KR20240000541A - 키메라 항원 수용체(car)-t 세포 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor)(CAR)-T 세포에 관한 것이며, 특히, 독점적이지는 않지만, 항-CD4 CAR, 및 면역요법에서, 및 T-세포 림프종과 같은 암, HIV 및 TB와 같은 다양한 미생물 감염, 및 또한 자가면역 질환을 치료, 예방 또는 개선하기 위한 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 특히 CAR-조작된 점막-관련 불변 T(mucosal-associated invariant T)(MAIT) 세포의 용도, 및 고도로 정제된 MAIT 세포(이어서 이는 상기와 같은 CAR-MAIT 세포로 조작될 수 있다)를 자극, 단리 및 확대하기 위한 신규의 방법에 관한 것이다. 본 발명은 유전자 작제물 자체, 및 CAR-MAIT 세포의 생성에서 그의 용도, 및 형질도입된 CAR-MAIT 세포 자체로 확장된다. 본 발명은 또한 작제물 및 형질도입된 CAR-MAIT 세포의 다양한 의학적 용도, 및 이들 작제물 및 CAR-MAIT 세포를 포함하는 약제학적 조성물로 확장된다.

Description

키메라 항원 수용체(CAR)-T 세포
본 발명은 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor)(CAR)-T 세포에 관한 것이며, 특히, 독점적이지는 않지만, 항-CD4 CAR, 및 면역요법에서, 및 T-세포 림프종과 같은 암, HIV 및 TB와 같은 다양한 미생물 감염, 및 또한 자가면역 질환을 치료, 예방 또는 개선하기 위한 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 특히 CAR-조작된 점막-관련 불변 T(mucosal-associated invariant T)(MAIT) 세포의 용도, 및 고도로 정제된 MAIT 세포(이어서 이는 상기와 같은 CAR-MAIT 세포로 조작될 수 있다)를 자극, 단리 및 확대하기 위한 신규의 방법에 관한 것이다. 본 발명은 유전자 작제물 자체, 및 CAR-MAIT 세포 생성에서의 이의 용도, 및 형질도입된 CAR-MAIT 세포 자체로 확장된다. 본 발명은 또한 작제물 및 형질도입된 CAR-MAIT 세포의 다양한 의학적 용도, 및 이들 작제물 및 CAR-MAIT 세포를 포함하는 약제학적 조성물로 확장된다.
T-세포 림프종은 인간 T-림프 친화 바이러스 유형 I(HTLV-1)에 의해 발생하는 성인 T-세포 백혈병/림프종(Adult T-Cell leukaemia/lymphoma)(ATL)과 같은 말초 T-세포 림프종(peripheral T-cell lymphoma)(PTCL), 및 세자리 증후군(Sezary Syndrome)(SS)과 같은 피부 T-세포 림프종(cutaneous T-cell lymphoma)(CTCL)을 포함한, 임상적으로 공격적인 질병의 이질적인 그룹이다. T-세포 악성종양은 B-세포 악성종양에 비해 치료가 더 어렵다. ATL과 SS는 드물고 종종 공격적인 유형의 T-세포 림프종을 나타내며, 치료 표준을 확립하기 위한 무작위 임상시험에 등록된 환자가 충분하지 않다. 결과적으로, 사용되는 일반적인 1차 치료법(therapy)은 다른 유형의 T-세포 림프종 치료에 사용되는 치료법과 동일하다. 예를 들어, T-세포 악성종양 치료를 위해 현재 허가된 약물에는 화학요법제, 생물학적 반응 변경제(예를 들어, 인터페론, 벡사로텐 및 HDAC 억제제), 단클론 항체(알렘투주맙, 모가물리주맙, 브렌툭시맙), 조혈 줄기세포 이식(HSCT) 및 체외광성분채집술(ECP)이 있다. 그러나 단일 요법은 전체 반응률이나 반응 지속 기간에서 다른 치료법보다 우수한 것으로 알려져 있지 않다. 동종이계(HSCT)가 유일한 잠재적 치료 섭생이었지만, HSCT 관련 사망률 외에 고령 및 동반 질환으로 인해 상당수의 환자가 HSCT에 적합하지 않을 수 있다. 따라서 ATL에 대한 현행 치료의 평균 생존 기간은 8개월에 불과하므로 보다 효과적인 치료가 필요하다(Katsuya et al., 2015).
최근 FDA가 승인한 키메라 항원 수용체(CAR) 기반 T-세포 치료법(CAR-T)은, CD19 항원을 표적화하여 거의 100% 관해율을 달성함에 의한 B-세포 악성종양 치료에서 가장 중요한 혁신 중 하나로 여겨져 왔다(Park et al., 2018). 그러나 B-세포 악성종양에 대한 CAR-T 치료의 효과에도 불구하고 T 세포-유래된 악성종양을 표적화하는 유사한 접근법은 잘 확립되지 않았다. 면역글로불린 유전자(즉, 클론성)의 동일한 재배열을 포함하고 CD19와 같은 범-B-세포 마커를 발현하는 대부분의 B-세포 악성종양과 마찬가지로, ATL 및 CTCL의 대다수(>95%)는 정의된 T-세포 수용체(TCR) 유전자(즉, 클론성 TCR-V베타 쇄) 및 범-T 헬퍼 세포 마커 CD4를 발현하는 우성 T 세포 클론으로부터 유래한다. 따라서, T 림프종 치료를 위해 단클론 항체(mAb)에 의해 CD4 또는 TCR-Vb 쇄와 같은 범-T 세포 마커를 표적화하는 것이 시험되었으나, 이는 단지 소규모 임상 시험에서는 부분적인 회귀 결과만을 나타내었다.
현행 CAR-T 치료법은 주로 기존 αβ T 세포를 기반으로 한다. 그러나 αβ T 세포의 항원 인식은 MHC에 의해 심각하게 제한되어, 자가 요법에는 적합하지만 동종이계 입양 전달의 경우는 매우 어렵다. 또한 αβ T 세포의 부적합한 종양 침윤으로 인해 기존 CAR-T 치료법은 CTCL과 같은 고형 종양에서는 효능이 낮지만 액체 종양 치료법에서는 유망한 잠재력을 보인다. 그러나 기존 CAR-T 세포 치료법은 추가 적용을 제한하는 몇 가지 주요 단점이 있다. 예를 들어, 현행 CAR-T 치료법은 (i) 이식편대숙주병(graft-vs-host disease)(GVHD)으로 인한 자가 수혈에 의해 제한되고, (ii) 사이토카인 방출 증후군을 포함한 표적/비-종양 독성에 의해 제한되며; (iii) 환자의 T 세포 기능의 가변성, 제품 표준화 및 비용과 같은 자기유래 CAR-T의 단점이 있다.
따라서, PTCL 및 CTCL을 포함한, T 세포 림프종과 같은 T 세포 악성종양, 및 또한 HIV 및 TB와 같은 미생물 감염을 치료하기 위한 개선된 면역요법을 제공할 필요가 있다.
T-세포 악성종양을 치료하기 위해, 발명자는 선천적인 효과기-유사 특성을 나타내는 면역계 내 T 세포의 서브세트(subset)인 점막 관련 불변 T 세포(MAIT 세포)에 관심을 집중하였다. MAIT 세포는 주 조직적합성 복합체(MHC)-Ib 관련 단백질인 MR1에 의해 제한되는 T 세포 수용체 쇄 Vα7.2의 변함없는 사용에 의해 정의되며 C형 렉틴 CD161 및 IL18 수용체의 높은 발현을 나타낸다. 인간의 경우 MAIT 세포는 혈액, 간, 폐 및 점막에서 발견되어 미생물 활동과 감염을 방어한다. MHC 부류 I-유사 단백질인 MR1은 세균에서 생성된 5-OP-RU와 같은 비타민 B 대사산물을 MAIT 세포에 전달하는 역할을 한다. MR1에 의한 외래 항원 제시 후, MAIT 세포는 염증전 사이토카인을 분비하고 세균에 감염된 세포를 용해시킬 수 있다.
현행 MAIT 세포 확대 방법은 시험관 내 배양에서 MAIT 세포의 성장을 지원하기 위해 인간 동종이계 영양 세포의 사용을 요구하는 데, 이는 인간의 적응 면역요법을 위한 대규모 생산 및 품질 관리가 어렵다. 또한, 이러한 공지된 방법을 사용하여 생산된 MAIT 세포는 기존의 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포와 같은 일정 비율의 다른 세포 서브세트를 포함하며, 따라서 이는 상기 세포 서브세트가 이식편 대 숙주병(GvHD)을 유발할 것이므로, 생성된 MAIT 단리물을 동종이계 입양 전달에 사용하기에 완전히 부적합하게 한다.
따라서, 동종이계 입양 전달에 사용되는 MAIT 세포 생산을 확대하기 위해, 동종이계 영양 세포의 필요 없이 순수한 MAIT 세포 배양물을 자극하고 단리하는 개선된 방법이 또한 필요하다.
실시예에 기재된 바와 같이, 발명자는 인간 PBMC로부터 MAIT 세포의 고순도 배양물을 자극하고 단리하기 위한 신규의 방법을 개발하였다. 발명자는 또한 각각 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하고 이어서 순수한 MAIT 세포 내로 형질도입되는 몇 가지 신규의 유전적 작제물 및 벡터(본원에서는 "CART4" 및 "CARTVb7.1"로 지칭됨)를 개발하였으며, 이로써 T 세포 상의 CD4 분자("CART4" 사용) 또는 TCR-V베타 7.1 쇄("CARTVb7.1" 사용)를 특이적으로 표적화하는 CAR-MAIT 세포를 생성시킨다. 이는 CD28/4-1BB/CD3제타 쇄 신호전달 모이어티(chain signalling moiety)와 함께 (i) 항-CD4 mAb(예를 들어, Hu5A8) 또는 (ii) 항-TCR-Vb 7.1 mAb(예를 들어 3G5)의 scFv를 포함하는 신규의 유전자 작제물을 생성시켜 3세대 CAR을 형성시킴으로써 달성되었다. 이어서 이러한 CAR을 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)로부터 정제된 MAIT 세포로 형질도입하여 T 세포의 CD4 또는 T 세포의 TCR-V베타 7.1 쇄를 표적화하는 CAR-MAIT 세포를 생성시켰다. 발명자는 이들 CAR-MAIT 세포가 놀랍게도 기존 CAR-T 세포에 필적할만하고, 심지어 더 우수한 항-T 림프종 활성을 나타냄을 입증하였다.
따라서, 본 발명의 첫 번째 양태에서, 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 점막 관련 불변 T(MAIT) 세포를 제공한다.
본원에서 논의되는 바와 같이, MAIT 세포는, 포유동물 진화 중에 고도로 보존되고 MR1 단백질에 의해 제시된 미생물 항원을 인식하며, 인간 혈액 중에 존재하고 광범위 항균 반응에 대해 조직 항상성을 유지하는, 불변 T-세포 수용체(TCR)를 발현하는, 통상적이지 않고 선천적으로 유사한 T 세포이다. 또한, 유리하게도, MAIT 세포의 항원 인식 기전은 MHC-독립적이며, 이는 MAIT 세포를 동종이계 T 세포 사멸 요법에 대한 흥미로운 후보로 만들고, 따라서 이는 MHC-의존적인 현행 T 세포 치료법에서와 같이, 자가 치료법으로 제한되지 않는다. 즉, MAIT 세포는 동종이계 반응성이 낮고, 인간에서 이식편 대 숙주병(GVHD)을 유발하는 경향이 적으며, 따라서 동종이계 CAR-T 치료법에 이상적인 T 세포 서브세트를 나타낸다. 이에 비해, 본 발명의 CART-MAIT 세포 및 생성된 세포 치료법은 쉽게 동종이계로 전달될 수 있으며, MAIT 세포의 내인성 특성은 상기 세포를 고형 종양 치료를 위해 말초 조직에 침윤할 수 있는 유망한 후보가 되게 한다. 따라서 CAR-MAIT 세포는 고형 종양에 효과적으로 침투할 수 있으며, 이는 MAIT 세포 기반 세포 치료법을 액체 종양뿐만 아니라 고형 종양에도 유망한 치료법이 되게 한다.
유리하게, 본 발명의 CAR-MAIT 세포는 T-세포 악성종양, 예를 들어 인간 T-림프 친화 바이러스 유형 I(HTLV-1)에 의해 발생하는 성인 T-세포 백혈병/림프종(ATL), 및 세자리 증후군과 같은 피부 T-세포 림프종(CTCL)을 치료하는 데 사용될 수 있다. T-세포 악성종양은 임상적으로 공격적인 질병의 이질적인 그룹이며, B-세포 악성종양보다 치료하기 훨씬 더 어렵다는 것이 이해될 것이다. 유리하게도, CAR-MAIT 치료법은 고형 종양에 대한 효능이 증가하고 동종이계이므로 자가 이식이 필요하지 않아 기성 치료법으로 자리매김할 것으로 예상된다.
바람직하게는, 하나의 구현예에서, CAR-MAIT 세포는 T-세포 상의 CD4 항원을 표적화하는 CAR을 발현한다. 따라서, 바람직하게는, CAR은 T-세포 상의 CD4 항원에 특이적이다. CD4 항원은 T 헬퍼 세포, 단핵구, 대식세포 및 수지상 세포와 같은 면역 세포의 표면에서 발견되는 당단백질(T 세포 표면 당단백질 CD4[호모 사피엔스] UniProt No. P01730.1; NCBI 참조 서열 NP_000607.1)인 것으로 이해될 것이다. CD4 항원의 폴리펩티드 서열의 하나의 구현예는 본원에서 하기와 같이 서열번호 1로 표시된다:
[서열번호 1]
따라서, 바람직하게는, CAR은 실질적으로 서열번호 1에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 또는 이의 변이체 또는 단편을 포함하는 CD4 항원에 특이적이다.
바람직하게는, 또 다른 구현예에서, CAR-MAIT 세포는 T-세포 상의 T-세포 수용체(TCR) 베타-쇄 가변 영역(V베타)을 표적화하는 CAR을 발현한다. T-세포 수용체(TCR)는 T 세포 또는 T 림프구의 표면에서 발견되는 단백질 복합체이며, 이는 항원 단편을 주 조직적합성 복합체(MHC) 분자에 결합된 펩티드로서 인식하는 역할을 한다는 것이 이해될 것이다. TCR은 2개의 상이한 단백질 쇄로 구성된다. 인간의 경우 T 세포의 95%에서 TCR은 TRA에 의해 암호화되는 알파(α) 쇄 및 TRB에 의해 암호화되는 베타(β) 쇄로 이루어진다.
하기 표 1은 연관된 암호화 유전자와 함께 T-세포 상의 V베타 영역을 나열하고, 이들 중 임의의 하나 이상은 본 발명의 CAR-MAIT 세포 상의 CAR에 의해 표적화될 수 있다.
[표 1]
T-세포 상의 베타-쇄 가변 영역(Vebta)
CAR-MAIT 세포는 T-세포 상의 다수의 T 세포 수용체(TCR) 베타-쇄 가변 영역(V베타)을 표적화하는 CAR을 발현할 수 있다. 바람직하게는, 다수의 V베타 영역은 표 1에 나타낸 V베타 영역의 그룹으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, CAR-MAIT 세포는 바람직하게는, 표 1에 열거된 바와 같은, T-세포 상의 적어도 2개, 또는 적어도 3개 또는 적어도 4개의 T-세포 수용체(TCR) 베타-쇄 가변 영역(V베타)을 표적화하는 CAR을 발현할 수 있다. CAR-MAIT 세포는 바람직하게는 표 1에 열거된 바와 같은, T-세포 상의 적어도 5개, 또는 적어도 6개 또는 적어도 7개의 T-세포 수용체(TCR) 베타-쇄 가변 영역(V베타)을 표적화하는 CAR을 발현할 수 있다. 다수의 TCR V 베타 영역은 동일하거나 상이한 V 베타 영역일 수 있다.
하기 Vb 패밀리, 즉 Vb 1, Vb 2, Vb 3, Vb 5.1, Vb 7.1, Vb 8, Vb 12, Vb 13.1, Vb 17, 및 Vb 20이 T-세포 림프종과 빈번하게 연관되는 것으로 여겨진다. 따라서, 바람직한 구현예에서, CAR-MAIT 세포는 하기의 V베타 영역으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 T-세포 상의 하나 이상의 TCR V베타 영역을 표적화하는 CAR을 발현한다: Vb 1, Vb 2, Vb 3, Vb 5.1, Vb 7.1, Vb 8, Vb 12, Vb 13.1, Vb 17, 및 Vb 20. 바람직하게는, CAR-MAIT 세포는 하기의 V베타 영역으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 T-세포 상의 적어도 2개 또는 적어도 3개의 TCR V베타 영역을 표적화하는 CAR을 발현한다: Vb 1, Vb 2, Vb 3, Vb 5.1, Vb 7.1, Vb 8, Vb 12, Vb 13.1, Vb 17, 및 Vb 20.
따라서, 바람직하게는, CAR은 T-세포 상의 적어도 하나 이상의 TCR V베타 영역, 및 가장 바람직하게는 TCR-V베타 7.1 쇄에 특이적이다. TCR V베타 7.1 영역(에이치 사피엔스(H. sapiens) 재배열된 TCR V베타 7.1 UniProtKB/Swiss-Prot: A0A577.1)의 폴리펩티드 서열의 하나의 구현예를 본원에서 하기와 같이 서열번호 2로서 나타낸다:
[서열번호 2]
따라서, 바람직하게는, CAR은 실질적으로 서열번호 2에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 또는 이의 변이체 또는 단편을 포함하는 적어도 하나 이상의 TCR V베타 영역(및 더욱 바람직하게는 TCR-V베타 7.1 쇄)에 특이적이다.
바람직하게는, CAR-MAIT 세포는 아팝토시스(apoptosis)를 유도함으로써 표적 T 세포를 직접 사멸하도록 구성된다.
바람직하게는, CAR-MAIT 세포는, 예를 들어 환자의 유해 반응의 경우 CAR-MAIT 세포가 조절 가능하게 또는 유도 가능하게 제거되도록 하는 하나 이상의 암호화 서열을 포함한다. 하나 이상의 암호화 서열은 소위 "자살 유전자"로서 당업자에게 알려져 있을 수 있다.
따라서, 하나의 구현예에서, 하나 이상의 암호화 서열은 표피 성장 인자 수용체(epidermal growth factor receptor)(EGFR) 또는 절두된 표피 성장 인자 수용체(truncated epidermal growth factor receptor)(tEGFR)(refs)(UniProt No. P00533; NCBI 참조 서열 NP_001333826.1)를 암호화할 수 있다. tEGFR의 발현은 환자의 CAR-T 세포 모니터링 또는 고갈을 위해 항-EGFR mAb(세툭시맙)에 의해 조절될 수 있다. EGFR은 인간에서 HER1로 공지되어 있으며, 세포외 단백질 리간드(UniProt No. P01133; NCBI 참조 서열 NP_001171601.1)의 표피 성장 인자(EGF) 구성원에 대한 수용체인 막관통 단백질이라는 것이 이해될 것이다.
또 다른 구현예에서, 하나 이상의 암호화 서열은 유도성 카스파제(inducible caspase)-9(iC9)를 암호화할 수 있다(Mol.Therapy, Diaconu et al., 580, 25, 3, March 2017). iC9는 인간 FK506 결합 단백질(UniProt No. P62942; NCBI 참조 서열 NP_000792.1)에 융합되어, 융합 단백질을 발현하는 CAR-T 세포의 아팝토시스를 촉발하는 화학적 이량체화 유도제(카스파제 유도성 약물(CID), 리미두시드)를 사용하여 조건부 이량체화를 허용하는 변형된 인간 카스파제-9(UniProt No. P55211; NCBI 참조 서열 NP_001220.2)이다.
바람직하게는, CAR-MAIT 세포는 절두된 표피 성장 인자 수용체(tEGFR) 및/또는 유도성 카스파제-9(iC9)를 암호화하는 암호화 서열을 포함한다. 더욱 바람직하게는, CAR-MAIT 세포는 절두된 표피 성장 인자 수용체(tEGFR) 및 유도성 카스파제-9(iC9)를 암호화하는 암호화 서열을 포함한다.
CAR-MAIT 세포는 CAR을 암호화하는 핵산 또는 유전자 작제물로 MAIT 세포를 형질도입함으로써 생성된다는 것이 이해될 것이다. T 세포 특이적 활성 CAR-MAIT 세포를 생성하기 위해 CAR 형질도입 단계에서 MAIT 세포의 고도로 정제된 배양을 사용하는 것이 중요하다. 따라서, 발명자는 자기 활성화 세포 분류(magnetic activation cell sorting)(MACS) 방법과 형광 활성화 세포 분류(fluorescence activated cell sorting)(FACS) 방법을 조합하여 인간 말초혈액 단핵구 세포(PBMC)로부터 정제된 MAIT 세포를 단리하는 효과적인 방법을 개발하였으며, 그 결과 생성된 방법은 높은 확대 배수로 다량의 MAIT 세포를 생성시킨다.
따라서, 바람직하게는, MAIT 세포가 인간 말초 혈액 단핵구 세포(PBMC)로부터 단리된다. 바람직하게는, MAIT 세포는 자기 활성화된 세포 분류(MACS) 및/또는 형광 활성화된 세포 분류(FACS), 더욱 바람직하게는 MACS 및 FACS 둘 다에 의해 PBMC로부터 단리된다. 발명자는 MAIT 단리 방법이 그 자체로 신규의 것이라고 여긴다.
따라서, 두 번째 양태에서, MAIT 세포 단리 방법을 제공하며, 이 방법은
(i) 말초 혈액 단핵구 세포(PBMC)를 제공하고;
(ii) PBMC에 자기 활성화된 세포 분류(MACS) 및/또는 형광 활성화된 세포 분류(FACS)를 적용하여 이로부터 MAIT 세포를 단리함
을 포함한다.
바람직하게는, 본 발명의 방법은 순수한 생체 외 MAIT 세포의 단리를 생성시킨다. 하나의 구현예에서, 방법은 PBMC에 MACS 또는 FACS를 적용하여 이로부터 MAIT 세포를 단리하는 것을 포함한다. 그러나, 바람직하게는, 이 방법은 PBMC에 MACS 및 FACS를 모두 적용하여 이로부터 MAIT 세포를 단리하는 것을 포함한다. 바람직하게는, PBMC에 먼저 MACS를 적용한 다음 FACS를 적용한다. 바람직하게는, 방법은 MACS에 의해 PBMC로부터 TCR Vα7.2+ 세포를 단리하고, 이어서 MR1-5-OP-RU 사량체 염색에 의해 이들 세포에 FACS를 적용하여 MAIT 세포를 단리하는 것을 포함한다.
MACS 절차(단계 (ii))는 PBMC를 수집한 후 결합 완충액으로 세포를 세척하는 것을 포함할 수 있다. 상등액을 버리고, 생성된 세포 펠릿을 MACS 완충액(예를 들어, 1 x 107/100 ㎕의 농도)에 재현탁할 수 있다. 용액을 피코에리트린(PE) 항-인간 TCR Vα7.2 항체와 접촉시킬 수 있다(예를 들어 1:100의 비로). 용액을 혼합한 후 배양할 수 있다(예를 들어, 얼음 위에서 30분 동안). 세포를 MACS 완충액으로 세척할 수 있다(예를 들어, 300 x g에서 5분간 원심분리). 세포를 MACS 완충액(예를 들어, 107/80 ㎕의 농도)에 재현탁할 수 있다. 현탁액을 항-PE 마이크로비드와 접촉시킨 후 배양할 수 있다(예를 들어, 얼음 위에서 20분 동안). 세포를 세척할 수 있다(예를 들어, MACS 완충액의 10배 부피). 용액을 원심분리할 수 있다(예를 들어, 300 x g에서 5분 동안). 세포를 재현탁할 수 있다(예를 들어, MACS 완충액 1 ㎖에). MS 컬럼을 MACS 완충액으로 미리 세척하고 자석 상에 조립할 수 있다. 세포를 컬럼에 적용하고 MACS를 수행할 수 있다. 이어서, 컬럼을 한 번 이상 세척할 수 있다(예를 들어, 매번 MACS 완충액으로). 컬럼에서 자석을 제거할 수 있으며, 결합된 세포를 컬럼(예를 들어, MACS 완충액 중의)으로부터 용출시킬 수 있다.
FACS 절차(단계 (ii))는 자석-분리된 세포를 수집한 다음 원심분리(예를 들어, 5분 동안 300 x g에서)를 포함할 수 있다. 세포를 재현탁할 수 있다(예를 들어, FACS 완충액을 사용하여 107/100 ㎕의 농도로). 용액을 BV421-표지된 인간 5-OP-RU MR1 사량체(예를 들어 1:500의 비) 및 APC-H7-접합된 항-인간 CD3(예를 들어 1:200의 비)과 접촉시킬 수 있다. 이어서 용액을 배양할 수 있다(예를 들어, 얼음 위에서 20분 동안). 세포를 세척할 수 있다(예를 들어, 10배 부피의 FACS 완충액으로). 용액을 원심분리할 수 있다(예를 들어, 300 x g에서 5분 동안). 세포를 재현탁할 수 있다(예를 들어, 2 ㎖의 FACS 완충액에). 이어서 FACS 분류기(예를 들어, BD Prodigy 분류기)에 세포 샘플을 로딩하고 FACS를 수행할 수 있다.
단리된 MAIT 세포를 CAR을 암호화하는 핵산으로 형질도입하기 전에, 바람직하게는 MAIT 세포를 두 번째 양태의 방법에서 단계 (ii) 이후 후속 단계에서 활성화한다. 따라서, 방법은 단리된 MAIT 세포를 항-CD3 항체로, 바람직하게는 시험관 내에서 활성화시키는 것을 추가로 포함한다. 방법은 단리된 MAIT 세포를 항-CD28 항체로, 바람직하게는 시험관 내에서 활성화하는 것을 포함한다. 바람직하게는, 단리된 MAIT 세포를 항-CD3 및 항-CD28 항체 모두로, 실질적으로 동시에 또는 순차적으로 활성화한다. 순차적 활성화는 MAIT 세포를 먼저 항-CD3에 접촉시킨 후 항-CD28 항체에 접촉시키거나, 또는 먼저 항-CD28 항체에 접촉시킨 후 항-CD3 항체에 접촉시키는 것을 포함할 수 있다. 항체와의 접촉은 적어도 1일, 2일 또는 3일 동안 일 수 있다.
MAIT 세포 활성화 과정은 분류된 MAIT 세포를 원심분리기(예를 들어 300 x g에서 5분 동안)에 의해 수집하는 것을 포함할 수 있다. 상등액을 버릴 수 있고 펠릿을 재현탁할 수 있다(예를 들어, R10 배지에서 106 세포/㎖로). 용액을 Dynabeads 인간 T-활성화제 CD3/CD28과 접촉시킬 수 있다(예를 들어, 30초 동안 볼텍스에 의해). 원하는 부피의 Dynabeads를 튜브로 옮길 수 있다. 동일한 부피의 완충액을 튜브에 추가할 수 있으며 혼합할 수 있다(예를 들어, 5초 동안 볼텍스에 의해). 튜브를 자석 위에 놓고(예를 들어, 1분 동안) 상등액을 버릴 수 있다. 튜브를 자석에서 제거하고 세척된 Dynabeads를 재현탁할 수 있다(예를 들어, R10 배지에). 원하는 부피의 Dynabeads를 세포 현탁액과 접촉시킬 수 있다(예를 들어 37℃ 배양기의 24웰-플레이트에서 100 IU/㎖ IL-2를 사용하여 약 1:1의 비드 대 세포 비를 얻기 위해).
이어서, 방법은 단리되고 이제 활성화된 MAIT 세포를, CAR을 암호화하는 핵산 으로 형질도입하는 것을 포함할 수 있다.
MAIT 세포는 MHC 부류 I-유사 분자인 MR1을 인식하는 CD3+ TCRVa7.2+ CD161+ 세포로서 정의된 선천적 T 세포의 서브세트이다. 이전 연구에서는 MAIT 세포가 시험관 내에서 확대될 수 있지만 동종이계 영양 세포의 존재가 필요하다는 것을 입증하였다. 그러나, 이 방법의 문제점은 대규모 생산과 품질관리가 어렵다는 것이다. 실시예 10에 기재되고 도 15에 도시된 바와 같이, 발명자는 본 발명에 이르러 처음에 다양한 사이토카인 조합의 존재 하에서 최대 6일의 시험관 내 배양으로, 항원(5-OP-RU)이 로딩된 MR1 사량체 비드 또는 5-OP-RU(단독)로 PBMC를 자극함으로써 시험관 내에서 MAIT 세포를 확대하는 놀랍도록 효과적인 방법을 개발하였다. 이어서 MAIT 세포를 상기에서 논의된 바와 같이, MACS 또는 FACS 분류에 의해 단리한 다음, 후속적으로 CAR 기반 치료법을 위해 항-CD3/CD28 비드에 의해 추가로 확대하였다.
따라서, 바람직한 구현예에서, 방법은 MACS 및/또는 FACS 단계(즉, 단계 ii)의 수행 전에 PBMC를 자극하는 것을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 이러한 초기 자극 단계는 PBMC를 (a) MR1/5-OP-RU 또는 5-OP-RU를 포함하는 항원; 및/또는 (b) 사이토카인과 접촉시키는 것을 포함한다. 바람직하게는, 자극 단계는 PBMC를 (a) MR1/5-OP-RU 또는 5-OP-RU를 포함하는 항원; 및 (b) 사이토카인과 접촉시키는 것을 포함한다. 자극 단계는 적어도 1일, 2일 또는 3일 동안 PBMC를 항원 및/또는 사이토카인과 접촉시키는 것을 포함할 수 있다. 자극 단계는 적어도 4일, 5일 또는 6일 동안 지속될 수 있다. 바람직하게는, 자극 단계는 PBMC를 시험관 내 배양에서 항원 및/또는 사이토카인과 접촉시키는 것을 포함한다.
MR1/5-OP-RU 및 5-OP-RU는, 내용 전체가 본원에 참고로 포함된 WO 2015/149130에 기재되어 있다. 따라서, 바람직하게는, 항원은 WO 2015/149130(PCT/AU2015/050148)에 기재된 바와 같이, MR1/5-OP-RU 또는 5-OP-RU를 포함한다.
사이토카인은 임의의 인터류킨일 수 있다. 그러나, 바람직하게는, 사이토카인은 IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18 및 IL-23, 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 인터류킨일 수 있다. 인터류킨의 농도는 적어도 5, 10 또는 20 ng/㎖, 바람직하게는 적어도 30, 40 또는 50 ng/㎖일 수 있다.
예를 들어, 하나 이상의 인터류킨은 (i) IL-2 단독(도 15의 조건 1); (ii) IL-12 및 IL-18(도 15의 조건 11); (iii) IL-2, IL-12 및 IL-18(도 15의 조건 3); (iv) IL-12, IL-18 및 IL-23(도 15의 조건 12); (v) IL-2, IL-12, IL-18 및 IL-23(도 15의 조건 13) 또는 (vi) IL-7, IL-15, IL-12 및 IL-18(도 15의 조건 8)을 포함할 수 있다.
가장 바람직하게는, 하나 이상의 인터류킨은 IL-12, IL-18 및 IL-23의 조합을 포함할 수 있다. 따라서, 바람직하게는, 자극 단계는 PBMC를 (a) MR1/5-OP-RU 또는 5-OP-RU를 포함하는 항원; 및 (b) IL-12, IL-18 및 IL-23의 조합과 접촉시키는 것을 포함한다.
발명자는 PBMC 배양물에서 MAIT 세포를 자극하는 신규의 방법을 고안한 것으로 여긴다.
이와 같이, 또 다른 양태에서, MAIT 세포를 PBMC의 배양물에서 자극하는 방법을 제공하며, 방법은 PMBC의 배양물을 (a) MR1/5-OP-RU 또는 5-OP-RU를 포함하는 항원; 및/또는 (b) IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18 및 IL-23, 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 인터류킨과 접촉시키는 것을 포함한다.
바람직하게는, 하나 이상의 인터류킨은 IL-12, IL-18 및/또는 IL-23이다. 더욱 바람직하게는, 하나 이상의 인터류킨은 IL-12, IL-18 및 IL-23이다.
발명자는 CAR-MAIT 세포의 생성 방법이 그 자체로도 신규의 것이라고 여긴다.
따라서, 세 번째 양태에서, CAR-MAIT 세포의 생성 방법을 제공하며, 방법은
(i) 말초 혈액 단핵구 세포(PBMC)를 제공하고;
(ii) PBMC에 MACS 및/또는 FACS를 적용하여 이로부터 MAIT 세포를 단리하고;
(iii) 임의로, 단리된 MAIT 세포를 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체와 접촉시킴으로써 단리된 MAIT 세포를 활성화하고;
(iv) 활성화된 MAIT 세포를, CAR을 암호화하는 핵산으로 형질도입하여 CAR-MAIT 세포를 생성시킴
을 포함한다.
세 번째 양태의 방법의 단계 (i), (ii) 및/또는 (iii)은 두 번째 양태의 방법과 관련하여 본원에 기재된 단계와 동일할 수 있으며, 따라서 이들 방법 단계는 상호교환 가능하다.
또한, 바람직하게는, 방법은 PBMC에 MACS 및/또는 FACS 단계(즉, 단계 ii)를 적용하기 전에 PBMC를 자극하는 것을 포함한다. 바람직하게는, 이러한 초기 자극 단계는 PBMC를 (a) MR1/5-OP-RU 또는 5-OP-RU를 포함하는 항원; 및/또는 (b) 사이토카인과 접촉시키는 것을 포함한다. 바람직하게는, 자극 단계는 PBMC를 (a) MR1/5-OP-RU 또는 5-OP-RU를 포함하는 항원; 및 (b) 사이토카인과 접촉시키는 것을 포함한다. 사이토카인은 두 번째 양태와 관련하여 기재된 인터류킨일 수 있으며, 바람직하게는 상술한 바와 같은 IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18 및 IL-23, 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 인터류킨일 수 있다.
가장 바람직하게는, 하나 이상의 인터류킨은 IL-12, IL-18 및 IL-23의 조합을 포함할 수 있다. 따라서, 바람직하게는, 자극 단계는 PBMC를 (a) MR1/5-OP-RU 또는 5-OP-RU를 포함하는 항원; 및 (b) IL-12, IL-18 및 IL-23의 조합과 접촉시키는 것을 포함한다.
단리된 MAIT 세포를 단계 (iv)에서 CAR을 암호화하는 핵산으로 형질도입하기 전에 MAIT 세포를 단계 (iii)에서 활성화하는 것이 바람직하다. 단리된 MAIT 세포를 바람직하게는 시험관 내에서 항-CD3 항체로 활성화할 수 있다. 단리된 MAIT 세포를 바람직하게는 시험관 내에서 항-CD28 항체로 활성화할 수 있다. 바람직하게는, 단리된 MAIT 세포를 두 번째 양태의 방법과 관련하여 기재된 바와 같이 항-CD3 및 항-CD28 항체 모두로, 실질적으로 동시에 또는 순차적으로 활성화한다.
MAIT 세포 형질도입 절차(즉, 단계 (iv))는 MAIT 세포를, CAR을 암호화하는 핵산으로 형질도입하는 것을 포함할 수 있다. 형질도입 단계는 바이러스 형질도입을 포함할 수 있다. 바람직하게는, MAIT 세포 형질도입 절차는 MAIT 세포를 CAR을 암호화하는 핵산으로 레트로바이러스에 의해 형질도입하는 것을 포함한다. MAIT 세포를 예를 들어 다섯 번째 양태에 따른 본원에 기재된 바와 같은 CAR을 암호화하는 임의의 핵산 또는 여섯 번째 양태에 따른 벡터로 형질도입할 수 있다. 핵산은 T-세포 상의 CD4 항원 또는 적어도 하나 이상의 TCR V베타 영역을 표적화하는 CAR을 암호화할 수 있다. 바람직하게는, 핵산은 T-세포 상의 표 1에 나타낸 하나 이상의 TCR V베타 영역(및 보다 바람직하게는 TCR-V베타 7.1 쇄)을 표적화하는 CAR을 암호화할 수 있다. 핵산은 하기의 V베타 영역으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 T-세포 상의 하나 이상의 TCR V베타 영역을 표적화하는 CAR을 암호화할 수 있다: Vb 1, Vb 2, Vb 3, Vb 5.1, Vb 7.1, Vb 8, Vb 12, Vb 13.1, Vb 17, 및 Vb 20.
바람직하게는, 형질도입을 MAIT 세포 활성화 적어도 34시간, 36시간 또는 48시간 후에 수행한다. 형질도입 전(예를 들어, 약 하루 전)에, RetroNectin 코팅된 플레이트를 제조할 수 있다. RetroNectin(예를 들어, 약 15 ㎍)을 PBS(예를 들어, 약 1 ㎖)와 접촉시켜 용액을 형성시킬 수 있다. 방법은 비-조직 배양물 처리된 24웰 플레이트의 한 웰에 용액을 도입하는 것을 포함할 수 있다. 플레이트를 래핑하여(예를 들어, 접착 필름으로) 약 4℃에서 보관할 수 있다(예를 들어, 밤새 냉장고에 보관). 유전자 전달(gene transfer) 당일, 결합되지 않은 RetroNectin을 웰에서 제거한다. 웰을 세척할 수 있다(예를 들어, PBS 2 ㎖로 1회 또는 2회). 바람직하게는 웰을 건조되지 않게 한다. 레트로바이러스 상등액을 해동할 수 있다(예를 들어, 37℃ 수욕(water bath)에서). 바이러스 상등액을 RetroNectin이 코팅된 플레이트의 각 웰에 옮기는 것이 바람직하다(예를 들어, 약 1 ㎖). 플레이트를 클링-필름으로 감쌀 수 있다. 플레이트를 원심분리할 수 있다(예를 들어, 1000 x g, 32℃에서 2시간 동안). 원심분리하는 동안 활성화된 MAIT 세포를 수집할 수 있다. 수집된 세포를 재현탁할 수 있다(예를 들어, 100 IU/㎖ IL-2를 1 x 106/㎖ 농도로 함유하는 신선한 R10 배지에). 원심분리가 완료되면 상등액을 플레이트에서 버릴 수 있다. 세포 현탁액(예를 들어, 1 ㎖)을 각 웰에 첨가할 수 있다. 플레이트를 원심분리할 수 있다(예를 들어, 500 x g에서 10분 동안). 그런 다음 플레이트를 배양할 수 있다(예를 들어, 37℃ 배양기에서). 필요한 경우, 더 높은 형질도입 효율을 달성하기 위해 형질도입 단계를 반복할 수 있다. 형질도입 효율을, 형질도입 약 48시간 후에 유세포분석(flow cytometry)에 의해 검출할 수 있다.
발명의 방법은 바람직하게는 세 번째 양태의 방법의 단계 (iv) 이후 후속 단계에서 CAR-MAIT 세포를 확대하는 것을 포함한다. CAR-MAIT 세포 확대 단계는, 바람직하게는 레트로바이러스 또는 바이러스로 형질도입 1일 또는 2일 후, 형질도입된 CAR-MAIT 세포를 수확하는 것을 포함할 수 있다. 이어서 수확된 세포를 계산할 수 있다(예를 들어, 혈구계산기로). 수확된 세포를 플레이트의 웰로 옮길 수 있다(예를 들어, Grex6M 웰 플레이트의 웰에 1 x 107 세포). 수확된 세포를 인터류킨과 접촉시킬 수 있다. 예를 들어, 인터류킨은 R10 배지(예를 들어, 130 ㎖)와 같은 적합한 배지에 포함된 IL-2(예를 들어, 약 100 IU/㎖)일 수 있다. 플레이트를 배양기로 반환할 수 있다. 이어서 IL-2를 리프레쉬할 수 있다(예를 들어, 3일마다 100 IU/㎖의 최종 농도로). CAR-MAIT 세포를 8-12일 배양 후 수확할 수 있다. 확대된 CAR-MAIT 세포를 표현형 시험, 기능 분석에 사용하고/하거나, 나중에 사용하기 위해 냉동시킬 수 있다(예를 들어, 액체 질소에서).
유리하게, 실시예에 기재된 바와 같이, 11일 배양은 50% 초과의 형질도입 효율로 CAR-MAIT 세포의 100배 확대 수준을 생성시켰다. 발명자는 CAR-MAIT 세포가 놀랍게도 통상적인 CAR-발현 CD8+ T 세포와 적어도 동등한 세포독성 효능을 나타냄을 관찰하였다.
네 번째 양태에서, 세 번째 양태의 방법에 의해 수득되거나 수득될 수 있는 CAR-MAIT 세포를 제공한다.
본원에 기재된 바와 같이, 두 번째 또는 세 번째 양태의 방법을 사용하여 수득된 단리된 MAIT 세포를 활성화할 수 있으며, 최종적으로 CAR을 암호화하는 핵산 작제물로 형질도입하여 첫 번째 또는 네 번째 양태의 CAR-MAIT 세포를 생성시킨다. 본원에 논의된 바와 같이, 발명자는 T-세포 상의 CD4 분자(이 경우 작제물 및 벡터는 본원에서 "CART4"로 지칭됨) 또는 하나 이상의 TCR-V베타 영역, 예를 들어 TCR-V베타 7.1 쇄(이 경우 작제물 및 벡터는 본원에서 "CARTVb7.1"로 지칭됨)를 특이적으로 표적화하는 CAR을 암호화하는 신규의 유전자 작제물 및 재조합 벡터를 개발하였다. 이들 작제물 및 벡터 중 어느 하나를 사용하여 세 번째 또는 네 번째 양태의 방법에서 MAIT 세포를 형질도입할 수 있다.
유전자 작제물은 (i) 항-CD4 mAb(예를 들어, Hu5A8) 또는 (ii) 항-TCR-Vb mAb, 예를 들어 항-TCR-Vb 7.1 mAb(예를 들어, 3G5) 중 어느 하나의 scFv를 CD28/ 4-1BB/CD3-제타 쇄 신호전달 모이어티를 포함하여 3세대 CAR을 형성한다. CAR을 암호화하는 작제물은 절두된 표피 성장 인자 수용체(tEGFR) 및/또는 유도성 카스파제-9(iC9)와 같은, 소위 자살 유전자에 의해 암호화되고 경우에 따라, 생성된 CAR-T 세포의 제거를 가능하게 하는 적어도 하나의 안전 스위치를 추가로 포함하며, 따라서 치료법에 CAR-T 세포 사용 시 우아한 모니터링 시스템 또는 안전 기전을 제공한다. tEGFR의 발현은 CAR-T 세포를 모니터링하거나 고갈시키기 위해 항-EGFR mAb(예를 들어, 세툭시맙)에 의해 인식될 수 있으며, iC9는 인간 FK506 결합 단백질에 융합되어, 융합 단백질을 발현하는 CAR-T 세포의 아팝토시스를 촉발하는 화학적 이량체화 유도제(예를 들어 리미두시드)를 사용하여 조건부 이량체화를 허용하는 변형된 인간 카스파제-9이다. 발명자는 이들이 개발한 CAR 암호화 핵산 작제물이 그 자체로 신규한 것으로 여긴다. 도 1A(1 및 2)를 참조하면, 본 발명에 따른 CAR-암호화 작제물의 두 가지 구현예에 포함된 기능적 요소를 예시하는 개략도를 도시한다, 즉 "CART4"는 도 1A(1)에 도시되고 "CARTVb7.1"은 도 1A(2)에 도시된다. 그러나, V베타 7.1 패밀리를 표적화하는 항-TCR-Vb 7.1을 갖는 "CARTVb7.1"은 단지 예시일 뿐이며 임의의 V베타 영역, 예를 들어 표 1에 나타낸 V베타 중 임의의 것, 및 특히 Vb 1, Vb 2, Vb 3, Vb 5.1, Vb 7.1, Vb 8, Vb 12, Vb 13.1, Vb 17 및 Vb 20 중 임의의 것이 CAR에 의해 표적화될 수 있다는 것이 인식될 것이다.
따라서, 다섯 번째 양태에서, 항-CD4 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 항-T 세포 수용체(TCR) V-베타 CAR을 암호화하는 제1 암호화 서열에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함하는 핵산 작제물을 제공한다.
프로모터는 구성적 프로모터, 활성화 가능한 프로모터, 유도성 프로모터, 또는 조직-특이적 프로모터를 포함하는 임의의 적합한 프로모터일 수 있다. 구성적 프로모터는 이종 유전자(트랜스유전자라고도 함)가 숙주 세포에서 구성적으로 발현되도록 허용한다. 본원에서 고려되는 예시적인 구성적 프로모터는 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, 인간 신장 인자-1 알파(hEFa), 유비퀴틴 C 프로모터(UbiC), 포스포글리세로키나제 프로모터(PGK), 원숭이 바이러스 40 초기 프로모터(SV40) 및 CMV 초기 인핸서와 결합된 치킨(chicken) β-액틴 프로모터(CAGG)를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 유도성 프로모터는 조절된 프로모터의 범주에 속한다. 유도성 프로모터는 물리적 조건, 조작된 면역 효과기 세포의 미세환경, 또는 조작된 면역 효과기 세포의 생리학적 상태, 유도인자(즉, 유도제) 또는 이들의 조합과 같은 하나 이상의 조건에 의해 유도될 수 있다. 일부 구현예에서, 유도 조건은 조작된 포유동물 세포 및/또는 약제학적 조성물을 투여받은 대상체(subject)에서 내인성 유전자의 발현을 유도하지 않는다. 일부 구현예에서, 유도 조건은 유도제, 조사(예를 들어 이온화 방사선, 빛), 온도(예를 들어 열), 산화환원 상태, 종양 환경 및 조작된 포유동물 세포의 활성화 상태로 이루어지는 그룹으로부터 선택된다.
하나의 구현예에서, 프로모터는 PGK 프로모터(EMBL NO: A19297.1)일 수 있다. 하나의 구현예에서, PGK 프로모터는 본원에서 하기와 같이 서열번호 3으로 지칭된다:
[서열번호 3]
따라서 바람직하게는, 프로모터는 실질적으로 서열번호 3에 제시된 바와 같은 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함할 수 있다.
핵산 작제물은 신호전달 펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 유리하게, 신호전달 펩티드는 CAR(즉, 융합 단백질이다)을 T-세포 외막으로 유도하도록 구성된다. 바람직하게는, 신호전달 펩티드를 암호화하는 서열은 프로모터의 3'에 배치된다. 바람직하게는, 신호전달 펩티드는 Igκ 신호전달 펩티드이다. 하나의 구현예에서, 신호전달 펩티드는 본원에서 하기와 같이 서열번호 4로 지칭되는 아미노산 서열을 가질 수 있다:
[서열번호 4]
따라서 바람직하게는, 작제물은 실질적으로 서열번호 4에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 갖는 신호전달 펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
하나의 구현예에서, 신호전달 펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 본원에서 하기와 같이 서열번호 5로 지칭된다:
[서열번호 5]
따라서 바람직하게는, 작제물은 실질적으로 서열번호 5에 제시된 바와 같은 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함한다.
바람직하게는, 제1 암호화 서열은 신호전달 펩티드를 암호화하는 서열의 3'에 배치된다. 핵산 작제물의 첫 번째 구현예에서, 제1 암호화 서열은 항-CD4 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화한다. 바람직하게는, CAR은 실질적으로 서열번호 1에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 또는 이의 변이체 또는 단편을 포함하는 CD4 항원에 특이적이다.
도 1A(1)("CART4")에 도시된 바와 같이, 제1 암호화 서열은 VL(가변 경쇄) 서열 및 VH(가변 중쇄) 서열을 포함할 수 있는 scFv 영역을 암호화할 수 있다. 바람직하게는, VL 서열은 VH 서열의 상류(즉, 5')이다. 그러나 일부 구현예에서, VH 서열은 VL 서열의 상류일 수 있다.
VL 및 VH 서열은 하나의 구현예에서 T-세포 상의 CD4 항원 결합을 위한 Hu5A8(즉, 항-CD4 단클론 항체의 하이브리도마 클론명) 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역일 수 있다.
따라서, 하나의 구현예에서, 제1 암호화 서열(CD4 결합을 위한 VL 서열을 암호화할 수 있음)은 본원에서 하기와 같이, 서열번호 6으로 지칭되는 아미노산 서열을 암호화한다:
[서열번호 6]
따라서 바람직하게는, 제1 암호화 서열은 실질적으로 서열번호 6에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
하나의 구현예에서, 제1 암호화 서열(CD4에 결합하기 위한 VL 서열을 암호화할 수 있음)은 본원에서 하기와 같이 서열번호 7로 지칭되는 뉴클레오티드 서열을 포함한다:
[서열번호 7]
따라서 바람직하게는, 제1 암호화 서열은 실질적으로 서열번호 7에 제시된 바와 같은 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함한다.
하나의 구현예에서, 제1 암호화 서열(CD4 결합을 위한 VH 서열을 암호화할 수 있음)은 본원에서 하기와 같이 서열번호 8로 지칭되는 아미노산 서열을 암호화한다:
[서열번호 8]
따라서 바람직하게는, 제1 암호화 서열은 실질적으로 서열번호 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
하나의 구현예에서, 제1 암호화 서열(CD4에 결합하기 위한 VH 서열을 암호화할 수 있음)은 본원에서 하기와 같이 서열번호 9로 지칭되는 뉴클레오티드 서열을 포함한다:
[서열번호 9]
따라서 바람직하게는, 제1 암호화 서열은 실질적으로 서열번호 9에 제시된 바와 같은 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함한다.
바람직하게는, VH(예를 들어, 서열번호 9) 및 VL(예를 들어, 서열번호 7) 서열은 어느 배향이든 링커(linker) 서열에 의해 분리된다. 하나의 구현예에서, 링커 서열은 G4S 링커 서열일 수 있으며, 이는 본원에서 하기와 같이 서열번호 10으로 지칭된다:
[서열번호 10]
따라서 바람직하게는, 제1 암호화 서열은 실질적으로 서열번호 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
하나의 구현예에서, 링커 서열은 본원에서 하기와 같이 서열번호 11로 지칭되는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화될 수 있다:
[서열번호 11]
따라서 바람직하게는, 링커 서열은 실질적으로 서열번호 11에 제시된 바와 같은 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함한다.
그러나, 핵산 작제물("CARTVb7.1")의 두 번째 구현예에서, 제1 암호화 서열은 항-T 세포 수용체(TCR) V-베타 영역 CAR을 암호화한다. 임의의 V베타 영역이 CAR에 의해 표적화될 수 있다는 것이 이해될 것이다. 예를 들어, 표 1에 나열된 임의의 V베타 영역은 제1 암호화 서열에 의해 암호화되는 CAR에 의해 표적화될 수 있다.
제1 암호화 서열은 다수의 T 세포 수용체(TCR) 베타-쇄 가변 영역(V베타) CAR을 암호화할 수 있다. 바람직하게는, 다수의 V베타 영역은 표 1에 제시된 V베타 영역의 그룹으로부터 선택될 수 있다. 동일한 작제물에서 2개 이상의 V베타 영역-표적화 CAR을 조합하는 것도 또한 가능하다. 예를 들어, 작제물은 바람직하게는 표 1에 열거된 바와 같은 적어도 2개, 또는 적어도 3개 또는 적어도 4개의 T 세포 수용체(TCR) 베타-쇄 가변 영역(V베타)-표적화 CAR을 암호화하는 암호화 서열을 포함할 수 있다. 작제물은 바람직하게는 표 1에 열거된 바와 같은 적어도 5개, 또는 적어도 6개 또는 적어도 7개의 T-세포 수용체(TCR) 베타-쇄 가변 영역(V베타)-표적화 CAR을 암호화하는 암호화 서열을 포함할 수 있다. 베타 영역은 동일하거나 다른 V 베타 영역일 수 있다.
하기의 Vb 패밀리, 즉 Vb 1, Vb 2, Vb 3, Vb 5.1, Vb 7.1, Vb 8, Vb 12, Vb 13.1, Vb 17 및 Vb 20이 T-세포 림프종과 빈번하게 연관되는 것으로 여겨진다. 따라서, 바람직한 구현예에서, 작제물은 하기의 V베타 영역: Vb 1, Vb 2, Vb 3, Vb 5.1, Vb 7.1, Vb 8, Vb 12, Vb 13.1, Vb 17 및 Vb 20으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 T-세포 상의 하나 이상의 TCR V베타 영역을 표적화하는 적어도 하나의 CAR을 암호화하는 암호화 서열을 포함한다. 바람직하게는, 작제물은 하기의 V베타 영역: Vb 1, Vb 2, Vb 3, Vb 5.1, Vb 7.1, Vb 8, Vb 12, Vb 13.1, Vb 17 및 Vb 20으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 T-세포 상의 적어도 2개 또는 3개의 TCR V베타 영역을 표적화하는 적어도 하나의 CAR을 암호화하는 암호화 서열을 포함한다.
따라서, 바람직하게는, 다수의 항-T 세포 수용체(TCR) V-베타 CAR을 암호화하는 제1 암호화 서열에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함하는 핵산 작제물을 제공하며, 여기서 T-세포 상의 상이한 V-베타 영역이 표적화된다.
바람직하게는, CAR은 실질적으로 서열번호 2에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 또는 이의 변이체 또는 단편을 포함하는 TCR V베타 영역(바람직하게는 TCR-V베타 7.1 쇄)에 특이적이다.
도 1A(2)에 도시된 바와 같이, 제1 암호화 서열은 VL(가변 경쇄) 서열 및 VH(가변 중쇄) 서열을 포함할 수 있는 scFv 영역을 암호화할 수 있다. 바람직하게는, VL 서열은 VH 서열의 상류(즉, 5')이다. 그러나 일부 구현예에서, VH 서열은 VL 서열의 상류일 수 있다. 바람직하게는, 어느 배향이든 VH 및 VL 암호화 서열은 G4S 링커 서열과 같은 링커 서열에 의해 분리된다.
VL 및 VH 서열은 하나의 구현예에서 TCR V-베타 7.1 항원 결합을 위한 3G5(즉, 항-TCR V 베타 7.1 단클론 항체의 하이브리도마 클론명) 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역일 수 있다.
하나의 구현예에서, 제1 암호화 서열(TCR V-베타, 바람직하게는 TCR-V베타 7.1 쇄 결합을 위한 VL 서열을 암호화할 수 있음)은 본원에서 하기와 같이 서열번호 12로 지칭되는 아미노산 서열을 암호화한다:
[서열번호 12]
따라서 바람직하게는, 제1 암호화 서열은 실질적으로 서열번호 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
하나의 구현예에서, 제1 암호화 서열(TCR V-베타, 바람직하게는 TCR-V베타 7.1 쇄에 결합하기 위한 VL 서열을 암호화할 수 있음)은 본원에서 하기와 같이 서열번호 13으로 지칭되는 뉴클레오티드 서열을 포함한다:
[서열번호 13]
따라서 바람직하게는, 제1 암호화 서열은 실질적으로 서열번호 13에 제시된 바와 같은 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함한다.
하나의 구현예에서, 제1 암호화 서열(TCR V-베타, 바람직하게는 TCR-V베타 7.1 쇄 결합을 위한 VH 서열을 암호화할 수 있음)은 본원에서 하기와 같이 서열번호 34로 지칭되는 아미노산 서열을 암호화한다:
[서열번호 34]
따라서 바람직하게는, 제1 암호화 서열은 실질적으로 서열번호 34에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
하나의 구현예에서, 제1 암호화 서열(TCR V-베타, 바람직하게는 TCR-V베타 7.1 쇄에 결합하기 위한 VH 서열을 암호화할 수 있음)은 본원에서 하기와 같이 서열번호 35로 지칭되는 뉴클레오티드 서열을 포함한다:
[서열번호 35]
따라서 바람직하게는, 제1 암호화 서열은 실질적으로 서열번호 35에 제시된 바와 같은 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함한다.
바람직하게는, VH(예를 들어, 서열번호 35) 및 VL(예를 들어, 서열번호 13) 서열은 어느 배향이든 링커 서열에 의해 분리된다. 하나의 구현예에서, 링커 서열은 실질적으로 서열번호 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하거나 이로 이루어질 수 있는 G4S 링커 서열일 수 있다. 따라서 바람직하게는, 링커 서열은 실질적으로 서열번호 11에 제시된 바와 같은 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함한다.
핵산 작제물은 CD8a 힌지 및 막관통(TM) 구조 도메인(structure domain)을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 유리하게, 힌지 및 TM 도메인은 CAR 디스플레이 및 CAR-T 세포에 고정되도록 구성된다. 바람직하게는, 힌지 및 TM 도메인을 암호화하는 서열은 제1 암호화 서열의 3'에 배치된다.
하나의 구현예에서, CD8a 힌지 및 막관통 도메인의 아미노산 서열은 본원에서 하기와 같이 서열번호 14로 지칭된다:
[서열번호 14]
따라서 바람직하게는, 작제물은 실질적으로 서열번호 14에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
하나의 구현예에서, CD8a 힌지 및 막관통 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 본원에서 하기와 같이 서열번호 15로 지칭된다:
[서열번호 15]
따라서 바람직하게는, 작제물은 실질적으로 서열번호 15에 제시된 바와 같은 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함한다.
핵산 작제물은 CD28의 신호전달 도메인, 4-1BB의 신호전달 도메인 및/또는 CD3ζ 쇄, 및 더욱 바람직하게는 CD28의 신호전달 도메인, 4-1BB의 신호전달 도메인 및 CD3ζ 쇄를 포함할 수 있는 세포내 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 이들 성분이 3세대 CAR의 기초를 형성하고 세포내 신호전달 경로를 촉발하는 데 필요하다는 것이 이해될 것이다. 바람직하게는, 세포내 도메인은 힌지 및 막관통 도메인을 암호화하는 서열의 3'에 배치된다. CD28의 신호전달 도메인은 4-1BB의 신호전달 도메인의 5'에 있을 수 있다. 4-1BB의 신호전달 도메인은 CD3ζ 쇄의 5'에 있을 수 있다.
CD28 신호전달 도메인의 하나의 구현예는 본원에서 하기와 같이 서열번호 16으로 지칭되는 아미노산 서열을 가질 수 있다:
[서열번호 16]
따라서 바람직하게는, 작제물은 실질적으로 서열번호 16에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
하나의 구현예에서, CD28 신호전달 도메인은 본원에서 하기와 같이 서열번호 17로 지칭되는 핵산 서열에 의해 암호화될 수 있다:
[서열번호 17]
따라서 바람직하게는, 작제물은 실질적으로 서열번호 17에 제시된 바와 같은 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함한다.
4-1BB 신호전달 도메인의 하나의 구현예는 본원에서 하기와 같이 서열번호 18로 지칭되는 아미노산 서열을 가질 수 있다:
[서열번호 18]
따라서 바람직하게는, 작제물은 실질적으로 서열번호 18에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
하나의 구현예에서 4-1BB 신호전달 도메인은 본원에서 하기와 같이 서열번호 19로 지칭되는 핵산 서열에 의해 암호화될 수 있다:
[서열번호 19]
따라서 바람직하게는, 작제물은 실질적으로 서열번호 19에 제시된 바와 같은 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함한다.
CD3ζ 쇄의 하나의 구현예는 본원에서 하기와 같이 서열번호 20으로 지칭되는 아미노산 서열을 가질 수 있다:
[서열번호 20]
따라서 바람직하게는, 작제물은 실질적으로 서열번호 20에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
하나의 구현예에서, CD3ζ 쇄는 본원에서 하기와 같이 서열번호 21로 지칭되는 핵산 서열에 의해 암호화될 수 있다:
[서열번호 21]
따라서 바람직하게는, 작제물은 실질적으로 서열번호 21에 제시된 바와 같은 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함한다.
바람직하게는, 핵산 작제물은 적어도 하나의 자살 단백질, 보다 바람직하게는 적어도 2개의 자살 단백질을 암호화하는 제2 암호화 서열을 포함한다. 본 발명의 작제물은, 적어도 하나의 자살 단백질을 암호화하는 제2 암호화 서열의 존재가 상기 작제물로 형질도입된 생성된 CAR-T 세포가, 예를 들어 환자의 불리한 반응의 경우에, 조절 가능하게 또는 유도 가능하게 검출되거나 제거될 수 있음을 의미한다는 점에서 유리하다.
따라서 바람직하게는, 하나의 구현예에서 항-CD4 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 제1 암호화 서열, 및 적어도 하나의 자살 단백질, 및 더욱 바람직하게는 적어도 2개의 자살 단백질을 암호화하는 제2 암호화 서열에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함하는 핵산 작제물을 제공한다.
바람직하게는, 또 다른 구현예에서, 항-T 세포 수용체(TCR) V-베타 CAR을 암호화하는 제1 암호화 서열, 및 적어도 하나의 자살 단백질, 및 더욱 바람직하게는 적어도 2개의 자살 단백질을 암호화하는 제2 암호화 서열에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함하는 핵산 작제물을 제공한다.
더욱 또 다른 구현예에서, 바람직하게는 다수의 항-T 세포 수용체(TCR) V-베타 CAR(여기서 T-세포 상의 상이한 V-베타 영역이 표적화된다)을 암호화하는 제1 암호화 서열, 및 적어도 하나의 자살 단백질, 및 더욱 바람직하게는 적어도 2개의 자살 단백질을 암호화하는 제2 암호화 서열에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함하는 핵산 작제물을 제공한다.
하나의 구현예에서, 제2 암호화 서열은 표피 성장 인자 수용체(EGFR), 또는 절두된 표피 성장 인자 수용체(tEGFR)(UniProt 번호 P00533; NCBI 참조 서열 NP 001333826.1)를 암호화할 수 있다. tEGFR의 발현은 환자의 CAR-T 세포의 모니터링 또는 고갈을 위해 항-EGFR mAb(세툭시맙)에 의해 조절될 수 있다. 하나의 구현예에서, tEGFR의 아미노산 서열은 본원에서 하기와 같이 서열번호 22로 지칭될 수 있다:
[서열번호 22]
따라서 바람직하게는, 작제물은 실질적으로 서열번호 22에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
하나의 구현예에서, tEGFR은 본원에서 하기와 같이 서열번호 23으로 지칭되는 핵산 서열에 의해 암호화될 수 있다:
[서열번호 23]
따라서 바람직하게는, 작제물은 실질적으로 서열번호 23에 제시된 바와 같은 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 제2 암호화 서열은 유도성 카스파제-9(iC9)를 암호화할 수 있다. iC9는 인간 FK506 결합 단백질(UniProt No. P62942; NCBI 참조 서열 NP_000792.1)에 융합되어, 융합 단백질을 발현하는 CAR-T 세포의 아팝토시스를 촉발하는 화학적 이량체화 유도제(카스파제 유도성 약물(CID), 리미두시드)를 사용하여 조건부 이량체화를 허용하는 변형된 인간 카스파제-9(UniProt No. P55211; NCBI 참조 서열 NP_001220.2)이다. 하나의 구현예에서, iC9의 아미노산 서열은 본원에서 하기와 같이 서열번호 24로 지칭될 수 있다:
[서열번호 24]
따라서 바람직하게는, 작제물은 실질적으로 서열번호 24에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
하나의 구현예에서, iC9는 본원에서 하기와 같이 서열번호 25로 지칭되는 핵산 서열에 의해 암호화될 수 있다:
[서열번호 25]
따라서 바람직하게는, 작제물은 실질적으로 서열번호 25에 제시된 바와 같은 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함한다.
바람직하게는, 발명의 핵산 작제물은 EGFR 또는 절두된 표피 성장 인자 수용체(tEGFR) 및/또는 유도성 카스파제-9(iC9)를 암호화하는 암호화 서열을 포함한다. 하나의 자살 유전자를 갖는 것은 치료법에 사용될 때 CAR 및 CAR-MAIT 세포의 발현에 대한 확고한 조절(검출 및/또는 제거를 위한)을 제공한다.
그러나 보다 바람직하게는, 핵산 작제물은 절두된 표피 성장 인자 수용체(tEGFR) 및 유도성 카스파제-9(iC9)를 둘 다 암호화하는 암호화 서열을 포함한다. 유리하게, 2개의 자살 유전자를 갖는 것은 치료법에 사용되는 경우 CAR 및 CAR-MAIT 세포의 발현에 대해 훨씬 더 엄격한 조절(검출 및/또는 제거를 위해)을 제공한다.
바람직하게는, 핵산 작제물은, 절단(또는 자가-절단)되어 스페이서의 어느 한 쪽에 별도의 분자로서 암호화된 폴리펩티드, 예를 들어 세포내 도메인 및 자살 유전자-암호화된 단백질(tEGFR 및/또는 iC9일 수 있다)을 생성시킬 수 있도록 구성된 펩티드 스페이서를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 따라서, 펩티드 스페이서는 자가-절단 펩티드로서 공지될 수 있다.
바람직하게는, 스페이서 서열은 바이러스 펩티드 스페이서 서열, 더욱 바람직하게는 바이러스 2A 펩티드 스페이서 서열을 포함하고 암호화한다(Furler S, Paterna J-C, Weibel M and Bueler H Recombinant AAV vectors containing the foot and mouth disease virus 2A sequence confer efficient bicistronic gene expression in cultured cells and rat substantia nigra neurons Gene Ther. 2001, vol. 8, PP: 864-873).
바람직하게, 2A 펩티드 서열을 암호화하는 스페이서 서열은 세포내 도메인을 암호화하는 서열을, 자살 단백질을 암호화하는 서열에 연결시킨다. 작제물이 2개의 자살 단백질(예를 들어, EGFR/tEGFR 및 iC9)을 암호화하는 구현예에서, 핵산 작제물은 세포내 도메인을 암호화하는 서열과 제1 자살 단백질을 암호화하는 서열 사이에 배치된 제1 스페이서 서열, 및 제1 자살 단백질을 암호화하는 서열과 제2 자살 단백질을 암호화하는 서열 사이에 배치된 제2 스페이서 서열을 포함한다. 제1 자살 단백질은 EGFR/tEGFR일 수 있고, 제2 자살 단백질은 iC9일 수 있다. 또 다른 구현예에서, 제1 자살 단백질은 iC9일 수 있고, 제2 자살 단백질은 EGFR/tEGFR일 수 있다.
2A 스페이서 서열은 문헌[Wang Y et al. Scientific Reports 2015, 5]에 개시된 바와 같이, E2A, F2A, P2A 및 T2A로서 지칭되는 서열을 포함하는, 임의의 공지된 변이체일 수 있다. 바람직하게는 자가-절단 펩티드는 P2A이다. 하나의 구현예에서, P2A 스페이서는 본원에서 하기와 같이 서열번호 26으로 지칭되는 아미노산 서열을 갖는다:
[서열번호 26]
따라서 바람직하게는, 작제물은 실질적으로 서열번호 26에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
하나의 구현예에서, 2A 스페이서는 본원에서 하기와 같이 서열번호 27로 지칭되는 핵산 서열에 의해 암호화될 수 있다:
따라서 바람직하게는, 작제물은 실질적으로 서열번호 27에 제시된 바와 같은 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함한다.
추가 구현예에서, 작제물은 트랜스유전자의 발현을 향상시키는 우드척 간염 바이러스 전사후 조절 요소(Woodchuck Hepatitis Virus Post-transcriptional Regulatory Element)(WPRE)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함할 수 있다. 바람직하게는, WPRE 암호화 서열은 자살 단백질을 암호화하는 서열의 3'에 배치된다. 특히, WPRE 서열은 바람직하게는 iC9-암호화 서열의 3'이다.
WPRE의 하나의 구현예는 감마-알파-베타 요소를 포함하여 길이가 592 bp이고, 본원에서 하기와 같이 서열번호 28로 지칭된다:
[서열번호 28]
바람직하게는, 핵산은 실질적으로 서열번호 28에 제시된 바와 같은 핵산 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함한다.
바람직하게는, 작제물은 왼쪽(즉, 5') 및/또는 오른쪽(즉, 3') 긴 말단 반복 서열(LTR)을 포함한다. 바람직하게는, 각각의 LTR은 작제물의 5' 및/또는 3' 단부에 배치된다.
바람직한 구현예에서, 핵산 작제물은 명시된 순서로 5' 프로모터; CD4 또는 TCR V-베타 영역에 특이적인 scFv를 암호화하는 서열; 및 세포내 도메인을 암호화하는 3' 서열을 포함한다. 5' 및 3'의 사용은 특징이 상류 또는 하류임을 가리키며, 특징이 반드시 말단 특징임을 나타내려는 의도는 아니다.
바람직한 구현예에서, 핵산 작제물은 명시된 순서로 5' 프로모터; CD4 또는 TCR V-베타 영역에 특이적인 scFv를 암호화하는 서열; 세포내 도메인을 암호화하는 서열; 및 적어도 하나의 자살 단백질을 암호화하는 3' 서열을 포함한다.
보다 바람직한 구현예에서, 핵산 작제물은 명시된 순서로 5' 프로모터(바람직하게는 PGK 프로모터); CD4 또는 하나 이상의 TCR V-베타 영역(바람직하게는 VL 및/또는 VH 도메인)에 특이적인 scFv를 암호화하는 서열; 세포내 도메인(바람직하게는 CD28, 4-1BB 및/또는 CD3ζ 쇄)을 암호화하는 서열; 적어도 하나의 자살 단백질(바람직하게는 EGFR/EGFRt 및/또는 iC9)을 암호화하는 3' 서열을 포함한다.
더욱 바람직한 구현예에서, 핵산 작제물은 명시된 순서로 5' 프로모터(바람직하게는 PGK 프로모터); 신호전달 펩티드(SP)를 암호화하는 서열; CD4 또는 하나 이상의 TCR V-베타 영역(바람직하게는 G4S 링커에 의해 분리된 VL 및 VH 도메인)에 특이적인 scFv를 암호화하는 서열; CD8a 힌지 및 막관통 도메인을 암호화하는 서열; 세포내 도메인(바람직하게는 CD28, 4-1BB 및 CD3ζ 쇄)을 암호화하는 서열; 적어도 하나의 자살 단백질(바람직하게는 EGFR/EGFRt 및 iC9)을 암호화하는 3' 서열을 포함하고, 임의로 세포내 도메인을 암호화하는 서열과 자살 단백질-암호화 서열 사이에 자가-절단 펩티드 스페이서가 있다.
첫 번째 가장 바람직한 구현예("CART4"로 공지됨)에서, 핵산 작제물은 명시된 순서로 5' PGK 프로모터; 신호전달 펩티드(SP)를 암호화하는 서열; CD4에 특이적인 scFv의 VL 및 VH 도메인(바람직하게는 G4S 링커에 의해 분리됨)을 암호화하는 서열; CD8a 힌지 및 막관통 도메인을 암호화하는 서열; 세포내 도메인의 CD28, 4-1BB 및 CD3ζ 쇄를 암호화하는 서열; 제1 자가-절단 펩티드 스페이서를 암호화하는 서열; EGFR/EGFRt를 암호화하는 서열; 제2 자가-절단 펩티드 스페이서를 암호화하는 서열; iC9를 암호화하는 3' 서열을 포함한다.
두 번째 가장 바람직한 구현예("CARTVb7.1"로 공지됨)에서, 핵산 작제물은 명시된 순서로 5' PGK 프로모터; 신호전달 펩티드(SP)를 암호화하는 서열; 하나 이상의 TCR V-베타 영역, 바람직하게는 TCR-V베타 7.1 쇄에 특이적인 scFv 의 VL 및 VH 도메인(바람직하게는 G4S 링커에 의해 분리됨)을 암호화하는 서열; CD8a 힌지 및 막관통 도메인을 암호화하는 서열; 세포내 도메인의 CD28, 4-1BB 및 CD3ζ 쇄를 암호화하는 서열; 제1 자가-절단 펩티드 스페이서를 암호화하는 서열; EGFR/EGFRt를 암호화하는 서열; 제2 자가-절단 펩티드 스페이서를 암호화하는 서열; iC9를 암호화하는 3' 서열을 포함한다.
따라서, 핵산 작제물("CART4"로 공지됨)의 하나의 바람직한 구현예는 본원에서 하기와 같이 서열번호 29로서 지칭되는 아미노산 서열을 갖는다:
[서열번호 29]
따라서 바람직하게는, 작제물은 실질적으로 서열번호 29에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
바람직하게는, 핵산 작제물("CART4"로 공지됨)의 구현예는 본원에서 하기와 같이 서열번호 30으로 지칭되는 뉴클레오티드 서열을 갖는다:
[서열번호 30]
따라서 바람직하게는, 작제물은 실질적으로 서열번호 30에 제시된 바와 같은 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함한다.
따라서, 핵산 작제물("CARTVb7.1"로 공지됨)의 두 번째 바람직한 구현예는 본원에서 하기와 같이 서열번호 31로 지칭되는 아미노산 서열을 갖는다:
[서열번호 31]
따라서 바람직하게는, 작제물은 실질적으로 서열번호 31에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
바람직하게는, 핵산 작제물("CARTVb7.1"로 공지됨)의 구현예는 본원에서 하기와 같이 서열번호 32로 지칭되는 뉴클레오티드 서열을 갖는다:
[서열번호 32]
따라서 바람직하게는, 작제물은 실질적으로 서열번호 32에 제시된 바와 같은 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함한다.
따라서, 두 번째 또는 세 번째 양태의 방법을 사용하여 수득된 단리된 MAIT 세포가 활성화될 수 있으며, 최종적으로 CAR을 암호화하는 다섯 번째 양태에 따른 핵산 작제물로 형질도입되어 첫 번째 양태 또는 네 번째 양태의 CAR-MAIT 세포를 생성시키는 것을 이해할 것이다.
여섯 번째 양태에서, 다섯 번째 양태의 핵산 작제물을 암호화하는 발현 벡터를 제공한다.
바람직하게는, 벡터는 재조합체이다. 바람직하게는, 벡터는 바이러스 벡터, 보다 바람직하게는 레트로바이러스 벡터이다. 본 발명의 벡터의 두 가지 바람직한 구현예의 특징을 도시하는 지도가 도 9 및 10에 도시되어 있다.
하나의 구현예(CART4: CAR4-tEGFR-iC9; 도 9 참조)에서, 벡터는 본원에서 하기와 같이 서열번호 33으로 지칭되는 핵산 서열을 갖는다:
[서열번호 33]
바람직하게는, 벡터는 실질적으로 서열번호 33에 제시된 바와 같은 핵산 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함한다.
하나의 구현예(CARTVb7.1: CARTVb7.1-tEGFR-iC9; 도 10 참조)에서, 벡터는 본원에서 하기와 같이 서열번호 36으로 지칭되는 핵산 서열을 갖는다:
[서열번호 36]
바람직하게는, 벡터는 실질적으로 서열번호 36에 제시된 바와 같은 핵산 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함한다.
따라서, 두 번째 또는 세 번째 양태의 방법을 사용하여 수득된 단리된 MAIT 세포가 활성화될 수 있으며, 최종적으로 CAR을 암호화하는 여섯 번째 양태에 따른 핵산 작제물로 형질도입되어 첫 번째 양태 또는 네 번째 양태의 CAR-MAIT 세포를 생성시키는 것을 이해할 것이다.
열 한 번째 양태에서, 제5 작제물에 따른 작제물, 또는 여섯 번째 양태에 따른 벡터를 포함하는 T-세포를 제공하며, 임의로 여기서 T-세포는 항-CD4 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 항-V베타 CAR을 발현한다.
바람직하게는, T-세포는 점막 관련 불변 T(MAIT) 세포이다.
일곱 번째 양태에서, 열 한 번째 양태에 따른 T-세포, 바람직하게는 첫 번째 양태 또는 네 번째 양태에 따른 MAIT 세포, 및 약제학적으로 허용되는 부형제(excipient)를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
바람직하게는, 약제학적 조성물은 본 발명의 다수의 T 세포 또는 MAIT 세포를 포함한다. 예를 들어, 조성물은 적어도 100개, 1000개, 또는 10,000개의 T 세포 또는 MAIT 세포를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 조성물은 적어도 100,000개, 또는 적어도 1,000,000개 또는 적어도 10,000,000개의 T 세포 또는 MAIT 세포를 포함한다.
여덟 번째 양태에서, 치료법에 사용하기 위한, 열 한 번째 양태에 따른 T 세포, 첫 번째 양태 또는 네 번째 양태에 따른 MAIT 세포, 또는 일곱 번째 양태의 약제학적 조성물을 제공한다.
아홉 번째 양태에서, (i) 면역요법에; (ii) 암의 치료, 예방 또는 개선에; (ii) 미생물 감염의 치료, 예방 또는 개선에; 또는 (iv) 자가면역 질환의 치료, 예방 또는 개선에 사용하기 위한, 열 한 번째 양태에 따른 T 세포, 첫 번째 양태 또는 네 번째 양태에 따른 MAIT 세포, 또는 일곱 번째 양태의 약제학적 조성물을 제공한다.
열 번 째 양태에서, 본 발명은 (i) 면역요법으로 대상체의 질환을 치료, 예방 또는 개선하거나; (ii) 암을 치료, 예방 또는 개선하거나; (iii) 대상체의 미생물 감염을 치료, 예방 또는 개선하거나; 또는 (iv) 대상체의 자가면역 질환을 치료, 예방 또는 개선하는 방법을 제공하며, 방법은 이와 같은 치료가 필요한 환자에게 치료학적 유효량의 열 한 번째 양태에 따른 T 세포, 또는 첫 번째 양태 또는 네 번째 양태에 따른 MAIT 세포, 또는 일곱 번째 양태의 약제학적 조성물을 투여하거나 투여한 것을 포함한다.
바람직하게는, T 세포, MAIT 세포 또는 약제학적 조성물은 고형 종양 또는 액체 종양 일 수 있는 T 세포 악성종양을 치료, 예방 또는 개선하는데 사용하기 위한 것이다.
T-세포 악성종양은 말초 T-세포 림프종(PTCL) 또는 피부 T-세포 림프종( CTCL)일 수 있다.
말초 T-세포 림프종(PTCL)은 환자의 T-세포가 암으로 변하는 흔치 않고 공격적인 다양한 질병 그룹을 포함한다. PTCL은 세 가지 범주, 즉 결절성, 결절외 및 백혈병으로 분류되며, 이들 각각은 본 발명에 포함된다.
PTCL은 성인 T세포 급성 림프모구성 림프종 또는 백혈병(Adult T-Cell Acute Lymphoblastic Lymphoma or Leukaemia)(ATL); 장병증-관련 림프종(Enteropathy-Associated Lymphoma); 간비장 림프종(Hepatosplenic Lymphoma); 피하 지방층염-유사 림프종(Subcutaneous Panniculitis-Like Lymphoma)(SPTCL); 전구 T-세포 급성 림프모구성 림프종 또는 백혈병(Precursor T-Cell Acute Lymphoblastic Lymphoma or Leukaemia); 및 혈관면역모세포성 T-세포 림프종(Angioimmunoblastic T-cell lymphoma)(AITL)으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 PTCL 하위유형일 수 있다.
성인 T-세포 급성 림프모구성 림프종 또는 백혈병(ATL)은 미국보다 일본과 카리브해 지역에서 더 흔하게 발견되며 인간 T세포 백혈병 바이러스-1(HTLV-1)과 관련이 있다. 장병증-관련 림프종은 밀, 호밀, 보리에서 발견되는 글루텐 단백질에 대한 과민증으로 인해 발생하는 만성 장 질환인 셀리악병(celiac disease)과 관련이 있다. 증상으로는 대개 복통, 체중 감소, 위장 출혈, 장 천공 등이 있다. 장병증-관련 T-세포 림프종 환자의 치료에는 안트라사이클린 기반 화학요법, 영양 보충제, 및 적절한 경우 글루텐-프리 식단이 포함된다. 간비장 림프종은 간이나 비장에서 시작되어 주로 20대 및 30대 젊은 성인에게 발병하는 극히 드물고 공격적인 질환이다. 간비장 T-세포 림프종 환자에 대한 치료에는 안트라사이클린 기반 화학요법, 및 경우에 따라 줄기세포 이식이 포함된다.
피하 지방층염-유사 림프종(SPTCL)은 T-세포 림프종 중에서 가장 드물고 정의가 가장 잘 알려져 있지 않다. 이 림프종은 주로 피하 지방 조직에서 발생하며 결절이 형성된다. 증상으로는 발열, 오한, 체중 감소, 구강 점막 궤양 등이 있다. SPTCL은 빠르게 공격적이거나 무통성(느린 성장)일 수 있다. 치료에는 안트라사이클린 기반 화학요법 또는 국소 방사선 병용이 포함된다. 전구 T-세포 급성 림프구성 림프종 또는 백혈병은 백혈병이나 림프종 또는 둘 다로 진단될 수 있다. 이 암은 아동과 성인 모두에서 발견되며 청소년과 성인 남성에게서 가장 흔히 진단된다. 전구 T-세포 급성 림프모구성 림프종 또는 백혈병으로 새로 진단된 환자에 대한 치료는 공격적인 화학 요법과 방사선 요법이다. 넬라라빈(Arranon®)은 성인과 아동의 재발성 또는 불응성 전구 T-세포 급성 림프구성 림프종 또는 백혈병 치료용으로 승인되었다.
혈관면역모세포성 T-세포 림프종(AITL)은 임상적, 병리학적, 세포적, 생물학적 특성으로 입증되는 바와 같이 강렬한 염증 및 면역 반응을 특징으로 하는 신생물을 예시한다. 종양 세포는 표현형적으로 T 여포성 헬퍼(Tfh) 세포와 유사하기 때문에 반응성 여포성 증식에서 나타나는 비종양성 Tfh 세포와 어느 정도 유사하게 기능하는 것으로 간주된다. 그러나 대부분의 AITL 사례에서 모낭은 증식성이 없으며 오히려 고갈되거나 파괴된다. AITL은 최근 PTCL의 36.1%를 차지하는 것으로 보고되었다.
피부 T-세포 림프종(CTCL)은 원발성 피부 림프종의 약 70-75%를 차지한다. CTCL은 균상식육종(Mycosis fungoides)(MF); 세자리 증후군(SS); 및 CD4+ 작은 중간 다형성 T-세포 림프증식성 장애로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 CTCL 하위유형일 수 있다.
균상식육종(MF)이 가장 흔한 하위유형이다. 세자리 증후군(SS)은 보다 공격적인 유형의 CTCL이다. SS 환자는 홍피증(erythroderma)(즉, 체표면적[BSA]의 >80%에 영향을 미치는 발진), 림프절병증(lymphadenopathy), 및 말초혈액 중 다수의 순환하는 신생물 CD4+ T 세포를 갖는다.
다른 구현예에서, T 세포, MAIT 세포 또는 약제학적 조성물은 바이러스(예를 들어, HIV, HBV, HTLV, EBV, HPV), 세균(예를 들어, TB) 또는 진균 감염의 치료, 예방 또는 개선에 사용될 수 있다.
다른 구현예에서, T 세포, MAIT 세포 또는 약제학적 조성물은 자가면역 질환, 예를 들어 전신홍반성루푸스(systemic lupus erythematosus), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 또는 중증근무력증(myasthenia gravis)을 치료, 예방 또는 개선하는데 사용될 수 있다.
바람직하게는, 방법은 자살 단백질을 암호화하는 서열을 촉발하는 것을 포함한다. 따라서, 핵산 작제물이 EGFR 또는 tEGFR을 암호화하는 서열을 포함하는 구현예에서, 방법은 바람직하게는 대상체에게 항-EGFR 항체를 투여하는 것을 포함한다. 예를 들어, 항-EGFR 항체는 단클론 항체인 세툭시맙일 수 있다. 항체의 투여는 대상체에서 CAR-T 세포의 모니터링 또는 고갈을 가능하게 한다.
핵산 작제물이 iC9를 암호화하는 서열을 포함하는 구현예에서, 방법은 대상체에게 카스파제 유도성 약물(CID)을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, CID는 리미두시드를 포함할 수 있다. CID를 투여하면 카스파제의 조건부 이량체화가 가능해지며, 이는 융합 단백질을 발현하는 CAR-T 세포의 아팝토시스를 촉발하고, 결과적으로 대상체에서 CAR-T 세포가 고갈된다.
가장 바람직한 구현예에서, 작제물은 iC9 및 tEGFR 둘 다를 포함하는 2개의 자살 단백질을 암호화하므로 항-EGFR 항체 및 CID를 사용하면 치료를 받는 대상체에서 CAR-T 또는 CAR-MAIT 세포의 수명을 절묘하게 조절할 수 있다.
본 발명에 따른 CAR-T 세포 또는 CAR-MAIT 세포(본원에서는 "제제(agent)"로 총칭함)가 치료법에, 바람직하게는 면역요법에, (i) 암 또는 T-세포 악성종양의 치료, 개선 또는 예방에; 또는 (ii) 미생물 감염의 치료, 예방 또는 개선에, 또는 (iii) 자가면역 질환에 단일요법(예를 들어 T 세포 또는 CAR-MAIT 세포 단독의 사용)에 사용될 수 있음을 인식할 것이다. 대안적으로, 본 발명에 따른 CAR-T 또는 CAR-MAIT 세포는 공지된 면역요법에, 또는 미생물 감염뿐만 아니라 암 또는 자가면역 질환을 치료하기 위해 보조제로서 또는 조합하여 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 제제는 특히 조성물이 사용되는 방식에 따라 다양한 형태를 갖는 조성물에 조합될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 조성물은 분말, 정제, 캡슐, 액체, 연고, 크림, 겔, 하이드로겔, 에어로졸(aerosol), 스프레이, 미셀 용액(micellar solution), 경피 패치, 리포솜 현탁액 또는 치료가 필요한 사람이나 동물에게 투여될 수 있는 임의의 다른 적합한 형태일 수 있다. 본 발명에 따른 약제(medicament)의 비히클은 상기가 투여되는 대상체에 의해 잘 허용되는 것이어야 함을 인식할 것이다.
본 발명의 제제를 포함하는 약제는 다양한 방식으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여가 필요할 수 있으며, 이 경우 제제는 예를 들어 정제, 캡슐 또는 액체의 형태로 경구로 섭취될 수 있는 조성물 내에 포함될 수 있다. 본 발명의 제제 및 약제를 포함하는 조성물은 흡입(예를 들어 비강내)으로 투여될 수 있다. 조성물은 또한 국소용으로 제형화될 수도 있다. 예를 들어, 크림이나 연고를 피부에 도포할 수 있다.
본 발명에 따른 제제 및 약제는 서방성 또는 지연 방출 장치 내에 포함될 수도 있다. 예를 들어, 이러한 장치는 피부 위 또는 아래에 삽입될 수 있으며, 약물은 몇 주 또는 심지어 몇 달에 걸쳐 방출될 수 있다. 장치는 적어도 치료 부위에 인접하게 위치할 수 있다. 이러한 장치는 본 발명에 따라 사용되는 제제를 사용하는 장기 치료가 필요하고 일반적으로 빈번한 투여(예를 들어 적어도 매일 주사)가 필요한 경우 특히 유리할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 제제 및 약제는 혈류 내로의 주사에 의해 또는 치료가 필요한 부위 내로 직접적으로 대상체에게 투여될 수 있다. 주사는 정맥내(볼루스 또는 주입), 또는 피하(볼루스 또는 주입), 또는 피내(볼루스 또는 주입)일 수 있다.
필요한 유전자 작제물 또는 벡터(즉, 제제)의 양은 생물학적 활성 및 생물학적 이용 가능성에 의해 결정되며, 이는 차례로 투여 방식, 제제의 물리화학적 특성, 및 단독요법 또는 병용요법으로서의 사용 여부에 따라 달라짐을 알 것이다. 투여 빈도는 또한 치료되는 대상체 내 제제의 반감기에 의해 영향을 받을 것이다. 투여되는 최적의 투여량은 당업자에 의해 결정될 수 있으며, 사용 중인 특정 제제, 약제학적 조성물의 강도, 투여 방식 및 치료되는 질병, 예를 들어 암의 진행 정도, T-세포 악성종양, 미생물 감염, 또는 자가면역질환에 따라 달라질 것이다. 대상체 연령, 체중, 성별, 식이요법 및 투여 시간을 포함하여 치료되는 특정 대상체에 따른 추가 요인으로 인해 투여량을 조정할 필요가 있을 것이다.
일반적으로, 본 발명에 따른 제제의 0.001 ㎍/㎏ 체중 내지 10 ㎎/㎏ 체중의 일일 용량이 제제에 따라, 치료법, 및 특히 암, T-세포 악성종양, 미생물 감염 또는 자가면역 질환의 치료, 개선 또는 예방에 사용될 수 있다. 보다 바람직하게는, 제제의 일일 용량은 0.01 ㎍/㎏ 체중 내지 1 ㎎/㎏ 체중, 더욱 바람직하게는 0.1 ㎍/㎏ 내지 100 ㎍/㎏ 체중, 가장 바람직하게는 대략 0.1 ㎍/㎏ 내지 10 ㎍/㎏ 체중이다.
대안적으로, 대상체에게 투여되는 용량은 체중의 0.5x107 내지 5x1012 변환 단위(TU)/㎏ 체중일 수 있다. 보다 바람직하게, 대상체에게 투여되는 용량은 0.5x108 내지 5x1011 TU/㎏ 체중일 수 있다. 가장 바람직하게는, 대상체에게 투여되는 용량은 0.5x109 내지 5x1010 TU/㎏ 체중일 수 있다.
제제는 암, T-세포 악성종양, 미생물 감염 또는 자가면역 질환 발병 전, 발병 중 또는 발병 후에 투여될 수 있다. 일일 용량은 단일 투여(예를 들어, 일일 단일 주사)로 제공될 수 있다. 대안적으로, 제제는 하루에 2회 이상 투여가 필요할 수도 있다. 예를 들어, 제제는 0.07 ㎍ 내지 700 ㎎(즉, 체중 70 ㎏을 가정하여)의 2회(또는 치료되는 질병, 예를 들어 암의 중증도에 따라 그 이상)의 일일 용량으로 투여될 수 있다. 치료를 받는 환자는 깨어나자마자 첫 번째 용량을 복용한 다음 저녁에 두 번째 용량을 복용하거나(2회 용량 요법을 사용하는 경우) 그 후 3 또는 4시간 간격으로 복용할 수 있다. 대안적으로, 제제는 일주일에 한 번, 심지어 한 달에 한 번 투여가 필요할 수도 있다. 대안적으로, 서방성 장치를 사용하여, 반복 용량을 투여할 필요 없이 환자에게 본 발명에 따른 제제의 최적 용량을 제공할 수 있다. 제약 산업에서 통상적으로 사용되는 것과 같은 공지된 절차(예를 들어, 생체내 실험, 임상 시험 등)를 사용하여 본 발명에 따른 제제의 특정 제형 및 정확한 치료 섭생(예를 들어, 제제의 일일 용량 및 투여 빈도)을 형성할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 바람직하게는 면역요법 치료 조성물, 또는 자가면역 질환 치료 조성물, 또는 항-감염 조성물, 또는 항암 조성물, 즉 대상체에서 암의 치료적 개선, 예방 또는 치료에 사용되는 약학 제형이다.
본 발명은 또한 열 한 번째 양태에서, 일곱 번째 양태에 따른 약제학적 조성물을 제조하는 공정을 제공하며, 이 공정은 치료학적 유효량의 첫 번째 또는 네 번째 양태에 따른 MAIT 세포와 약제학적으로 허용되는 비히클을 조합하는 것을 포함한다.
"대상체"는 척추동물, 포유동물 또는 가축일 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 약제는 임의의 포유동물, 예를 들어 가축(예를 들어, 말), 반려동물을 치료하는 데 사용될 수 있거나 다른 수의학적 적용에 사용될 수 있다. 가장 바람직하게는 대상체는 인간이다.
유전자 작제물 또는 벡터의 "치료학적 유효량"은 대상체에게 투여될 때 치료되는 질환, 예를 들어 암을 치료하거나 원하는 효과를 생성시키는 데 필요한 제제의 양인 임의의 양이다.
예를 들어, 사용되는 유전자 작제물 또는 벡터의 치료학적 유효량은 약 0.001 ng 내지 약 1 ㎎, 및 바람직하게는 약 0.01 ng 내지 약 100 ng일 수 있다. 유전자 작제물 또는 벡터의 양은 약 0.1 ng 내지 약 10 ng인 것이 바람직하고, 가장 바람직하게는 약 0.5 ng 내지 약 5 ng이다.
본원에서 언급된 바와 같은 "약제학적으로 허용되는 비히클"은 약제학적 조성물을 제형화하는데 유용한 것으로 당업자에게 알려진 임의의 공지된 화합물 또는 공지된 화합물의 조합이다.
하나의 구현예에서, 약제학적으로 허용되는 담체는 고체일 수 있고, 조성물은 분말 또는 정제 형태일 수 있다. 약제학적으로 허용되는 고체 비히클에는 풍미제, 윤활제, 가용화제, 현탁제, 염료, 충전제, 활택제, 압축 보조제, 불활성 결합제, 감미제, 보존제, 염료, 코팅제 또는 정제 붕해제로도 작용할 수 있는 하나 이상의 물질이 포함될 수 있다. 비히클은 또한 캡슐화 물질일 수도 있다. 분말에서, 비히클은 본 발명에 따른 미분된 활성제와 혼합된 미분된 고체이다. 정제에서, 활성제는 필요한 압축 특성을 갖는 비히클과 적절한 비율로 혼합되고 원하는 모양과 크기로 압축될 수 있다. 분말 및 정제는 바람직하게는 활성 성분을 99%까지 함유한다. 적합한 고체 비히클에는 예를 들어 인산칼슘, 스테아르산마그네슘, 활석, 당, 락토스, 덱스트린, 전분, 젤라틴, 셀룰로스, 폴리비닐피롤리딘, 저용융 왁스 및 이온 교환 수지가 포함된다. 다른 구현예에서, 약학 담체는 젤일 수 있고, 조성물은 크림 등의 형태일 수 있다.
그러나, 약학적 비히클은 액체일 수 있고, 약제학적 조성물은 용액 형태이다. 액체 비히클은 용액, 현탁액, 유화액, 시럽, 엘릭서 및 가압 조성물을 제조하는 데 사용된다. 본 발명에 따른 활성제는 물, 유기 용매, 둘의 혼합물 또는 약제학적으로 허용되는 오일 또는 지방과 같은 약제학적으로 허용되는 액체 비히클에 용해되거나 현탁될 수 있다. 액체 비히클은 가용화제, 유화제, 완충제, 보존제, 감미제, 풍미제, 현탁제, 증점제, 색소, 점도 조절제, 안정제 또는 삼투압 조절제와 같은 기타 적합한 약학적 첨가제를 함유할 수 있다. 경구 및 비경구 투여를 위한 액체 비히클의 적합한 예에는 물(상기와 같은 첨가제, 예를 들어 셀룰로스 유도체, 바람직하게는 나트륨 카르복시메틸 셀룰로스 용액을 부분적으로 함유함), 알코올(1가 알코올 및 다가 알코올, 예를 들어 글리콜 포함) 및 이들의 유도체, 및 오일(예를 들어 분류된 코코넛 오일 및 아라키스 오일)이 포함된다. 비경구 투여의 경우, 비히클은 또한 에틸 올레이트 및 이소프로필 미리스테이트와 같은 유성 에스테르일 수도 있다. 멸균 액체 비히클은 비경구 투여용 멸균 액체 형태 조성물에 유용하다. 가압된 조성물을 위한 액체 비히클은 할로겐화 탄화수소 또는 기타 약제학적으로 허용되는 추진제일 수 있다.
멸균 용액 또는 현탁액인 액체 약제학적 조성물은 예를 들어 근육내, 경막내, 경막외, 복강내, 정맥내 및 특히 피하 주사에 의해 활용될 수 있다. 제제는 멸균수, 식염수 또는 기타 적절한 멸균 주사용 매질을 사용하여, 투여 시 용해되거나 현탁될 수 있는 멸균 고체 조성물로 제조될 수 있다.
본 발명의 제제 및 조성물은 다른 용질 또는 현탁제(예를 들어, 용액을 등장성으로 만들기에 충분한 식염수 또는 글루코스), 담즙염, 아카시아, 젤라틴, 소르비탄 모노레에이트, 폴리소르베이트 80(에틸렌 옥사이드와 공중합된 소르비톨 및 이의 무수물의 올레에이트 에스테르) 등을 함유하는 멸균 용액 또는 현탁액의 형태로 경구 투여될 수 있다. 본 발명에 따라 사용되는 제제는 액체 또는 고체 조성물 형태로 경구 투여될 수도 있다. 경구 투여에 적합한 조성물에는 환제, 캡슐제, 과립제, 정제 및 분말의 고형제와 용액, 시럽, 엘릭서 및 현탁액 등의 액상제가 포함된다. 비경구 투여에 유용한 형태에는 멸균 용액, 유화액 및 현탁액이 포함된다.
본 발명은 임의의 핵산 또는 펩티드 또는 이의 변이체 또는 단편을 포함하여 본원에 언급된 임의의 서열의 아미노산 또는 핵산 서열을 실질적으로 포함하는 임의의 핵산 또는 펩티드 또는 이의 변이체, 유도체 또는 유사체로 확장된다는 것이 이해될 것이다. "실질적으로 아미노산/뉴클레오티드/펩티드 서열", "변이체" 및 "단편"이라는 용어는 본원에서 언급된 서열 중 어느 하나의 아미노산/뉴클레오티드/펩티드 서열과 적어도 40%의 서열 동일성(sequence identity), 예를 들어 서열번호 1-36 등으로서 나타낸 서열과 40% 동일성을 갖는 서열일 수 있다.
언급된 임의의 서열에 대해 65% 초과, 더욱 바람직하게는 70% 초과, 훨씬 더 바람직하게는 75% 초과, 더욱 더 바람직하게는 80% 초과의 서열 동일성을 갖는 아미노산/폴리뉴클레오타이드/폴리펩티드 서열이 또한 예상된다. 바람직하게는, 아미노산/폴리뉴클레오티드/폴리펩티드 서열은 언급된 임의의 서열과 적어도 85% 동일성, 더욱 바람직하게는 본원에 언급된 서열 중 임의의 서열과 적어도 90% 동일성, 더욱 더 바람직하게는 적어도 92% 동일성, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 95% 동일성, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 97% 동일성, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 98% 동일성, 가장 바람직하게는 적어도 99% 동일성을 갖는다.
숙련가는 2개의 아미노산/폴리뉴클레오티드/폴리펩티드 서열 사이의 동일성 백분율을 계산하는 방법을 이해할 것이다. 2개의 아미노산/폴리뉴클레오티드/폴리펩티드 서열 간의 동일성 백분율을 계산하려면 먼저 두 서열의 정렬을 준비한 다음 서열 동일성 값을 계산해야 한다. 두 서열의 동일성 백분율은 하기에 따라 상이한 값을 가질 수 있다: - (i) 서열을 정렬하는 데 사용되는 방법, 예를 들어 ClustalW, BLAST, FASTA, Smith-Waterman(상이한 프로그램에서 구현됨) 또는 3D 비교로부터의 구조적 정렬; (ii) 정렬 방법에 사용되는 매개변수, 예를 들어 국소 대 전체 정렬, 사용된 쌍-점수 행렬(예를 들어, BLOSUM62, PAM250, Gonnet 등) 및 갭-벌점(gap-penalty), 예를 들어, 함수형 및 상수.
정렬을 수행한 후 두 서열 간의 동일성 백분율을 계산하는 다수의 상이한 방법이 존재한다. 예를 들어, 동일성의 수를 (i) 가장 짧은 서열의 길이; (ii) 정렬 길이; (iii) 서열의 평균 길이; (iv) 갭이 없는 위치의 수; 또는 (v) 오버행을 제외한 동등한 위치의 수에 의해 분류할 수 있다. 더욱 또한, 동일성 백분율은 길이에 크게 의존한다는 것도 이해될 것이다. 따라서 서열 쌍이 짧을수록, 우연히 발생할 것으로 예상되는 서열 동일성이 더 높아질 수 있다.
그러므로, 단백질 또는 DNA 서열의 정확한 정렬은 복잡한 과정이라는 것이 이해될 것이다. 대중적인 다중 정렬 프로그램 ClustalW(Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Research, 22, 4673-4680; Thompson et al., 1997, Nucleic Acids Research, 24, 4876-4882)는 본 발명에 따른 단백질 또는 DNA의 다중 정렬을 생성시키는 바람직한 방식이다. ClustalW에 적합한 매개변수는 하기와 같다: DNA 정렬의 경우: 갭 오픈 벌점(Gap Open Penalty) = 15.0, 갭 연장 벌점(Gap Extension Penalty) = 6.66 및 행렬 = Identity. 단백질 정렬의 경우: 갭 오픈 벌점 = 10.0, 갭 연장 벌점 = 0.2 및 행렬 = Gonnet. DNA 및 단백질 정렬의 경우: ENDGAP = -1, 및 GAPDIST = 4. 당업자는 최적의 서열 정렬을 위해 이들 매개변수 및 다른 매개변수를 변경시키는 것이 필요할 수 있음을 인식할 것이다.
바람직하게는, 2개의 아미노산/폴리뉴클레오티드/폴리펩티드 서열 사이의 동일성 백분율의 계산은 (N/T)*100과 같은 정렬로부터 계산될 수 있으며, 여기서 N은 서열이 동일한 잔기를 공유하는 위치의 수이고, T는 갭을 포함하고 오버행을 포함하거나 제외하여 비교된 전체 위치 수이다. 바람직하게는 오버행이 계산에 포함된다. 따라서, 두 서열 사이의 동일성 백분율을 계산하기 위한 가장 바람직한 방법은 (i) 예를 들어 상기에 제시된 바와 같이 적합한 매개변수 세트를 사용하여 ClustalW 프로그램으로 서열 정렬을 준비하고; (ii) N 및 T의 값을 하기의 공식에 대입하는 것을 포함한다: 서열 동일성 = (N/T)*100.
유사한 서열을 확인하기 위한 대안의 방법은 당업자에게 공지되어 있을 것이다. 예를 들어, 실질적으로 유사한 뉴클레오티드 서열은 엄격한 조건 하에서 DNA 서열 또는 이들의 보체에 하이브리드화하는 서열에 의해 암호화될 것이다. 엄격한 조건이란, 뉴클레오티드가 약 45℃에서 3x 염화나트륨/시트르산 나트륨(SSC)에서 필터-결합된 DNA 또는 RNA에 하이브리드화하고, 이어서 약 20-65℃에서 0.2x SSC/0.1% SDS에서 적어도 1회 세척된다는 것을 의미한다. 대안적으로, 실질적으로 유사한 폴리펩티드는 예를 들어, 아미노산 서열인 서열번호 1 내지 36의 서열에 제시된 서열과 1개 이상 5개, 10개, 20개, 50개 또는 100개 미만의 아미노산만큼 상이할 수 있다.
유전자 암호의 축퇴성으로 인해, 본원에 기재된 임의의 핵산 서열은 그에 의해 암호화되는 단백질의 서열에 실질적으로 영향을 주지 않고 변화되거나 변경되어 그의 기능적 변이체를 제공할 수 있다는 것이 분명하다. 적합한 뉴클레오티드 변이체는 서열 내에서 동일한 아미노산을 암호화하는 상이한 코돈의 치환에 의해 변경된 서열을 갖는 것이며, 이에 따라 침묵(동의어) 변화를 생성시킨다. 다른 적합한 변이체는 상동성 뉴클레오티드 서열을 갖지만, 서열의 전부 또는 일부가, 치환되는 아미노산과 유사한 생물물리학적 성질의 측쇄를 갖는 아미노산을 암호화하는 상이한 코돈의 치환에 의해 변경되어 보존적 변화를 생성시키는 것들이다. 예를 들어, 작은 비-극성, 소수성 아미노산에는 글리신, 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린 및 메티오닌이 포함된다. 큰 비-극성, 소수성 아미노산에는 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신이 포함된다. 극성 중성 아미노산에는 세린, 트레오닌, 시스테인, 아스파라긴 및 글루타민이 포함된다. 양으로 하전된(염기성) 아미노산에는 리신, 아르기닌 및 히스티딘이 포함된다. 음으로 하전된(산성) 아미노산에는 아스파르트산과 글루탐산이 포함된다. 따라서 어떤 아미노산이 유사한 생물물리학적 특성을 갖는 아미노산으로 대체될 수 있는지 이해할 것이며, 숙련가는 이들 아미노산을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 알 것이다.
본원에 기재된 모든 특징(수반된 청구범위, 요약 및 도면 포함) 및/또는 그렇게 개시된 모든 방법 또는 과정의 모든 단계는, 상기와 같은 특징 및/또는 단계의 적어도 일부가 상호 배타적인 조합을 제외하고, 상기 양태 중 어느 하나와 임의의 조합으로 조합될 수 있다.
본 발명의 보다 양호한 이해와, 이의 구현예가 어떻게 수행될 수 있는 지를 나타내기 위해서, 이제 예로서 첨부된 도면을 참조할 것이다, 도면에서:
도 1은 본 발명의 구현예에 따른 3세대 CD4 표적화 T 세포의 생성을 도시한다. A(1). 다이어그램은 본 발명에 따른 CAR 작제물("CART4"로 알려짐)의 한 구현예에 포함된 기능적 요소를 나타낸다. 단클론 항체 Hu5A8로부터 유래된 scFv는 CD8 막관통 도메인(TM), CD28 엔도도메인, 4-1BB 엔도도메인 및 CD3 ζ 쇄와 융합되었다. tEGFR(절두된 표피 성장 인자 수용체) 및 iC9(유도성 카스파제-9)의 유전자 서열은 자가-절단 2A 링커를 통해 CAR 뒤에 태그되었다. A(2). 다이어그램은 본 발명에 따른 CAR 작제물("CARTVb7.1"로 알려짐)의 또 다른 구현예에 포함된 기능적 요소를 나타낸다. 단클론 항체 3G5로부터 유래된 scFv는 CD8 막관통 도메인(TM), CD28 엔도도메인, 4-1BB 엔도도메인 및 CD3 ζ 쇄와 융합되었다. tEGFR(절두된 표피 성장 인자 수용체) 및 iC9(유도성 카스파제-9)의 유전자 서열은 자가-절단 2A 링커를 통해 CAR 뒤에 태그되었다. B. 형질도입된 T 세포가 항-마우스 IgG F(ab)'2 항체 및 항-EGFR 항체로 염색되었다. 세포는 CD3+ 단일 림프구에서 증식되었으며, 숫자는 CAR+/tEGFR+ 세포의 백분율을 나타낸다. C. CAR의 레트로바이러스 형질도입 후, 1차 T 세포를 매일 샘플링하고 CD3 및 tEGFR을 포함한 표면 마커에 대해 염색하였다. 파란색 히스토그램은 형질도입되지 않은 세포의 결과였다. CAR 및 마커에 대해 양성인 세포의 백분율이 플롯에 표시된다. D. 생존율은 표시된 용량의 CID에 노출 24시간 후 미처리 조건 및 화학적 이량체화 유도제(CID, 리미두시드)-처리 조건의 EGFR 양성(A) 또는 EGFR-고(B) 백분율의 비로서 정의되었다. E.는 생존 세포에서 EGFR 발현의 평균 형광 강도를 도시한다. 데이터는 별도 공여자의 3회 반복 실험으로부터의 전형적인 결과를 반영한다. 각 샘플을 3회 반복하여 수행하였다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다. 양측 독립표본 스튜던츠 t-검정에 의해 결정된 바와 같이 그룹 간에 통계적으로 유의미한 차이가 발견되었다. ** = p<0.01; * = p<0.05.
도 2는 본 발명에 따른 CART4 T 세포의 구현예의 시험관내 기능적 검증을 도시한다. A. PBMC는 Dynabeads 인간 T-활성화제 및 IL7/IL15에 의해 활성화되었다. 활성화된 PBMC에는 T 세포의 두 서브세트인 CD4+ 및 CD8+(왼쪽)가 포함되어 있다. 세포는 CART20(가운데) 또는 CART4(오른쪽) 레트로바이러스 입자에 의해 형질도입되었다. 형질도입 후 3일차부터 세포를 항-CD4 및 항-CD8 항체로 염색하고 유세포분석에 의해 분석하였다. CD4+ 비의 통계는 B에 요약되어 있다 . 데이터는 5명의 건강한 개인의 전형적인 결과를 반영한다. C. 1차 CD4+ T 세포(왼쪽) 또는 CD20+ B 세포(오른쪽)를 자기유래 CART4 세포, CART20 세포 또는 형질도입되지 않은 CD8+ T 세포 와 4시간 동안 공동-배양하였다. 유세포분석을 통해, Countbright 비드를 사용하여 생존한 표적 세포의 절대량을 카운트하였다. D. 2개의 T 세포주 CEM-ss 세포, Jurkat 세포 및 1개의 B 세포주가 항-CD4 항체에 의해 염색되었다. CD4 발현 수준을 유세포분석을 통해 평가하였다. E. T 종양 세포를 사멸하는 CART4 세포의 전형적인 결과. 각 샘플을 3회 반복하여 수행하였다. 데이터는 3개의 독립적인 실험의 전형적인 결과를 반영한다. F. 상이한 표적 세포와 공동-배양된 CART4 세포의 세포내 사이토카인 발현. 각 샘플을 3회 반복하여 수행하였다. 데이터는 3개의 독립적인 실험의 일반적인 결과를 반영한다.
도 3은 CART4 세포가 CD4+ T 종양 세포를 특이적으로 사멸하는 것을 도시한다. ATLL 환자의 PBMC 바이알을 액체 질소에서 소생시키고 유세포분석 및 공동-배양 실험 전에 밤새 배양기에 두었다. A. PBMC는 항-CD4, CD8 및 특정 TCR Vβ에 의해 염색되었다. PBS로 2회 세척한 후 유세포분석을 수행하였다. 소생된 ATLL(B) 또는 CTCL(C) PBMC를 유세포분석 전에 4시간 동안 동종이계 CART4 또는 CART20 세포와 공동-배양하였다. 각 조건에 대해 3회의 반복을 수행하였다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다.
도 4는 CART4 세포가 생체 내에서 항백혈병 효과를 효율적으로 매개한다는 것을 도시한다. A. NRG 면역결핍 마우스에 1x105 Gluc/GFP-형질도입 CEM-ss 세포를 주사한 후, 역-궤도 경로를 통해 4x106 T 세포를 추가로 주입하였다. NTD n=5, CART4 n=7. B. 각 마우스의 말초 혈액 50 ㎕를 채혈하고 혈장을 루시페라제 활성 측정에 사용하였다. 루시페라제 활성의 연속 측정에서 CART4 T 세포에 의한 CD4+ 백혈병 억제가 나타났으나 NTD CD8+ T 세포에서는 그렇지 않은 것으로 나타났다. C. Kaplan-Meier 생존 분석에 의한 지시된 CART4 세포 또는 대조용 NTD T 세포로 처리된 마우스의 전체 생존. D. 종점에서 마우스를 해부하였다. 비장 및 골수를 분쇄하고 잔류 종양 세포의 검출을 위해 항-CD4 mAb 및 DAPI로 염색하였다. 종양 세포는 DAPI- CD4+ GFP+로 확인되었다. E. 비장에서 잔류 종양 세포의 CD4 발현 수준. 회색선-배양된 CEMss 세포, 검은색 선-NTD 대조용 마우스의 CEMss 세포, 빨간색 선-CART4 처리된 마우스의 CEMss 세포. F. 비장 세포를 CART4 세포 또는 NTD T 세포와 1:5 비로 4시간 동안 공동-배양한 후 유세포분석으로 분석하였다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다. 유의수준 분석을 위해 양측 독립표본 스튜던츠 t-검정을 사용하였다. * = p<0.05.
도 5는 GMP-를 준수하는 CAR-T 세포 제조 방법의 개발을 도시한다. A. CAR-T 세포 제조를 위한 시간 과정. 인간 PBMC는 CAR의 레트로바이러스 형질도입 전에 플라스크 내 CD3/CD28 Dynabeads 및 IL7/IL15에 의해 활성화된다. 형질도입된 세포를 형질도입 2일 후 G-Rex 플레이트(평방 미터당 1x106)로 옮긴다. 사이토카인이 12일차까지 2 내지 3일마다 보충된다. B. 제조 과정 중 세포 확대. 12일차에 CAR 형질도입 비(C) 및 분화 상태(D)의 전형적인 흐름도. E. T 세포 분화의 통계. CM, 중심 기억; EM, 효과기 기억. 각 샘플을 3회 반복하여 수행하였다. 각 샘플을 3회 반복하여 수행하였다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다. 데이터는 4명의 건강한 개인의 전형적인 결과를 반영한다.
도 6은 CARTVb7.1의 생성 및 기능 검증을 도시한다. A. 형질도입된 T 세포를 항-EGFR 항체로 염색하여 CAR 발현을 검출하였다. 세포는 CD3+ 단일 림프구에서 증식되었으며, 숫자는 tEGFR+ 세포의 백분율을 나타낸다. B. CAR 형질도입 후 5일차에 내인성 TCRVb7.1+ 집단 검출. C. TCRVb7.1+ 1차 ATL 샘플을 CFSE로 염색하고 다양한 수의 효과기 CAR-T 세포와 혼합하였다. 6시간 배양 후, 세포를 수집하고 DAPI, 3G5 및 CD3 항체로 15분 동안 염색하였다. 고정된 용량의 5 uL Countbright 비드를 각 샘플에 추가하였다. 절대 정량화를 위해 샘플을 유세포분석기에 로딩하였다. D. T 종양 세포를 사멸하는 CARTVb7.1 세포의 전형적인 결과. 각 샘플을 3회 반복하여 수행하였다.
도 7은 MAIT-CART 세포의 생성을 도시한다. A. MAIT 세포 염색의 전형적인 유세포분석 예. PBMC를 BV421 MR1-5-OP-RU 사량체 및 PE 항-TCR Vα7.2 항체로 20분 동안 염색하였다. 세포를 유세포분석에 의해 특성화하기 전에 PBS로 2회 세척하였다. B. MAIT 세포의 유세포분석 분류를 위한 게이팅 전략. TCR Vα7.2+ 세포를 BV421 MR1-5-OP-RU 사량체 및 PE 항-CD3 항체에 의해 20분 동안 염색하기 전에 PBMC로부터 자기 분리 방법에 의해 단리하였다. 세포를 PBS에 의해 2회 세척 한 후에 Melody 세포 분류기에 로딩하였다 MR1-5-OP-RU 사량체 양성 집단을 분류하고 배양하였다. C. 시험관내 배양된 MAIT 세포 및 대조용으로서 CD8+ T 세포의 확대 곡선. D. 12-14일 배양 후, 확대된 MAIT 세포의 90% 초과가 MR1-5-OP-RU 사량체 특이적이었다. E. CAR 형질도입된 CD8+ T 세포 및 MAIT 세포를 항-EGFR 유동 항체에 의해 염색하여 형질도입 효율을 검출하였다.
도 8은 확대된 MAIT 및 CD8 T 세포를 0:1, 1:1, 3:1 및 5:1의 E:T 비로 CFSE-염색된 CD4+ 세포주 CEMss와 공동-배양하였음을 도시한다. 배양 20시간 후에 공동-배양 시스템을 수확하였다. 생존한 종양 세포의 절대량을 유세포분석을 통해 Countbright 비드를 사용하여 계산하였다. (A) 3:1 E:T 조건의 유세포분석 도면. (B) 세포독성의 통계 결과. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다.
도 9는 MAIT 세포를 형질도입하는데 사용된 발현 벡터 "CART4"의 첫 번째 구현예를 도시하는 지도이다.
도 10은 MAIT 세포를 형질도입하는데 사용된 발현 벡터 "CARTVb7.1"의 두 번째 구현예를 도시하는 지도이다.
도 11은 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)로부터 인간 MAIT 세포의 검출을 도시한다. 림프구를 게이팅하고 MAIT 세포를 CD3의 발현 및 5-OP-RU/MR1 사량체와의 반응성(A) 또는 CD161 및 TCRVα7.2의 발현(B)에 의해 식별하였다.
도 12는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)로부터 인간 MAIT 세포를 단리한 것을 도시한다. Vα7.2 발현에 의해 자기 비드를 통해 분리한 후, Vα 7.2-양성 세포 집단이 2.2%(A)에서 >97%로 농축되었다. MAIT 세포는 5-OP-RU/MR1 사량체와의 반응성에 의해 분류되었다(B).
도 13은 CAR-MAIT 세포의 생성을 도시한다. 12-14일 배양 후, 확대된 MAIT 세포의 90% 초과가 MR1-5-OP-RU 사량체 특이적이었다(A). CAR 형질도입된 CD8+ T 세포 및 MAIT 세포를 항-EGFR 유동 항체로 염색하여 형질도입 효율을 검출하였다(B).
도 14는 CAR-MAIT4 세포가 생체내에서 효율적으로 항-백혈병 기능을 나타냄을 도시한다. A. NSG 면역결핍 마우스에게 1x106 Gluc/GFP-형질도입된 CEM-ss 세포를 정맥내 주사 한 후, 4x106 CAR-형질도입 세포를 추가로 정맥내 주입하였다. 종양 주사 후 45일까지 생물발광 영상화를 주당 2회 수행하였다. B. Kaplan-Meier 생존 분석에 의해 지시된 CAR-형질도입 세포로 처리된 마우스의 전체 생존. C. 종양 주사 후 40일차에 마우스의 생물발광 영상화(BLI). D. 40일차의 개별 마우스의 휘도. n = 그룹당 5 또는 6마리의 마우스. *스튜던츠 t-검정에 의한 P<0.05. Ph, 광자; sr, 스테라디안.
도 15는 PBMC에서 MAIT 세포의 농축을 도시한다. PBMC는 6일 동안 표에 표시된 대로 상이한 사이토카인의 존재 하에 1:1의 비드 대 세포 비의 MR1/5-OP-RU 복합 비드 또는 10 nM의 5-OP-RU 항원에 의해 자극되었다. MAIT 세포 증가 배수는 6일차의 살아있는 MAIT(CD3+ Va7.2+ CD161+) 세포의 빈도를 0일차의 MAIT 세포의 원래 빈도로 나누어 계산하였다. 상위 5개 그룹은 주황색으로 강조 표시되었다(즉, 조건 1, 3, 11, 12 및 13). IL-12 , IL-18 및 IL-23의 조합은 PBMC에서 MAIT 세포의 가장 높은 증가 배수를 제공한다.
실시예
키메라 항원 수용체(CAR)-기반 T 세포 치료법은 범-B 세포 특이적 항원을 표적화함으로써 B-세포 악성종양 치료에 큰 성공을 거두었다. 그러나 T-세포 림프종에 대한 유사한 전략은 B-세포 악성종양과 비교하여 T-림프종에서 전체 T 세포 고갈 및 정상 T 세포의 기능 장애/낮은 빈도로 인한 잠재적인 심각한 독성으로 인해 지금까지 실현되지 않았다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 발명자는 2개의 신규의 CAR 작제물을 조작했는데, 첫 번째는 본원에서 "CART4"(이는 범-T 세포 마커(CD4)에 특이적이다)로 지칭되고, 두 번째는 "CARTVb7.1"(이는 TCR-Vb 아이소타입 쇄에 특이적이다)로 지칭된다. 두 CAR 작제물 모두 절두된 표피 성장 인자 수용체(tEGFR) 및 유도성 카스파제-9(iC9)로부터 선택된 하나 또는 2개의 안전 스위치를 포함한다. 그러나, 도 1에 예시된 것처럼 두 안전 스위치가 모두 도시되어 있다. 발명자는 낮은 동종이계 반응성을 갖는 점막 관련 불변 T(MAIT) 세포가 CAR 작제물로 형질도입된 후 기존 T 세포와 유사한 항종양 사멸 활성을 나타낼지 여부를 조사하였다.
또한, MAIT 세포는 MHC 부류 I-유사 분자인 MR1을 인식하는 CD3+ TCRVa7.2+ CD161+ 세포로 정의되는 선천성 T 세포의 서브세트인 것으로 공지되어 있다. 이전 연구에서는 MAIT 세포가 시험관 내에서 확대될 수 있지만 동종이계 영양 세포의 존재가 필요하다는 것을 보여 주었으나, 이 방법은 대규모 생산 및 품질 관리가 어렵다. 본 연구에서, 발명자는 처음에 최대 6일 동안 시험관 내 배양에서 다양한 사이토카인(IL-2, IL-7, IL-15, IL-12, IL-18 및 IL-23)의 조합의 존재 하에, 항원(5-OP-RU) 로딩된 MR1 사량체 비드 또는 5-OP-RU 단독으로 PBMC를 자극함으로써 시험관 내에서 MAIT 세포를 확대하는 효과적인 방법을 개발하였다. 이어서, 생성된 MAIT 세포를 MACS 또는 FACS 분류에 의해 단리하고 선행 실시예에서 기재된 바와 같이, CAR-기반 치료법을 위해 항-CD3/CD28 비드에 의해 추가로 확대하였다.
물질 및 방법
CAR 플라스미드의 작제
Hu5A8 및 Leu16의 scFv 및 인간 Igκ 선도 서열을 암호화하는 DNA 단편이 Genewiz에 의해 합성되었다. NcoI 및 NotI를 사용하여 이들 단편뿐만 아니라 MSCV CAR 발현 레트로바이러스 벡터를 절단하였다. MSCV CAR 발현 벡터를, IRES-GFP 영역을 인간 CD8 막관통 도메인 및 3세대 CAR 세포내 신호전달 도메인(CD28 및 4-1BB의 공동자극 도메인, CD3ζ 신호전달 도메인)으로 대체함으로써 MSCV-IRES-GFP 벡터(Addgene)로부터 변형시켰다. tEGFR의 서열은 US 8802347B2에서 수득하였으며, 인간 EGFR 단백질의 세포외 부분과 세포내 도메인의 도메인 I 및 II가 결실되었다. tEGFR은 자가-절단 T2A 서열과 인간 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF) 수용체의 리더 펩티드를 사용하여 Genewiz에 의해 합성되었다. iC9의 DNA 서열은 Lishan Su 교수(노쓰 캘리포니아 대학, Chapel Hill)가 친절하게 제공하였다. iC9의 DNA 단편은 짧은 Gly-Gly-Gly-Ser(GGGS) 유연한 링커를 통해 하나의 12-kDa 인간 FK506 결합 단백질(FKBP12)에 연결된 크고 작은 카스파제 분자 서브유닛을 포함하여 절두된 카스파제 9로 이루어진다.
레트로바이러스 벡터의 생성
Plat-GP 세포(Cellbiolabs)를 7 ul의 X-tremeGENE HP 형질감염 시약(Roche)을 통해 MSCV-레트로바이러스 플라스미드 및 pCMV-VSVG 벡터(Addgene)로 형질감염시켜 VSV 외피를 갖는 바이러스를 생성시켰다. 높은 역가의 CAR-암호화 레트로바이러스 상등액을 생성하기 위해, PG-13(ATCC)을 사용하여 후속적으로 안정한 바이러스 생산 세포주를 수행하였다. PG-13 세포를 8 ug/㎖ 폴리브렌(Sigma)을 함유하는 Plat-GP의 바이러스 상등액에 의해 형질도입하였다. 플레이트를 클링-필름으로 감싸고 1000 g, 32℃에서 2시간 동안 원심분리하였다. 높은 역가의 바이러스 입자를 생성하기 위해, 합류 세포를 트립신처리에 의해 둘 중 하나로 계대한다. 24시간 후 상등액을 수집한다. 배지를 분액하고 300 g에서 5분간 원심분리한 후 -80℃에서 보관한다.
1차 T 세포 및 종양 세포
CAR-T 세포 조작을 위해 건강한 공여자의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 Ficoll-Paque PLUS 밀도 구배 원심분리(GE Healthcare)에 의해 단리하였다. ATL 또는 CTCL 환자로부터 생성된 T 림프종 세포주를 D10 배지(10% 소 태아 혈청, 100 IU/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 및 2 mM L-글루타민을 함유하는 DMEM)에서 배양하고, T 백혈병 세포주(Jurket 또는 CEM)를 R10 배지(10% 소 태아 혈청, 100 IU/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 및 2 mM L-글루타민을 함유하는 RPMI 1640)에서 유지시켰다.
MAIT 세포의 단리 및 확대
MAIT 세포를 항-인간 TCR Vα7.2 항체(Biolegend, Cat# 351724) MicroBeads(Miltenyi, Cat# 130-090-485)에 이어서 Jim McCluskey 교수(호주 멜버른 대학)가 친절하게 제공한 BV421 MR1-5-OP-RU 사량체를 사용하는 2단계 방법에 의해 건강한 PBMC로부터 단리하였다. 간략하게, TCR Vα7.2+ T 세포를 제조 절차(Miltenyi)에 따라 비오틴화된 항-인간 TCR Vα7.2 항체 및 항-비오틴 MicroBeads 키트를 사용하여 PBMC로부터 단리하였다. 이어서 MAIT 세포를, BV421 MR1-5-OP-RU 사량체를 염색하고 FACSMelody 세포 분류기(BD)를 사용하여 FACS 분류에 의해 TCR Vα7.2+ T 세포로부터 단리하였다.
MAIT 세포를 2단계 방법에 의해 PBMC로부터 분리하였다. PBMC 세포를 카운트하고 15 ㎖ 튜브의 PBS/EDTA 완충액에서 1 x 108 세포/㎖로 희석한다. 108 세포당 비오틴 항-인간 TCR Vα7.2 항체(Biolegend, Cat# 351724) 5 ㎕를 추가하고 4℃에서 20분 동안 배양한다. 10배 부피의 PBS/EDTA 완충액을 첨가하여 세포를 세척하고 300xg에서 10분간 원심분리한다. 상등액을 완전히 흡인한다. 총 108 세포당 PBS/EDTA 완충액 800 ㎕ 및 항-비오틴 마이크로비드(Miltenyi, Cat# 130-090-485) 200 ㎕를 추가한다. 잘 혼합하고 4℃에서 15분 동안 배양한다. 10배 부피의 PBS/EDTA 완충액을 첨가하여 세포를 세척하고 300xg에서 10분간 원심분리한다. 상등액을 완전히 흡인한다. PBS/EDTA 완충액 1 ㎖에 최대 108 세포를 재현탁한다. 적합한 MACS 분리기의 자기장에 MS 컬럼(Miltenyi)을 놓는다. 500 ㎕의 PBS/EDTA 완충액으로 세정하여 컬럼을 준비한다. 컬럼에 세포 현탁액을 적용한다. 3 x 500 ㎕의 PBS/EDTA 완충액으로 컬럼을 세척한다. PBS/EDTA 완충액 1 ㎖를 추가하여 자기장 외부에 유지된 세포를 용출시킨다. TCR Vα7.2+ 세포를 수집하고 APC 항-인간 CD3(Biolegend) 및 BV421 MR1-5-OP-RU 사량체(1:500)로 4℃에서 30분 동안 염색한다. 10배 부피의 PBS/EDTA 완충액을 첨가하여 세포를 세척하고 300xg에서 10분간 원심분리한다. 상등액을 완전히 흡인한다. 총 108 세포당 PBS/EDTA 완충액 1 ㎖를 추가한다. FACSMelody 세포 분류기(BD)에 의해 CD3+ MR1-5-OP-RU+ 세포 집단을 유식 분류한다.
MAIT 세포의 활성화 및 확대
분류된 MAIT 세포를 카운트하고 R10 배지(90% RPMI+10% FBS+1% 페니실린/스트렙토마이신+ 2 mM L-글루타민)에서 106/㎖까지 재현탁한다. Dynabeads 인간 T-활성화제 CD3/CD28(Life Technologies)로 세포를 활성화하여 37℃ 배양기의 24웰 플레이트에서 100 IU/㎖ IL-2를 사용하여 1:1의 비드 대 세포 비를 획득한다. 형질도입 2일 후, 세포를 수확하고 세포를 6웰 플레이트로 옮긴다. R10을 0.5-1 x 106/㎖로 리프레쉬한다. 2-3일마다 R10 배지로 세포를 리프레쉬한다.
CAR-T 또는 CAR-MAIT 세포의 생성
정제된 PBMC 또는 MAIT 세포를 100 IU/㎖ IL-2를 함유한 R10 배지에서 Dynabeads 인간 T-활성화제 CD3/CD28(Life Technologies)을 사용하여 48시간 동안 자극하였다. 이어서 활성화된 세포를, CAR 작제물을 암호화하는 레트로바이러스 바이러스로 형질감염시키고 추가로 48시간 동안 R10에서 배양하였다. CAR-T 또는 CAR-MAIT 세포를 수확 전 추가 7일 동안 재조합 IL7 및 IL15(Miltenyi)의 존재 하에 G-Rex 6웰 플레이트(Wilsonwolf)에서 유지시켰다.
CAR-T 또는 CAR-MAIT 세포의 생성
레트로바이러스 형질도입을 T-세포 활성화 48시간 후에 수행하였다. 필요한 경우 24시간 후에 더 높은 형질도입 효율을 달성하기 위해 형질도입 단계를 반복한다. 10x106 세포를 옮겨 110 ㎖ R10 배지가 있는 G-Rex 6웰 플레이트(Wilsonwolf)에서 추가로 배양하였다. 사이토카인 IL7/15를 2 내지 3일마다 보충하였다. 세포를 수확 전 1주일 동안 G-Rex에서 배양하였다.
공동-배양 세포독성 분석
이 비-방사성 사멸 분석을 이전에 보고된 대로 수행하였다(Rowan et al., 2014). 간략하게, 표적 세포를 1 uM CFSE(Biolegend)로 37℃에서 15분간 염색하였다. PBS로 3회 세척한 후 100,000개의 표적 세포를 CAR-T 또는 CAR-MAIT 세포와 1:1, 1:3, 1:5 비로 혼합하였다. 200 ul의 공동-배양물을 37℃ 배양기에서 4시간 동안 배양하였다. 1 ul DAPI 및 5 ul Countbright 비드(BD Biosciences)를 샘플에 첨가하였다. 샘플을 일정한 속도로 유세포분석에 의해 획득하였다. 생존한 표적 세포의 수를 튜브 내 세포 = (수집된 세포/수집된 비드) x 튜브에 추가된 총 비드로 계산하였다.
세포내 사이토카인 염색
CART4 또는 CART20 T 세포를 96-웰 U 바닥 플레이트에서 명시된 표적 세포와 함께 공동-배양하였다. 모든 세포를 200 uL/웰 R10 배지에 2x105 세포/웰로 접종하였다. 단독으로 배양된 T 세포는 음성 대조군으로, 10 ug/㎖ PMA 및 10 ug/㎖ 이오노마이신(Biolegend)의 복합 자극으로 배양된 T 세포는 양성 대조군으로 포함되었다. 10 ug/㎖ 브레펠딘 A(Biolegend)를 1시간 배양 후 모든 웰에 첨가하였다. 공동-배양 시스템을 수확하기 전에 추가로 5시간 동안 배양하였다. 암실에서 30분 동안 항체를 사용하여 표면 마커에 대해 세포를 염색하였다. 세포를 PBS로 세척한 후 4% 파라포름알데히드 용액(Biolegend)을 사용하여 실온에서 15분간 고정시켰다. 고정 완충액으로 다시 세척한 후, 세포내 염색 항체를 함유한 혼합물로 세포를 재현탁시켰다. 고정 완충액으로 세척하기 전에 세포를 4℃에서 30분간 배양한다. IFN-γ 및 TNF-α의 발현 수준을 결정하기 위해, 형광 마이너스 1(FMO) 대조군을 사용하여 유세포분석에 의해 분석하였다.
시험관내 자살 분석
iC9 세포가 있거나 없는 CART4를, CART4 또는 iC9 작제물이 없는 CART4를 사용한 레트로바이러스 형질도입을 통해 생성시켰다. 형질도입 후 CAR-T 세포를 5 내지 7일 동안 확대된 상태로 유지시켰다. 카스파제 유도성 약물(CID)인 B/B 동종이량화제 AP20187(Clontech Laboratories)을 T 세포 배양물에 다양한 농도로 첨가하였다. CID에 의해 유도된 아팝토시스의 유도를 24시간 후에 아넥신-v/7-AAD(BD Biosciences) 염색 및 유세포분석을 사용하여 평가하였다. 생존 세포를, 비드(BD Biosciences)를 카운트하여 정량화하였다. 생존 지수를 하기와 같이 계산하였다: 살아있는 tEGFR+ 세포의 수/처리되지 않은 대조용 샘플 중의 살아 있는 tEGFR+ 세포의 수.
생체내 마우스 이종이식 실험
6- 내지 8-주령 NRG 마우스(Jackson Laboratory)를 T 백혈병 세포주를 이용한 생체내 실험에 사용하였다. 가우시아(Gaussia) 루시페라제 및 EGFP를 공동-발현하는 0.5 x106 CEM-ss 세포를 역-궤도를 통해 마우스에 주사하였다. T 세포 주사 전에 마우스를 무작위로 분류하였다. 건강한 공여자의 PBMC를 활성화하고 형질도입하여 CART4 T 세포 또는 형질도입되지 않은 T 세포를 생성시켰다. 주입 당일, CART4 CD8+ T 세포 및 형질도입되지 않은 CD8+ T 세포를 제조사의 지침에 따라 본래 그대로의 마이크로비드 인간 CD8 T 세포 키트(Miltenyi)를 사용하여 CART4 T 세포 또는 형질도입되지 않은 T 세포로부터 음으로 단리하였다. 4 x 106 개의 단리된 세포를 PBS에 의해 2회 세척하고 100 ul에 재현탁한 다음 안와후 주사를 통해 이종이식된 마우스에 주입하였다. 30-50 ul의 말초 혈액을 꼬리 정맥을 통해 매주 채혈하였다. 500 g에서 5분간 원심분리한 후 혈장을 분리하여 제조사의 장비(Thermo Fisher Scientific)에 따라 루시페라제 활성을 검출하였다. 적혈구 용해 후, 인간 CD45, 마우스 CD45, 인간 CD3, 인간 CD8, 인간 EGFR 및 살아 있는/죽은 염료를 함유하는, 표면 마커 염색을 위한 100 ul 항체 마스터 믹스로 세포를 재현탁시켰다. 세포 서브세트 조성을 유세포분석기(BD AriaIII)를 사용하여 분석하였다. 기재된 연구 전체를 통해 마우스를 면밀히 모니터링하였다. 초기 체중의 20% 이상 감소, 뚜렷한 무기력, 구부정한 자세, 심한 설사 또는 심한 피부염 등의 증상 중 하나를 나타내는 경우 마우스를 안락사시켰다.
통계 분석
GraphPad Prism 소프트웨어 버전 6.0(GraphPad 소프트웨어)을 사용하여 통계 분석을 수행하였다. 양측 독립표본 스튜던츠 t-검정을 사용하여 두 그룹 간의 데이터를 비교하였다. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001. 오차 막대가 있는 모든 데이터는 평균값 ± 평균의 표준 오차(SEM)로 표시된다. 0.05 미만의 P 값은 유의수준으로 간주되었다. GraphPad Prism 소프트웨어(버전 8)를 사용하여 데이터를 분석하였다.
1. 상세한 방법
1.1. MAIT 세포의 검출
1.1.1. 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 제조
1.1.1.1. 자원 공여자의 말초 혈액 5 ㎖를 헤파린 처리된 튜브로 옮긴다.
1.1.1.2. 동일한 부피의 PBS로 전혈을 희석한다.
1.1.1.3. Histopaque-1077 5 ㎖를 15 ㎖ 원심분리 튜브에 넣는다. 희석된 혈액 용액 10 ㎖를 튜브 벽을 따라 조심스럽게 Histopaque-1077에 첨가하며; 액체 계면을 파괴시키지 않는다.
1.1.1.4. 실온에서 400 x g로 30분 동안 원심분리한다.
참고: 원심 분리기의 브레이크 및 가속이 가장 낮은 설정인지 확인하며, 급제동 및 가속은 층 분리에 영향을 미칠 수 있다.
1.1.1.5. 원심분리 후 단핵 세포가 포함된 불투명 계면의 0.5 ㎝ 이내까지 파스퇴르 피펫으로 상부 층을 조심스럽게 흡인한다. 상부층을 버린다.
1.1.1.6. 수확된 PBMC를 10분 동안 250 x g에서 원심분리하여 PBS 10 ㎖로 2회 세척한다.
1.1.1.7. RPMI1640 배양 배지로 PBMC 펠릿을 재현탁한다.
1.1.2. BV421-표지된 5-OP-RU/MR1-사량체의 제조
1.1.2.1. 6.8 ㎕의 스트렙트아비딘-BV421을 0.5 ㎎/㎖에서 10.2 ㎕ PBS로 희석하고 충분히 혼합한다.
1.1.2.2. 스트렙트아비딘-BV421 용액(1.7 ㎕)의 1/10을 10분마다 18 ㎕ MR1-5-OP-RU 용액(5 ㎍)에 추가하고 피펫을 사용하여 혼합하고 단계 사이에 암실에서 실온에서 배양한다.
1.1.2.3. BV421-표지 5-OP-RU/MR1 용액을 4℃로 유지한다.
사량체는 사용을 위해 적정되어야 하며; 전형적으로 1:500 희석이면 충분하다.
1.1.3. 유세포분석에 의한 인간 MAIT 세포 검출
인간 MAIT 세포를 5-OP-RU가 로딩된 MR1 사량체에 의해 또는 CD161 및 TCR Vα7.2 쇄에 대한 항체로 공동-염색함으로써 유세포분석으로 검출할 수 있다. 일반적으로 MAIT 세포는 CD3+ T 세포 중 말초혈액에 0.1-10% 정도 존재한다.
1.1.3.1. 100 ㎕ FACS 염색 완충액당 1 x 106 세포의 농도로 PBMC를 재현탁한다.
1.1.3.2. 샘플에 FACS 항체 및/또는 5-OP-RU/MR1 사량체를 추가한다.
인간 MAIT 세포를 검출하기 위해 2개의 방법을 사용할 수 있다:
a) 사량체 염색: BV421-표지된 인간 5-OP-RU MR1 사량체(1:500) 및 APC-H7-접합된 항-인간 CD3(1:200)을 사용한다.
b) 치환 표시: PE-접합된 항-인간 TCR Va7.2(1:200), APC-H7-접합된 항-인간 CD3(1:200) 및 FITC-접합된 항-인간 CD161(1:200).
1.1.3.3. 암실에서 4℃에서 30분 동안 배양한다.
1.1.3.4. 4℃에서 5분 동안 300 x g에서 원심분리하여 FACS 염색 완충액으로 세포를 세척하고 300 ㎕ FACS 염색 완충액으로 재현탁한다.
1.1.3.5. 유세포분석에 의해 MAIT 세포를 분석한다(도 11 참조).
1.2. MAIT 세포의 단리
1.2.1. Vα7.2+ 세포의 자기 비드 분리.
1.2.1.1. PBMC를 수집하고 결합 완충액으로 세포를 세척한다. 상등액을 버리고 1 x 107/100 ㎕의 농도의 MACS 완충액으로 세포 펠릿을 재현탁한다. PE 항-인간 TCR Vα7.2 항체(1:100)를 추가한다. 균일하게 혼합하고 얼음 위에서 30분 동안 배양한다.
1.2.1.2. 300 x g에서 5분 동안 원심분리하여 MACS 완충액으로 세포를 1회 세척한다.
1.2.1.3. 세포를 MACS 완충액으로 107/80 ㎕의 농도로 재현탁한다. 107 세포당 항-PE 마이크로비드 20 ㎕를 추가하고, 얼음 위에서 20분 동안 배양한다.
1.2.1.4. 10배 부피의 MACS 완충액으로 세포를 1회 세척한다. 300 x g에서 5분간 원심분리한다. 1 ㎖ MACS 완충액에 재현탁한다.
1.2.1.5. MS 컬럼을 1 ㎖ MACS 완충액으로 미리 세척하고 자석에 조립한다. 세포를 컬럼에 적용하고 매번 1 ㎖ MACS 완충액으로 컬럼을 3회 세척한다.
1.2.1.6. 자석에서 컬럼을 제거하고 1 ㎖ MACS 완충액에 결합된 세포를 용출시킨다.
1.2.2. MAIT 세포의 유식 분류
1.2.2.1. 자석 분리된 세포를 수집하고 300 x g에서 5분 동안 원심분리한다.
1.2.2.2. 세포를 MACS 완충액으로 107/100 ㎕의 농도로 재현탁한다. BV421-표지된 인간 5-OP-RU MR1 사량체(1:500) 및 APC-H7-접합된 항-인간 CD3(1:200)을 추가한다. 얼음 위에서 20분 동안 배양한다.
1.2.2.3. 세포를 10배 부피의 MACS 완충액으로 1회 세척한다. 300 x g에서 5분간 원심분리한다. 2 ㎖ MACS 완충액에 재현탁한다.
1.2.2.4. BD Prodigy 분류기를 켜고 세포 샘플을 로딩한다. CD3+ 사량체+ 세포 집단을 분류한다(도 12 참조).
1.3. MAIT 세포의 활성화
1.3.1. 분류된 MAIT 세포를 수집하고 300 x g에서 5분 동안 원심분리한다.
1.3.2. 상등액을 버리고 R10 배지에 106 세포/㎖로 재현탁한다.
1.3.3. Dynabeads 인간 T-활성화제 CD3/CD28을 30초 동안 볼텍스에 의해 재현탁한다.
1.3.4. 원하는 부피의 Dynabeads를 튜브로 옮긴다.
1.3.5. 동일한 부피의 완충액을 추가하고 5초 동안 볼텍스에 의해 혼합한다. 튜브를 자석 위에 1분 동안 놓고 상등액을 버린다.
1.3.6. 자석에서 튜브를 제거하고 세척된 Dynabeads를 R10 배지에 재현탁한다.
1.3.7. 원하는 부피의 Dynabeads를 세포 현탁액에 첨가하여 37℃ 배양기의 24웰 플레이트에서 100 IU/㎖ IL-2를 사용하여 1:1의 비드 대 세포 비를 획득한다.
1.4. MAIT 세포의 레트로바이러스 형질도입
1.4.1. MAIT 세포 활성화 48시간 후에 레트로바이러스 형질도입을 수행하였다.
1.4.2. 형질도입 하루 전에 RetroNectin 코팅된 플레이트를 제조한다. 15 ㎍ RetroNectin을 1 ㎖ PBS에 추가한다. 충분히 혼합 후 비-조직 배양물 처리된 24웰 플레이트의 한 웰에 추가한다.
1.4.3. 접시를 플링-필름으로 싸서 4℃ 냉장고에 밤새 보관한다.
1.4.4. 유전자 전달 당일, 웰에서 결합되지 않은 RetroNectin을 제거한다. 2 ㎖의 PBS로 2회 세척한다. 웰 건조를 피한다.
1.4.5. 37℃ 수욕에서 레트로바이러스 상등액을 해동한다. RetroNectin이 코팅된 플레이트의 각 웰에 바이러스 상등액 1 ㎖를 옮긴다.
1.4.6. 플링-필름으로 플레이트를 감싸고 1000 x g, 32℃에서 2시간 동안 플레이트를 원심분리한다.
1.4.7. 원심분리 중에 활성화된 MAIT 세포를 수집한다. 100 IU/㎖ IL-2를 함유한 신선한 R10 배지로 세포를 1 x 106/㎖의 농도로 재현탁한다.
1.4.8. 회전이 끝나면, 플레이트로부터 상등액을 버린다. 각 웰에 세포 현탁액 1 ㎖를 추가한다.
1.4.9. 플레이트를 500 x g에서 10분 동안 원심분리한다.
1.4.10. 플레이트를 37℃ 배양기에 다시 넣는다.
1.4.11. 필요한 경우, 더 높은 형질도입 효율을 달성하기 위해 형질도입 단계를 반복한다.
참고: 형질도입 효율은 유세포분석을 통해 형질도입 48시간 후에 검출할 수 있다.
1.5 CAR-MAIT 세포의 확대
1.5.1. 레트로바이러스 형질도입 2일 후, 세포를 수확하고 혈구계로 세포를 카운트한다.
1.5.2. 1 x 107 세포를 Grex6M 웰 플레이트 중 하나의 웰로 옮긴다. 100 IU/㎖ IL-2를 함유한 신선한 R10 배지 130 ㎖를 추가하고 플레이트를 배양기에 다시 넣는다.
1.5.3. 3일마다 IL-2를 최종 농도 100 IU/㎖로 리프레쉬한다.
1.5.4. CAR-MAIT 세포를 8-12일 배양 후에 수확할 수 있다(도 13 참조).
참고: 확대된 CAR-MAIT 세포를 표현형 시험, 기능 분석에 사용하거나 액체 질소에서 동결시킬 수 있다.
결과
실시예 1 - CD4-표적화 T 세포 및 TCR V베타 7.1-표적화 T 세포의 생성
도 1A(1) 및 (2)를 참조하면, 본 발명에 따른 CAR 작제물의 2개의 상이한 구현예에 포함된 기능적 요소를 예시하는 도식적 지도가 도시되어 있다.
각각의 구현예에서, 작제물은 상류 및 하류의 긴 말단 반복부(LTR)가 측면에 위치한다. 5' 프로모터는 5' LTR의 하류에 배치되며 PGK 프로모터일 수 있다. 프로모터의 3' 위치에는 융합 단백질을 T 세포 외막으로 유도하기 위한 Igκ 신호전달 펩티드인 SP가 있다. SP의 3'에는 상류 VL(가변 경쇄) 서열, 중심 G4S 서열 및 하류 VH(가변 중쇄) 서열을 포함하는 scFv 영역이 제공된다. VL 및 VH 서열은 한 구현예에서 (도 1A(1)에 도시된 바와 같이) CD4 항원 결합을 위한 Hu5A8 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역 일 수 있다. 다른 구현예 (도 1A(2)에 도시됨)에서, VL 및 VH 서열은 TCR-Vb7.1 결합을 위한 3G5 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역일 수 있다.
scFv 영역의 3'에, CAR 디스플레이 및 고정을 위한 CD8a 힌지 및 막관통(TM) 도메인 구조 도메인이 존재한다. 힌지와 TM의 3'에는 세포내 신호전달 경로를 촉발하기 위한 CD28, 4-1BB 및 CD3ζ 쇄의 신호전달 도메인을 포함한 세포내 도메인이 존재한다. P2A 자가-절단 펩티드가, 추적을 위해 제1 안전 스위치 역할을 하도록 ζ 쇄의 3' 및 절두된 버전의 EGFR(EGFRt)의 5'에 배치된다. 두 번째 P2A-자가절단 펩티드는 EGFRt의 3' 및 유도성 카스파제-9(iC9)(제2 안전 스위치 역할을 한다)의 5'에 배치된다. 작제물은 발현을 향상시키는 우드척 간염 조절 요소(WPRE)(도 9 및 10 플라스미드 참조) 및 최종적으로 말단 3' LTR을 포함한다.
인간 CD4에 대한 면역특이성을 갖는 마우스 IgG 항체 인간화된 5A8(Hu5A8)의 DNA 서열이 CN103282385에서 발견되었다. TNX-355 또는 이발리주맙으로도 공지된 Hu5A8은 CD4 분자의 HIV 결합 부위를 차단하여 HIV 진입을 억제하는 것에 대해 1상 및 2상 임상 시험에서 광범위하게 평가되었다. 대조군으로서 항-CD20 단클론 항체(Leu16)의 VH 쇄 및 VL 쇄가 또한 합성되었으며, 이는 전임상 및 임상 CAR-T 연구에서 효능이 평가되었다. scFv 단편이 CD8 막관통 도메인, CD28 엔도도메인, 4-1BB 엔도도메인 및 CD3 ζ 쇄와 함께 3세대 CAR 플라스미드의 주쇄에 프레임 내 클로닝되었다. 1세대 및 2세대 CAR에 비해 우수성이 입증된 연구로 인해 3세대 CAR이 사용되었다. tEGFR의 유용성이 조작된 CAR-T 세포의 절제를 위한, 선택, 생체 내 추적 마커 및 제1 안전 스위치로서 검사되었다. 따라서, 이 잔여 tEGFR 서열은 T2A-리보솜 스킵 서열에 의해 CAR 서열과 연결되었다.
CAR-T 세포는 항-CD19 및 항-HIV CAR 시험의 경우처럼 때때로 수십 년 정도로 오래 환자에게 남아 있을 수 있다. B 세포 무형성증(B-cell aplasia)과 달리, 장기간의 CD4+ T 세포 무형성증은 생명을 위협한다. 따라서 종양 또는 바이러스 고갈 후 또는 CAR-T 치료 중 심각한 부작용으로 인한 응급 상황인 경우 환자로부터 본 발명의 CART4 세포를 제거하기 위한 안전성 방법의 확립이 필요하다. 이량체화 약물 유발 카스파제-9(iC9) 자살 스위치는 인간 카스파제-9와 돌연변이 인간 FK506 결합 단백질(FKBP)의 융합을 기반으로 하며, 이는 작은 화학 분자 약물인 AP20187(카스파제 유도성 약물(CID)로서 지칭된다)의 존재 하에서 조건부 이량체화를 허용한다. iC9의 사용은 이미 반일치(haploidentical) HSC 이식에 대한 임상 시험에서 안전하고 효과적인 것으로 입증되었다. 따라서, CD4 CAR, tEGFR 및 iC9를 포함하는 유전자 단편을 합성하고(도 1A.1) 레트로바이러스 MSCV(쥐 줄기 세포 바이러스) 벡터(도 9에 도시됨, 10,348 bp)에 삽입하였다. 또한, 이어서 TCR V베타7.1 CAR, tEGFR 및 iC9를 함유하는 유전자 단편을 합성하고(도 1A.2) 레트로바이러스 MSCV(쥐 줄기 세포 바이러스) 벡터(도 10에 표시됨, 10,347 bp)에 삽입하였다.
CAR 및 tEGFR의 공동 발현을 입증하기 위해, 인간 PBMC를 Dynabeads 인간 T-활성화제로 활성화하고 도 9 및 10에 도시된 플라스미드의 레트로바이러스 형질도입을 통해 유전자 조작하여 CAR/tEGFR/iC9 유전자 작제물을 발현하였다. 실제로, CAR 및 tEGFR의 발현 수준은, EGFR-특이적 항체와 함께 마우스 scFv-특이적 항-마우스 IgG F(ab')2 항체로 표면 염색 시 이중 양성 세포 집단의 검출에 의해 나타난 바와 같이 밀접한 상관관계가 있는 것으로 밝혀졌다(도 1B). T 세포 확대와 함께, tEGFR+ 세포 집단은 전체 세포의 ~50%를 차지하는 비율을 유지하였다(도 1C).
시험관 내에서 iC9 안전 스위치의 효율을 평가하기 위해, iC9 유전자가 없는 CART4 변이(iC9가 없는 CART4)를 대조군으로 클로닝하였다. iC9 작제물 없는 CART4 또는 CART4로 형질도입된 T 세포를 24시간 동안 증가하는 농도의 CID AP20187(0.1 nM 내지 100 nM)에 노출시켰다. 7AAD 및 Annexin-V를 사용한 유세포분석을 통해 세포 사멸에 접근하였다. 생존한 집단의 tEGFR 양성 백분율은 CID 농도가 증가함에 따라 감소하였다. tEGFR 높은 세포의 69.1%는 CID의 단일 100 nM 용량 후에 제거되었다(도 1D). 다른 연구의 관찰과 일관되게, 사멸을 피한 세포는 CID 후 tEGFR의 평균 형광 강도(MFI)가 50% 감소한 낮은 수준의 트랜스유전자를 발현하는 세포였다(도 1E). 따라서, 비-반응 T 세포는 CID의 기능적 활성화를 위한 iC9가 불충분하게 발현되었다. 임상 적용을 위해 CAR-T 세포를 투여 전에 충분한 트랜스유전자 발현을 위해 분류해야 할 수 있다.
실시예 2 - 시험관 내에서 CART4 T 세포의 기능적 검증
CAR 형질도입 후 4일 이내에, CD4+ T 세포는 형질도입되지 않은(NTD) 및 CART20 대조군과 비교하여 거의 완전히 고갈되었으며, 여기서 세포의 약 45%는 CD4-양성으로 남아있었다(도 2A). 이러한 데이터는 T 세포 확대 동안 CART4 세포의 CD4에 대한 강력한 활성을 가리킨다.
자기유래의 1차 건강한 공여자 PBMC에 대해 공동-배양을 확립하였다. CFSE-표지된 자기유래 PBMC를 CD8+ CART4 세포 또는 CART20 세포와 공동-배양하였다. 두 설정 모두에서 CART4/20 세포는 각 표적 세포에 대해 높은 수준의 세포독성을 매개하였다. 4시간의 공동-배양 동안 E:T 비 3:1의 조건에서 PBMC 내 CD4+ 세포의 94%가 CART4 세포에 의해 용해되었다. 그러나 NTD T 세포와 비교하여 CD20+ 세포에 반응하는 CART4의 특정 T 세포 세포독성은 없었다(도 2C).
CART4 세포의 기능을 추가로 평가하기 위해, 발명자는 Jurkat 세포주 및 CEM-ss 세포주를 사용하여 CART4 세포의 항-종양 효능을 시험하였다. Jurkat 및 CEM-ss 세포주는 T 세포 백혈병 또는 인간 T4 림프모구성 백혈병 환자의 말초 혈액에서 초기에 확립된 T 세포주였다. 두 세포주 모두 CD4를 발현하는 반면, CEM-ss 세포주는 더 높은 수준의 CD4를 발현한다(도 2D). 실제로 CART4 세포는 CD4 발현 수준을 기반으로 T 종양 세포주를 표적화하였다. 단기 배양 후 CART4 세포는 5:1의 E:T(효과기:표적) 비에서 CEM-ss 세포를 성공적으로 제거하였다. 대조군으로서 CART4 세포를, CD4를 발현하지 않는 인간 B 세포주(BCL)인 CD4-림프종 세포에 대한 활성에 대해서도 시험하였다(도 2D). 유세포분석 결과, CART4 세포가 BCL을 표적화할 수 없음이 입증되었다(도 2E). 더욱이, CD4+ 종양 세포와 함께 배양된 CART4 세포는 세포내 사이토카인 염색에 의해 유의수준의 IFN-γ 및 TNF-α 반응을 나타내었다(도 2F). 따라서 이러한 데이터는 CD4 발현에 대한 CART4의 강력한 용량 의존적 반응을 입증하였다. CART4 세포를 CD4 음성 세포와 함께 배양한 경우에는 사멸 효과가 관찰되지 않았다. 따라서 이러한 결과는 CART4 세포 절제가 CD4에 특유하다는 것을 보여준다.
실시예 3 - CART4 세포는 CD4 + T 종양 세포를 특이적으로 사멸한다
환자 샘플에 대한 CART4의 기능을 조사하기 위해 ATLL 환자의 PBMC를 해동하고 표현형을 분석하였다. 모든 샘플은 67.4%에서 97.7%까지의 CD4 발현 범위를 가졌다. 대부분의 CD4+ 세포는 T 세포 백혈병202-204의 클론 발생을 나타내는 T 세포 수용체의 하나의 독특한 β 쇄(TCR Vβ)를 발현한다(도 3A). 유세포분석에 의해 정량화한 바와 같이, ATLL 환자 샘플과 CART4 세포를 4시간 동안 공동-배양하면 CD4+ 악성종양이 신속하고 확실하게 제거되었다. 모든 ATLL 공동-배양에서 약 80%의 절제가 관찰되었으며, 이는 이전에 표시된 모세포 T 세포주의 절제와 일치한다(도 3B). 6명의 CTCL 환자의 샘플을 사용하는 연구를 또한 수행하였다. 유사하게, 새로 해동된 1차 CTCL 세포에 대한 CART4 세포의 관찰된 확고한 세포독성이 관찰되었으며, 그 결과 4시간의 공동-배양 후 악성 T 세포가 약 60%~80% 감소하였다(도 3C). 따라서 CART4 세포는 환자 샘플에서 직접 단리된 공격적인 CD4+ T-악성종양을 효율적으로 제거하였다. 이러한 결과는 CD4가 CD4+ T-악성종양에 대한 유망한 치료 표적임을 나타낸다.
실시예 4 - CART4 세포는 생체 내에서 항-백혈병 효과를 효율적으로 매개한다
생체 내 항종양 활성을 평가하기 위해, 발명자는 가우시아 루시페라제 발현 CEM-ss 세포주를 사용하여 이종발생 마우스 모델을 개발하였다. 이들은 먼저 NRG 마우스에서 단일 용량(4x106)의 CART4 세포에 의해 백혈병의 출현을 지연시키는 CART4 세포의 능력을 시험하였다. 주사 전, 유세포분석에 의해 입증된 바와 같이, 세포의 약 50%가 항-CD4 CAR을 발현하였다. 마우스에게 CEM-ss 세포를 안와후 주사하였다. 종양 이식 4일 후, 단일 용량의 CART4 세포 또는 NTD CD8+ T 세포의 안와후 주사를 백혈병 보유 마우스에 투여하였다(도 4A). 매주 말초 혈액에서 루시페라제 활성을 측정하여 종양 부담을 모니터링하였다. 주입된 CART4 세포는 백혈병 진행에 대한 강력한 보호를 제공하였으며(도 4B) 마우스의 중간 생존 기간을 크게 연장하였다(대조군에서 38일 대 CART4 그룹에서 60일, Mantel-Cox 로그 순위 검정에 의해 P = 0.026)(도 4C). 실제로, 종점까지, eGFP+ 종양 진행이 유세포분석에 따르면 비장과 골수에서 극적으로 지연되었다(도 4D).
재발된 종양 세포는 CD4의 발현을 유지하였지만 발현 수준은 대조군에 비해 MFI가 약 40%까지 떨어졌다(도 4E). 그러나 이러한 하향조절은 재발된 종양을 제거하는 CART4 세포의 능력을 손상시키기에는 불충분하였다(도 4F). 이 결과는 항원 탈출보다는 CAR-T 세포 지속성 부족이 종양 재발의 주요 원인임을 나타낸다.
실시예 5 - GMP-준수 CAR-T 세포 제조 방법의 개발
확장성을 평가하고 CAR-T 세포 제조를 단순화하기 위해 CAR-T 제조용 기체-투과성 정적 세포 배양 시스템(G-Rex)을 사용하여 최적화된 표준 실행 절차를 확립하였다(도 5A). G-Rex 시스템은 플레이트 바닥에 실리콘 멤브레인을 포함하고 있다. 막을 통한 O2 및 CO2를 포함한 가스 교환은 배양 배지의 깊이를 증가시켜 더 많은 영양분을 제공하고 폐기물을 희석시킨다. PBMC를 활성화하여 형질도입하였고, 10x106 세포를 G-Rex 6웰 플레이트에 옮겨 추가로 배양하였다. 세포에 2 내지 3일마다 사이토카인 IL-7 및 IL-15를 보충하였다. 세포는 초기 2x106 세포 수에서 3 x 108 초과까지 확대되었으며, 15일에 걸쳐 150배 증가하였다(도 5B). 다음으로 G-Rex 시스템에서 T 세포 확대 후 최종 생성물의 형질도입 효율을 확인하였다. CART4의 최종 형질도입 효율은 57.6%±7.1%로, 이는 도 5C에 도시된 바와 같이 기존 플라스크에서 생성된 세포(53.7%±5.3%)와 유사하였다. 예상한 대로, 내인성 CD4+ 집단은 최종 제품에서 완전히 고갈되었으며, 이는 CAR-T 세포의 항-CD4 활성을 가리킨다.
흥미롭게도, G-Rex에서 생성된 CAR-T 세포는 중심 기억 표현형에 대한 분화 선호도를 나타내었다. 기억 마커 CD45RO 및 CD62L의 평가에서는 기존 배양 플라스크에서 배양된 세포와 비교하여 더 높은 CD45RO CD62L 이중 양성 모집단 백분율(77%±7.1% 대 41%±5.5%)을 나타내었다(도 5D). CD45RO CD62L 이중 양성 세포는 생체 내 장기 지속성에 필요한 것으로 간주되는 중심 기억 T 세포였다. 따라서 이러한 생물공정 최적화 방법은 기술자 개입 횟수와 CAR-T 제조 비용을 줄이면서 세포 생산량과 중심 기억 표현형의 비율을 증가시켰다.
실시예 6 - TCR Vβ7.1-특이적 CAR-T 세포의 생성
T 세포 악성종양은 일반적으로 독특한 TCR을 발현하는 하나의 단클론성 암세포에서 발생한다. TCR β(Vβ) 쇄의 가변(V) 영역에 대한 광범위한 항체 배열을, 정상 순환 T-세포 레퍼토리의 75%를 포함하는, 25개 Vβ 계열 중 22개를 평가할 수 있는 직접 접합된 다색 포맷으로 이용할 수 있게 되었다. 따라서, 발명자는 TCR Vβ가 T 세포 악성종양에 대한 CAR-T 치료법의 잠재적인 표적이라고 생각한다. CAR-T(CARTVb7.1) 세포를 표적화하는 TCR Vβ를 개발하기 위해, 발명자는 인간 TCR Vβ 7.1(옥스퍼드 소재 Andrew 연구실의 Margret Callam 박사)에 특이적인 단클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포 3G5의 scFv 영역을, 도 1A(2)에 도시된 바와 같이 CAR 작제물에 클로닝하였다. CAR 형질도입 5일 후, 내인성 TCR Vβ7.1+ 집단은 CART20 대조군과 비교하여 거의 완전히 고갈되었으며, 여기서 약 1.2%의 세포가 TCR Vβ7.1-양성으로 남아있었다(도 6B). 이러한 데이터는 T 세포 확대 동안 CAR-T 세포의 TCR Vβ7.1에 대한 강력한 활성을 가리킨다.
CARTVb7.1 세포의 기능을 추가로 평가하기 위해, 발명자는 TCRVβ7.1 양성 종양으로 진단받은 ATL 환자로부터 단리한 종양 세포를 사용하여 항종양 효능을 시험하였다. 실제로, 유세포분석에 의해 정량화한 바와 같이, ATL 환자 샘플과 CARTVb7.1 세포를 6시간 동안 공동-배양하면 CD4+ 악성종양이 신속하고 확실하게 제거되었다. 모든 ATL 공동-배양에 대해 약 60% 절제가 관찰되었다(도 6C, D). 이러한 결과는 TCR Vβ가 T-악성종양에 대한 유망한 치료 표적임을 나타낸다.
실시예 7 - CAR-MAIT 세포의 개발
현재, 대부분의 CAR-T 치료법은 기존 자기유래 CD3+ T 세포를 활용한다. 그러나 암환자의 면역세포는 기능이 떨어지거나 그 수가 적을 수 있다. 특히 CAR로 종양 세포를 조작하는 것이 가능하기 때문에 T-악성종양 환자의 PBMC를 확대하고 유전자 변형하는 것은 위험할 수 있다. 따라서, 제3자 동종이계 세포를 제조할 수 있는 면역치료제를 개발하는 것이 바람직하다. 본원에서, 발명자는 자기 분리와 유세포분석 분류를 조합하여 PBMC로부터 점막 관련 불변 T 세포(MAIT 세포)를 단리하는 2단계 방법을 개발하였다. TCR Vα7.2 발현을 기반으로 한 첫 번째 단계 분리 후 MAIT 세포 백분율은 0.74%에서 33.3%로 증가하였다(도 7A, B). 다음 단계 유식 분류를 통해 MAIT 순도를 95%까지 더 높일 수 있었다. 분류된 세포를 Dynabeads 인간 T-활성화제 CD3/CD28로 활성화하고 사이토카인(IL-2, IL-7 및 IL-15) 칵테일의 존재 하에서 확대시켰다. 확대 방법은 12-14일 내에 약 100배 확대를 가져왔다(도 7C). 수확 시, 확대된 세포의 90.9%가 MR1-5-OP-RU 사량체에 대한 특이성을 유지하였다(도 7D). 또한, 확대된 MAIT 세포는 레트로바이러스 형질도입에 의해 CAR 유전자에 의해 성공적으로 조작될 수 있었다(도 7E). CAR 형질도입된 MAIT(CAR-MAIT) 세포는 기존 CAR-T 세포에 필적하는 세포독성 능력을 보유한다(도 8).
실시예 8 - CAR-MAIT 세포는 생체 내에서 항-백혈병 효과를 효율적으로 매개한다
생체 내에서 CAR-MAIT 세포의 항종양 기능을 평가하기 위해, 발명자는 단일 용량(4x106)의 CAAR 세포로 NSG 마우스에서 백혈병 진행을 지연시키는 항-CD4 CAR-MAIT(CAR-MAIT4) 세포의 능력을 시험하였다. 마우스에게 CEM-ss 세포를 정맥내 주사하였다. 종양 생착 4일 후, CAR-MAIT4 세포 또는 CART4 세포의 단일 용량의 정맥내 주사를 백혈병 보유 마우스에 투여하였다(도 14A). 항-CD20 CAR-MAIT(CAR-MAIT-Ctrl) 세포 또는 항-CD20 CART(CART-Ctrl) 세포를 대조군으로 투여하였다. 매주 루시페라제 활성을 측정하여 종양 부담을 모니터링하였다. 주입된 CAR-MAIT4 세포 및 CART4 세포는 백혈병 진행에 필적하는 보호를 제공하였으며(도 14C 및 D) 종양 보유 마우스의 생존 기간을 상당히 연장시켰다(도 14B).
실시예 9 - 인간 MAIT 세포의 검출, 단리, 확대 및 조작
본원에 기재된 방법을 사용하여 인간 MAIT 세포를 검출, 단리, 확대 및 조작하였다.
도 11에 도시된 바와 같이, 인간 MAIT 세포를 유세포분석에 의해 분석하였다.
도 12에 도시된 바와 같이, MAIT 세포를 유식 분류하였다.
이어서 MAIT 세포를 활성화하고 CAR 발현 벡터로 형질도입하여 CAR-MAIT 세포를 생성한 다음 도 13에 도시된 대로 확대하였다.
실시예 10 - PMBC 자극에 의한 MAIT 세포의 확대
MAIT 세포는 MHC 부류 I-유사 분자인 MR1을 인식하는 CD3+ TCRVa7.2+ CD161+ 세포로 정의된 선천적 T 세포의 서브세트이다. 이전 연구에서는 MAIT 세포가 시험관 내에서 확대될 수 있지만 동종이계 영양 세포의 존재가 필요하다는 것을 보여 주었으나, 이 방법은 대규모 생산 및 품질 관리가 어렵다. 본 연구에서, 발명자는 처음에 최대 6일 동안 시험관 내 배양에서 다양한 사이토카인(IL-2, IL-7, IL-15, IL-12, IL-18 및 IL-23)의 조합의 존재 하에, 항원(5-OP-RU) 로딩된 MR1 사량체 비드 또는 5-OP-RU 단독으로 PBMC를 자극함으로써 시험관 내에서 MAIT 세포를 확대하는 매우 새롭고 효과적인 방법을 개발하였다. 이어서, 생성된 MAIT 세포를 MACS 또는 FACS 분류에 의해 단리하고 선행 실시예에서 기재된 바와 같이, CAR-기반 치료법을 위해 항-CD3/CD28 비드에 의해 추가로 확대하였다.
물질 및 방법
1. PBMC 단리
PBMC를 Ficoll-Hypaque 밀도 구배에서 원심분리를 통해 건강한 혈액 공여자의 연막으로부터 단리하였다. 단리된 PBMC의 분액을 냉동하고 사용할 때까지 액체 질소에 보관하였다. 실험을 시작하기 전에 냉동 PBMC 스톡을 해동하고 10% FBS가 보충된 RPMI 배지에서 37℃에서 배양하였다.
2. MR1/5-OP-RU 복합체 비드의 제조
MR1/5-OP-RU 사량체-코팅된 비드를, ThermoFisher의 스트렙트아비딘 및 비오틴화된 MR1 단량체와 함께 M-280 다이나비드를 사용하여 생성시켰다. 5-OP-RU 로딩된 MR1 단량체는 Jim McCluskey 박사(호주 멜버른 대학교)가 친절하게 제공하였다. 비드를 혼합하고 5-OP-RU가 로딩된 MR1 단량체(5 ug/3x107 비드)로 로커에서 4℃에서 12시간 동안 코팅하였다. 과잉의 결합되지 않은 단백질을 PBS에서 10분간 2회 세척하여 제거하였다. 제조된 MR1 사량체 코팅된 비드를 PBS에 재현탁시키고 사용시까지 4℃에 보관하였다.
3. PBMC에서 MAIT 세포의 농축
PBMC(웰당 2x105개 세포)를 37℃ 배양기에서 R10 배지(90% RPMI + 10% FBS + 1% 페니실린/스트렙토마이신 + 2 mM L-글루타민)가 포함된 96웰 플레이트에서 배양하고 시험관내에서 6일 동안 상이한 사이토카인과 함께 1:1의 비드 대 세포 비의 MR1/5-OP-RU 복합체 코팅된 비드 또는 정제된 5-OP-RU 항원(10 nM)(호주 퀸즈랜드 대학의 Jeffrey Mak 박사 제공)에 의해 자극하였다. 사이토카인 IL-2(100 IU/㎖)(Roche), IL-7(50 ng/㎖)(Miltenyi), IL-15(50 ng/㎖)(Miltenyi), IL-12(50 ng/㎖)(Miltenyi), IL-18(50 ng/㎖)(ThermoFisher) 및 IL-23(50 ng/㎖)(Miltenyi)을 도 15의 표에 표시된 대로 1 내지 15번으로 넘버링된 15개의 상이한 조합으로 추가하였다. 6일차에, 확대된 세포를 수집하고 분석하여 하기에 기재된 대로 유세포분석에 의해 MAIT 세포의 백분율을 결정하였다.
4. PBMC에서 MAIT 세포 빈도에 대한 FACS 분석
확대된 PBMC를 암실에서 30분 동안 항체를 사용하여 표면 마커 염색하였다. FITC-접합된 CD3(클론 BW264/56, Miltenyi), PE-접합된 Va7.2(클론 3C10, Biolegend), APC-접합된 CD161(클론 DX12, BD)을 1:100으로 사용하여 세포를 표지하였다. MAIT 세포는 CD3+ Va7.2+ CD161+ 세포로 정의된다. LIVE/DEAD™ 고정성 아쿠아 죽은 세포 염색 키트(Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit)(ThermoFisher)를 사용하여 죽은 세포를 제외시켰다. 염색된 세포를 500 x g에서 5분간 원심분리를 위해 5 내지 10-부피의 PBS로 세척하고 유세포분석 전에 200 ㎕ PBS로 재현탁하였다. 유세포분석 결과는 FlowJo로 분석되었다.
결과
도 15를 참조하면, PBMC에서 MAIT 세포를 농축한 결과를 도시한다. PBMC를 6일 동안 표에 표시된 바와 같이, 각각 상이한 사이토카인(IL-2, IL-7, IL-15, IL-12, IL-18 및 IL-23) 존재 하에서 (i) 비드 대 세포 비가 1:1인 MR1/5-OP-RU 복합 비드 또는 (ii) 10 nM의 5-OP-RU 항원에 의해 자극하였다. 예를 들어, 조건 1은 IL-2에만 해당하고, 조건 2는 IL-7 및 IL-15에 해당하며, 조건 3은 IL-2, IL-12 및 IL-18에 해당하는 등이다.
MAIT 세포 증가 배수를, 6일차의 살아있는 MAIT(CD3+ Va7.2+ CD161+) 세포의 빈도를 0일차의 MAIT 세포의 원래 빈도로 나누어 계산하였다. 상위 5개 그룹을 오렌지색으로 강조 표시하였다(즉, 조건 1, 3, 11, 12 및 13).
볼 수 있는 바와 같이, MR1/5-OP-RU 복합 비드(공여자 1의 경우)의 경우, 1, 13, 12, 3 및 11의 사이토카인 조합은 PBMC에서 MAIT 세포의 가장 높은 증가 배수를 제공하였다. MR1/5-OP-RU 복합 비드(공여자 2의 경우)의 경우, 12, 13, 1, 11 및 3의 사이토카인 조합이 PBMC에서 MAIT 세포의 가장 높은 증가 배수를 제공하였다.
볼 수 있는 바와 같이, 5-OP-RU(공여자 1의 경우)의 경우, 3, 1, 12, 13 및 11의 사이토카인 조합은 PBMC에서 MAIT 세포의 가장 높은 증가 배수를 제공하였다. 5-OP-RU(공여자 2의 경우)의 경우, 8, 13, 12, 11 및 3의 사이토카인 조합은 PBMC에서 MAIT 세포의 가장 높은 증가 배수를 제공하였다.
이러한 데이터를 바탕으로, 상이한 사이토카인과, 사이토카인(IL-2, IL-7, IL-15, IL-12, IL-18 및 IL-23)의 조합이 상이한 수준의 자극을 초래하여 결과적으로 PBMC에 MAIT 세포의 농축을 개선시키는 것이 분명하다. 전반적으로, IL-12, IL-18 및 IL-23의 조합이 PBMC에서 MAIT 세포의 가장 높은 증가 배수를 제공한다.
논의
현재, T-세포 림프종에 대한 잘 확립된 치료는 B-세포 악성종양과 비교하여 이용 가능하지 않으며, 유일한 잠재적인 치료 섭생은 동종이계 조혈 줄기세포 이식(HSCT)이며, 이는 그 자체로 상당한 치료 관련 사망률이 존재한다. T-세포 림프종의 대부분(>95%)은 정의된 T-세포 수용체(TCR) 유전자(즉, 클론 TCR-Vb 쇄)와 범-T 보조 세포 마커 CD4를 발현하는 우성 T 세포 클론에서 유래하므로, 이들 마커를 표적화하는 단클론 항체는 T-세포 림프종 치료를 위해 연구되었고 일부는 소규모 임상 시험에서 부분적인 퇴보를 가져왔다(d'Amore et al., 2010; Hagberg et al., 2005; Kim et al., 2007).
CAR-T는 범-B 세포 마커 CD19의 표적화에 의한 B-세포 악성종양에 대한 매우 효과적인 치료임에도 불구하고, 이 접근법은 T-세포 림프종 치료에 적용될 때 상당한 장애에 직면하였다. 첫째, B-세포 고갈과 달리, 지속적인 T-세포 무형성증(aplasia), 특히 CD4+ T 세포 고갈은 만성 HIV 감염 중에 관찰되는 기회 감염과 같은 심각한 독성을 초래할 수 있다. 둘째, T-세포 림프종과 관련된 손상된 T 세포 기능 및 우성 T 세포 종양 성장으로 인한 낮은 정상 T 세포 수는 자기유래 CAR-T 세포 생성에 사용될 수 없으므로, T-세포 림프종의 치료에는 동종이계 CAR-T 세포가 필요하다. 마지막으로, 대부분의 T-세포 림프종은 림프절 및 피부 조직과 관련된 고형 종양으로, 낮은 조직 침윤 능력과 적대적인 종양 미세 환경으로 인해 기존 CAR-T로 치료가 어렵다.
이러한 문제를 다루기 위해, 발명자는 종양 세포 근절 후에 CART4-형질도입된 T 세포를 선택적으로 제거하여, 자기유래 조혈 줄기 세포 또는 동종이계 HSCT로부터 정상 CD4+ T 세포를 회수할 수 있게 하는 안전 스위치로서 tEGFR 및 iC9를 함유하는 CAR-표적화 CD4 항원(CART4)을 설계하였다. CD4+ T 세포의 통과 고갈은 항-CD4 항체에 의한 자가면역 질환 치료에서 안전하고 허용될 수 있는 것으로 나타났다(Hagberg et al., 2005; Kim et al., 2007). CART4-형질도입된 인간 T 세포는 시험관 내에서 ATLL 또는 CTCL 환자로부터 단리된 CD4+ T-세포 림프종 세포주를 사멸할 수 있었고 마우스 이종이식 모델에서 생체 내 종양 성장을 억제할 수 있었다. 더 중요한 것은 이러한 CART4+ T 세포가 항-EGFR 항체에 의해 검출된 tEGFR과 시험관 내 및 생체 내 CART4+ T 세포의 CID 약물 유발 세포사멸에 의해 결정된 iC9와 함께 CAR을 공동 발현한다는 것이다. tEGFR의 발현은 CART4+ T 세포 증식을 모니터링하거나 생체 내에서 항-EGFR 항체를 사용하여 CART4+ T 세포를 제거하는 데 사용될 수 있었다.
일반적으로, 정상 T 세포는 병원체 감염에 대한 세포 면역을 유지하기 위해 매우 다양한 TCR 레퍼토리로 이루어진다. TCR은 N-말단 가변 영역과 C-말단 불변 영역을 포함하는 a 및 b 쇄의 이종이량체로 이루어진다. TCR-Vb 영역(쇄)은 TCR-Va보다 다형성이 더 크며 면역 반응이나 T 세포 악성종양의 클론성을 분석하는 데 자주 사용된다. 현재 TCR 레퍼토리의 75%를 차지하는 TCR-Vb 쇄 계열에 특정한 22개의 mAb가 존재한다. 대부분의 T 세포 림프종은 동일한 TCR Vb 쇄를 발현하는 단일 T 세포 클론에서 유래하므로 나머지 정상 T 세포 레퍼토리를 보존하면서 종양 클론에 정의된 TCR-Vb 쇄를 표적화하는 CART는 기회 감염을 최소화하는 데 이상적인 접근법이 될 것이며, 수혈 후 CART 세포를 제거할 필요가 없을 것이다.
항-TCR-Vb 기반 면역요법에 대한 개념 증명으로서, 발명자는 TCR-Vb 7.1 쇄(CARTVb7.1)를 특이적으로 표적화하는 CAR을 조작하였고 CARTVb7.1 형질도입된 T 세포가 ATL 환자로부터 단리된 TCR-Vb 7.1 양성 종양 세포를 효과적으로 제거할 수 있음을 보여주었으며, 이는 항-TCR-Vb CAR이 T-세포 림프종에 대한 대체 면역요법을 제공할 수 있음을 시사한다.
최종적으로, 발명자는 MAIT 세포가 CAR 기반 치료법을 위한 효과기 세포로 사용될 수 있는지 여부를 조사했는데, 그 이유는 MAIT 세포가 기존 T 세포에 비해 하기를 포함하여 몇 가지 장점을 갖기 때문이다:
(1) 포유동물 진화 동안 고도로 보존된 불변 TCR의 발현으로 인한 낮은 동종이계 반응성(즉, 이식편 대 숙주병(graft vs host disease), GVHD 유발);
(2) 마우스 모델에서 GVHD의 억제를 포함한 조절 기능;
(3) GrB, 퍼포린 및 GrA를 유도하는 활성화를 통한 사멸 활성; 및
(4) 장 점막, 피부 및 폐의 분배와 같은 조직 귀소.
본원에 기재된 바와 같이, CAR-형질도입된 MAIT 세포(CAR-MAIT)는 기존 CAR-T 세포와 마찬가지로 시험관 내 및 생체 내에서 적어도 유사한 항종양 활성을 나타내었다. 결론적으로, 발명자는 범-T 세포 마커 CD4를 전환가능한 CAR-T로 표적화하여 표적/비-종양 독성 및 사이토카인 방출 증후군(cytokine release syndrom) 또는 특이적인 TCR-Vb 쇄(전반적인 면역억제를 피하기 위해 악성종양 T 세포에 특유하다)를 감소시킴으로써 T-세포 악성종양의 효과적인 치료를 위한 신규의 CAR-MAIT 기반 면역요법을 개발하였다. 더 중요한 것은, CAR-MAIT 세포가 T-세포 림프종 치료에 필요한 동종이계 CAR 기반 치료법을 개발할 가능성이 있다는 점이다. 일관되게 제조된다면, 즉 대규모 생체 외 확장이 가능하다면, 기성품 개발에 사용될 수 있다. 발명자는 CAR-MAIT가 T-세포 악성종양뿐만 아니라 다른 비-면역 세포 유형의 종양에도 효과적인 치료법을 위한 새로운 접근법을 제공할 수 있다고 믿는다.
결론
키메라 항원 수용체(CAR)-기반 T 세포 치료법은 범-B 세포 특이적 항원을 표적화하여 B-세포 악성종양 치료에 큰 성공을 거두었다. 그러나 T 세포 림프종에 대한 유사한 전략은 B-세포 악성종양과 비교하여 T 림프종에서 전체 T 세포 고갈 및 정상 T 세포의 기능 장애/낮은 빈도로 인한 잠재적인 심각한 독성으로 인해 지금까지 실현되지 않았다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 발명자는 2개의 안전 스위치인 절두된 표피 성장 인자 수용체(tEGFR) 및 유도성 카스파제-9(iC9)를 통합하여 범-T 세포 마커(CD4) 또는 TCR-Vb 아이소타입 쇄에 특이적인 새로운 CAR 작제물을 설계하였다. 발명자는 낮은 동종이계 반응성을 갖는 점막 관련 불변 T(MAIT) 세포가 CAR 작제물로 형질도입된 후 기존 T 세포와 유사한 항-종양 사멸 활성을 나타낼지 여부를 조사하였다.
놀랍게도, CAR 형질도입된 T 세포는 환자로부터 단리된 CD4+ T 림프종 세포 또는 TCR-Vb 특이적 T 백혈병 클론의 특이적인 사멸을 나타낼 뿐만 아니라, 시험관 내 및 생체 내에서 유도제로 치료 시 제거되었다. 더욱이, 발명자는 CAR-MAIT 세포가 시험관 내 및 생체 내에서 기존의 T 세포만큼 효율적으로 종양 성장을 억제할 수 있음을 처음으로 보여주었다. 이 연구는 T 세포 림프종 치료를 위한 신규의 전략을 제공한다.
따라서, 광범위한 감염성 및 비-감염성 질병에의 관련성, 및 주 조직적합성 복합체(MHC) 부류 I-유사 단백질 MR1에 의해 제시된 미생물 리보플라빈-유래 항원에 대한 그의 특이한 특이성으로 알려진 면역 세포의 일종인 본 발명의 점막 관련 불변 T(MAIT) 세포는, T 림프종을 특이적으로 인식하고 공격할 수 있는 키메라 항원 수용체(CAR)를 갖춘 유전자 변형 MAIT 세포를 통해 암 환자를 치료하기 위한 신규 형태의 면역요법으로 개발되었다.
참고문헌
조항
1. 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 점막 관련 불변 T(MAIT) 세포.
2. 1항에 있어서, CAR-MAIT 세포가 T-세포 상의 CD4 항원을 표적화하는 CAR을 발현하는, MAIT 세포.
3. 2항에 있어서, CAR이 실질적으로 서열번호 1에 제시된 바와 같은 아미노산 또는 이의 변이체 또는 단편을 포함하는 CD4 항원에 특이적인, MAIT 세포.
4. 1항 내지 3항 중 어느 한 항에 있어서, CAR-MAIT 세포가 T-세포 상의 T-세포 수용체(TCR) 베타-쇄 가변 영역(V베타), 바람직하게는 표 1에 나타낸 V베타 영역 중 어느 하나를 표적화하는 CAR을 발현하는, MAIT 세포.
5. 4항에 있어서, CAR이 T-세포 상의 다수의 T 세포 수용체(TCR) 베타-쇄 가변 영역(V베타)을 표적화하고, 바람직하게는 다수의 V베타 영역이 표 1에 나타낸 V베타 영역의 그룹으로부터 선택되고, 임의로 다수의 TCR V 베타 영역이 동일하거나 상이한 V 베타 영역인, MAIT 세포.
6. 4항 또는 5항에 있어서, CAR이 하기 V베타 영역: Vb 1, Vb 2, Vb 3, Vb 5.1, Vb 7.1, Vb 8, Vb 12, Vb 13.1, Vb 17 및 Vb 20으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 T-세포 상의 하나 이상의 TCR V베타 영역을 표적화하는, MAIT 세포.
7. 4항 내지 6항 중 어느 한 항에 있어서, CAR이 실질적으로 서열번호 2에 제시된 바와 같은 아미노산, 또는 이의 변이체 또는 단편을 포함하는 TCR V베타 영역에 특이적인, MAIT 세포.
8. 1항 내지 7항 중 어느 한 항에 있어서, CAR-MAIT 세포가, CAR-MAIT 세포를 조절 가능하게 또는 유도 가능하게 제거되게 하는 하나 이상의 암호화 서열을 포함하는, MAIT 세포.
9. 8항에 있어서, 하나 이상의 암호화 서열이 표피 성장 인자 수용체(EGFR), 또는 절두된 표피 성장 인자 수용체(tEGFR)를 암호화하는, MAIT 세포.
10. 8항 또는 9항에 있어서, 하나 이상의 암호화 서열이 유도성 카스파제-9(iC9)를 암호화하는, MAIT 세포.
11. 1항 내지 10항 중 어느 한 항에 있어서, MAIT 세포가 자기 활성화된 세포 분류(MACS) 및/또는 형광 활성화된 세포 분류(FACS), 더욱 바람직하게는 MACS 및 FACS 둘 다에 의해 인간 말초 혈액 단핵구 세포(PBMC) 로부터 단리되는, MAIT 세포.
12. 항-CD4 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 항-T-세포 수용체(TCR) V-베타 CAR을 암호화하는 제1 암호화 서열에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함하는 핵산 작제물.
13. 12항에 있어서, 프로모터가 PGK 프로모터이고, 임의로 프로모터가 실질적으로 서열번호 3에 제시된 바와 같은 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하는 작제물.
14. 12항 또는 13항에 있어서, 제1 암호화 서열이 항-CD4 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하고, 임의로 CAR이 실질적으로 서열번호 1에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 또는 이의 변이체 또는 단편을 포함하는 CD4 항원에 특이적인, 작제물.
15. 14항에 있어서,
(i) 제1 암호화 서열이 실질적으로 서열번호 6에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고;
(ii) 제1 암호화 서열이 실질적으로 서열번호 7에 제시된 바와 같은 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하고;
(iii) 제1 암호화 서열이 실질적으로 서열번호 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고; 및/또는
(iv) 제1 암호화 서열이 실질적으로 서열번호 9에 제시된 바와 같은 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하는
작제물.
16. 12항 또는 13항에 있어서, 제1 암호화 서열이 항-T-세포 수용체(TCR) V-베타 영역 CAR, 임의로 표 1에 나열된 V베타 영역 중 임의의 것을 암호화하는, 작제물.
17. 16항에 있어서, 제1 암호화 서열이 다수의 T-세포 수용체(TCR) 베타-쇄 가변 영역(V베타) CAR을 암호화하고, 바람직하게는 다수의 V베타 영역이 표 1에 나타낸 V베타 영역의 그룹으로부터 선택되는, 작제물.
18. 16항 또는 17항에 있어서, 하기 V베타 영역: Vb 1, Vb 2, Vb 3, Vb 5.1, Vb 7.1, Vb 8, Vb 12, Vb 13.1, Vb 17 및 Vb 20으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 T-세포 상의 하나 이상의 TCR V베타 영역을 표적화하는 적어도 하나의 CAR을 암호화하는 암호화 서열을 포함하고, 임의로 하기 V베타 영역: Vb 1, Vb 2, Vb 3, Vb 5.1, Vb 7.1, Vb 8, Vb 12, Vb 13.1, Vb 17 및 Vb 20으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 T-세포 상의 적어도 2개 또는 3개의 TCR V베타 영역을 표적화하는 적어도 하나의 CAR을 암호화하는 암호화 서열을 포함하는, 작제물.
19. 16항 내지 18항 중 어느 한 항에 있어서, CAR이 실질적으로 서열번호 2에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 또는 이의 변이체 또는 단편을 포함하는 TCR V베타 영역(바람직하게는 TCR-V베타 7.1 쇄)에 특이적인, 작제물.
20. 16항 내지 19항 중 어느 한 항에 있어서,
(i) 제1 암호화 서열이 실질적으로 서열번호 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고;
(ii) 제1 암호화 서열이 실질적으로 서열번호 13에 제시된 바와 같은 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하고;
(iii) 제1 암호화 서열이 실질적으로 서열번호 34에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고; 및/또는
(iv) 제1 암호화 서열이 실질적으로 서열번호 35에 제시된 바와 같은 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하는
작제물.
21. 12항 내지 20항 중 어느 한 항에 있어서, CD8a 힌지 및 막관통(TM) 구조 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 임의로 실질적으로 서열번호 14에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고/하거나, 실질적으로 서열번호 15에 제시된 바와 같은 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하는, 작제물.
22. 12항 내지 21항 중 어느 한 항에 있어서, CD28의 신호전달 도메인, 4-1BB의 신호전달 도메인 및/또는 CD3ζ 쇄, 및 더욱 바람직하게는 CD28의 신호전달 도메인, 4-1BB의 신호전달 도메인 및 CD3ζ 쇄를 포함하는 세포내 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 작제물.
23. 22항에 있어서,
(i) 실질적으로 서열번호 16에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고;
(ii) 실질적으로 서열번호 17에 제시된 바와 같은 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하고;
(iii) 실질적으로 서열번호 18에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고;
(iv) 실질적으로 서열번호 19에 제시된 바와 같은 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하고;
(v) 실질적으로 서열번호 20에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고; 및/또는
(vi) 실질적으로 서열번호 21에 제시된 바와 같은 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하는
작제물.
24. 12항 내지 23항 중 어느 한 항에 있어서,
핵산 작제물이, 적어도 하나의 자살 단백질, 및 더욱 바람직하게는 적어도 2개의 자살 단백질을 암호화하는 제2 암호화 서열을 포함하는, 작제물.
25. 24항에 있어서,
제2 암호화 서열이 (i) 표피 성장 인자 수용체(EGFR), 또는 절두된 표피 성장 인자 수용체(tEGFR); 및/또는 (ii) 유도성 카스파제-9(iC9)를 암호화하는, 작제물.
26. 25항에 있어서,
(i) 실질적으로 서열번호 22에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 임의로 실질적으로 서열번호 23에 제시된 바와 같은 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하고; 및/또는 (ii) 실질적으로 서열번호 24에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 임의로 실질적으로 서열번호 25에 제시된 바와 같은 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하는, 작제물.
27. 12항 내지 26항 중 어느 한 항에 있어서, 실질적으로 서열번호 29에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 임의로 실질적으로 서열번호 30에 제시된 바와 같은 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하는, 작제물.
28. 12항 내지 26항 중 어느 한 항에 있어서, 실질적으로 서열번호 31에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 임의로 실질적으로 서열번호 32에 제시된 바와 같은 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하는, 작제물.
29. 12항 내지 28항 중 어느 한 항에 따른 핵산 작제물을 암호화하는 발현 벡터로서, 임의로 벡터가 실질적으로 서열번호 33 또는 36에 제시된 바와 같은 핵산 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하는, 발현 벡터.
30. MAIT 세포를 단리하는 방법으로서,
(i) 말초 혈액 단핵구 세포(PBMC)를 제공하고;
(ii) PBMC에 자기 활성화된 세포 분류 (MACS) 및/또는 형광 활성화된 세포 분류(FACS)를 적용하여 이로부터 MAIT 세포를 단리함
을 포함하는, 방법.
31. CAR-MAIT 세포를 생산하는 방법으로서,
(i) 말초 혈액 단핵구 세포(PBMC)를 제공하고;
(ii) PBMC에 MACS 및/또는 FACS를 적용하여 이로부터 MAIT 세포를 단리하고;
(iii) 임의로, 단리된 MAIT 세포를 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체와 접촉시킴으로써 단리된 MAIT 세포를 활성화시키고;
(iv) 활성화된 MAIT 세포를, CAR을 암호화하는 핵산으로 형질도입하여 CAR-MAIT 세포를 생성시킴
을 포함하는 방법.
32. 30항 또는 31항에 있어서, PBMC에 MACS 및 FACS를 모두 적용하여 이로부터 MAIT 세포를 단리하는 것을 포함하고, 임의로 PBMC에, MACS에 이어서 FACS를 적용하는, 방법.
33. 30항 내지 32항 중 어느 한 항에 있어서, 단리된 MAIT 세포를 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체로 활성화시키는, 방법.
34. 31항 내지 33항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (iv)가 MAIT 세포를, CAR을 암호화하는 핵산으로 바이러스에 의해 또는 레트로바이러스에 의해 형질도입하는 것을 포함하고, 바람직하게는 핵산이 (i) CD4 항원 또는 (ii) T-세포 상의 적어도 하나 이상의 TCR V베타 영역, 바람직하게는 표 1에 나타낸 하나 이상의 TCR V베타 영역, 또는 하기 V베타 영역: Vb 1, Vb 2, Vb 3, Vb 5.1, Vb 7.1, Vb 8, Vb 12, Vb 13.1, Vb 17 및 Vb 20으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 T-세포 상의 하나 이상의 TCR V베타 영역을 표적화하는 CAR을 암호화하는, 방법.
35. 30항 내지 43항 중 어느 한 항에 있어서, MAIT 세포를 12항 내지 28항 중 어느 한 항에 따른 핵산 작제물 또는 29항에 따른 발현 벡터로 형질도입하는, 방법.
36. 30항 내지 35항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (iv) 이후의 후속 단계 에서 CAR-MAIT 세포를 확대시키는 것을 포함하는, 방법.
37. 30항 내지 36항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득되거나 수득될 수 있는, CAR-MAIT 세포.
38. 1항 내지 11항, 또는 37항 중 어느 한 항에 따른 MAIT 세포 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는, 약제학적 조성물.
39. 치료법에 사용하기 위한, 1항 내지 11항, 또는 37항 중 어느 한 항에 따른 MAIT 세포, 또는 38항에 따른 약제학적 조성물.
40. 1항 내지 11항, 또는 37항 중 어느 한 항, 또는 38항에 있어서,
(i) 면역요법; (ii) 암의 치료, 예방 또는 개선; (ii) 미생물 감염의 치료, 예방 또는 개선; 또는 (iv) 자가면역 질환의 치료, 예방 또는 개선에 사용하기 위한, MAIT 세포, 또는 약제학적 조성물.
41. 1항 내지 11항, 또는 37항 중 어느 한 항, 또는 38항에 있어서,
T-세포 악성종양, 임의로 고형 종양 또는 액체 종양의 치료, 예방 또는 개선에 사용하기 위한, 39항 또는 40항에 따라 사용하기 위한, MAIT 세포, 또는 약제학적 조성물.
42. 1항 내지 11항, 또는 37항 중 어느 한 항, 또는 38항에 있어서,
T 세포 악성종양이 말초 T 세포 림프종(PTCL) 또는 피부 T세포 림프종(CTCL)인, 41항에 따라 사용하기 위한, MAIT 세포, 또는 약제학적 조성물.
43. 1항 내지 11항, 또는 37항 중 어느 한 항, 또는 38항에 있어서,
(i) PTCL이 성인 T세포 급성 림프모구성 림프종 또는 백혈병(ATL); 장병증-관련 림프종; 간비장 림프종; 피하 지방층염-유사 림프종(SPTCL); 전구 T-세포 급성 림프모구성 림프종 또는 백혈병; 및 혈관면역모세포성 T-세포 림프종(AITL)으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 PTCL 하위유형이고;
(ii) CTCL이 균상 식육종(MF); 세자리 증후군(SS); 및 CD4+ 작은 중간 다형성 T-세포 림프증식성 장애인
41항에 따라 사용하기 위한, MAIT 세포, 또는 약제학적 조성물.
44. 1항 내지 11항, 또는 37항 중 어느 한 항, 또는 38항에 있어서, 바이러스(예를 들어, HIV, HBV, HTLV, EBV, HPV), 세균(예를 들어, TB) 또는 진균 감염의 치료, 예방 또는 개선, 또는 자가면역 질환, 예를 들어 전신 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 또는 중증 근무력증(myasthenia gravis)의 치료, 예방 또는 개선을 위한, 40항 내지 43항 중 어느 한 항에 따라 사용하기 위한, MAIT 세포, 또는 약제학적 조성물.
45. 1항 내지 11항, 또는 37항 중 어느 한 항, 또는 38항에 있어서, 용도가 자살 단백질을 암호화하는 서열을 촉발하는 것을 포함하고, 임의로 방법이 대상체에게 항-EGFR 항체 및/또는 카스파제-유도성 약물(CID)을 투여하는 것을 포함하는, 40항 내지 44항 중 어느 한 항에 따른 용도를 위한, MAIT 세포, 또는 약제학적 조성물.
46. 38항에 따른 약제학적 조성물을 제조하기 위한 공정으로서, 상기 공정이 치료학적 유효량의 1항 내지 11항, 또는 37항 중 어느 한 항에 따른 MAIT 세포, 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 조합하는 단계를 포함하는, 공정.
SEQUENCE LISTING <110> Imperial College Innovations Limited <120> Chimeric antigen receptor (CAR)-T cells <130> 115551PCT1 <150> 2105684.1 <151> 2021-04-21 <160> 36 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 458 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Asn Arg Gly Val Pro Phe Arg His Leu Leu Leu Val Leu Gln Leu 1 5 10 15 Ala Leu Leu Pro Ala Ala Thr Gln Gly Lys Lys Val Val Leu Gly Lys 20 25 30 Lys Gly Asp Thr Val Glu Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gln Lys Lys Ser 35 40 45 Ile Gln Phe His Trp Lys Asn Ser Asn Gln Ile Lys Ile Leu Gly Asn 50 55 60 Gln Gly Ser Phe Leu Thr Lys Gly Pro Ser Lys Leu Asn Asp Arg Ala 65 70 75 80 Asp Ser Arg Arg Ser Leu Trp Asp Gln Gly Asn Phe Pro Leu Ile Ile 85 90 95 Lys Asn Leu Lys Ile Glu Asp Ser Asp Thr Tyr Ile Cys Glu Val Glu 100 105 110 Asp Gln Lys Glu Glu Val Gln Leu Leu Val Phe Gly Leu Thr Ala Asn 115 120 125 Ser Asp Thr His Leu Leu Gln Gly Gln Ser Leu Thr Leu Thr Leu Glu 130 135 140 Ser Pro Pro Gly Ser Ser Pro Ser Val Gln Cys Arg Ser Pro Arg Gly 145 150 155 160 Lys 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Leu Leu Ser Asp Ser Gly Gln Val Leu Leu Glu Ser Asn Ile 370 375 380 Lys Val Leu Pro Thr Trp Ser Thr Pro Val Gln Pro Met Ala Leu Ile 385 390 395 400 Val Leu Gly Gly Val Ala Gly Leu Leu Leu Phe Ile Gly Leu Gly Ile 405 410 415 Phe Phe Cys Val Arg Cys Arg His Arg Arg Arg Gln Ala Glu Arg Met 420 425 430 Ser Gln Ile Lys Arg Leu Leu Ser Glu Lys Lys Thr Cys Gln Cys Pro 435 440 445 His Arg Phe Gln Lys Thr Cys Ser Pro Ile 450 455 <210> 2 <211> 114 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Gly Cys Arg Leu Leu Cys Cys Ala Val Leu Cys Leu Leu Gly Ala 1 5 10 15 Val Pro Ile Asp Thr Glu Val Thr Gln Thr Pro Lys His Leu Val Met 20 25 30 Gly Met Thr Asn Lys Lys Ser Leu Lys Cys Glu Gln His Met Gly His 35 40 45 Arg Ala Met Tyr Trp Tyr Lys Gln Lys Ala Lys Lys Pro Pro Glu Leu 50 55 60 Met Phe Val Tyr Ser Tyr Glu Lys Leu Ser Ile Asn Glu Ser Val Pro 65 70 75 80 Ser Arg Phe Ser Pro Glu Cys Pro Asn Ser Ser Leu Leu Asn Leu His 85 90 95 Leu His Ala Leu Gln Pro Glu Asp Ser Ala Leu Tyr Leu Cys Ala Ser 100 105 110 Ser 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tgaaagaccc cacctgtagg tttggcaagc tagcttaagt aacgccattt tgcaaggcat 60 ggaaaataca taactgagaa tagagaagtt cagatcaagg ttaggaacag agagacagca 120 gaatatgggc caaacaggat atctgtggta agcagttcct gccccggctc agggccaaga 180 acagatggtc cccagatgcg gtcccgccct cagcagtttc tagagaacca tcagatgttt 240 ccagggtgcc ccaaggacct gaaatgaccc tgtgccttat ttgaactaac caatcagttc 300 gcttctcgct tctgttcgcg cgcttctgct ccccgagctc aataaaagag cccacaaccc 360 ctcactcggc gcgccagtcc tccgatagac tgcgtcgccc gggtacccgt attcccaata 420 aagcctcttg ctgtttgcat ccgaatcgtg gactcgctga tccttgggag ggtctcctca 480 gattgattga ctgcccacct cgggggtctt tcatttggag gttccaccga gatttggaga 540 cccctgccca gggaccaccg acccccccgc cgggaggtaa gctggccagc ggtcgtttcg 600 tgtctgtctc tgtctttgtg cgtgtttgtg ccggcatcta atgtttgcgc ctgcgtctgt 660 actagttagc taactagctc tgtatctggc ggacccgtgg tggaactgac gagttctgaa 720 cacccggccg caaccctggg agacgtccca gggactttgg gggccgtttt tgtggcccga 780 cctgaggaag ggagtcgatg tggaatccga ccccgtcagg atatgtggtt ctggtaggag 840 acgagaacct aaaacagttc ccgcctccgt ctgaattttt gctttcggtt tggaaccgaa 900 gccgcgcgtc ttgtctgctg cagcgctgca gcatcgttct gtgttgtctc tgtctgactg 960 tgtttctgta tttgtctgaa aattagggcc agactgttac cactccctta agtttgacct 1020 taggtcactg gaaagatgtc gagcggatcg ctcacaacca gtcggtagat gtcaagaaga 1080 gacgttgggt taccttctgc tctgcagaat ggccaacctt taacgtcgga tggccgcgag 1140 acggcacctt taaccgagac ctcatcaccc aggttaagat caaggtcttt tcacctggcc 1200 cgcatggaca cccagaccag gtcccctaca tcgtgacctg ggaagccttg gcttttgacc 1260 cccctccctg ggtcaagccc tttgtacacc ctaagcctcc gcctcctctt cctccatccg 1320 ccccgtctct cccccttgaa cctcctcgtt cgaccccgcc tcgatcctcc ctttatccag 1380 ccctcactcc ttctctaggc gccggaatta gatctctcga ggttaacgaa ttctaccggg 1440 taggggaggc gcttttccca aggcagtctg gagcatgcgc tttagcagcc ccgctgggca 1500 cttggcgcta cacaagtggc ctctggcctc gcacacattc cacatccacc ggtaggcgcc 1560 aaccggctcc gttctttggt ggccccttcg cgccaccttc tactcctccc ctagtcagga 1620 agttcccccc cgccccgcag ctcgcgtcgt gcaggacgtg acaaatggaa gtagcacgtc 1680 tcactagtct cgtgcagatg gacagcaccg ctgagcaatg gaagcgggta ggcctttggg 1740 gcagcggcca atagcagctt tgctccttcg ctttctgggc tcagaggctg ggaaggggtg 1800 ggtccggggg cgggctcagg ggcgggctca ggggcggggc gggcgcccga aggtcctccg 1860 gaggcccggc attctgcacg cttcaaaagc gcacgtctgc cgcgctgttc tcctcttcct 1920 cattctccgg gcctttcgac ctgcagccca agccaccatg gctctgcctg ttacagctct 1980 gctgctgcct ctggctctgc ttctgcatgc cgccagacct gacatccaga tgacacagag 2040 ccctagcagc ctgtctgcct ctctcggcgg aaaagtgacc ctgacatgca aggccagcca 2100 ggacatcaac aagtatatcg cctggtatca gcacaagccc ggcaagggac ctagactgct 2160 gatccactac accagcacac tgcagcctgg catccccagc agattttctg gcagcggctc 2220 cggcagagac tacagcttca gcatcagcaa cctggaacct gaggacgtgg ccacctacta 2280 ctgcctgcag tacgacaacc tgcggacctt tggcggcgga acaaagctgg aaatcaagcg 2340 gacagatggc ggaggcggat caggcggcgg aggaagcggt ggcggaggat ctcaagttca 2400 gctgcaacag cctggcgccg agcttgtgaa acctggcgcc tctgtgaaga tgagctgcaa 2460 ggcctccggc tacaccttca ccagatactg gatcacctgg gtcaagcaga ggcctggaca 2520 gggactcgag tggatcggcg atatctatcc tggctccggc ttcaccaagt acaacgagaa 2580 gttcaagagc aaggccacac tgaccgtgga caccagcagc agcacagcct acatgcagct 2640 gtctagcctg accagcgagg acagcgccgt gtactactgt gctagagaag gcggcaacta 2700 ctggtacttc gacgtgtggg gcaccggcac cacagtgaca gttagttctg cggccgcggc 2760 cgcattcgtg ccggtcttcc tgccagcgaa gcccaccacg acgccagcgc cgcgaccacc 2820 aacaccggcg cccaccatcg cgtcgcagcc cctgtccctg cgcccagagg cgtgccggcc 2880 agcggcgggg ggcgcagtgc acacgagggg gctggacttc gcctgtgata tctacatctg 2940 ggcgcccttg gccgggactt gtggggtcct tctcctgtca ctggttatca ccctttactg 3000 caaccacagg aacaggagta agaggagcag gctcctgcac agtgactaca tgaacatgac 3060 tccccgccgc cccgggccca cccgcaagca ttaccagccc tatgccccac cacgcgactt 3120 cgcagcctat cgctcccgtt tctctgttgt taaacggggc agaaagaagc tcctgtatat 3180 attcaaacaa ccatttatga gaccagtaca aactactcaa gaggaagatg gctgtagctg 3240 ccgatttcca gaagaagaag aaggaggatg tgaactgaga gtgaagttca gcaggagcgc 3300 agacgccccc gcgtaccagc agggccagaa ccagctctat aacgagctca atctaggacg 3360 aagagaggag tacgatgttt tggacaagag acgtggccgg gaccctgaga tggggggaaa 3420 gccgagaagg aagaaccctc aggaaggcct gtacaatgaa ctgcagaaag ataagatggc 3480 ggaggcctac agtgagattg ggatgaaagg cgagcgccgg aggggcaagg ggcacgatgg 3540 cctttaccag ggtctcagta cagccaccaa ggacacctac gacgcccttc acatgcaggc 3600 cctgccccct cgcggatccg gagccacgaa cttctctctg ttaaagcaag caggagacgt 3660 ggaagaaaac cccggtccta tgcttctcct ggtgacaagc cttctgctct gtgagttacc 3720 acacccagca ttcctcctga tcccacgcaa agtgtgtaac ggaataggta ttggtgaatt 3780 taaagactca ctctccataa atgctacgaa tattaaacac ttcaaaaact gcacctccat 3840 cagtggcgat ctccacatcc tgccggtggc atttaggggt gactccttca cacatactcc 3900 tcctctggat ccacaggaac tggatattct gaaaaccgta aaggaaatca cagggttttt 3960 gctgattcag gcttggcctg aaaacaggac ggacctccat gcctttgaga acctagaaat 4020 catacgcggc aggaccaagc aacatggtca gttttctctt gcagtcgtca gcctgaacat 4080 aacatccttg ggattacgct ccctcaagga gataagtgat ggagatgtga taatttcagg 4140 aaacaaaaat ttgtgctatg caaatacaat aaactggaaa aaactgtttg ggacctccgg 4200 tcagaaaacc aaaattataa gcaacagagg tgaaaacagc tgcaaggcca caggccaggt 4260 ctgccatgcc ttgtgctccc ccgagggctg ctggggcccg gaacccaggg actgcgtctc 4320 ttgccggaat gtcagccgag gcagggaatg cgtggacaag tgcaaccttc tggagggtga 4380 gccaagggag tttgtggaga actctgagtg catacagtgc cacccagagt gcctgcctca 4440 ggccatgaac atcacctgca caggacgggg accagacaac tgtatccagt gtgcccacta 4500 cattgacggc ccccactgcg tcaagacctg cccggcagga gtcatgggag aaaacaacac 4560 cctggtctgg aagtacgcag acgccggcca tgtgtgccac ctgtgccatc caaactgcac 4620 ctacggatgc actgggccag gtcttgaagg ctgtccaacg aatgggccta agatcccgtc 4680 catcgccact gggatggtgg gggccctcct cttgctgctg gtggtggccc tggggatcgg 4740 cctcttcatg ggatctggag ccacgaactt ctctctgtta aagcaagcag gagacgtgga 4800 agaaaacccc ggtcctatgc tcgagggagt gcaggtggaa accatctccc caggagacgg 4860 gcgcaccttc cccaagcgcg gccagacctg cgtggtgcac tacaccggga tgcttgaaga 4920 tggaaagaaa gttgattcct cccgggacag aaacaagccc tttaagttta tgctaggcaa 4980 gcaggaggtg atccgaggct gggaagaagg ggttgcccag atgagtgtgg gtcagagagc 5040 caaactgact atatctccag attatgccta tggtgccact gggcacccag gcatcatccc 5100 accacatgcc actctcgtct tcgatgtgga gcttctaaaa ctggaatctg gcggtggatc 5160 cggagtcgac ggatttggtg atgtcggtgc tcttgagagt ttgaggggaa atgcagattt 5220 ggcttacatc ctgagcatgg agccctgtgg ccactgcctc attatcaaca atgtgaactt 5280 ctgccgtgag tccgggctcc gcacccgcac tggctccaac atcgactgtg agaagttgcg 5340 gcgtcgcttc tcctcgctgc atttcatggt ggaggtgaag ggcgacctga ctgccaagaa 5400 aatggtgctg gctttgctgg agctggcgca gcaggaccac ggtgctctgg actgctgcgt 5460 ggtggtcatt ctctctcacg gctgtcaggc cagccacctg cagttcccag gggctgtcta 5520 cggcacagat ggatgccctg tgtcggtcga gaagattgtg aacatcttca atgggaccag 5580 ctgccccagc ctgggaggga agcccaagct ctttttcatc caggcctgtg gtggggagca 5640 gaaagaccat gggtttgagg tggcctccac ttcccctgaa gacgagtccc ctggcagtaa 5700 ccccgagcca gatgccaccc cgttccagga aggtttgagg accttcgacc agctggacgc 5760 catatctagt ttgcccacac ccagtgacat ctttgtgtcc tactctactt tcccaggttt 5820 tgtttcctgg agggacccca agagtggctc ctggtacgtt gagaccctgg acgacatctt 5880 tgagcagtgg gctcactctg aagacctgca gtccctcctg cttagggtcg ctaatgctgt 5940 ttcggtgaaa gggatttata aacagatgcc tggttgcttt aatttcctcc ggaaaaaact 6000 tttctttaaa acatcagtcg actatccgta cgacgtacca gactacgcac tcgactaaac 6060 aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 6120 ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 6180 atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 6240 tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 6300 ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 6360 attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 6420 ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaatcat cgtcctttcc ttggctgctc 6480 gcctgtgttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 6540 aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 6600 cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc tatcgataaa 6660 ataaaagatt ttatttagtc tccagaaaaa ggggggaatg aaagacccca cctgtaggtt 6720 tggcaagcta gcttaagtaa cgccattttg caaggcatgg aaaatacata actgagaata 6780 gagaagttca gatcaaggtt aggaacagag agacagcaga atatgggcca aacaggatat 6840 ctgtggtaag cagttcctgc cccggctcag ggccaagaac agatggtccc cagatgcggt 6900 cccgccctca gcagtttcta gagaaccatc agatgtttcc agggtgcccc aaggacctga 6960 aatgaccctg tgccttattt gaactaacca atcagttcgc ttctcgcttc tgttcgcgcg 7020 cttctgctcc ccgagctcaa taaaagagcc cacaacccct cactcggcgc gccagtcctc 7080 cgatagactg cgtcgcccgg gtacccgtgt atccaataaa ccctcttgca gttgcatccg 7140 acttgtggtc tcgctgttcc ttgggagggt ctcctctgag tgattgacta cccgtcagcg 7200 ggggtctttc atgggtaaca gtttcttgaa gttggagaac aacattctga gggtaggagt 7260 cgaatattaa gtaatcctga ctcaattagc cactgttttg aatccacata ctccaatact 7320 cctgaaatag ttcattatgg acagcgcaga agagctgggg agaattaatt cgtaatcatg 7380 gtcatagctg tttcctgtgt gaaattgtta tccgctcaca attccacaca acatacgagc 7440 cggaagcata aagtgtaaag cctggggtgc ctaatgagtg agctaactca cattaattgc 7500 gttgcgctca ctgcccgctt tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc attaatgaat 7560 cggccaacgc gcggggagag gcggtttgcg tattgggcgc tcttccgctt cctcgctcac 7620 tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt 7680 aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca 7740 gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc 7800 ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact 7860 ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct 7920 gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag 7980 ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca 8040 cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa 8100 cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc 8160 gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag 8220 aaggacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg 8280 tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca 8340 gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc 8400 tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag 8460 gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata 8520 tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat 8580 ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg 8640 ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac gctcaccggc 8700 tccagattta tcagcaataa accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc 8760 aactttatcc gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc 8820 gccagttaat agtttgcgca acgttgttgc cattgctaca ggcatcgtgg tgtcacgctc 8880 gtcgtttggt atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc 8940 ccccatgttg tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa 9000 gttggccgca gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg cataattctc ttactgtcat 9060 gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat tctgagaata 9120 gtgtatgcgg cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaata cgggataata ccgcgccaca 9180 tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag 9240 gatcttaccg ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc 9300 agcatctttt actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc 9360 aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc tttttcaata 9420 ttattgaagc atttatcagg gttattgtct catgagcgga tacatatttg aatgtattta 9480 gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac ctgacgtcta 9540 agaaaccatt attatcatga cattaaccta taaaaatagg cgtatcacga ggccctttcg 9600 tctcgcgcgt ttcggtgatg acggtgaaaa cctctgacac atgcagctcc cggagacggt 9660 cacagcttgt ctgtaagcgg atgccgggag cagacaagcc cgtcagggcg cgtcagcggg 9720 tgttggcggg tgtcggggct ggcttaacta tgcggcatca gagcagattg tactgagagt 9780 gcaccatatg cggtgtgaaa taccgcacag atgcgtaagg agaaaatacc gcatcaggcg 9840 ccattcgcca ttcaggctgc gcaactgttg ggaagggcga tcggtgcggg cctcttcgct 9900 attacgccag ctggcgaaag ggggatgtgc tgcaaggcga ttaagttggg taacgccagg 9960 gttttcccag tcacgacgtt gtaaaacgac ggcgcaagga atggtgcatg caaggagatg 10020 gcgcccaaca gtcccccggc cacggggcct gccaccatac ccacgccgaa acaagcgctc 10080 atgagcccga agtggcgagc ccgatcttcc ccatcggtga tgtcggcgat ataggcgcca 10140 gcaaccgcac ctgtggcgcc ggtgatgccg gccacgatgc gtccggcgta gaggcgatta 10200 gtccaatttg ttaaagacag gatatcagtg gtccaggctc tagttttgac tcaacaatat 10260 caccagctga agcctataga gtacgagcca tagataaaat aaaagatttt atttagtctc 10320 cagaaaaagg ggggaa 10336

Claims (33)

  1. 항-CD4 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor)(CAR)를 암호화하는, 제1 암호화(coding) 서열에 작동적으로 연결된 프로모터(promoter)를 포함하는 핵산 작제물.
  2. 제1항에 있어서,
    프로모터가 구성적 프로모터, 활성화 가능한 프로모터, 유도성 프로모터, 또는 조직-특이적 프로모터인, 작제물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    프로모터가 사이토메갈로바이러스(Cytomegalovirus)(CMV) 프로모터, 인간 신장 인자-1 알파(hEFa), 유비퀴틴 C 프로모터(UbiC), 포스포글리세로키나제 프로모터(PGK), 원숭이 바이러스 40 초기 프로모터(SV40), 또는 CMV 초기 인핸서(enhancer)와 결합된 치킨(chicken) β-액틴 프로모터(CAGG)인, 작제물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    프로모터가 PGK 프로모터이고, 임의로 프로모터가 실질적으로 서열번호 3에 제시된 바와 같은 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하는, 작제물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    CAR이, 실질적으로 서열번호 1에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 또는 이의 변이체 또는 단편을 포함하는 CD4 항원에 특이적인, 작제물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    제1 암호화 서열이, 실질적으로 서열번호 6에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고/하거나; 제1 암호화 서열이, 실질적으로 서열번호 7에 제시된 바와 같은 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하는, 작제물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    제1 암호화 서열이, 실질적으로 서열번호 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고/하거나; 제1 암호화 서열이, 실질적으로 서열번호 9에 제시된 바와 같은 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하는, 작제물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    CD8a 힌지(hinge) 및 막관통(transmembrane)(TM) 구조 도메인(structure domain)을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 작제물.
  9. 제8항에 있어서,
    실질적으로 서열번호 14에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고/하거나; 실질적으로 서열번호 15에 제시된 바와 같은 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하는, 작제물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    CD28의 신호전달(signalling) 도메인, 4-1BB의 신호전달 도메인 및/또는 CD3ζ 쇄, 및 더욱 바람직하게는 CD28의 신호전달 도메인, 4-1BB의 신호전달 도메인 및 CD3ζ 쇄를 포함하는 세포내 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 작제물.
  11. 제10항에 있어서,
    실질적으로 서열번호 16에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고/하거나; 실질적으로 서열번호 17에 제시된 바와 같은 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하는, 작제물.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서,
    실질적으로 서열번호 18에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고/하거나; 실질적으로 서열번호 19에 제시된 바와 같은 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하는, 작제물.
  13. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    실질적으로 서열번호 20에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고/하거나; 실질적으로 서열번호 21에 제시된 바와 같은 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하는, 작제물.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    핵산 작제물이 적어도 하나의 자살 단백질(suicide protein), 및 더욱 바람직하게는 적어도 2개의 자살 단백질을 암호화하는 제2 암호화 서열을 포함하는, 작제물.
  15. 제14항에 있어서,
    제2 암호화 서열이 (i) 표피 성장 인자 수용체(epidermal growth factor receptor)(EGFR), 또는 절두된 표피 성장 인자 수용체(truncated epidermal growth factor receptor)(tEGFR); 및/또는 (ii) 유도성 카스파제(inducible caspase)-9(iC9)를 암호화하는, 작제물.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서,
    (i) 표피 성장 인자 수용체(EGFR), 또는 절두된 표피 성장 인자 수용체(tEGFR); 및 (ii) 유도성 카스파제-9(iC9)를 암호화하는, 작제물.
  17. 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    실질적으로 서열번호 22에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고/하거나; 실질적으로 서열번호 23에 제시된 바와 같은 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하는, 작제물.
  18. 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    실질적으로 서열번호 24에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고/하거나; 실질적으로 서열번호 25에 제시된 바와 같은 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하는, 작제물.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    실질적으로 서열번호 29에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 작제물.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    실질적으로 서열번호 30에 제시된 바와 같은 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하는, 작제물.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 핵산 작제물을 암호화하는 발현 벡터(expression vector).
  22. 제21항에 있어서,
    실질적으로 서열번호 33에 제시된 바와 같은 핵산 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하는, 발현 벡터.
  23. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 작제물, 또는 제21항 또는 제22항의 벡터를 포함하는 T-세포로서, 임의로 여기서 T-세포가 항-CD4 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는, T-세포.
  24. 제23항에 있어서,
    점막 관련 불변 T(mucosal-associated invariant T)(MAIT) 세포인, T-세포.
  25. 제23항 또는 제24항에 따른 T-세포, 및 약제학적으로 허용되는 부형제(excipient)를 포함하는 약제학적 조성물.
  26. 제23항 또는 제24항, 또는 제25항에 있어서,
    치료법(therapy)에 사용하기 위한, T-세포, 또는 약제학적 조성물.
  27. 제23항 또는 제24항, 또는 제25항에 있어서,
    (i) 면역요법; (ii) 암의 치료, 예방 또는 개선; (ii) 미생물 감염의 치료, 예방 또는 개선; 또는 (iv) 자가면역 질환의 치료, 예방 또는 개선에 사용하기 위한, T-세포, 또는 약제학적 조성물.
  28. 제23항 또는 제24항, 또는 제25항에 있어서,
    T-세포 악성종양, 임의로 고형 종양 또는 액체 종양의 치료, 예방 또는 개선에 사용하기 위한, 제26항 또는 제27항에 따라 사용하기 위한, T-세포, 또는 약제학적 조성물.
  29. 제23항 또는 제24항, 또는 제25항에 있어서,
    T-세포 악성종양이 말초 T 세포 림프종(Peripheral T-cell lymphoma)(PTCL) 또는 피부 T세포 림프종(Cutaneous T-cell lymphoma)(CTCL)인, 제28항에 따라 사용하기 위한, T-세포, 또는 약제학적 조성물.
  30. 제23항 또는 제24항, 또는 제25항에 있어서,
    (i) PTCL이 성인 T-세포 급성 림프모구성 림프종 또는 백혈병(Adult T-Cell Acute Lymphoblastic Lymphoma or Leukaemia)(ATL); 장병증-관련 림프종(Enteropathy-Associated Lymphoma); 간비장 림프종(Hepatosplenic Lymphoma); 피하 지방층염-유사 림프종(Subcutaneous Panniculitis-Like Lymphoma)(SPTCL); 전구 T-세포 급성 림프모구성 림프종 또는 백혈병(Precursor T-Cell Acute Lymphoblastic Lymphoma or Leukaemia); 및 혈관면역모세포성 T-세포 림프종(Angioimmunoblastic T-cell lymphoma)(AITL)으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 PTCL 하위유형이고; 및/또는
    (ii) CTCL이 균상 식육종(Mycosis fungoides)(MF); 세자리 증후군(Sezary syndrome)(SS); 및 CD4+ 작은 중간 다형성 T 세포 림프증식성 장애(small medium pleomorphic T-cell lymphoproliferative disorder)로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 CTCL 하위유형인,
    제41항에 따라 사용하기 위한, T-세포, 또는 약제학적 조성물.
  31. 제23항 또는 제24항, 또는 제25항에 있어서,
    (i) 바이러스 감염, 임의로 HIV, HBV, HTLV, EBV 또는 HPV, (ii) 세균 감염, 임의로 TB, 또는 (iii) 진균 감염의 치료, 예방 또는 개선, 또는 자가면역 질환, 예를 들어 전신 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 또는 중증 근무력증(myasthenia gravis)의 치료, 예방 또는 개선을 위한, 제27항에 따라 사용하기 위한, T-세포, 또는 약제학적 조성물.
  32. 제23항 또는 제24항, 또는 제25항에 있어서,
    용도가 자살 단백질을 암호화하는 서열을 촉발하는 것을 포함하고, 임의로 방법이 대상체에게 항-EGFR 항체 및/또는 카스파제-유도성 약물(caspase-inducible drug)(CID)을 투여하는 것을 포함하는, 제26항 내지 제31항 중 어느 한 항에 따른 용도를 위한, T-세포, 또는 약제학적 조성물.
  33. 제25항에 따른 약제학적 조성물을 제조하기 위한 공정으로서, 상기 공정이 치료학적 유효량의 제23항 또는 제24항에 따른 T-세포,및 약제학적으로 허용되는 부형제를 조합하는 단계를 포함하는, 공정.
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