白的氨基酸序列。在这种情况下，优选的是不会干扰或抑制功能变体的生物活性的非保守性氨基酸置换。优选地，非保守性氨基酸置换增强功能变体的生物活性，以使得与亲本TCR、多肽或蛋白相比，功能变体的生物活性增加。

TCR(或其功能变体)、多肽或蛋白可以基本上由本文所述的指定的氨基酸序列组成，以使得TCR(或其功能变体)、多肽或蛋白的其它组成，例如，其它氨基酸不会实质上改变TCR(或其功能变体)、多肽或蛋白的生物活性。在这方面，本发明的TCR(或其功能变体)、多肽或蛋白可以，例如，基本上由SEQ ID NO:11、12、17或18、SEQ ID NO:11和12两者、SEQ IDNO:17和18两者、SEQ ID NO:11和18两者或SEQ ID NO:17和12两者的氨基酸序列组成。另外，例如，本发明的TCR(包括其功能变体)、多肽或蛋白可以基本上由SEQ ID NO:9、10或SEQID NO:9和10两者的氨基酸序列组成。此外，本发明的TCR(包括其功能变体)、多肽或蛋白可以基本上由SEQ ID NO:3(α链的CDR1)、SEQ ID NO:4(α链的CDR2)、SEQ ID NO:5(α链的CDR3)、SEQ ID NO:6(β链的CDR1)、SEQ ID NO:7(β链的CDR2)、SEQ ID NO:8(β链的CDR3)或它们的任何组合，例如，SEQ ID NO:3-5；6-8；或3-8的氨基酸序列组成。

本发明的TCR、多肽和蛋白(包括其功能变体)可以为任何长度，即可以包含任何数目的氨基酸，前提是TCR、多肽或蛋白(或其功能变体)保留它们的生物活性，例如，能够特异性结合HPV 16 E6；检测哺乳动物中的癌症、HPV 16感染或HPV阳性初癌；或治疗或预防哺乳动物中的癌症、HPV 16感染或HPV阳性初癌等。例如，多肽可以为约50至约5000个氨基酸的长度，如50、70、75、100、125、150、175、200、300、400、500、600、700、800、900、1000或更多个氨基酸的长度。在这方面，本发明的多肽也包括寡肽。

本发明的TCR、多肽和蛋白(包括其功能变体)可以包含代替一个或多个天然存在的氨基酸的合成氨基酸。此类合成氨基酸为本领域已知的，并且包括例如氨基环己烷羧酸、正亮氨酸、α-氨基正癸酸、高丝氨酸、S-乙酰基氨甲基-半胱氨酸、反式-3-和反式-4-羟脯氨酸、4-氨基苯丙氨酸、4-硝基苯丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、4-羧基苯丙氨酸、β-苯基丝氨酸β-羟基苯丙氨酸、苯甘氨酸、α-萘基丙氨酸、环己基丙氨酸、环己基甘氨酸、二氢吲哚-2-羧酸、1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸、氨基丙二酸、氨基丙二酸单酰胺、N’-苄基-N’-甲基-赖氨酸、N’,N’-二苄基-赖氨酸、6-羟赖氨酸、鸟氨酸、α-氨基环戊烷羧酸、α-氨基环己烷羧酸、α-氨基环庚烷羧酸、α-(2-氨基-2-降莰烷)-羧酸、α,γ-二氨基丁酸、α,γ-二氨基丙酸、高苯丙氨酸和α-叔丁基甘氨酸。

本发明的TCR、多肽和蛋白(包括其功能变体)可以被糖基化、酰胺化、羧化、磷酸化、酯化、N-酰化、经由例如二硫桥而环化，或被转化成酸加成盐和/或任选地二聚化或聚合或缀合。

本发明的TCR、多肽和/或蛋白(包括其功能变体)可以通过本领域已知的方法获得。从头合成多肽和蛋白的合适的方法描述在诸如Chan等,Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis,Oxford University Press,Oxford,United Kingdom,2005；Peptide and Protein Drug Analysis,ed.Reid,R.,Marcel Dekker,Inc.,2000；Epitope Mapping,ed.Westwood等,Oxford University Press,Oxford,United Kingdom,2000的参考文献；以及美国专利第5,449,752号中。另外，多肽和蛋白可以利用标准的重组方法使用本文描述的核酸重组产生。参见，例如，Green and Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,4^th ed.,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,NY 2012；以及Ausubel等,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates andJohn Wiley&Sons,NY,1994。此外，本发明的一些TCR、多肽和蛋白(包括其功能变体)可以分离自和/或纯化自诸如植物，细菌，昆虫，哺乳动物如大鼠、人等的来源。分离和纯化的方法为本领域熟知的。可选地，本文所述的TCR、多肽和/或蛋白(包括其功能变体)可以通过诸如Synpep(Dublin,CA)、Peptide Technologies Corp.(Gaithersburg,MD)和MultiplePeptide Systems(San Diego,CA)的公司商业合成。在这方面，本发明的TCR(包括其功能变体)、多肽和蛋白可以为合成的、重组的、分离的和/或纯化的。

包括在本发明范围内的是包含任何本发明的TCR、多肽或蛋白(包括它们的任何功能变体)、核酸、重组表达载体、宿主细胞、宿主细胞群体或抗体或其抗原结合部分的缀合物，例如，生物缀合物。缀合物以及通常合成缀合物的方法为本领域已知的(参见，例如，Hudecz,F.,Methods Mol.Biol.298:209-223(2005)和Kirin等,Inorg Chem.44(15):5405-5415(2005))。

本发明的实施方案提供了包含编码本文的任何TCR、多肽和蛋白的核苷酸序列的核酸。本文使用的“核酸”包括“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸分子”，并且通常意指DNA或RNA的聚合物，其可为单链或双链的，合成的或由天然来源获得的(例如分离的和/或纯化的)，其可以含有天然的、非天然的或改变的核苷酸，以及其可以含有天然的、非天然的或改变的核苷酸间连键，如氨基磷酸酯键或硫代磷酸酯键替代未修饰的寡核苷酸的核苷酸之间存在的磷酸二酯。在实施方案中，核酸包括互补的DNA(cDNA)。通常优选的是核酸不包含任何插入、缺失、倒置和/或置换。然而，在一些情况下，如本文所讨论的，包含一个或多个插入、缺失、倒置和/或置换的核酸可能为合适的。

优选地，本发明的核酸为重组体。如本文所用，术语“重组体”是指(i)通过将天然或合成的核酸片段连接至可以在活细胞中复制的核酸分子而在活细胞外构建的分子，或(ii)来自以上(i)中所述的那些复制的分子。为了本文的目的，复制可为体外复制或体内复制。

可以使用本领域已知的程序基于化学合成和/或酶促连接反应构建核酸。参见，例如，Green and Sambrook等,见上文和Ausubel等,见上文。例如，核酸可以使用天然存在的核苷酸或为增加分子的生物稳定性或增加杂交后形成的双链体的物理稳定性而设计的不同修饰的核苷酸(如，硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸)化学合成。可以用于生成核酸的修饰的核苷酸的实例包括但不限于5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基-2-硫尿苷、5-羧甲基氨甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖苷辫苷、肌苷、N⁶-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N⁶-取代的腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-苷葡聚糖辫苷、5'-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲基硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧基乙酸(v)、怀丁苷(wybutoxosine)、假尿嘧啶、辫苷(queosine)、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、3-(3-氨基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧啶和2,6-二氨基嘌呤。可选地，本发明的一个或多个核酸可以购自诸如Macromolecular Resources(Fort Collins,CO)和Synthegen(Houston,TX)的公司。

核酸可以包含编码本文所述的任何TCR、多肽、蛋白或它们的功能变体的任何核苷酸序列。在本发明的实施方案中，核苷酸序列可以包含以下，由以下组成或基本上由以下组成：全部SEQ ID NO:31-36(分别编码CDR1α、CDR2α、CDR3α、CDR1β、CDR2β、CDR3β)；全部SEQID NO:31-33；全部SEQ ID NO:34-36；SEQ ID NO:19-20两者(分别编码α和β链的可变区)；SEQ ID NO:23-24两者(分别编码人α和β链的恒定区)；SEQ ID NO:25-26两者(分别编码鼠α和β链的恒定区)；全部SEQ ID NO:19-20和23-24；全部SEQ ID NO:19-20和25-26；SEQ IDNO:21-22两者(分别编码人α和β链)或SEQ ID NO:27-28两者(分别编码嵌合α和β链)。在本发明的另一实施方案中，核苷酸序列可以包含SEQ ID NO:19-28和31-36中的任何一个，由SEQ ID NO:19-28和31-36中的任何一个组成或基本上由SEQ ID NO:19-28和31-36中的任何一个组成。

在本发明的实施方案中，核酸包含非天然核苷酸序列。如果核苷酸序列在自然界中不存在，则该核苷酸序列可以被认为是“非天然的”。在一些实施方案中，核苷酸序列可以为密码子优化的。不受特定理论或机制的束缚，认为核苷酸序列的密码子优化增加mRNA转录物的翻译效率。核苷酸序列的密码子优化可以涉及将天然密码子置换为编码相同氨基酸，但可以被细胞内更容易获得的tRNA翻译的另一密码子，从而增加翻译效率。核苷酸序列的优化还可以减少干扰翻译的mRNA的二级结构，从而增加翻译效率。在本发明的实施方案中，密码子优化的核苷酸序列可以包含以下，由以下组成或基本上由以下组成：SEQ ID NO:38(α链的可变区)、SEQ ID NO:39(β链的可变区)或SEQ ID NO:38和39。

本发明还提供了核酸，其包含与本文所述的任何核酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列或在严紧条件下与本文所述的任何核酸的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。

在严紧条件下杂交的核苷酸序列优选在高严紧条件下杂交。“高严紧条件”意指核苷酸序列以可检测地强于非特异性杂交的量与靶序列(本文描述的任何核酸的核苷酸序列)特异性杂交。高严紧条件包括区分具有精确互补序列的多核苷酸，或仅含有少数分散错配的多核苷酸与碰巧具有匹配核苷酸序列的一些小区域(例如，3-10个碱基)的随机序列。此类小的互补区域比14-17个或更多个碱基的全长互补更容易熔解，并且高严紧杂交使得它们易于被区分。相对高的严紧条件将包括，例如，低盐和/或高温条件，如在约50-70℃的温度下通过约0.02-0.1M NaCl或等同物提供的。此类高严紧条件容许如果有的话，核苷酸序列与模板或靶链之间很少的错配，并且特别适于检测任何本发明TCR(包括其功能部分和功能变体)的表达。通常应理解可以通过加入增加量的甲酰胺使条件更严紧。

本发明还提供包含与本文所述的任何核酸具有至少约70％或更多，例如，约80％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的核苷酸序列的核酸。

本发明的核酸可以掺入至重组表达载体中。在这方面，本发明提供了包含本发明的任何核酸的重组表达载体。在本发明的实施方案中，重组表达载体包含编码α链、β链和接头肽的核苷酸序列。例如，在实施方案中，重组表达载体包含含有SEQ ID NO:29的密码子优化的核苷酸序列(编码具有位于它们之间的接头的嵌合α和β链的SEQ ID NO:17和18)。

为了本文的目的，术语“重组表达载体”意指基因修饰的寡核苷酸或多核苷酸构建体，当构建体包含编码mRNA、蛋白、多肽或肽的核苷酸序列，并且在足以在宿主细胞内表达mRNA、蛋白、多肽或肽的条件下将载体与宿主细胞接触时，所述基因修饰的寡核苷酸或多核苷酸构建体允许该宿主细胞表达mRNA、蛋白、多肽或肽。本发明的载体并非是整个天然存在的。然而，部分载体可以为天然存在的。本发明的重组表达载体可以包含任何类型的核苷酸，包括但不限于DNA和RNA，所述DNA和RNA可为单链或双链，合成的或部分由天然来源获得，并且可以含有天然的、非天然的或改变的核苷酸。重组表达载体可以包含天然存在的、非天然存在的核苷酸间连键或这两种类型的连键。优选地，非天然存在的或改变的核苷酸或核苷酸间连键不会阻碍载体的转录或复制。

本发明的重组表达载体可以为任何合适的重组表达载体，并且可被用于转化或转染任何合适的宿主细胞。合适的载体包括设计用于繁殖和扩增或用于表达或这两者的那些载体，如质粒和病毒。载体可以选自pUC系列(Fermentas Life Sciences)、pBluescript系列(Stratagene,LaJolla,CA)、pET系列(Novagen,Madison,WI)、pGEX系列(PharmaciaBiotech,Uppsala,Sweden)和pEX系列(Clontech,Palo Alto,CA)。也可使用噬菌体载体，如λGT10、λGT11、λZapII(Stratagene)、λEMBL4和λNM1149。植物表达载体的实例包括pBI01、pBI101.2、pBI101.3、pBI121和pBIN19(Clontech)。动物表达载体的实例包括pEUK-Cl、pMAM和pMAMneo(Clontech)。优选地，重组表达载体为病毒载体，例如，逆转录病毒载体。在特别优选的实施方案中，重组表达载体为MSGV1载体。在实施方案中，包含密码子优化的核苷酸序列的MSGV1载体包含SEQ ID NO:30的核苷酸序列，所述密码子优化的核苷酸序列编码包含本发明的SEQ ID NO:17和18的嵌合TCR。

本发明的重组表达载体可以使用在例如Green and Sambrook等,见上文以及Ausubel等,见上文中描述的标准重组DNA技术进行制备。可以制备含有在原核或真核宿主细胞中有功能的复制系统的表达载体的构建体，其为环状或线性的。复制系统可以来源于，例如，ColEl、2μ质粒、λ、SV40、牛乳头瘤病毒等。

期望重组表达载体包含调控序列，如转录和翻译起始密码子和终止密码子，其对待引入载体的宿主细胞类型(例如细菌、真菌、植物或动物)为特异的，视情况而定并且考虑载体是否基于DNA或RNA。

重组表达载体可以包含一个或多个标记基因，所述标记基因允许对转化或转染的宿主细胞进行选择。标记基因包括杀菌剂抗性，例如对抗生素、重金属等的抗性，与营养缺陷型宿主细胞互补以提供原养型等。本发明表达载体的合适标记基因包括，例如新霉素/G418抗性基因、潮霉素抗性基因、组氨醇抗性基因、四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因。

重组表达载体可以包含天然或非天然的启动子，其可操作地连接至编码TCR、多肽或蛋白(包括其功能变体)的核苷酸序列或可操作地连接至与编码TCR、多肽或蛋白(包括其功能变体)的核苷酸序列互补或杂交的核苷酸序列。启动子的选择，例如强、弱、可诱导的、组织特异的和发育特异的，在本领域普通技术人员的能力内。类似地，核苷酸序列与启动子的组合也在本领域技术人员的能力内。启动子可以为非病毒启动子或病毒启动子，例如巨细胞病毒(CMV)启动子、SV40启动子、RSV启动子或在鼠干细胞病毒的长末端重复序列中存在的启动子。

本发明的重组表达载体可被设计用于瞬时表达、用于稳定表达或两者。另外，可以制备用于组成型表达或用于诱导型表达的重组表达载体。此外，可以制备包含自杀基因的重组表达载体。

如本文所用，术语“自杀基因”是指引起表达自杀基因的细胞死亡的基因。自杀基因可以为，该基因在细胞中表达后赋予对药剂例如药物的敏感性，并且当细胞与药剂接触或暴露于药剂时引起细胞死亡的基因。自杀基因为本领域已知的(参见，例如，Suicide Gene Therapy:Methods and Reviews,Springer,Caroline J.(Cancer Research UKCentre for Cancer Therapeutics at the Institute of Cancer Research,Sutton,Surrey,UK),Humana Press,2004)并且包括，例如，单纯性疱疹病毒(HSV)胸苷激酶(TK)基因、胞嘧啶脱氨酶基因、嘌呤核苷磷酸化酶基因和硝基还原酶基因。

本发明的另一实施方案还提供了包含本文所述的任何重组表达载体的宿主细胞。如本文所用，术语“宿主细胞”是指可以含有本发明的重组表达载体的任何类型的细胞。宿主细胞可以为真核细胞，例如，植物、动物、真菌或藻类，或可以为原核细胞，例如，细菌或原生动物。宿主细胞可以为培养的细胞或原代细胞，即直接分离自生物体，例如人。宿主细胞可以为贴壁细胞或悬浮细胞，即悬浮生长的细胞。合适的宿主细胞为本领域已知的并且包括，例如，DH5α大肠杆菌细胞、中国仓鼠卵巢细胞、猴VERO细胞、COS细胞、HEK293细胞等。为了扩增或复制重组表达载体的目的，宿主细胞优选为原核细胞，例如，DH5α细胞。为了产生重组的TCR、多肽或蛋白的目的，宿主细胞优选为哺乳动物细胞。最优选地，宿主细胞为人细胞。虽然宿主细胞可以为任何细胞类型，可以源于任何类型的组织，并且可以为任何发育阶段，但宿主细胞优选为外周血淋巴细胞(PBL)或外周血单核细胞(PBMC)。更优选地，宿主细胞为T细胞。

为了本文的目的，T细胞可为任何T细胞，如培养的T细胞，例如原代T细胞或来自培养的T细胞系的T细胞，例如Jurkat、SupTl等，或从哺乳动物获得的T细胞。如果从哺乳动物获得，则T细胞可从许多来源获得，包括但不限于血液、骨髓、淋巴结、胸腺或其它组织或液体。T细胞也可被富集或纯化。优选地，T细胞为人T细胞。更优选地，T细胞为分离自人的T细胞。T细胞可以为任何类型的T细胞并且可以为任何发育阶段，包括但不限于CD4+/CD8+双阳性T细胞、CD4+辅助性T细胞，例如Th1和Th2细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞(例如，细胞毒性T细胞)、肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)、记忆T细胞(例如，中心记忆性T细胞和效应记忆性T细胞)、初始T细胞等。

本发明还提供了包含至少一种本文所述的宿主细胞的细胞群体。细胞群体可为异源群体，除了至少一种不包含任何重组表达载体的其它细胞，例如宿主细胞(例如T细胞)，或T细胞之外的细胞，例如B细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、红细胞、肝细胞、内皮细胞、上皮细胞、肌肉细胞、脑细胞等之外，所述异源群体还包含含有所述的任何重组表达载体的宿主细胞。可选地，细胞群体可为大体上同质的群体，其中所述群体主要包含含有重组表达载体的宿主细胞(例如，基本上由其组成)。群体也可为克隆细胞群体，其中群体的所有细胞为包含重组表达载体的单个宿主细胞的克隆，以使得群体的所有细胞包含重组表达载体。在本发明的一个实施方案中，细胞群体为克隆群体，所述克隆群体包含含有如本文所述的重组表达载体的宿主细胞。

在本发明的实施方案中，群体中细胞的数目可以快速地扩增。T细胞数目的扩增可以通过如例如，美国专利8,034,334；美国专利8,383,099；美国专利申请公开号2012/0244133；Dudley等,J.Immunother.,26:332-42(2003)；以及Riddell等,J.Immunol.Methods,128:189-201(1990)中所述的本领域已知的许多方法的任一个来实现。

本发明还提供了抗体或其抗原结合部分，其能特异性结合本文所述的任何TCR(或其功能变体)的功能部分。优选地，功能部分能特异性结合癌症抗原，例如，功能部分包含SEQ ID NO:3(α链的CDR1)、4(α链的CDR2)、5(α链的CDR3)、6(β链的CDR1)、7(β链的CDR2)、8(β链的CDR3)、SEQ ID NO:9(α链的可变区)、SEQ ID NO:10(β链的可变区)或它们的组合，例如，3-5；6-8；3-8；9；10；或9-10的氨基酸序列。更优选地，功能部分包含SEQ ID NO:3-8或SEQ ID NO:9和10的氨基酸序列。在优选的实施方案中，抗体或其抗原结合部分能结合通过全部6个CDR(α链的CDR1-3和β链的CDR1-3)形成的表位。抗体可以为本领域已知的任何类型的免疫球蛋白。例如，抗体可以为任何同种型，例如，IgA、IgD、IgE、IgG、IgM等。抗体可以为单克隆或多克隆的。抗体可以为天然存在的抗体，例如，分离和/或纯化自哺乳动物(例如，小鼠、兔、山羊、马、鸡、仓鼠、人等)的抗体。可选地，抗体可以为基因工程改造的抗体，例如，人源化抗体或嵌合抗体。抗体可以为单体形式或聚合形式。另外，抗体可以对本发明TCR(或其功能变体)的功能部分具有任何水平的亲和力或亲合力。期望抗体对本发明的TCR(或其功能变体)的功能部分为特异的，以使得与其它肽或蛋白存在最小的交叉反应。

测试抗体结合至本发明TCR的任何功能部分或功能变体的能力的方法为本领域已知的并且包括任何抗体-抗原结合测定，诸如，例如，放射性免疫测定(RIA)、ELISA、蛋白质印迹、免疫沉淀和竞争性抑制测定(参见，例如Janeway等,下文和美国专利申请公开号2002/0197266A1)。

制备抗体的合适的方法为本领域已知的。例如，标准杂交瘤方法描述在，例如，and Milstein,Eur.J.Immunol.,5,511-519(1976),Harlow and Lane(eds.),Antibodies:A Laboratory Manual,CSH Press(1988)以及C.A.Janeway等(eds.),Immunobiology,8^th Ed.,Garland Publishing,New York,NY(2011))中。可选地，其它方法，如EBV-杂交瘤方法(Haskard and Archer,J.Immunol.Methods,74(2),361-67(1984)以及Roder等,Methods Enzymol.,121,140-67(1986))和噬菌体载体表达系统(参见，例如，Huse等,Science,246,1275-81(1989))为本领域已知的。此外，在非人动物中产生抗体的方法描述在，例如，美国专利5,545,806、5,569,825和5,714,352以及美国专利公开号2002/0197266A1中。

此外，噬菌体展示可用于生成本发明的抗体。在这方面，编码抗体的抗原结合可变(V)结构域的噬菌体文库可以使用标准的分子生物学和重组DNA技术生成(参见，例如，Green and Sambrook等(eds.),Molecular Cloning,A Laboratory Manual,4^th Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York(2012))。选择编码具有期望特异性的可变区的噬菌体来特异性结合期望抗原，并重建包含选定的可变结构域的完整或部分抗体。将编码重建抗体的核酸序列引入合适的细胞系，诸如用于杂交瘤产生的骨髓瘤细胞，以使得细胞分泌具有单克隆抗体特性的抗体(参见，例如，Janeway等,见上文,Huse等,见上文和美国专利6,265,150)。

抗体可以通过针对特定的重链和轻链免疫球蛋白基因而转基因的转基因小鼠产生。此类方法为本领域已知的并且描述在，例如美国专利5,545,806和5,569,825以及Janeway等,见上文中。

生成人源化抗体的方法为本领域熟知的并且详细描述在例如Janeway等,见上文，美国专利5,225,539、5,585,089和5,693,761，欧洲专利第0239400 B1号以及英国专利第2188638号中。人源化抗体也可以使用，例如，美国专利5,639,641和Pedersen等,J.Mol.Biol.,235,959-973(1994)中所述的抗体表面重塑技术生成。

本发明还提供了本文所述的任何抗体的抗原结合部分。抗原结合部分可以为具有至少一个抗原结合位点的任何部分，如Fab、F(ab')₂、dsFv、sFv、双抗体和三链抗体。

可以使用常规的重组DNA技术方法(参见，如，Janeway等，见上文)生成单链可变区片段(sFv)抗体片段，其由截短的Fab片段组成，所述截短的Fab片段包含经由合成肽连接至抗体轻链的V结构域的抗体重链的可变(V)结构域。类似地，二硫化物稳定的可变区片段(dsFv)可以通过重组DNA技术制备(参见，例如，Reiter等,Protein Engineering,7,697-704(1994))。然而，本发明的抗体片段不限于这些示例性类型的抗体片段。

另外，抗体或其抗原结合部分可修饰为包含可检测标记，诸如，例如放射性同位素、荧光团(例如异硫氰酸荧光素(FITC)、藻红蛋白(PE))、酶(例如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶)和元素颗粒(例如金颗粒)。

可以分离和/或纯化本发明的TCR、多肽、蛋白(包括其功能变体)、核酸、重组表达载体、宿主细胞(包括其群体)和抗体(包括其抗原结合部分)。本文使用的术语“分离的”意指已经脱离其天然环境。本文使用的术语“纯化的”意指纯度已经增加，其中“纯度”为相对术语，并且不一定解释为绝对纯度。例如，纯度可以为至少约50％，可以大于60％、70％、80％、90％、95％或可以为100％。

本发明的TCR、多肽、蛋白(包括其功能变体)、核酸、重组表达载体、宿主细胞(包括其群体)和抗体(包括其抗原结合部分)，在下文中其全部被统称为“本发明的TCR物质”，可以被配制成组合物，如药物组合物。在这方面，本发明提供了包含本文所述的任何TCR、多肽、蛋白、功能部分、功能变体、核酸、表达载体、宿主细胞(包括其群体)和抗体(包括其抗原结合部分)以及药学上可接受的载体的药物组合物。含有任何本发明的TCR物质的本发明的药物组合物可以包含多于一种本发明的TCR物质，例如，多肽和核酸，或两种或更多种不同的TCR(包括其功能部分和功能变体)。可选地，药物组合物可以包含与另一药物活性剂或药物如化学治疗剂，例如天冬酰胺酶、白消安、卡铂、顺铂、柔红霉素、阿霉素、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、甲氨蝶呤、紫杉醇、利妥昔单抗(rituximab)、长春碱、长春新碱等组合的本发明的TCR物质。

优选地，载体为药学上可接受的载体。关于药物组合物，载体可以为考虑中任何常规地用于本发明的具体TCR物质的那些。此类药学上可接受的载体为本领域技术人员熟知的并且公众容易获得。优选的是在使用条件下无有害的副作用或毒性的药学上可接受的载体。

载体的选择将部分由本发明的具体TCR物质以及用于施用本发明TCR物质的具体方法来确定。因此，存在本发明的药物组合物的多种合适的制剂。合适的制剂可以包括任何用于口服、肠胃外、皮下、静脉内、肌内、动脉内、鞘内或腹膜内施用的那些制剂。可以使用多于一种途径来施用本发明的TCR物质，并且在某些情况下，特定的途径可以提供比另一途径更直接且更有效的应答。

优选地，本发明的TCR物质通过注射例如静脉内施用。当本发明的TCR物质为表达本发明的TCR(或其功能变体)的宿主细胞时，用于注射的细胞的药学上可接受的载体可以包括任何等渗载体，诸如，例如，生理盐水(约0.90％w/v的NaCl水溶液、约300mOsm/L的NaCl水溶液或约9.0g/L NaCl水溶液)、NORMOSOL R电解质溶液(Abbott,Chicago,IL)、PLASMA-LYTE A(Baxter,Deerfield,IL),约5％葡萄糖水溶液或林格氏乳酸盐水溶液。在实施方案中，药学上可接受的载体补充有人血清白蛋白。

为了本发明的目的，施用的本发明TCR物质的量或剂量(例如，本发明的TCR物质为一个或多个细胞时的细胞的数目)应足以在合理的时间范围内引起受试者或动物的例如治疗性或预防性响应。例如，本发明的TCR物质的剂量应在从施用时起约2小时或更久，例如12小时至24小时或更久时间的时段内足以结合癌症抗原或检测、治疗或预防癌症。在某些实施方案中，时间段甚至可以更久。剂量将由本发明的具体TCR物质的功效和动物(例如人)的状况以及待治疗的动物(例如人)的体重来确定。

用于确定施用剂量的许多测定为本领域已知的。为了本发明的目的，测定可用于确定待施用于哺乳动物的起始剂量，所述测定包括，将给定剂量的表达本发明TCR(或其功能变体或功能部分)、多肽或蛋白的T细胞施用于一组哺乳动物中的哺乳动物(各自被给予不同剂量的T细胞)后，比较靶细胞裂解或由此类T细胞分泌的IFN-γ所达到的程度。在施用某剂量后，靶细胞裂解或IFN-γ分泌所达到的程度可以通过本领域已知的方法测定。

本发明TCR物质的剂量也通过可能伴随本发明具体TCR物质的施用的任何不利副作用的存在、性质和程度来确定。通常，主治医师决定治疗每个个体患者的本发明TCR物质的剂量，这考虑到多种因素，如年龄、体重、一般健康、饮食、性别、待施用的本发明TCR物质、施用途径以及治疗病况的严重性。在本发明的TCR物质为细胞群体的实施方案中，每次输注施用的细胞数目可以例如从约1×10⁶至约1×10¹²个细胞或更多变化。

本领域普通技术人员应容易地理解本发明的TCR物质可以以许多方式进行修饰，以使得本发明TCR物质的治疗性或预防性功效通过修饰增加。例如，本发明的TCR物质可以直接地或通过桥间接地缀合于靶向部分。将化合物，例如本发明的TCR物质缀合于靶向部分的实践为本领域已知的。参见，例如，Wadwa等,J.Drug Targeting 3:111(1995)和美国专利5,087,616。本文使用的术语“靶向部分”是指这样的任何分子或试剂：其特异性识别并结合细胞表面受体，以使得靶向部分定向本发明TCR物质至其表面表达受体的细胞群体的递送。靶向部分包括但不限于抗体或其片段、肽、激素、生长因子、细胞因子以及能结合于细胞表面受体(例如，上皮生长因子受体(EGFR)、T细胞受体(TCR)、B-细胞受体(BCR)、CD28、血小板来源的生长因子受体(PDGF)、烟碱乙酰胆碱受体(nAChR)等)的任何其它天然或非天然的配体。本文使用的术语“桥”是指将本发明的TCR物质连接于靶向部分的任何试剂或分子。本领域普通技术人员意识到本发明的TCR物质的位点(其对于本发明TCR物质的功能是非必需的)是附接桥和/或靶向部分的理想位点，前提是一旦附接到本发明的TCR物质，所述桥和/或靶向部分不会干扰本发明TCR物质的功能，即结合HPV 16 E6；或检测、治疗或预防癌症、HPV 16感染或HPV阳性初癌的能力。

预期本发明的药物组合物、TCR(包括其功能变体)、多肽、蛋白、核酸、重组表达载体、宿主细胞或细胞群体可以用于治疗或预防癌症、HPV 16感染或HPV阳性初癌的方法中。不受特定理论的束缚，认为本发明的TCR(及其功能变体)能特异性结合HPV 16 E6，以使得当由细胞表达时，TCR(或相关的本发明多肽或蛋白及其功能变体)能够介导针对表达HPV16 E6的靶细胞的免疫应答。在这方面，本发明提供了治疗或预防哺乳动物中病况的方法，其包括以有效治疗或预防哺乳动物中病况的量向哺乳动物施用本文所述的任何药物组合物、TCR(及其功能变体)、多肽或蛋白，包含编码本文所述的任何TCR(及其功能变体)、多肽、蛋白的核苷酸序列的任何核酸或重组表达载体，或包含编码本文所述的任何TCR(及其功能变体)、多肽或蛋白的重组载体的任何宿主细胞或细胞群体，其中所述病况为癌症、HPV 16感染或HPV阳性初癌。

本文使用的术语“治疗”和“预防”以及源自于此的词不必暗示100％或完全治疗或预防。相反，存在不同程度的治疗或预防，其被本领域普通技术人员认为具有潜在的益处或治疗效果。在这方面，本发明方法可以提供任何量或任何水平的治疗或预防哺乳动物的病况。此外，本发明方法提供的治疗或预防可以包括正在治疗或预防的病况例如癌症的一种或多种状况或症状的治疗或预防。例如，治疗或预防可以包括促进肿瘤的消退。另外，为了本文的目的，“预防”可以涵盖延迟病况或其症状或状况的发作。

还提供了检测哺乳动物中存在病况的方法。所述方法包括(i)将包含来自哺乳动物的一种或多种细胞的样品与本文所述的任何本发明TCR(及其功能变体)、多肽、蛋白、核酸、重组表达载体、宿主细胞、细胞群体、抗体或其抗原结合部分或药物组合物相接触，从而形成复合物，以及检测所述复合物，其中检测到复合物指示哺乳动物中存在病况，其中所述病况为癌症、HPV 16感染或HPV阳性初癌。

关于本发明的检测哺乳动物中病况的方法，细胞的样品可为包含全细胞、其裂解物或一部分全细胞裂解物，例如细胞核或细胞质部分、全蛋白部分、或核酸部分的样品。

为了本发明检测方法的目的，接触可以在相对于哺乳动物的体外或体内发生。优选地，所述接触为体外的。

另外，复合物的检测可以通过本领域已知的多种方法进行。例如，本文所述的本发明TCR(及其功能变体)、多肽、蛋白、核酸、重组表达载体、宿主细胞、细胞群体或抗体或其抗原结合部分可以用可检测标记，诸如，例如放射性同位素、荧光团(例如异硫氰酸荧光素(FITC)、藻红蛋白(PE))、酶(例如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶)和元素颗粒(例如，金颗粒)进行标记。

为了本发明方法的目的，其中施用宿主细胞或细胞群体时，所述细胞可为与哺乳动物同种异体或哺乳动物自体的细胞。优选地，所述细胞为哺乳动物自体的。

关于本发明方法，癌症可为任何癌症，包括任何的急性淋巴细胞性癌症、急性骨髓性白血病、腺泡状横纹肌肉瘤、骨癌、脑癌、乳腺癌、肛门癌、肛管癌或直肠肛门癌、眼癌、肝内胆管癌、关节癌、颈癌、胆囊癌或胸膜癌、鼻癌、鼻腔癌或中耳癌、口腔癌、阴道癌、外阴癌、慢性淋巴细胞白血病、慢性骨髓性癌症、结肠癌、食管癌、宫颈癌、胃肠道类癌肿瘤、胶质瘤、霍奇金(Hodgkin)淋巴瘤、下咽癌、肾癌、喉癌、肝癌、肺癌、恶性间皮瘤、黑素瘤、多发性骨髓瘤、鼻咽癌、非霍奇金淋巴瘤、口咽癌、卵巢癌、阴茎癌、胰腺癌、腹膜癌、网膜癌和肠系膜癌、咽癌、前列腺癌、直肠癌、肾癌、皮肤癌、小肠癌、软组织癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌、输尿管癌和膀胱癌。优选的癌症为宫颈癌、口咽癌、肛门癌、肛管癌、直肠肛门癌、阴道癌、外阴癌或阴茎癌。特别优选的癌症为HPV 16阳性癌症。虽然最常见的与HPV 16感染相关的癌症包括宫颈癌、口咽癌、肛门癌、肛管癌、直肠肛门癌、阴道癌、外阴癌和阴茎癌，但本发明方法可以用于治疗任何HPV 16阳性癌症，包括在其它解剖区出现的那些癌症。

本发明方法提及的哺乳动物可为任何哺乳动物。如本文所用，术语“哺乳动物”是指任何哺乳动物，包括但不限于啮齿目的哺乳动物，如小鼠和仓鼠，以及兔形目的哺乳动物，如兔。优选的是哺乳动物来自食肉目，包括猫科动物(猫)和犬科动物(犬)。更优选的是哺乳动物来自偶蹄目，包括牛科动物(牛)和猪科动物(猪)、或奇蹄目，包括马科动物(马)。最优选的是哺乳动物为灵长目、猿(Ceboids)目或猴(Simoids)目(猴)或类人猿亚目(人和猿)。特别优选的哺乳动物为人。

以下实施例进一步阐明本发明，但当然不应理解为以任何方式限制其范围。

实施例1

本实施例显示从肿瘤中分离人抗HPV 16 TCR。

转移性HPV 16 E6阳性肛门癌肿瘤(肿瘤3809)的样品获自患者。通过逆转录酶(RT)聚合酶链式反应(PCR)分析相对于甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)而言，肿瘤样品的HPV16 E6、HPV 16 E7、HPV 18 E6和HPV 18 E7的表达。将HPV 16 E6、HPV 16 E7、HPV 18 E6和HPV 18 E7的相对表达与CaSki细胞、HeLa细胞和624细胞(黑色素瘤细胞系)的表达进行比较。结果显示在图1中。如图1中所示，肿瘤3809样品对于HPV 16 E6表达为阳性的。

将肿瘤3809样品分成24个碎块并且从各个碎块获得肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)。将TIL与自体未成熟的树突细胞(DC)在96孔板中共培养，所述树突细胞已经用单独的HPV16 E6、HPV 16 E6与抗I类抗体的组合、单独的HPV 16 E7、HPV 16 E7与抗I类抗体的组合、gp100或OKT3脉冲刺激。测量干扰素γ(IFN-γ)。结果显示在图2A和2B中。如图2A和2B中所示，TIL对HPV 16 E6具有反应性，但对gp100或E7没有反应性。TIL的抗HPV 16 E6的反应性被抗I类抗体阻断。

使用抗4-1BB磁珠选择来自反应性共培养孔的细胞。选定细胞的数目的快速扩增使用如先前所述的快速扩增方案(REP)(Dudley等,J.Immunother.26:332-42(2003)和Riddell等,J.Immunol.Methods,128:189-201(1990))进行。简言之，将TIL与经辐射的(40Gy)同种异体外周血单核细胞“饲养”细胞在具有30ng/mL抗CD3抗体和6000IU/mL IL-2的完全培养基(CM)中培养。

将扩增数目的3809 4-1BB-选定的细胞与用绿色荧光蛋白(GFP)转染的293-A2细胞(稳定表达HLA-A2的HEK-293细胞)、用E6转染的293-A2细胞、在无肽时培养的3809淋巴样干细胞系(LCL)(已经使用爱泼斯坦-巴尔病毒转染的B细胞)、与HPV 16 E6肽库共培养的3809LCL或OKT3共培养。该肽库包括具有11个氨基酸重叠的15-mer的肽，这覆盖HPV 16 E6的全序列。测量IFN-γ。结果显示在图3中。如图3中所示，扩增数目的TIL对于用E6转染的293-A2细胞具有反应性，但是对于用GFP转染的293-A2细胞无反应性。与E6肽库共培养的3809LCL细胞显示出反应性，而与无肽共培养的3809LCL细胞未显示出反应性。流式细胞术研究显示扩增数目的细胞结合于HLA-A2/E6_29-38四聚体。

在无需REP或克隆的其它循环的情况下，通过使用抗4-1BB磁珠的分选进一步选定细胞，随后进行5’cDNA末端快速扩增(RACE)。来自磁珠分离的5’RACE产物的基因型分析显示在表A中。如表A中所示，获得了几乎克隆的细胞群体。

表A

TRAV

TRAJ

克隆

TRBV

TRBJ

TRBD

克隆

TRAV35*02

TRAJ41*01

4

TRBV7-6*01

TRBV2-3*01

TRBD1*01

8

TRAV10*01

TRAJ44*01

3

TRBV14*01

TRBJ1-6*01

TRBD1*01

1

TRAV5*01

TRAJ34*01

1

包含编码含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的α链的cDNA(SEQ ID NO:21)的核苷酸序列获得自TRAV35*02/TRAJ41*01。包含编码含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的β链的cDNA(SEQ ID NO:22)的核苷酸序列获得自TRBV7-6*01/TRBV2-3*01/TRBD1*01。

实施例2

本实施例显示制备包含人可变区和小鼠恒定区的嵌合抗HPV 16 TCR的方法。

编码包含小鼠恒定区和人可变区的嵌合TCR的核苷酸序列如下制备。将编码实施例1中获得的TCR的α和β链的初始(人)恒定区(分别为SEQ ID NO:23和24的恒定区氨基酸序列)的核苷酸序列切除并用分别编码鼠α和β链的恒定区的核苷酸序列替换。将所得的编码嵌合α和β链的核苷酸序列克隆至具有编码位于α和β链之间的细小核糖核酸病毒2A肽的核苷酸序列的单核苷酸序列。将组合的核苷酸序列针对在人组织中的表达进行密码子优化(opt)以提供载体插入物(SEQ ID NO:29)。将载体插入物克隆至MSGV1表达载体，从而产生SEQ ID NO:30的核苷酸序列(E6 TCR)。载体编码的TCR包含α链和β链，所述α链包含含有SEQID NO:17的氨基酸序列，所述β链包含含有SEQ ID NO:18的氨基酸序列。

实施例3

本实施例显示用编码SEQ ID NO:17和18的氨基酸序列的重组表达载体转导的外周血淋巴细胞(PBL)以HLA-A2-限制性方式特异性识别HPV 16阳性肿瘤细胞系。

将外周血淋巴细胞(PBL)用实施例2的表达载体转导，并且与用HPV 16 E6_29-38肽脉冲刺激的293-A2靶细胞、用HPV 16 E7_11-19肽脉冲刺激的293-A2细胞、用编码HPV 16 E6的质粒转导的293-A2细胞、用编码GFP的质粒转导的293-A2细胞、用编码HPV 16 E6的质粒转导的293细胞、用编码HPV 16 E6的质粒转导的624细胞、用编码HPV 16 E7的质粒转导的624细胞、SCC152细胞、SCC90细胞、CaSki细胞、HPV-18宫颈癌细胞、黑色素瘤对照细胞、胆道对照细胞、624细胞或SiHa细胞共培养。测量IFN-γ。结果显示在图4A中。如图4A中所示，用编码SEQ ID NO:17和18的氨基酸序列的重组表达载体转导的PBMC以HLA-A2-限制性方式特异性识别HPV 16阳性肿瘤细胞系和其它HLA-A2+HPV16+靶标。

在无抗体、抗MHC I类抗体或抗MHC II类抗体的情况下，将用实施例2的表达载体转导的PBL与用编码E6的质粒转导的293-A2靶细胞，用编码E6的质粒转导的293细胞，SCC90细胞，CaSki细胞或624细胞(黑色素瘤细胞系)共培养。在无抗体、抗MHC I类抗体或抗MHCII类抗体的情况下，将DMF5(经转导表达针对MART-1的MHC I类限制性TCR的T细胞)与被DMF5识别的黑色素瘤细胞系(624)共培养。在无抗体、抗MHC I类抗体或抗MHC II类抗体的情况下，将4.7.20(经转导表达针对HPV 16 E7的MHC II类限制性TCR的T细胞)与用E7肽库“E7肽”脉冲刺激的PBMC培养。测量IFN-γ。结果显示在图4B中。如图4B中所示，抗MHC I类抗体阻断转导的细胞对HLA-A2⁺HPV16⁺靶标的反应性，而抗II类抗体不阻断反应性。

实施例4

本实施例显示用编码SEQ ID NO:17和18的氨基酸序列的重组表达载体转导的细胞以CD8独立性方式结合HLA-A2-E629-38四聚体。

将用实施例2的重组表达载体转导的PBL通过FACS分选成CD8阳性细胞和CD8阴性细胞。结合于HLA-A2-E6_29-38四聚体通过流式细胞术测量。CD8阳性和CD8阴性细胞均结合于HLA-A2-E6_29-38四聚体。

实施例5

本实施例显示用编码SEQ ID NO:17和18的氨基酸序列的重组表达载体转导的CD4和CD8阳性细胞特异性识别HPV-16阳性肿瘤细胞系。

CD8阳性或CD4阳性PBL为未转导的或用实施例2的表达载体转导，并且与用HPV 16E6_29-38肽脉冲刺激的293-A2靶细胞、用HPV 16 E7_11-19肽脉冲刺激的293-A2细胞、用编码HPV16 E6的质粒转导的293-A2细胞、用编码GFP的质粒转导的293-A2细胞、293-A2细胞、稳定表达HPV 16 E7的逆转录病毒转导的624细胞(624-E7)、稳定表达HPV 16 E6的逆转录病毒转导的624细胞(624-E6)、SCC152细胞、SCC90细胞、CaSki细胞、HPV-18宫颈癌细胞、黑色素瘤对照细胞、624细胞或SiHa细胞共培养。测量IFN-γ。结果显示在图5中。如图5中所示，用编码SEQ ID NO:17和18的氨基酸序列的重组表达载体转导的CD8阳性和CD4阳性PBMC均以HLA-A2-限制性方式特异性识别HPV 16阳性肿瘤细胞系和其它HLA-A2⁺HPV16⁺靶标。

实施例6

本实施例显示用编码SEQ ID NO:17和18的氨基酸序列的重组表达载体转导的细胞对HPV 16 E6_29-38-脉冲刺激的T2细胞显示出亲合识别。

CD8阳性或CD4阳性PBL为未转导的或用实施例2的表达载体转导的，并且与用不同浓度的HPV 16 E6_29-38肽脉冲刺激的T2靶细胞共培养。测量IFN-γ。结果显示在图6A和6B中。如图6A和6B中所示，用编码SEQ ID NO:17和18的氨基酸序列的重组表达载体转导的CD4阳性和CD8阳性细胞对HPV 16 E6_29-38-脉冲刺激的T2细胞显示出亲合识别。

实施例7

本实施例显示治疗人类患者中HPV 16⁺癌症的方法，其包括向患者施用经转导以表达包含SEQ ID NO:17和18的氨基酸序列的抗HPV 16 E6_29-38TCR的自体T细胞。

患者具有复发的/难治的或转移性HPV-16⁺癌症。通过原位杂交(ISH)或PCR测试癌性组织样品的HPV 16基因型。也测试患者的HLA-A2表达。对于复发的/难治的或转移性疾病，患者具有先前的一线治疗或患者具有降低的标准治疗。

在第-7天和第-6天用环磷酰胺(60mg/kg/天，静脉内(IV))治疗患者，并且在第-5天至第-1天用氟达拉滨(25mg/m2/天IV)治疗患者。用实施例2的MSGV1表达载体转导自体的PBMC。转导的细胞的数目如先前所述(Dudley等J.Immunother.26:332-42(2003)和Riddell等J.Immunol.Methods 128:189-201(1990))迅速扩增。简言之，将细胞与经辐射的(40Gy)同种异体外周血单核细胞“饲养”细胞在具有30ng/mL抗CD3抗体和6000IU/mL IL-2的完全培养基(CM)中培养。在第0天，将扩增数目的转导细胞连同高剂量的白细胞介素(IL)-2施用于患者。

客观的肿瘤应答应根据RECIST(实体瘤疗效评价标准)1.0进行评价。如果18名患者中至少有3名患者在治疗之后4个月或更久对治疗有应答，则群组将扩大至35名患者。也评价了毒性。也研究了免疫学研究(包括，例如，输注细胞的扩增、存留、表型和功能)。

本文引用的所有参考文献，包括出版物、专利申请和专利在此通过引用并入，其程度如同每份参考文献单独地和具体地表示为通过引用并入并且在本文以其整体示出。

在描述本发明的上下文中(特别是在以下权利要求的上下文中)使用的术语“一个/一种”和“所述”和“至少一种/一个”以及类似的指示物应被解释为覆盖单数和复数两者，除非本文另外指出或与上下文明显矛盾。术语“至少一种/一个”之后一项或多项列表(例如，“A和B中的至少一种/一个”)的使用应被解释为意指选自列出的项中的一项(A或B)或两个或更多个列出的项的组合(A和B)，除非本文另外指出或与上下文明显矛盾。术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应被解释为开放式的术语(即意指“包括，但不限于”)，除非另外指明。本文数值的范围的描述仅旨在用作分别提及属于范围内的每个单独数值的速记法，除非本文另外指出，并且每个单独的数值均并入说明书中如同其被单独的列举出一样。本文所述的所有方法可以以任何合适的顺序进行，除非本文另外指出或与上下文明显矛盾。本文提供的任何和所有的实例或示例性语言(例如，“诸如”)的使用仅仅意图更好地阐明本发明，并且不会对以其它方式要求保护的本发明范围构成限制。不应将本说明书中的语言解释为表明任何未要求保护的组分对实施本发明是必要的。

本发明的优选实施方案在本文中描述，包括发明人已知的实施该发明的最佳模式。对本领域的普通技术人员来说，阅读上述说明后这些优选的实施方案中的改变可以是显而易见的。发明人期望熟练的技术人员酌情利用这些改变，并且发明人意欲以不同于本文具体描述的方式实施该发明。因此，在适用法律允许的情况下，本发明包括在所附的权利要求中所引用主题的所有修改和等同物。此外，在其所有可能的改变中上述要素的任何组合涵盖于本发明中，除非本文另外说明或上下文中明显矛盾。

序列表

<110> 美国卫生和人力服务部（THE UNITED STATES OF AMERICA, AS REPRESENTEDBY THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES）

<120> 抗人乳头瘤病毒16 E6 T细胞受体

<130> 716827

<150> US 61/846,167

<151> 2013-07-15

<160> 39

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 158

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> 合成的

<400> 1

Met His Gln Lys Arg Thr Ala Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro

1 5 10 15

Arg Lys Leu Pro Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp

20 25 30

Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu

35 40 45

Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly

50 55 60

Asn Pro Tyr Ala Val Cys Asp Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile

65 70 75 80

Ser Glu Tyr Arg His Tyr Cys Tyr Ser Leu Tyr Gly Thr Thr Leu Glu

85 90 95

Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu Cys Asp Leu Leu Ile Arg Cys Ile Asn

100 105 110

Cys Gln Lys Pro Leu Cys Pro Glu Glu Lys Gln Arg His Leu Asp Lys

115 120 125

Lys Gln Arg Phe His Asn Ile Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys Met

130 135 140

Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg Thr Arg Arg Glu Thr Gln Leu

145 150 155

<210> 2

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> 合成的

<400> 2

Thr Ile His Asp Ile Ile Leu Glu Cys Val

1 5 10

<210> 3

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> 合成的

<400> 3

Ser Ile Phe Asn Thr

1 5

<210> 4

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> 合成的

<400> 4

Leu Tyr Lys Ala Gly Glu Leu

1 5

<210> 5

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> 合成的

<400> 5

Ala Gly His Pro Ser Ser Asn Ser Gly Tyr Ala Leu Asn

1 5 10

<210> 6

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> 合成的

<400> 6

Ser Gly His Val Ser

1 5

<210> 7

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> 合成的

<400> 7

Phe Asn Tyr Glu Ala Gln

1 5

<210> 8

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> 合成的

<400> 8

Ala Ser Ser Ser Gln Thr Gly Ala Arg Thr Asp Thr Gln Tyr

1 5 10

<210> 9

<211> 131

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> 合成的

<400> 9

Met Leu Leu Glu His Leu Leu Ile Ile Leu Trp Met Gln Leu Thr Trp

1 5 10 15

Val Ser Gly Gln Gln Leu Asn Gln Ser Pro Gln Ser Met Phe Ile Gln

20 25 30

Glu Gly Glu Asp Val Ser Met Asn Cys Thr Ser Ser Ser Ile Phe Asn

35 40 45

Thr Trp Leu Trp Tyr Lys Gln Asp Pro Gly Glu Gly Pro Val Leu Leu

50 55 60

Ile Ala Leu Tyr Lys Ala Gly Glu Leu Thr Ser Asn Gly Arg Leu Thr

65 70 75 80

Ala Gln Phe Gly Ile Thr Arg Lys Asp Ser Phe Leu Asn Ile Ser Ala

85 90 95

Ser Ile Pro Ser Asp Val Gly Ile Tyr Phe Cys Ala Gly His Pro Ser

100 105 110

Ser Asn Ser Gly Tyr Ala Leu Asn Phe Gly Lys Gly Thr Ser Leu Leu

115 120 125

Val Thr Pro

130

<210> 10

<211> 135

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> 合成的

<400> 10

Met Gly Thr Ser Leu Leu Cys Trp Val Val Leu Gly Phe Leu Gly Thr

1 5 10 15

Asp His Thr Gly Ala Gly Val Ser Gln Ser Pro Arg Tyr Lys Val Thr

20 25 30

Lys Arg Gly Gln Asp Val Ala Leu Arg Cys Asp Pro Ile Ser Gly His

35 40 45

Val Ser Leu Tyr Trp Tyr Arg Gln Ala Leu Gly Gln Gly Pro Glu Phe

50 55 60

Leu Thr Tyr Phe Asn Tyr Glu Ala Gln Gln Asp Lys Ser Gly Leu Pro

65 70 75 80

Asn Asp Arg Phe Ser Ala Glu Arg Pro Glu Gly Ser Ile Ser Thr Leu

85 90 95

Thr Ile Gln Arg Thr Glu Gln Arg Asp Ser Ala Met Tyr Arg Cys Ala

100 105 110

Ser Ser Ser Gln Thr Gly Ala Arg Thr Asp Thr Gln Tyr Phe Gly Pro

115 120 125

Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu

130 135

<210> 11

<211> 272

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> 合成的

<400> 11

Met Leu Leu Glu His Leu Leu Ile Ile Leu Trp Met Gln Leu Thr Trp

1 5 10 15

Val Ser Gly Gln Gln Leu Asn Gln Ser Pro Gln Ser Met Phe Ile Gln

20 25 30

Glu Gly Glu Asp Val Ser Met Asn Cys Thr Ser Ser Ser Ile Phe Asn

35 40 45

Thr Trp Leu Trp Tyr Lys Gln Asp Pro Gly Glu Gly Pro Val Leu Leu

50 55 60

Ile Ala Leu Tyr Lys Ala Gly Glu Leu Thr Ser Asn Gly Arg Leu Thr

65 70 75 80

Ala Gln Phe Gly Ile Thr Arg Lys Asp Ser Phe Leu Asn Ile Ser Ala

85 90 95

Ser Ile Pro Ser Asp Val Gly Ile Tyr Phe Cys Ala Gly His Pro Ser

100 105 110

Ser Asn Ser Gly Tyr Ala Leu Asn Phe Gly Lys Gly Thr Ser Leu Leu

115 120 125

Val Thr Pro His Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg

130 135 140

Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp

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Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr

165 170 175

Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser

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210 215 220

Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn

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Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu

245 250 255

Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser

260 265 270

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> 合成的

<400> 12

Met Gly Thr Ser Leu Leu Cys Trp Val Val Leu Gly Phe Leu Gly Thr

1 5 10 15

Asp His Thr Gly Ala Gly Val Ser Gln Ser Pro Arg Tyr Lys Val Thr

20 25 30

Lys Arg Gly Gln Asp Val Ala Leu Arg Cys Asp Pro Ile Ser Gly His

35 40 45

Val Ser Leu Tyr Trp Tyr Arg Gln Ala Leu Gly Gln Gly Pro Glu Phe

50 55 60

Leu Thr Tyr Phe Asn Tyr Glu Ala Gln Gln Asp Lys Ser Gly Leu Pro

65 70 75 80

Asn Asp Arg Phe Ser Ala Glu Arg Pro Glu Gly Ser Ile Ser Thr Leu

85 90 95

Thr Ile Gln Arg Thr Glu Gln Arg Asp Ser Ala Met Tyr Arg Cys Ala

100 105 110

Ser Ser Ser Gln Thr Gly Ala Arg Thr Asp Thr Gln Tyr Phe Gly Pro

115 120 125

Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro

130 135 140

Glu Val Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln

145 150 155 160

Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val

165 170 175

Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser

180 185 190

Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg

195 200 205

Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn

210 215 220

Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu

225 230 235 240

Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val

245 250 255

Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser

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Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> 合成的

<400> 13

His Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys

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Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr

20 25 30

Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr

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Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala

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65 70 75 80

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Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe

100 105 110

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Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> 合成的

<400> 14

Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro

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Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu

20 25 30

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Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys

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65 70 75 80

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85 90 95

Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp

100 105 110

Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg

115 120 125

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Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asp

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Ser Arg Gly

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> 合成的

<400> 15

Asp Ile Gln Asn Pro Glu Pro Ala Val Tyr Gln Leu Lys Asp Pro Arg

1 5 10 15

Ser Gln Asp Ser Thr Leu Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Ile

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Asn Val Pro Lys Thr Met Glu Ser Gly Thr Phe Ile Thr Asp Lys Thr

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Val Leu Asp Met Lys Ala Met Asp Ser Lys Ser Asn Gly Ala Ile Ala

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Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser

130 135

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> 合成的

<400> 16

Glu Asp Leu Arg Asn Val Thr Pro Pro Lys Val Ser Leu Phe Glu Pro

1 5 10 15

Ser Lys Ala Glu Ile Ala Asn Lys Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu

20 25 30

Ala Arg Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn

35 40 45

Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Ala Tyr Lys

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Glu Ser Asn Tyr Ser Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala

65 70 75 80

Thr Phe Trp His Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe

85 90 95

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100 105 110

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> 合成的

<400> 17

Met Leu Leu Glu His Leu Leu Ile Ile Leu Trp Met Gln Leu Thr Trp

1 5 10 15

Val Ser Gly Gln Gln Leu Asn Gln Ser Pro Gln Ser Met Phe Ile Gln

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Glu Gly Glu Asp Val Ser Met Asn Cys Thr Ser Ser Ser Ile Phe Asn

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130 135 140

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Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Lys Ala Met Asp Ser Lys Ser Asn Gly

180 185 190

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210 215 220

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Asn Leu Ser Val Met Gly Leu Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly

245 250 255

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260 265

<210> 18

<211> 308

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> 合成的

<400> 18

Met Gly Thr Ser Leu Leu Cys Trp Val Val Leu Gly Phe Leu Gly Thr

1 5 10 15

Asp His Thr Gly Ala Gly Val Ser Gln Ser Pro Arg Tyr Lys Val Thr

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Lys Arg Gly Gln Asp Val Ala Leu Arg Cys Asp Pro Ile Ser Gly His

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Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala Arg Gly Phe Phe Pro Asp His Val

165 170 175

Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser

180 185 190

Thr Asp Pro Gln Ala Tyr Lys Glu Ser Asn Tyr Ser Tyr Cys Leu Ser

195 200 205

Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp His Asn Pro Arg Asn His

210 215 220

Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe His Gly Leu Ser Glu Glu Asp Lys Trp

225 230 235 240

Pro Glu Gly Ser Pro Lys Pro Val Thr Gln Asn Ile Ser Ala Glu Ala

245 250 255

Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Ile Thr Ser Ala Ser Tyr Gln Gln Gly

260 265 270

Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr

275 280 285

Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Thr Leu Val Val Met Ala Met Val Lys

290 295 300

Arg Lys Asn Ser

305

<210> 19

<211> 393

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> 合成的

<400> 19

atgctccttg aacatttatt aataatcttg tggatgcagc tgacatgggt cagtggtcaa 60

cagctgaatc agagtcctca atctatgttt atccaggaag gagaagatgt ctccatgaac 120

tgcacttctt caagcatatt taacacctgg ctatggtaca agcaggaccc tggggaaggt 180

cctgtcctct tgatagcctt atataaggct ggtgaattga cctcaaatgg aagactgact 240

gctcagtttg gtataaccag aaaggacagc ttcctgaata tctcagcatc catacctagt 300

gatgtaggca tctacttctg tgctgggcac ccttcctcaa attccgggta tgcactcaac 360

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<210> 20

<211> 405

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> 合成的

<400> 20

atgggcacca gtctcctatg ctgggtggtc ctgggtttcc tagggacaga tcacacaggt 60

gctggagtct cccagtctcc caggtacaaa gtcacaaaga ggggacagga tgtagctctc 120

aggtgtgatc caatttcggg tcatgtatcc ctttattggt accgacaggc cctggggcag 180

ggcccagagt ttctgactta cttcaattat gaagcccaac aagacaaatc agggctgccc 240

aatgatcggt tctctgcaga gaggcctgag ggatccatct ccactctgac gatccagcgc 300

acagagcagc gggactcggc catgtatcgc tgtgccagca gctcccagac aggggcccgc 360

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<210> 21

<211> 819

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> 合成的

<400> 21

atgctccttg aacatttatt aataatcttg tggatgcagc tgacatgggt cagtggtcaa 60

cagctgaatc agagtcctca atctatgttt atccaggaag gagaagatgt ctccatgaac 120

tgcacttctt caagcatatt taacacctgg ctatggtaca agcaggaccc tggggaaggt 180

cctgtcctct tgatagcctt atataaggct ggtgaattga cctcaaatgg aagactgact 240

gctcagtttg gtataaccag aaaggacagc ttcctgaata tctcagcatc catacctagt 300

gatgtaggca tctacttctg tgctgggcac ccttcctcaa attccgggta tgcactcaac 360

ttcggcaaag gcacctcgct gttggtcaca ccccatatcc agaaccctga ccctgccgtg 420

taccagctga gagactctaa atccagtgac aagtctgtct gcctattcac cgattttgat 480

tctcaaacaa atgtgtcaca aagtaaggat tctgatgtgt atatcacaga caaaactgtg 540

ctagacatga ggtctatgga cttcaagagc aacagtgctg tggcctggag caacaaatct 600

gactttgcat gtgcaaacgc cttcaacaac agcattattc cagaagacac cttcttcccc 660

agcccagaaa gttcctgtga tgtcaagctg gtcgagaaaa gctttgaaac agatacgaac 720

ctaaactttc aaaacctgtc agtgattggg ttccgaatcc tcctcctgaa agtggccggg 780

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<210> 22

<211> 945

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> 合成的

<400> 22

atgggcacca gtctcctatg ctgggtggtc ctgggtttcc tagggacaga tcacacaggt 60

gctggagtct cccagtctcc caggtacaaa gtcacaaaga ggggacagga tgtagctctc 120

aggtgtgatc caatttcggg tcatgtatcc ctttattggt accgacaggc cctggggcag 180

ggcccagagt ttctgactta cttcaattat gaagcccaac aagacaaatc agggctgccc 240

aatgatcggt tctctgcaga gaggcctgag ggatccatct ccactctgac gatccagcgc 300

acagagcagc gggactcggc catgtatcgc tgtgccagca gctcccagac aggggcccgc 360

acagatacgc agtattttgg cccaggcacc cggctgacag tgctcgagga cctgaaaaac 420

gtgttcccac ccgaggtcgc tgtgtttgag ccatcagaag cagagatctc ccacacccaa 480

aaggccacac tggtgtgcct ggccacaggc ttctaccccg accacgtgga gctgagctgg 540

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ttctggcaga acccccgcaa ccacttccgc tgtcaagtcc agttctacgg gctctcggag 720

aatgacgagt ggacccagga tagggccaaa cctgtcaccc agatcgtcag cgccgaggcc 780

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accatcctct atgagatctt gctagggaag gccaccttgt atgccgtgct ggtcagtgcc 900

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<210> 23

<211> 426

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> 合成的

<400> 23

catatccaga accctgaccc tgccgtgtac cagctgagag actctaaatc cagtgacaag 60

tctgtctgcc tattcaccga ttttgattct caaacaaatg tgtcacaaag taaggattct 120

gatgtgtata tcacagacaa aactgtgcta gacatgaggt ctatggactt caagagcaac 180

agtgctgtgg cctggagcaa caaatctgac tttgcatgtg caaacgcctt caacaacagc 240

attattccag aagacacctt cttccccagc ccagaaagtt cctgtgatgt caagctggtc 300

gagaaaagct ttgaaacaga tacgaaccta aactttcaaa acctgtcagt gattgggttc 360

cgaatcctcc tcctgaaagt ggccgggttt aatctgctca tgacgctgcg gctgtggtcc 420

agctga 426

<210> 24

<211> 540

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> 合成的

<400> 24

gaggacctga aaaacgtgtt cccacccgag gtcgctgtgt ttgagccatc agaagcagag 60

atctcccaca cccaaaaggc cacactggtg tgcctggcca caggcttcta ccccgaccac 120

gtggagctga gctggtgggt gaatgggaag gaggtgcaca gtggggtcag cacagacccg 180

cagcccctca aggagcagcc cgccctcaat gactccagat actgcctgag cagccgcctg 240

agggtctcgg ccaccttctg gcagaacccc cgcaaccact tccgctgtca agtccagttc 300

tacgggctct cggagaatga cgagtggacc caggataggg ccaaacctgt cacccagatc 360

gtcagcgccg aggcctgggg tagagcagac tgtggcttca cctccgagtc ttaccagcaa 420

ggggtcctgt ctgccaccat cctctatgag atcttgctag ggaaggccac cttgtatgcc 480

gtgctggtca gtgccctcgt gctgatggcc atggtcaaga gaaaggattc cagaggctag 540

<210> 25

<211> 414

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> 合成的

<400> 25

gacatccaga acccagaacc tgctgtgtac cagttaaaag atcctcggtc tcaggacagc 60

accctctgcc tgttcaccga ctttgactcc caaatcaatg tgccgaaaac catggaatct 120

ggaacgttca tcactgacaa aactgtgctg gacatgaaag ctatggattc caagagcaat 180

ggggccattg cctggagcaa ccagacaagc ttcacctgcc aagatatctt caaagagacc 240

aacgccacct accccagttc agacgttccc tgtgatgcca cgttgactga gaaaagcttt 300

gaaacagata tgaacctaaa ctttcaaaac ctgtcagtta tgggactccg aatcctcctg 360

ctgaaagtag ccggatttaa cctgctcatg acgctgaggc tgtggtccag ttga 414

<210> 26

<211> 522

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> 合成的

<400> 26

gaggatctga gaaatgtgac tccacccaag gtctccttgt ttgagccatc aaaagcagag 60

attgcaaaca aacaaaaggc taccctcgtg tgcttggcca ggggcttctt ccctgaccac 120

gtggagctga gctggtgggt gaatggcaag gaggtccaca gtggggtcag cacggaccct 180

caggcctaca aggagagcaa ttatagctac tgcctgagca gccgcctgag ggtctctgct 240

accttctggc acaatcctcg caaccacttc cgctgccaag tgcagttcca tgggctttca 300

gaggaggaca agtggccaga gggctcaccc aaacctgtca cacagaacat cagtgcagag 360

gcctggggcc gagcagactg tgggattacc tcagcatcct atcaacaagg ggtcttgtct 420

gccaccatcc tctatgagat cctgctaggg aaagccaccc tgtatgctgt gcttgtcagt 480

acactggtgg tgatggctat ggtcaaaaga aagaattcat ga 522

<210> 27

<211> 807

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> 合成的

<400> 27

atgctccttg aacatttatt aataatcttg tggatgcagc tgacatgggt cagtggtcaa 60

cagctgaatc agagtcctca atctatgttt atccaggaag gagaagatgt ctccatgaac 120

tgcacttctt caagcatatt taacacctgg ctatggtaca agcaggaccc tggggaaggt 180

cctgtcctct tgatagcctt atataaggct ggtgaattga cctcaaatgg aagactgact 240

gctcagtttg gtataaccag aaaggacagc ttcctgaata tctcagcatc catacctagt 300

gatgtaggca tctacttctg tgctgggcac ccttcctcaa attccgggta tgcactcaac 360

ttcggcaaag gcacctcgct gttggtcaca cccgacatcc agaacccaga acctgctgtg 420

taccagttaa aagatcctcg gtctcaggac agcaccctct gcctgttcac cgactttgac 480

tcccaaatca atgtgccgaa aaccatggaa tctggaacgt tcatcactga caaaactgtg 540

ctggacatga aagctatgga ttccaagagc aatggggcca ttgcctggag caaccagaca 600

agcttcacct gccaagatat cttcaaagag accaacgcca cctaccccag ttcagacgtt 660

ccctgtgatg ccacgttgac tgagaaaagc tttgaaacag atatgaacct aaactttcaa 720

aacctgtcag ttatgggact ccgaatcctc ctgctgaaag tagccggatt taacctgctc 780

atgacgctga ggctgtggtc cagttga 807

<210> 28

<211> 927

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> 合成的

<400> 28

atgggcacca gtctcctatg ctgggtggtc ctgggtttcc tagggacaga tcacacaggt 60

gctggagtct cccagtctcc caggtacaaa gtcacaaaga ggggacagga tgtagctctc 120

aggtgtgatc caatttcggg tcatgtatcc ctttattggt accgacaggc cctggggcag 180

ggcccagagt ttctgactta cttcaattat gaagcccaac aagacaaatc agggctgccc 240

aatgatcggt tctctgcaga gaggcctgag ggatccatct ccactctgac gatccagcgc 300

acagagcagc gggactcggc catgtatcgc tgtgccagca gctcccagac aggggcccgc 360

acagatacgc agtattttgg cccaggcacc cggctgacag tgctcgagga tctgagaaat 420

gtgactccac ccaaggtctc cttgtttgag ccatcaaaag cagagattgc aaacaaacaa 480

aaggctaccc tcgtgtgctt ggccaggggc ttcttccctg accacgtgga gctgagctgg 540

tgggtgaatg gcaaggaggt ccacagtggg gtcagcacgg accctcaggc ctacaaggag 600

agcaattata gctactgcct gagcagccgc ctgagggtct ctgctacctt ctggcacaat 660

cctcgcaacc acttccgctg ccaagtgcag ttccatgggc tttcagagga ggacaagtgg 720

ccagagggct cacccaaacc tgtcacacag aacatcagtg cagaggcctg gggccgagca 780

gactgtggga ttacctcagc atcctatcaa caaggggtct tgtctgccac catcctctat 840

gagatcctgc tagggaaagc caccctgtat gctgtgcttg tcagtacact ggtggtgatg 900

gctatggtca aaagaaagaa ttcatga 927

<210> 29

<211> 1815

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> 合成的

<400> 29

atggcccttg aacatctgtt gataatactg tggatgcaac ttacctgggt atctggtcag 60

caattgaacc agtctccaca gtccatgttt atccaagaag gggaggacgt gtccatgaat 120

tgtacaagct ccagtatctt caacacgtgg ctgtggtaca aacaggatcc tggggaagga 180

ccagtactgt tgatagccct ctataaggcg ggcgaactga catccaatgg aagactcaca 240

gcccaattcg gaattacccg gaaggattct ttcctcaaca tctccgcgag tattccatct 300

gatgtaggaa tatacttctg tgcagggcat ccgtctagca acagtggata tgccctcaat 360

tttggaaagg gcacctccct gctggttacc ccagacattc agaaccccga accagccgta 420

tatcagttga aggacccaag atctcaggat agtacactct gtttgtttac ggactttgac 480

tcacaaatca acgtcccgaa gactatggaa agtggtacgt tcatcacaga taagacggtt 540

ctggacatga aggctatgga ctcaaagagc aacggggcaa ttgcttggtc caaccagaca 600

agctttacct gtcaggacat ttttaaggag actaatgcta cttatccctc cagcgacgtt 660

ccgtgtgatg cgactcttac cgagaagtct tttgagaccg atatgaatct caacttccag 720

aatctgtcag tgatgggtct gcggatcctg cttctgaagg ttgcaggatt caatcttctt 780

atgactctcc ggctctggtc ttcaagagcc aaaagaagtg gttctggcgc gacgaatttt 840

agtttgctta agcaagccgg agatgtggag gaaaatcctg gaccgatggg cacaagtttg 900

ctgtgctggg ttgtgttggg ctttctgggt acagatcata ctggggcggg agtctctcaa 960

agcccccgat acaaagtcac taaaagaggg caggatgtcg cgcttcgctg tgatcccatt 1020

agcgggcatg tctcccttta ttggtaccgg caggctttgg gacaaggacc ggagttcctc 1080

acttacttca actacgaagc gcagcaggac aagtccggtc tgcctaatga tagattcagc 1140

gccgagagac cggagggcag tatctctact cttacgatac aaagaacgga gcagcgagac 1200

tctgctatgt atagatgtgc aagttctagc cagacgggtg ctcgcacgga cactcaatat 1260

ttcggtcctg gtacaagatt gaccgtcttg gaggatctcc ggaacgtcac cccaccaaag 1320

gtcagtttgt ttgagccatc aaaggcggag atcgccaaca aacagaaagc tacgctcgtg 1380

tgtttggctc ggggcttctt cccagaccac gtagaacttt cctggtgggt caatggaaag 1440

gaggttcatt ccggagtgtc cactgatccc caagcgtaca aggaatccaa ctatagctac 1500

tgtctctcat ctcggctccg ggtgagtgcg acattctggc ataatcctcg gaaccacttt 1560

cgatgccaag tgcagtttca tgggttgagc gaggaagaca agtggcccga gggcagtcct 1620

aaaccagtca ctcaaaacat aagcgccgag gcatggggta gagccgattg tgggattact 1680

agcgcttcat accaacaagg ggtattgagc gctacaattc tttacgaaat tctcctcggc 1740

aaggcgacgc tctacgccgt actggtgtct actctcgtgg ttatggcaat ggtgaaacgg 1800

aaaaacagct aatga 1815

<210> 30

<211> 7325

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> 合成的

<400> 30

ccatggccct tgaacatctg ttgataatac tgtggatgca acttacctgg gtatctggtc 60

agcaattgaa ccagtctcca cagtccatgt ttatccaaga aggggaggac gtgtccatga 120

attgtacaag ctccagtatc ttcaacacgt ggctgtggta caaacaggat cctggggaag 180

gaccagtact gttgatagcc ctctataagg cgggcgaact gacatccaat ggaagactca 240

cagcccaatt cggaattacc cggaaggatt ctttcctcaa catctccgcg agtattccat 300

ctgatgtagg aatatacttc tgtgcagggc atccgtctag caacagtgga tatgccctca 360

attttggaaa gggcacctcc ctgctggtta ccccagacat tcagaacccc gaaccagccg 420

tatatcagtt gaaggaccca agatctcagg atagtacact ctgtttgttt acggactttg 480

actcacaaat caacgtcccg aagactatgg aaagtggtac gttcatcaca gataagacgg 540

ttctggacat gaaggctatg gactcaaaga gcaacggggc aattgcttgg tccaaccaga 600

caagctttac ctgtcaggac atttttaagg agactaatgc tacttatccc tccagcgacg 660

ttccgtgtga tgcgactctt accgagaagt cttttgagac cgatatgaat ctcaacttcc 720

agaatctgtc agtgatgggt ctgcggatcc tgcttctgaa ggttgcagga ttcaatcttc 780

ttatgactct ccggctctgg tcttcaagag ccaaaagaag tggttctggc gcgacgaatt 840

ttagtttgct taagcaagcc ggagatgtgg aggaaaatcc tggaccgatg ggcacaagtt 900

tgctgtgctg ggttgtgttg ggctttctgg gtacagatca tactggggcg ggagtctctc 960

aaagcccccg atacaaagtc actaaaagag ggcaggatgt cgcgcttcgc tgtgatccca 1020

ttagcgggca tgtctccctt tattggtacc ggcaggcttt gggacaagga ccggagttcc 1080

tcacttactt caactacgaa gcgcagcagg acaagtccgg tctgcctaat gatagattca 1140

gcgccgagag accggagggc agtatctcta ctcttacgat acaaagaacg gagcagcgag 1200

actctgctat gtatagatgt gcaagttcta gccagacggg tgctcgcacg gacactcaat 1260

atttcggtcc tggtacaaga ttgaccgtct tggaggatct ccggaacgtc accccaccaa 1320

aggtcagttt gtttgagcca tcaaaggcgg agatcgccaa caaacagaaa gctacgctcg 1380

tgtgtttggc tcggggcttc ttcccagacc acgtagaact ttcctggtgg gtcaatggaa 1440

aggaggttca ttccggagtg tccactgatc cccaagcgta caaggaatcc aactatagct 1500

actgtctctc atctcggctc cgggtgagtg cgacattctg gcataatcct cggaaccact 1560

ttcgatgcca agtgcagttt catgggttga gcgaggaaga caagtggccc gagggcagtc 1620

ctaaaccagt cactcaaaac ataagcgccg aggcatgggg tagagccgat tgtgggatta 1680

ctagcgcttc ataccaacaa ggggtattga gcgctacaat tctttacgaa attctcctcg 1740

gcaaggcgac gctctacgcc gtactggtgt ctactctcgt ggttatggca atggtgaaac 1800

ggaaaaacag ctaatgagaa ttctgcagtc gacggtaccg cgggcccggg atccgataaa 1860

ataaaagatt ttatttagtc tccagaaaaa ggggggaatg aaagacccca cctgtaggtt 1920

tggcaagcta gcttaagtaa cgccattttg caaggcatgg aaaatacata actgagaata 1980

gagaagttca gatcaaggtt aggaacagag agacagcaga atatgggcca aacaggatat 2040

ctgtggtaag cagttcctgc cccggctcag ggccaagaac agatggtccc cagatgcggt 2100

cccgccctca gcagtttcta gagaaccatc agatgtttcc agggtgcccc aaggacctga 2160

aaatgaccct gtgccttatt tgaactaacc aatcagttcg cttctcgctt ctgttcgcgc 2220

gcttctgctc cccgagctca ataaaagagc ccacaacccc tcactcggcg cgccagtcct 2280

ccgatagact gcgtcgcccg ggtacccgtg tatccaataa accctcttgc agttgcatcc 2340

gacttgtggt ctcgctgttc cttgggaggg tctcctctga gtgattgact acccgtcagc 2400

gggggtcttt catgggtaac agtttcttga agttggagaa caacattctg agggtaggag 2460

tcgaatatta agtaatcctg actcaattag ccactgtttt gaatccacat actccaatac 2520

tcctgaaatc catcgatgga gttcattatg gacagcgcag aaagagctgg ggagaattgt 2580

gaaattgtta tccgctcaca attccacaca acatacgagc cggaagcata aagtgtaaag 2640

cctggggtgc ctaatgagtg agctaactca cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt 2700

tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc attaatgaat cggccaacgc gcggggagag 2760

gcggtttgcg tattgggcgc tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg 2820

ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat 2880

caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta 2940

aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa 3000

atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc 3060

cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt 3120

ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca 3180

gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg 3240

accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat 3300

cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta 3360

cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aagaacagta tttggtatct 3420

gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac 3480

aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa 3540

aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa 3600

actcacgtta agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt 3660

taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca 3720

gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca 3780

tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc 3840

ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac gctcaccggc tccagattta tcagcaataa 3900

accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc 3960

agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc gccagttaat agtttgcgca 4020

acgttgttgc cattgctaca ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat 4080

tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag 4140

cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac 4200

tcatggttat ggcagcactg cataattctc ttactgtcat gccatccgta agatgctttt 4260

ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt 4320

gctcttgccc ggcgtcaata cgggataata ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc 4380

tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat 4440

ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt actttcacca 4500

gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga 4560

cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc tttttcaata ttattgaagc atttatcagg 4620

gttattgtct catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg 4680

ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac ctgacgtcta agaaaccatt attatcatga 4740

cattaaccta taaaaatagg cgtatcacga ggccctttcg tctcgcgcgt ttcggtgatg 4800

acggtgaaaa cctctgacac atgcagctcc cggagacggt cacagcttgt ctgtaagcgg 4860

atgccgggag cagacaagcc cgtcagggcg cgtcagcggg tgttggcggg tgtcggggct 4920

ggcttaacta tgcggcatca gagcagattg tactgagagt gcaccatatg cggtgtgaaa 4980

taccgcacag atgcgtaagg agaaaatacc gcatcaggcg ccattcgcca ttcaggctgc 5040

gcaactgttg ggaagggcga tcggtgcggg cctcttcgct attacgccag ctggcgaaag 5100

ggggatgtgc tgcaaggcga ttaagttggg taacgccagg gttttcccag tcacgacgtt 5160

gtaaaacgac ggcgcaagga atggtgcatg caaggagatg gcgcccaaca gtcccccggc 5220

cacggggcct gccaccatac ccacgccgaa acaagcgctc atgagcccga agtggcgagc 5280

ccgatcttcc ccatcggtga tgtcggcgat ataggcgcca gcaaccgcac ctgtggcgcc 5340

ggtgatgccg gccacgatgc gtccggcgta gaggcgatta gtccaatttg ttaaagacag 5400

gatatcagtg gtccaggctc tagttttgac tcaacaatat caccagctga agcctataga 5460

gtacgagcca tagataaaat aaaagatttt atttagtctc cagaaaaagg ggggaatgaa 5520

agaccccacc tgtaggtttg gcaagctagc ttaagtaacg ccattttgca aggcatggaa 5580

aatacataac tgagaataga gaagttcaga tcaaggttag gaacagagag acagcagaat 5640

atgggccaaa caggatatct gtggtaagca gttcctgccc cggctcaggg ccaagaacag 5700

atggtcccca gatgcggtcc cgccctcagc agtttctaga gaaccatcag atgtttccag 5760

ggtgccccaa ggacctgaaa tgaccctgtg ccttatttga actaaccaat cagttcgctt 5820

ctcgcttctg ttcgcgcgct tctgctcccc gagctcaata aaagagccca caacccctca 5880

ctcggcgcgc cagtcctccg atagactgcg tcgcccgggt acccgtattc ccaataaagc 5940

ctcttgctgt ttgcatccga atcgtggact cgctgatcct tgggagggtc tcctcagatt 6000

gattgactgc ccacctcggg ggtctttcat ttggaggttc caccgagatt tggagacccc 6060

tgcccaggga ccaccgaccc ccccgccggg aggtaagctg gccagcggtc gtttcgtgtc 6120

tgtctctgtc tttgtgcgtg tttgtgccgg catctaatgt ttgcgcctgc gtctgtacta 6180

gttagctaac tagctctgta tctggcggac ccgtggtgga actgacgagt tcggaacacc 6240

cggccgcaac cctgggagac gtcccaggga cttcgggggc cgtttttgtg gcccgacctg 6300

agtcctaaaa tcccgatcgt ttaggactct ttggtgcacc ccccttagag gagggatatg 6360

tggttctggt aggagacgag aacctaaaac agttcccgcc tccgtctgaa tttttgcttt 6420

cggtttggga ccgaagccgc gccgcgcgtc ttgtctgctg cagcatcgtt ctgtgttgtc 6480

tctgtctgac tgtgtttctg tatttgtctg aaaatatggg cccgggctag cctgttacca 6540

ctcccttaag tttgacctta ggtcactgga aagatgtcga gcggatcgct cacaaccagt 6600

cggtagatgt caagaagaga cgttgggtta ccttctgctc tgcagaatgg ccaaccttta 6660

acgtcggatg gccgcgagac ggcaccttta accgagacct catcacccag gttaagatca 6720

aggtcttttc acctggcccg catggacacc cagaccaggt cccctacatc gtgacctggg 6780

aagccttggc ttttgacccc cctccctggg tcaagccctt tgtacaccct aagcctccgc 6840

ctcctcttcc tccatccgcc ccgtctctcc cccttgaacc tcctcgttcg accccgcctc 6900

gatcctccct ttatccagcc ctcactcctt ctctaggcgc ccccatatgg ccatatgaga 6960

tcttatatgg ggcacccccg ccccttgtaa acttccctga ccctgacatg acaagagtta 7020

ctaacagccc ctctctccaa gctcacttac aggctctcta cttagtccag cacgaagtct 7080

ggagacctct ggcggcagcc taccaagaac aactggaccg accggtggta cctcaccctt 7140

accgagtcgg cgacacagtg tgggtccgcc gacaccagac taagaaccta gaacctcgct 7200

ggaaaggacc ttacacagtc ctgctgacca cccccaccgc cctcaaagta gacggcatcg 7260

cagcttggat acacgccgcc cacgtgaagg ctgccgaccc cgggggtgga ccatcctcta 7320

gaccg 7325

<210> 31

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> 合成的

<400> 31

agcatattta acacc 15

<210> 32

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> 合成的

<400> 32

ttatataagg ctggtgaatt g 21

<210> 33

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> 合成的

<400> 33

gctgggcacc cttcctcaaa ttccgggtat gcactcaac 39

<210> 34

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> 合成的

<400> 34

tcgggtcatg tatcc 15

<210> 35

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> 合成的

<400> 35

ttcaattatg aagcccaa 18

<210> 36

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> 合成的

<400> 36

gccagcagct cccagacagg ggcccgcaca gatacgcagt at 42

<210> 37

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> 合成的

<400> 37

Arg Ala Lys Arg Ser Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys

1 5 10 15

Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro

20 25

<210> 38

<211> 393

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> 合成的

<400> 38

atggcccttg aacatctgtt gataatactg tggatgcaac ttacctgggt atctggtcag 60

caattgaacc agtctccaca gtccatgttt atccaagaag gggaggacgt gtccatgaat 120

tgtacaagct ccagtatctt caacacgtgg ctgtggtaca aacaggatcc tggggaagga 180

ccagtactgt tgatagccct ctataaggcg ggcgaactga catccaatgg aagactcaca 240

gcccaattcg gaattacccg gaaggattct ttcctcaaca tctccgcgag tattccatct 300

gatgtaggaa tatacttctg tgcagggcat ccgtctagca acagtggata tgccctcaat 360

tttggaaagg gcacctccct gctggttacc cca 393

<210> 39

<211> 405

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> 合成的

<400> 39

atgggcacaa gtttgctgtg ctgggttgtg ttgggctttc tgggtacaga tcatactggg 60

gcgggagtct ctcaaagccc ccgatacaaa gtcactaaaa gagggcagga tgtcgcgctt 120

cgctgtgatc ccattagcgg gcatgtctcc ctttattggt accggcaggc tttgggacaa 180

ggaccggagt tcctcactta cttcaactac gaagcgcagc aggacaagtc cggtctgcct 240

aatgatagat tcagcgccga gagaccggag ggcagtatct ctactcttac gatacaaaga 300

acggagcagc gagactctgc tatgtataga tgtgcaagtt ctagccagac gggtgctcgc 360

acggacactc aatatttcgg tcctggtaca agattgaccg tcttg 405

Claims (15)

1.为瞬时表达或稳定表达而设计的重组表达载体，其中所述重组表达载体包含含有核苷酸序列的核酸，所述核苷酸序列编码对人乳头瘤病毒(HPV)16 E6具有抗原特异性的T细胞受体(TCR)，其中所述TCR包含人可变区和鼠恒定区，并且其中所述TCR包含SEQ ID NO:3-8的氨基酸序列，并且任选地其中：

(i)所述TCR对包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HPV 16 E6_29-38具有抗原特异性；

(ii)所述TCR包含SEQ ID NO:15和16的氨基酸序列；

(iii)所述TCR包含SEQ ID NO:17和18的氨基酸序列；或者

(iv)所述TCR包含SEQ ID NO:9和10的氨基酸序列。

2.为瞬时表达或稳定表达而设计的重组表达载体，其中所述重组表达载体包含含有核苷酸序列的核酸，所述核苷酸序列编码对HPV 16 E6具有抗原特异性的TCR，其中所述TCR包含SEQ ID NO:3-8的氨基酸序列，任选地其中所述TCR包含：

(i)SEQ ID NO:9和10的氨基酸序列；

(ii)SEQ ID NO:13和14；或者

(iii)SEQ ID NO:11和12。

3.为瞬时表达或稳定表达而设计的重组表达载体，其中所述重组表达载体包含含有核苷酸序列的核酸，所述核苷酸序列编码包含对HPV 16 E6具有抗原特异性的TCR的功能部分的多肽，其中所述功能部分能特异性结合HPV 16 E6并且包含以下的氨基酸序列：

(i)SEQ ID NO:3-8；

(ii)SEQ ID NO:9和10；或者

(iii)SEQ ID NO:11和12。

4.如权利要求3所述的重组表达载体，其中所述多肽包含SEQ ID NO:17和18的氨基酸序列。

5.为瞬时表达或稳定表达而设计的重组表达载体，其中所述重组表达载体包含含有核苷酸序列的核酸，所述核苷酸序列编码蛋白，其中所述蛋白包含：

(i)含有SEQ ID NO:3-5的氨基酸序列的第一多肽链以及含有SEQ ID NO:6-8的氨基酸序列的第二多肽链；

(ii)含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的第一多肽链以及含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的第二多肽链；或者

(iii)含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的第一多肽链以及含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的第二多肽链，

任选地，其中所述蛋白是融合蛋白和/或重组抗体。

6.如权利要求5所述的重组表达载体，其中所述蛋白包含含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的第一多肽链以及含有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的第二多肽链，任选地，其中所述蛋白是融合蛋白和/或重组抗体。

7.如权利要求1-6中任一项所述的重组表达载体，其中所述核酸包含：

(i)(a)SEQ ID NO:31-36的核苷酸序列或(b)SEQ ID NO:19和20的核苷酸序列；或者

(ii)(a)SEQ ID NO:21和22的核苷酸序列或(b)SEQ ID NO:27和28的核苷酸序列。

8.如权利要求7所述的重组表达载体，(i)其中所述核酸还包含(a)SEQ ID NO:23和24的核苷酸序列或(b)SEQ ID NO:25和26的核苷酸序列；或者(ii)其中所述核苷酸序列是密码子优化的，其中密码子优化的核苷酸序列任选地包含SEQ ID NO:38和39的核苷酸序列。

9.如权利要求1-6中任一项所述的重组表达载体，其包含SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:30的核苷酸序列。

10.如权利要求1-6中任一项所述的重组表达载体，其中所述重组表达载体经设计用于瞬时表达。

11.如权利要求1-6中任一项所述的重组表达载体，其中所述重组表达载体经设计用于稳定表达。

12.分离的宿主细胞，其包含权利要求1-11中任一项所述的重组表达载体，任选地其中所述细胞是人细胞。

13.细胞群体，其包含至少一种权利要求12所述的宿主细胞。

14.药物组合物，其包含(i)权利要求1-11中任一项所述的重组表达载体，权利要求12所述的宿主细胞或权利要求13所述的细胞群体，以及(ii)药学上可接受的载体。

15.权利要求1-11中任一项所述的重组表达载体，权利要求12所述的宿主细胞，权利要求13所述的细胞群体，或者权利要求14所述的药物组合物在制备用于治疗或预防哺乳动物的病况的药物中的用途，其中所述病况为癌症、HPV 16感染，或者HPV阳性初癌，

任选地，其中所述病况为：

(i)宫颈癌、口咽癌、肛门癌、肛管癌、直肠肛门癌、阴道癌、外阴癌或阴茎癌；和/或

(ii)HPV 16阳性癌症。