TW201928052A - 靶向ny-eso-1的基因修飾免疫細胞及其用途 - Google Patents

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Abstract

本發明提供經修飾的免疫細胞（例如，經修飾的T細胞），其包含對NY-ESO-1具有特異性的外源性T細胞受體（TCR）。本發明提供經修飾的免疫細胞或其前體（例如，經修飾的T細胞），其包含外源性TCR和切換受體。本發明還提供經基因編輯修飾的細胞，使得內源性T細胞受體基因（例如，TRAC、TRBC）或內源性免疫檢查點基因（例如，PD-1或TIM-3）中的一或多種的表現被下調。

Description

靶向NY-ESO-1的基因修飾免疫細胞及其用途
本發明係關於靶向NY-ESO-1的基因修飾免疫細胞及其用途。
紐約食道鱗狀細胞癌1（New York esophageal squamous cell carcinoma 1，NY-ESO-1）蛋白係由CTAG1B基因所編碼，且最初係透過一種稱為血清學表現（serological expression，SEREX）複製的方法從人類腫瘤之重組cDNA表現庫鑑定為一種人類腫瘤抗原。NY-ESO-1屬於癌症-睪丸（cancer-testis ，CT）抗原蛋白群，其功能尚不清楚。
透過RT-PCR技術檢測，除了睪丸和卵巢以外，並未在其他正常組織中檢測到NY-ESO-1。另一方面，在分子和蛋白層級下，在許多類型的腫瘤中都有觀察到NY-ESO-1表現，包括骨髓瘤、肉瘤、黑色素瘤和其他實體瘤。
在多發性骨髓瘤中，NY-ESO-1的檢測結果根據研究而有所不同。分子和免疫組織化學分析已經證明在所測試的所有多發性骨髓瘤樣品中NY-ESO-1表現範圍為約7％至56％。整體而言，在多份報告中，在晚期疾病階段以及在具有異常細胞基因學特徵的骨髓瘤（約佔總病患群體的三分之一）中有觀察到NY-ESO-1的增加。
據報導，NY-ESO-1蛋白在肉瘤樣品中的表現大於等於80％。滑膜肉瘤（Synovial sarcoma，SS）和黏液樣/圓形細胞脂肪肉瘤（Myxoid/Round Cell Liposarcoma，MRCL）其NY-ESO-1表現程度最高。研究結果顯示強烈且均勻的染色模式，超過70％的滑膜肉瘤和黏液樣/圓形細胞脂肪肉瘤樣品在超過一半的惡性細胞中出現強烈的訊號。在陽性樣品中，NY-ESO-1表現在細胞內，且表現主要位在細胞質。
根據研究和轉移狀態，黑色素瘤樣品有不同程度的NY-ESO-1表現。一項報告顯示，NY-ESO-1不表現在原發性腫瘤中，但在28％的轉移樣本中有檢測到，而另外兩項研究顯示約45％的黑色素瘤樣品為NY-ESO-1陽性，且表現程度與腫瘤分期無關。此外，在不同形態的轉移瘤中所觀察到的NY-ESO-1表現亦有不同。還有研究指出，NY-ESO-1表現與腫瘤厚度呈正相關，且與腫瘤浸潤淋巴細胞呈負相關。
因此，本領域需要靶向NY-ESO-1的新型腫瘤療法。本發明致力於滿足這種需要。
本發明基於以下發現：具有外源性目標特異性T細胞受體（例如，NY-ESO-1 T細胞受體）的基因修飾的免疫細胞（例如，T細胞）在腫瘤微環境中展現出增強的目標腫瘤細胞毒殺功效。免疫細胞可以經基因修飾以包括外源性受體（例如，切換受體）和/或經基因編輯以破壞一或多種會抑制腫瘤微環境中免疫細胞增生的內源性受體（例如，T細胞受體基因和/或免疫檢查點蛋白）其表現。
相應地，在某些實施例中，本文提供了經修飾的T細胞，包括外源T細胞受體（TCR），其對目標細胞上的NY-ESO-1有親和力，其中內源性受體（例如，T細胞受體α鏈編碼序列、T細胞受體β鏈編碼序列和/或內源性PD1編碼序列）的表現被下調。在其他方面，本發明提供經修飾的T細胞，包括外源T細胞受體（TCR）和切換受體，外源T細胞受體對目標細胞上的NY-ESO-1有親和力，其中內源性T細胞受體α鏈編碼序列和內源性T細胞受體β鏈編碼序列的表現被下調。
在一實施例中，本文提供一種經修飾的T細胞，包括外源T細胞受體（TCR），外源T細胞受體對目標細胞上的NY-ESO-1有親和力，其中內源性T細胞受體編碼序列和/或內源性免疫檢查點編碼序列的表現被下調。
在一些示例性實施例中，免疫檢查點編碼序列編碼一免疫檢查點蛋白，免疫檢查點蛋白係選自於由PD1、A2AR、B7-H3（CD276）、B7-H4（VTCN1）、BTLA（CD272）、CD96、CTLA-4（CD152）、IDO、KIR、LAG3、TIGIT、TIM-3和VISTA所組成之群組。
在一些示例性實施例中，內源性TCR編碼序列為TRAC或TRBC。
在一些示例性實施例中，至少一核苷酸取代（substitution）、缺失（deletion）、插入（insertion）和/或插入/缺失係位在包括SEQ ID NO：128所示之核酸序列的內源性T細胞受體α鏈的編碼序列中，從而導致內源性T細胞受體α鏈的編碼序列的表現被下調。
在一些示例性實施例中，至少一核苷酸取代、缺失、插入和/或插入/缺失係位在包括SEQ ID NO：129所示之核酸序列的內源性T細胞受體β鏈編碼序列中，從而導致內源性T細胞受體β鏈編碼序列的表現被下調。
在一些示例性實施例中，至少一核苷酸取代、缺失、插入和/或插入/缺失係位在包括SEQ ID NO：130所示之核酸序列的內源性PD1鏈編碼序列中，從而導致內源性PD1編碼序列的表現被下調。
在一些示例性實施例中，可選地，至少一核苷酸取代、缺失、插入和/或插入/缺失係位在內源性編碼序列中，內源性編碼序列係選自A2AR、B7-H3（CD276）、B7-H4（VTCN1）、BTLA（CD272）、CD96、CTLA-4（CD152）、IDO、KIR、LAG3、TIGIT、TIM-3和VISTA，從而導致內源性A2AR、B7-H3（CD276）、 B7-H4（VTCN1）、BTLA（CD272）、CD96、CTLA-4（CD152）、IDO、KIR、LAG3、TIGIT、TIM-3或VISTA編碼序列的表現被下調。
在一些示例性實施例中，外源性T細胞受體包括一T細胞受體α鏈，且T細胞受體α鏈包括SEQ ID NO：5所示之胺基酸序列。
在一些示例性實施例中，外源性T細胞受體包括一T細胞受體β鏈，且T細胞受體β鏈包括SEQ ID NO：12所示之胺基酸序列。
在另一實施例中，本文提供一種經修飾的T細胞，包括：a）一外源性T細胞受體（TCR），其對一目標細胞上的NY-ESO-1有親和力，其中外源性T細胞受體包括：（i）T細胞受體α鏈，包括SEQ ID NO：5所示之胺基酸序列；以及（ⅱ）T細胞受體β鏈，包括SEQ ID NO：12 所示之胺基酸序列；b）在包括SEQ ID NO：128所示之核酸序列的一內源性T細胞受體α鏈的編碼序列中具有至少一核苷酸取代、缺失、插入和/或插入/缺失；以及c）在包括SEQ ID NO：129所示之核酸序列的一內源性T細胞受體β鏈的編碼序列中有至少一核苷酸取代、缺失、插入和/或插入/缺失，其中內源性T細胞受體α鏈和內源性T細胞受體β鏈的編碼序列表現被下調。
在一些示例性實施例中，經修飾的T細胞更包括至少一核苷酸取代、缺失、插入和/或插入/缺失位在一內源性編碼序列中，該內源性編碼序列係選自PD1、A2AR、B7-H3（CD276）、B7-H4（VTCN1）、BTLA（CD272）、CD96、CTLA-4（CD152）、IDO、KIR、LAG3、TIGIT、TIM-3和VISTA。
在一些示例性實施例中，經修飾的T細胞更包括d）至少一核苷酸取代、缺失、插入和/或插入/缺失位在包括SEQ ID NO：130所示之核酸序列的一內源性PD1編碼序列中。
在一些示例性實施例中，經修飾的T細胞為一自體T細胞。
在一些示例性實施例中，自體T細胞係衍生自人類。
在一些示例性實施例中，自體T細胞為CD3+ T細胞。
在另一實施例中，本文提供一種經修飾的T細胞，包括一外源性T細胞受體（TCR），該外源性T細胞受體對目標細胞上的NY-ESO-1有親和力，其中一內源性T細胞受體α鏈的編碼序列及一內源性T細胞受體β鏈的編碼序列的表現被下調。
在一些示例性實施例中，至少一核苷酸取代、缺失、插入和/或插入/缺失係位在包括SEQ ID NO：128所示核酸序列的內源性T細胞受體α鏈的編碼序列中，從而導致內源性T細胞受體α鏈的編碼序列的表現被下調。
在一些示例性實施例中，其中至少一核苷酸取代、缺失、插入和/或插入/缺失係位在包括SEQ ID NO：129所示之核酸序列的內源性T細胞受體β鏈的編碼序列中，從而導致內源性T細胞受體β鏈的編碼序列的表現被下調。
在另一實施例中，本文提供一種經修飾的T細胞，包括：a）一外源性T細胞受體（TCR），其對一目標細胞上的NY-ESO-1有親和力，其中外源性T細胞受體包括：（i）T細胞受體α鏈，包括SEQ ID NO：5所示之胺基酸序列；以及（ⅱ）T細胞受體β鏈，包括SEQ ID NO：12所示之胺基酸序列；b）在包括SEQ ID NO：128所示之核酸序列的一內源性T細胞受體α鏈的編碼序列中有至少一核苷酸取代、缺失、插入和/或插入/缺失c）在包括SEQ ID NO：129所示之核酸序列的一內源性T細胞受體β鏈的編碼序列中有至少一核苷酸取代、缺失、插入和/或插入/缺失；以及d）在包括SEQ ID NO：130所示之核酸序列的一內源性PD1編碼序列中有至少一核苷酸取代、缺失、插入和/或插入/缺失；其中內源性T細胞受體α鏈的編碼序列、內源性T細胞受體β鏈的編碼序列及內源性PD1編碼序列的表現被下調。
在一些示例性實施例中，經修飾的T細胞更包括至少一核苷酸取代、缺失、插入和/或插入/缺失位在一內源性編碼序列中，且內源性編碼序列係選自A2AR、B7-H3（CD276）、B7-H4（VTCN1）、BTLA（CD272）、CD96、CTLA-4（CD152）、IDO、KIR、LAG3、PD1、TIGIT、TIM-3和VISTA。
在一些示例性實施例中，經修飾的T細胞更包括一切換受體（switch receptor）。
在一些示例性實施例中，切換受體包括：一第一結構域，其中第一結構域係衍生自一第一多肽，且第一多肽與一負向信號（negative signal）相關聯；以及一第二結構域，其中第二結構域係衍生自一第二多肽，且第二多肽與一正向信號（positive signal）相關聯。
在一些示例性實施例中，第一結構域包括第一多肽的一細胞外結構域的至少一部分，且第一多肽與一負向信號相關聯，且其中第二結構域包括與第二多肽的一細胞內結構域的至少一部分，且第二多肽與一正向信號相關聯。
在一些示例性實施例中，切換受體更包括一切換受體跨膜結構域。
在一些示例性實施例中，切換受體跨膜結構域包括：一第一多肽的一跨膜結構域，且第一多肽與一負向信號相關聯；或者一第二多肽的一跨膜結構域，且第二多肽與一正向信號相關聯。
在一些示例性實施例中，與一負向信號相關聯的第一多肽係選自於由TIM-3、CTLA4、PD-1、BTLA和TGFβR所組成之群組。
在一些示例性實施例中，與一負向信號相關聯的第一多肽為一變異型PD-1變異型，變異型PD-1相對於野生型PD-1的胺基酸序列，在胺基酸位置132的丙胺酸被取代為亮胺酸。
在一些示例性實施例中，與一正向信號相關聯的第二多肽係選自於由4-1BB、CD28、ICOS和IL-12R所組成之群組。
在一些示例性實施例中，切換受體包括：第一結構域，一第一結構域，包括PD1的細胞外結構域的至少一部分；一切換受體跨膜結構域，且切換受體跨膜結構域包括CD28的跨膜結構域的至少一部分；以及一第二結構域，包括CD28的胞內結構域的至少一部分。
在一些示例性實施例中，切換受體包括第一結構域，一第一結構域，包括PD-1的胞外結構域的至少一部分，其中PD-1為一變異型，且變異型PD-1相對於野生型PD-1的胺基酸序列，在胺基酸位置132的丙胺酸被取代為亮胺酸；一第二結構域，包括一切換受體跨膜結構域，且切換受體跨膜結構域包括CD28的跨膜結構域的至少一部分；以及一第三結構域，包括CD28的胞內結構域的至少一部分。
在一些示例性實施例中，切換受體包括一第一結構域，包括PD-1的胞外結構域的至少一部分；一第二結構域，包括一切換受體跨膜結構域，其包括CD8α的跨膜結構域的至少一部分；以及一第三結構域，包括4-1BB的胞內結構域的至少一部分。
在一些示例性實施例中，切換受體包括一第一結構域，包括PD-1的胞外結構域的至少一部分，其中PD-1為一變異型，且變異型PD-1相對於野生型PD-1的胺基酸序列，在胺基酸位置132的丙胺酸被取代為亮胺酸；一第二結構域，包括一切換受體跨膜結構域，且切換受體跨膜結構域包括CD8α的跨膜結構域的至少一部分；以及一第三結構域，包括CD28的胞內結構域的至少一部分。
在一些示例性實施例中，切換受體包括SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：134、SEQ ID NO：136或SEQ ID NO：138中任一者所示之胺基酸序列。
在一些示例性實施例中，切換受體包括：一第一結構域，包括TIM-3的胞外結構域的至少一部分；一第二結構域，包括一切換受體跨膜結構域，且切換受體跨膜結構域包括CD28的跨膜結構域的至少一部分；以及一第三結構域，包括CD28的胞內結構域的至少一部分。
在一些示例性實施例中，切換受體包括SEQ ID NO：132所示之胺基酸序列。
在一些示例性實施例中，切換受體包括：一第一結構域，包括TGFβR的細胞外結構域的至少一部分；一第二結構域，包括IL-12R的細胞內結構域的至少一部分。
在一些示例性實施例中，切換受體包括SEQ ID NO：16所示之胺基酸序列。
在一些示例性實施例中，切換受體包括SEQ ID NO：18所示之胺基酸序列。
在一些示例性實施例中，切換受體包括一野生型蛋白的一截短變異型（truncated variant），且野生型蛋白與一負向信號相關聯。
在一些示例性實施例中，切換受體包括SEQ ID NO：20所示之胺基酸序列。
在另一實施例中，本文提供一種經修飾的T細胞，包括：a）一外源性T細胞受體（TCR），其對一目標細胞上的NY-ESO-1有親和力，其中外源性T細胞受體包括：（i）T細胞受體α鏈，包括SEQ ID NO：5所示之胺基酸序列；以及（ⅱ）T細胞受體β鏈，包括SEQ ID NO：12所示之胺基酸序列；b）在包括SEQ ID NO：128所示之核酸序列的一內源性T細胞受體α鏈的編碼序列中有至少一核苷酸取代、缺失、插入和/或插入/缺失；c）在包括SEQ ID NO：129所示之核酸序列的一內源性T細胞受體β鏈的編碼序列中有至少一核苷酸取代、缺失、插入和/或插入/缺失；以及d）一切換受體，包括SEQ ID NO：14所示之胺基酸序列，其中內源性T細胞受體α鏈的編碼序列的表現以及內源性T細胞受體β鏈的編碼序列的表現被下調。
在另一實施例中，本文提供一種經修飾的T細胞，包括：a）一外源性T細胞受體（TCR），其對一目標細胞上的NY-ESO-1有親和力，其中外源性T細胞受體包括：（i）T細胞受體α鏈，包括SEQ ID NO：5所示之胺基酸序列；以及和（ⅱ）T細胞受體β鏈，包括SEQ ID NO：12所示之胺基酸序列；b）在包括SEQ ID NO：128所示之核酸序列的一內源性T細胞受體α鏈的編碼序列中有至少一核苷酸取代、缺失、插入和/或插入/缺失；c）在包括SEQ ID NO：129所示之核酸序列的一內源性T細胞受體β鏈的編碼序列中有至少一核苷酸取代、缺失、插入和/或插入/缺失；以及d）一切換受體，包括SEQ ID NO：136所示之胺基酸序列，其中內源性T細胞受體α鏈的編碼序列的表現以及內源性T細胞受體β鏈的編碼序列的表現被下調。
在另一實施例中，本文提供一種經修飾的T細胞，包括：a）一外源性T細胞受體（TCR），其對一目標細胞上的NY-ESO-1有親和力，其中外源性T細胞受體包括：（i）T細胞受體α鏈，包括SEQ ID NO：5所示之胺基酸序列；以及（ⅱ）T細胞受體β鏈，包括SEQ ID NO：12所示之胺基酸序列；b）在包括SEQ ID NO：128所示之核酸序列的一內源性T細胞受體α鏈的編碼序列中有至少一核苷酸取代、缺失、插入和/或插入/缺失；c）在包括SEQ ID NO：129所示之核酸序列的一內源性T細胞受體β鏈的編碼序列中有至少一核苷酸取代、缺失、插入和/或插入/缺失；d）在一內源性TIM-3編碼序列中有至少一核苷酸取代、缺失、插入和/或插入/缺失；以及e）一切換受體，包括SEQ ID NO：14所示之胺基酸序列，其中內源性T細胞受體α鏈的編碼序列的表現、且內源性T細胞受體β鏈的編碼序列的表現和內源性TIM-3編碼序列的表現被下調。
在另一實施例中，本文提供一種經修飾的T細胞，包括：a）一外源性T細胞受體（TCR），其對一目標細胞上的NY-ESO-1有親和力，其中外源性T細胞受體包括：（i）T細胞受體α鏈，包括SEQ ID NO：5所示之胺基酸序列；以及（ⅱ）T細胞受體β鏈，包括SEQ ID NO：12所示之胺基酸序列；b）在包括SEQ ID NO：128所示之核酸序列的一內源性T細胞受體α鏈的編碼序列中有至少一核苷酸取代、缺失、插入和/或插入/缺失；c）在包括SEQ ID NO：129所示之核酸序列的一內源性T細胞受體β鏈的編碼序列中有至少一核苷酸取代、缺失、插入和/或插入/缺失；d）一內源性編碼序列中的至少一核苷酸取代、缺失、插入和/或插入/缺失，且內源性編碼序列係選自A2AR、B7-H3 (CD276)、B7-H4 (VTCN1)、BTLA (CD272)、CD96、CTLA-4 (CD152)、IDO、KIR、LAG3、PD1、TIGIT、TIM-3和VISTA；以及e）一切換受體，包括SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：134、SEQ ID NO：136和SEQ ID NO：138中任一者所示之胺基酸序列，其中內源性T細胞受體α鏈的編碼序列、內源性T細胞受體β鏈的編碼序列和/或選自A2AR、B7-H3（CD276）、B7-H4（VTCN1）、BTLA（CD272）、CD96、CTLA-4（CD152）、IDO、KIR、LAG3、PD1、TIGIT、TIM-3或VISTA的內源性編碼序列的表現被下調。
在另一實施例中，本文提供一種產生經修飾的T細胞的方法，包括：a）將一第一核酸導入一T細胞中，且第一核酸包括編碼一外源性T細胞受體（TCR）的一核酸序列，且外源性T細胞受體對一目標細胞上的NY-ESO-1有親和力；以及b）將一或多個核酸導入T細胞中，一或多個核酸具有下調一或多個內源性基因其基因表現的能力，一或多個內源性基因係選自於由T細胞受體α鏈、T細胞受體β鏈、A2AR、B7-H3（CD276）、B7-H4（VTCN1）、BTLA（CD272）、CD96、CTLA-4（CD152）、IDO、KIR、LAG3、PD1、TIGIT、TIM-3和VISTA所組成之群組。
在一些示例性實施例中，第一核酸包括一T細胞受體α鏈編碼序列和一T細胞受體β鏈編碼序列。
在一些示例性實施例中，T細胞受體α鏈編碼序列和T細胞受體β鏈編碼序列係藉由一連接子所分開。
在一些示例性實施例中，連接子包括一核酸序列，且核酸序列編碼一內部核糖體進入位點（internal ribosome entry site，IRES）。
在一些示例性實施例中，連接子包括一核酸序列，且核酸序列編碼一自我切割肽（self-cleaving peptide）。
在一些示例性實施例中，自我切割肽為2A肽。
在一些示例性實施例中，2A肽係選自於由豬鐵士古病毒-2A（porcine teschovirus-1 2A，P2A）、明脈扁刺蛾β四體病毒（Thoseaasigna virus 2A，T2A）、馬鼻病毒A 2A（equine rhinitis A virus 2A，E2A）和口蹄疫病毒2A（foot-and-mouth disease virus 2A，F2A）所組成之群組。
在一些示例性實施例中，2A肽為T2A。
在一些示例性實施例中，連接子包括弗林蛋白酶（furin）切割位點。
在一些示例性實施例中，連接子包括弗林蛋白酶切割位點和T2A。
在一些示例性實施例中，第一核酸從5'端至3'端依序包括T細胞受體α鏈編碼序列、連接子和T細胞受體β鏈編碼序列。
在一些示例性實施例中，第一核酸從5'端至3'端依序包括T細胞受體β鏈編碼序列、連接子和T細胞受體α鏈編碼序列。
在一些示例性實施例中，T細胞受體α鏈編碼序列包括SEQ ID NO：6所示之核酸序列。
在一些示例性實施例中，T細胞受體β鏈編碼序列包括SEQ ID NO ：13所示之核酸序列。
在一些示例性實施例中，第一核酸係藉由病毒轉導所導入。
在一些示例性實施例中，病毒轉導包括使細胞與一病毒載體接觸，病毒載體包含第一核酸。
在一些示例性實施例中，病毒載體選自於由反轉錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體和腺相關病毒載體所組成之群組。
在一些示例性實施例中，病毒載體為慢病毒載體。
在一些示例性實施例中，慢病毒載體更包括EF-1α啟動子。
在一些示例性實施例中，慢病毒載體更包括Rev響應元件（RRE）。
在一些示例性實施例中，慢病毒載體更包括土撥鼠肝炎病毒轉錄後調控元件（woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element，WPRE）。
在一些示例性實施例中，慢病毒載體更包括cPPT序列。
在一些示例性實施例中，慢病毒載體更包括EF-1α啟動子、Rev響應元件（RRE）、土撥鼠肝炎病毒轉錄後調控元件（WPRE）和cPPT序列。
在一些示例性實施例中，慢病毒載體為自我滅活（self-inactivating）的慢病毒載體。
在一些示例性實施例中，一或多個具有下調基因表現能力的各個核酸包括反義核醣核酸（antisense RNA）、安塔夠妙核醣核酸（antagomir RNA）、小干擾核醣核酸（small interference RNA，siRNA）、小髮夾RNA（short hairpin RNA，shRNA）和常間回文重複序列叢集（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，CRISPR）系統，或其任意組合。
在一些示例性實施例中，CRISPR系統包括一Cas9 RNA和一引導RNA（guide RNA，gRNA）。
在一些示例性實施例中，CRISPR系統包括Cas9/gRNA核糖核蛋白（ribonucleoprotein，RNP）複合體。
在一些示例性實施例中，CRISPR 系統包括gRNA，且gRNA包括SEQ ID NO：37至SEQ ID NO：127和SEQ ID NO：131中任一者所示之核酸序列。
在一些示例性實施例中，具有下調基因表現能力的一或多個核酸中的每一者係藉由電穿孔所導入。
在另一實施例中，本文提供一種產生經修飾的T細胞的方法，包括：A）將一第一核酸導入一T細胞中，且第一核酸包括編碼一外源性T細胞受體（TCR）的一核酸序列，外源性T細胞受體對一目標細胞上的NY-ESO-1有親和力；以及b）將一或多個核酸導入T細胞中，一或多個核酸具有下調一或多個內源性基因的基因表現的能力，一或多個內源性基因係選自於由T細胞受體α鏈及T細胞受體β鏈所組成之群組。
在一些示例性實施例中，第一核酸更包括編碼一切換受體的核酸序列。
在一些示例性實施例中，切換受體的核酸序列包括SEQ ID NO：15所示之核酸序列。
在一些示例性實施例中，編碼切換受體的核酸序列包括SEQ ID NO：137所示之核酸序列。
在一些示例性實施例中，編碼切換受體的核酸序列包括SEQ ID NO：139所示之核酸序列。
在一些示例性實施例中，方法更包括：c）將一或多個核酸導入T細胞中，一或多個核酸具有下調一或多個內源性基因的基因表現的能力，一或多個內源性基因係選自於由A2AR、B7-H3（CD276）、B7-H4（VTCN1）、BTLA（CD272）、CD96、CTLA-4（CD152）、IDO、KIR、LAG3、TIGIT、TIM-3和VISTA所組成之群組。
在另一實施例中，本文提供一種產生經修飾的T細胞的方法，包括：a）將一第一核酸導入一T細胞中，第一核酸包括編碼一外源性T細胞受體（TCR）的一核酸序列，外源性T細胞受體對一目標細胞上的NY-ESO-1有親和力；以及b）將一或多個核酸導入T細胞中，一或多個核酸具有下調一或多個內源性基因的基因表現的能力，一或多個內源性基因係選自於由T細胞受體α鏈及T細胞受體β鏈所組成之群組。
在一些示例性實施例中，編碼外源性T細胞受體的核酸序列包括一T細胞受體α鏈的編碼序列和一T細胞受體β鏈的編碼序列。
在一些示例性實施例中，T細胞受體α鏈的編碼序列包括SEQ ID NO：6所示之核酸序列。
在一些示例性實施例中，T細胞受體β鏈的編碼序列包括SEQ ID NO：13所示之核酸序列。
在一些示例性實施例中，編碼切換受體的核酸序列包括SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：135、SEQ ID NO：137或SEQ ID NO：139所示之核酸序列。
在一些示例性實施例中，編碼外源性T細胞受體的核酸序列和編碼切換受體的核酸序列係藉由一第一連接子所分開。
在一些示例性實施例中，T細胞受體α鏈的編碼序列和T細胞受體β鏈的編碼序列係藉由一第二連接子所分開。
在一些示例性實施例中，第一連接子和第二連接子各自獨立地包括一核酸序列，核酸序列編碼一內部核糖體進入位點（IRES）。
在一些示例性實施例中，第一連接子和第二連接子各自獨立地包括編碼自我切割肽的一核酸序列。
在一些示例性實施例中，自我切割肽為2A肽。
在一些示例性實施例中，2A肽係選自於由豬鐵士古病毒-2A（porcine teschovirus-1 2A，P2A），明脈扁刺蛾β四體病毒（Thoseaasigna virus 2A，T2A）、馬鼻病毒A 2A（equine rhinitis A virus 2A，E2A）和口蹄疫病毒2A（foot-and-mouth disease virus 2A，F2A）所組成之群組。
在一些示例性實施例中，2A肽為T2A。
在一些示例性實施例中，第一連接子和第二連接子為不相同的。
在一些示例性實施例中，第二連接子包括一核酸序列，核酸序列編碼弗林蛋白酶切割位點。
在一些示例性實施例中，第二連接子包括一核酸序列，核酸序列編碼弗林蛋白酶切割位點和T2A。
在一些示例性實施例中，第一連接子包括一核酸序列，核酸序列編碼F2A的核酸序列
在一些示例性實施例中，第一核酸從5'端至3'端依序包括編碼一切換受體的核酸序列、一第一連接子、一T細胞受體α鏈的編碼序列、一第二連接子和一T細胞受體β鏈的編碼序列。
在一些示例性實施例中，第一核酸從5'端至3'端依序包括一T細胞受體β鏈的編碼序列、一第二連接子、一T細胞受體α鏈的編碼序列、一第一連接子和編碼切換受體的一核酸序列。
在一些示例性實施例中，第一核酸係藉由病毒轉導所導入。
在一些示例性實施例中，病毒轉導包括使細胞與一病毒載體接觸，病毒載體包括第一核酸。
在一些示例性實施例中，病毒載體選自於由反轉錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體和腺相關病毒載體所組成之群組。
在一些示例性實施例中，病毒載體為慢病毒載體。
在一些示例性實施例中，慢病毒載體更包括EF-1α啟動子。
在一些示例性實施例中，慢病毒載體更包括Rev響應元件（RRE）。
在一些示例性實施例中，慢病毒載體更包括土撥鼠肝炎病毒轉錄後調控元件（woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element，WPRE）。
在一些示例性實施例中，慢病毒載體更包括cPPT序列。
在一些示例性實施例中，慢病毒載體更包括EF-1α啟動子、Rev反應元件（RRE）、土撥鼠肝炎病毒轉錄後調控元件（WPRE）和cPPT序列。
在一些示例性實施例中，慢病毒載體為自我滅活（self-inactivating）的慢病毒載體。
在一些示例性實施例中，一或多個具有下調基因表現能力的各個核酸包括反義核醣核酸（antisense RNA）、安塔夠妙核醣核酸（antagomir RNA）、小干擾核醣核酸（small interference RNA，siRNA）、小髮夾RNA（short hairpin RNA，shRNA）和常間回文重複序列叢集（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，CRISPR）系統，或其任意組合。
在一些示例性實施例中，CRISPR系統包括一Cas9 RNA和一引導RNA（guide RNA，gRNA）。
在一些示例性實施例中，CRISPR 系統包括Cas9/gRNA核糖核蛋白（ribonucleoprotein，RNP）複合體。
在一些示例性實施例中，CRISPR 系統包括gRNA，gRNA包括SEQ ID NO：37至SEQ ID NO：127和SEQ ID NO：131中任一個所示之核酸序列。
在一些示例性實施例中，能夠下調基因表現的一或多個核酸中的每一種係藉由電穿孔所導入。
在另一實施例中，本文提供一種在有需要的一個體中治療癌症的方法，包括對個體施予有治療效果的組合物，且有治療效果的組合物包括本文所述的經修飾的免疫細胞。
在另一實施例中，本文提供一種在有需要的一個體中治療多發性骨髓瘤的方法，包括：a）對個體施予淋巴細胞刪除性化療（lymphodepleting chemotherapy），包括將一有效量的環磷醯胺（cyclophosphamide）投予個體；b）將一經修飾的T細胞投與給個體，包括：i）一外源性T細胞受體（TCR），其對一目標細胞上的NY-ESO-1有親和力，其中外源性T細胞受體包括：（1）T細胞受體α鏈，包括SEQ ID NO：5所示之胺基酸序列；以及（2）T細胞受體β鏈，包括SEQ ID NO：12所示之胺基酸序列；ii）在包括SEQ ID NO：128所示之核酸序列的一內源性T細胞受體α鏈的編碼序列中有至少一核苷酸取代、缺失、插入和/或插入/缺失；iii）在包括SEQ ID NO：129所示之核酸序列的一內源性T細胞受體β鏈的編碼序列中有至少一核苷酸取代、缺失、插入和/或插入/缺失；以及iv）在包括SEQ ID NO：130所示之核酸序列的一內源性PD1編碼序列中有至少一核苷酸取代、缺失、插入和/或插入/缺失，其中內源性T細胞受體α鏈的編碼序列、內源性T細胞受體β鏈的編碼序列和內源性PD1編碼序列的表現被下調。
在另一實施例中，本文提供一種在有需要的一個體中治療黑色素瘤、滑膜肉瘤（synovial sarcoma）或黏液樣/圓形細胞脂肪肉瘤（myxoid/round cell liposarcoma）的方法，包括：a）對個體施予淋巴細胞刪除性化療（lymphodepleting chemotherapy），包括將一有效量的環磷醯胺以及一有效量的氟達拉濱（fludarabine）投予個體；b）將一經修飾的T細胞投與給個體，包括：i）一外源性T細胞受體（TCR），其對一目標細胞上的NY-ESO-1有親和力，其中外源性T細胞受體包括：（1）T細胞受體α鏈，包括SEQ ID NO：5所示之胺基酸序列；以及（2）T細胞受體β鏈，包括SEQ ID NO：12所示之胺基酸序列；ii）在包括SEQ ID NO：128所示之核酸序列的一內源性T細胞受體α鏈的編碼序列中有至少一個核苷酸取代、缺失、插入和/或插入/缺失；iii）在包括SEQ ID NO：129所示之核酸序列的一內源性T細胞受體β鏈的編碼序列中有至少一個核苷酸取代、缺失、插入和/或插入/缺失；以及iv）在包括SEQ ID NO：130所示之核酸序列的一內源性PD1編碼序列中有至少一個核苷酸取代、缺失、插入和/或插入/缺失，其中內源性T細胞受體α鏈的編碼序列、內源性T細胞受體β鏈的編碼序列和內源性PD1編碼序列的表現被下調。
本發明提供了用於經修飾的免疫細胞（例如，T細胞和NK細胞）或其前驅細胞（例如，經修飾的T細胞）的組合物和方法，其包括外源性（例如重組、基因轉殖或改造的）T細胞受體（TCR）。在一些實施例中，外源性T細胞受體是對目標細胞（NY-ESO-1 TCR）—特別是黑色素瘤和其他實體腫瘤細胞上—的NY-ESO-1有親和力的T細胞受體。本發明所提供的細胞包括額外的基因修飾，以增強免疫細胞在腫瘤微環境中的功效。在一些實施例中，免疫細胞中編碼內源性TCR多肽（例如，TRAC或TRBC）或內源性免疫檢查點蛋白（例如，PD1或TIM3）的基因被破壞。在其他或替代的實施例中，免疫細胞包括外源性切換分子。在一些實施例中，經修飾的免疫細胞或其前驅細胞（例如，經修飾的T細胞）更包括一切換受體。在一些實施例中，經修飾的免疫細胞或其前驅細胞（例如，具有NY-ESO-1 TCR的經修飾T細胞）係進一步地被修飾，使其TRAC和/或TRBC中一或多者的表現被下調。在其他或替代的實施例中，經修飾的免疫細胞係進一步地被修飾，使其免疫檢查點蛋白（例如，PD1或TIM3）的表現被下調。在一個實施例中，本發明提供了經修飾的T細胞，包括外源性T細胞受體，所述外源性T細胞受體對目標細胞上的NY-ESO-1有親和力，其中該T細胞被進一步修飾，使其TRAC、TRBC和PD-1的表現被下調。在另一個實施例中，本發明提供了經修飾的T細胞，包括外源性T細胞受體和切換受體，該外源性T細胞受體對目標細胞上的NY-ESO-1有親和力，其中該T細胞被進一步修飾，使其TRAC和TRBC的表現被下調。本發明更提供了產生這種基因改造細胞的方法。在一些實施例中，該些細胞和組合物可用於過繼性細胞療法（adoptive cell therapy），例如過繼性腫瘤免疫療法（adoptive tumor immunotherapy）。
在一些實施例中，本文所提供的免疫細胞、組合物和方法係在腫瘤微環境中改變或降低T細胞抑制途徑或信號所產生的作用。本發明的經修飾免疫細胞係抵消抑制性受體或配體的上調和/或表現，該些抑制性受體或配體會負向調控T細胞活化和T細胞功能。舉例而言，在T細胞上的某些免疫檢查點蛋白（例如，PD-1或PD-Ll）和/或在腫瘤微環境中的某些免疫檢查點蛋白，其表現會減少過繼性T細胞療法的能力和效果。除此之外，這些抑制途徑可能會損害過繼性細胞療法中某些期望的效用功能。腫瘤細胞和/或腫瘤微環境中的細胞通常會上調某些傳遞抑制信號的抑制蛋白（例如，PD-L1和PD-L2）。在腫瘤微環境中的T細胞上這些蛋白也會被上調，例如在腫瘤浸潤T細胞上，這個上調的情況可在透過抗原受體或某些其他活化信號所造成的訊息傳導後發生。此些事件可能會導致經基因改造的免疫細胞（例如，靶向NY-ESO-1的T細胞）產生衰竭（exhausted phenotype），例如其鄰近的其他細胞表現有此些蛋白時，反而會導致其功能性降低。因此，本發明的經修飾免疫細胞係解決T細胞衰竭（exhaustion）和/或T細胞缺乏持久性（lack of T cell persistence）的問題，前述情況對現有的過繼性細胞療法功效和治療結果來說是個阻礙。
應理解的是，本文所描述的方法並不限於本文所公開的特定方法和實驗條件，因為這些方法和條件是可以改變的。需要注意的是，本文所使用的術語僅是為了描述特定實施例，而非不是限制性的。
除非另有說明，否則本文所描述的實驗係採用熟習此項技術者所習知的分子生物學及免疫學的技術。此等技術均為這些技術人員所熟知，且全面地闡述於下列文獻中：參見，例如，Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley＆Sons，Inc.，NY，NY（1987-2008）出版，包括所有補充資料；MR Green和J. Sambrook和Harlow等人所著的Molecular Cloning：A Laboratory Manual（第四版）；Antibodies：A Laboratory Manual，第14章，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor（2013，第2版）。
A. 定義
除非另有定義，否則本文使用的科學和技術術語其涵義與本發明所屬技術領域具有通常知識之人所理解的相同。如果存在任何潛在的歧義，本文提供的定義優先於任何字典或外部定義。除非上下文另有要求，否則單數形式的術語應包括複數形式，複數形式的術語應包括單數形式。除非另有說明，否則「或」的使用代表「和/或」。術語「包括」（including/ includes/included）的使用不是限制性的。
通常來說，本文提及與細胞和組織培養、分子生物學、免疫學、微生物學、遺傳學、蛋白和核酸化學，以及雜交技術相關的術語是本領域熟知和常用的。除非另有說明，本文提供的方法和技術通常根據本領域熟知的習知方法且如其所引用的各種一般和更具體的參考文獻中所描述的方式進行。酵素反應和純化技術係根據製造商的說明書來進行，如本領域一般方法或如本文所描述的。本文提及與分析化學、合成有機化學，以及醫用與藥物化學相關的術語和這些領域的實驗室程序和技術，係為本領域所熟知和常用的。標準技術係用於化學合成、化學分析、藥物製備、配製和遞送以及病患的治療。
透過以下對所選術語的定義，可以更容易地理解本發明。
本文中的冠詞「一」及「一個」（a及an）用於指一個或多於一個該冠詞的文法上受詞（即為，至少一個）。舉例來說，「一個元件」係指一個元件或多於一個元件。
當涉及例如量、持續時間等可測量值時，本文所使用的「約」意指涵蓋指定數值±20%或±10%的變化，較佳地係±5%，甚至更佳地係±1%，以及最佳地係±0.1%，只要此種變化程度適合於執行本文所公開的方法。
本文所使用的「活化」意指T細胞已經充分刺激以誘發出可被檢測到的細胞增生狀態。活化亦與細胞激素的誘發生成以及可被檢測到的效用功能（effector function）有關。術語「活化的T細胞」特別意指正在進行細胞分裂的T細胞。
本文所使用的「減輕」一疾病，意指降低該疾病的一或多種症狀的嚴重程度。
本文所用的術語「抗原」，係定義為引起免疫反應的分子。這種免疫反應可能涉及抗體的產生，或特定免疫活性細胞的活化，或涉及這兩者情況。本領域技術人員能夠理解，任何大分子，包括幾乎所有的蛋白或肽，都可以做為抗原。
此外，抗原可以源於重組或基因組DNA。本領域之普通技術人員能夠理解，任何包括編碼有引發免疫反應之蛋白的核苷酸序列或部分核苷酸序列的DNA，其係編碼有如本文所使用的術語「抗原」。此外，本領域之普通技術人員能夠理解，抗原不需要一具有全長核苷酸序列的基因所獨立編碼。很明顯地，本發明包括但不限於使用多於一個基因的部分核苷酸序列，且這些核苷酸序列係以不同組合方式進行排列來引發所期望的免疫反應。而且，本領域的普通技術人員能夠理解，抗原全然不需要由一「基因」所編碼。很明顯地，抗原可以以合成方式產生或由生物樣本所衍生。這樣的生物樣本可以包括但不限於組織樣本、腫瘤樣本、細胞或生物體液。
本文所用的術語「自體」，意指來自於同一個體的任何材料，其稍後被重新導入回該個體。
「共刺激分子」意指T細胞上的同源結合配偶體，其與共刺激配體特異性結合，從而介導T細胞的共刺激反應，例如但不限於增生。共刺激分子包括但不限於MHC I型分子、B和T淋巴細胞弱化蛋白（B and T Lymphocyte Attenuator，BTLA）及Toll配體受體。
本文所用的「共刺激信號」是指與主要信號（例如TCR/CD3連接）搭配的信號，兩者共同導致T細胞增殖及/或關鍵分子之上調或下調。
「疾病」是動物無法維持動態平衡健康狀況，且若該疾病沒有改善則該動物的健康將持續惡化。相對地，動物的「失調」是指動物能夠維持動態平衡的健康狀況，但是該動物的健康狀況不如沒有失調時的那樣良好。如果不進行治療，失調不一定會導致動物健康狀況下降。
本文所用的術語「下調」是指減少或是消除一或多個基因的基因表現。
本文所用的「有效量」或「治療有效量」可以互換使用，並且是指本文所述的化合物、調配物、材料或組合物的數量，其有效地實現特定的生物學結果、提供治療，或預防的益處。此些結果可以包括但不限於當投與一數量之組合物至一動物時，與不存在本發明組合物時所檢測到的免疫反應相比，其引起一可檢測程度的免疫抑制反應或是免疫耐受反應。該免疫反應可以很容易地以許多本領域所認可的方法來分析。本領域技術人員能夠理解，本文所投與的組合物數量會改變，且會基於許多因素所決定，例如所治療的疾病或病症類型、所治療的哺乳動物的年齡及健康狀況及身體狀況、該疾病的嚴重性、所投與的化合物種類等。
「編碼」是指多核苷酸中特定的核苷酸序列（例如，一基因、一cDNA或一mRNA）其固有特性，此序列在生物性程序裡被當做合成其它聚合物與巨分子的模板，該聚合物與巨分子具有一特定的核苷酸（亦即rRNA、tRNA、與mRNA）序列、或是特定的胺基酸序列，以及由此產生的生物性質。因此，若由轉錄一基因所產生的mRNA於細胞或其它生物系統中進行轉譯而產生一蛋白，則表示該基因係編碼此蛋白。編碼鏈（其核苷酸序列與mRNA序列相同，且通常存在於序列表中）與非編碼鏈（係作為基因或cDNA的轉錄模板）均可以意指編碼有該蛋白或其他產物的該基因或cDNA。
本文所用的「內源性」是指來自生物體、細胞、組織或系統的任何物質，或是由生物體、細胞、組織或系統內部所產生的任何物質。
本文所用的「表位」係定義為抗原上的化學小分子，其可以引發免疫反應、誘發B及/或T細胞反應。一個抗原可以具有一或多個表位。大部分的抗原具有許多表位—亦即為多價（multivalent）抗原。通常來說，表位的大小約為10個胺基酸及/或醣。較佳地，表位的大小約為4至18個胺基酸，更佳地約為5至16個胺基酸，且最佳地約為8至10個胺基酸。本領域的普通技術人員理解的是，一般來說，抗原特異性的主要條件是分子之整體三維結構，而非其特定線性序列，因而由此區分不同的表位。基於本文的揭露內容，用於本發明之肽可以是一表位。
本文所用的「外源性」是指從生物體、細胞、組織或系統外部引入的任何物質，或是由生物體、細胞、組織或系統外部所產生的任何物質。
本文所用的「擴增」是指數量上的增加，如T細胞數量的增加。在一個實施例中，，以離體方式進行擴增的T細胞其數量相對於其於培養中的初始數量有所增加。在另一個實施例中，以離體方式進行擴增的T細胞其數量相對於培養中的其他細胞類型之數量有所增加。本文所用的「離體」是指已經從活的生物體（例如人類）中移出，並在該生物體的外部進行繁殖（例如在培養皿、試管或生物反應器中）的細胞。
本文所用的「表現」係定義為特定核苷酸序列藉由其啟動子所驅動的轉錄及/或轉譯。
「表現載體」是指包括重組多核苷酸的載體，該重組多核苷酸包括與待表現的核苷酸序列可操作地連接的表現控制序列。表現載體包括足夠的表現用順式作用元件（cis-acting elements）。其他表現用的元件可以由宿主細胞提供或由體外表現系統提供。表現載體包括所有本領域的已知類型，例如併入重組多核苷酸的黏質體、質粒（例如裸露的質粒或是包括在微脂體中的質粒）及病毒（例如仙台病毒（Sendai viruses）、慢病毒、反轉錄病毒、腺病毒，及腺相關病毒）。
本文所用的「一致性」是指兩個聚合分子之間的次單元序列一致性，特別是指兩個胺基酸分子之間的次單元序列一致性（例如兩個多肽分子之間的次單元序列一致性）。當兩個胺基酸序列在相同位置具有相同的殘基時（例如，如果兩個多肽分子中各自的一位置都被精胺酸佔據時），則它們在該位置是一致的。兩個胺基酸序列在相同比對位置中相同殘基的一致性或程度通常以百分比表示。兩個胺基酸序列之間的一致性是對應或一致位置數量的直接函數。例如，如果兩個序列中有一半位置（例如，長度為十個次單元的聚合物中有五個位置）是一致的，則兩個序列的一致性為50％。如果有90％的位置（例如，10個中有9個）為相匹配（matched）或一致的，則兩個序列的一致性為90％。
本文使用的術語「免疫反應」定義為對於抗原的細胞反應，這種反應發生在淋巴細胞將抗原性分子鑑定為外來物並誘發抗體形成和/或活化淋巴細胞以除去抗原時。
本文使用的術語「免疫抑制（immunosuppressive）」是指降低整體的免疫反應。
「插入/缺失」（Insertion/deletion），通常縮寫為“indel”，是一種遺傳多態性，其中特定核苷酸序列在基因組中存在（插入）或不存在（缺失）。
「分離的」是指從自然狀態中改變或移除。舉例而言，自然狀態下存在於活體動物中的核酸或肽即不屬於「分離的」，但是與其自然狀態的共存材料部分或完全地分開的相同核酸或肽即屬於「分離的」。分離的核酸或蛋白可以以本質上純化的形式存在，或者可以存在於非自然環境中（例如，宿主細胞）。
本文所用的「敲落（knockdown）」是指減少一個或多個基因的基因表現。
本文所用的「剔除（knockout）」是指消除一個或多個基因的基因表現。
本文所用的「慢病毒（lentivirus）」是指反轉錄病毒科的一個屬。慢病毒屬於反轉錄病毒中獨特的一類，因為它們在能夠感染非分裂細胞。它們可以將大量的遺傳訊息傳遞到宿主細胞的DNA中，因此它們是最有效的基因傳遞載體其中之一。人類免疫缺陷病毒（HIV）、猿猴免疫缺乏病毒（SIV）和貓免疫缺陷病毒（FIV）都是慢病毒。源自慢病毒的載體提供了以體內方式進行基因轉移而造成大量表現的手段。
本文所用的術語「修飾」是指本發明的分子或細胞其狀態或結構有改變。分子可以以多種方式進行修飾，包括以化學性、結構性和功能性的方式進行。細胞可以藉由導入核酸來進行修飾。
本文所用的術語「調節」，是指相較於沒有接受治療或化合物處理的個體，和/或相較於在其他方面相同但未經處理的個體，在個體中介導出的反應，其增加或減少的程度係可被檢測到。該術語包括擾亂和/或影響天然信號或反應，從而介導出個體（較佳為人類）的有益治療反應。
在本發明中，以下列縮寫來代表常見的核酸鹼基。「A」是指腺苷，「C」是指胞嘧啶，「G」是指鳥苷，「T」是指胸苷，「U」是指尿苷。
除非另外指明，否則「編碼一胺基酸序列的核苷酸序列」包括彼此之簡併形式（degenerate versions）且編碼相同胺基酸序列的所有核苷酸序列。編碼蛋白或RNA的術語「核苷酸序列」還可以包括內含子，以至於編碼蛋白的核苷酸序列在一些形式中可含有內含子。
以「腸胃外的」方式施予免疫原性組合物包括例如皮下注射（s.c.）、靜脈注射（i.v.）、肌肉注射（i.m.）或胸骨內注射或輸液技術（infusion techniques）。
本文所用的術語「多核苷酸」被定義為核苷酸鏈。此外，核酸是核苷酸的聚合物。因此，本文使用的核酸和多核苷酸是可互換的。本領域技術人員皆能明瞭，核酸是可以被水解成「核苷酸」單體的多核苷酸。核苷酸單體可以被水解成核苷。如本文所用，多核苷酸包括但不限於藉由本領域可用的任何手段獲得的所有核酸序列，此些手段包括但不限於重組手段（即，使用一般複製技術和PCRTM 等技術從重組文庫（recombinant library）或細胞基因組複製核苷酸序列），以及以合成方式獲得。
本文所用術語「肽」、「多肽」和「蛋白」可互換使用，並且是指由藉由肽鍵共價連接的胺基酸殘基組成的化合物。蛋白或肽必須包括至少兩個胺基酸，且對可以包括蛋白或肽序列的胺基酸的最大數量並沒有限制。多肽包括了藉由肽鍵彼此連接的兩個或更多個胺基酸的任何肽或蛋白。如本文所用，該術語可用來指稱短鏈以及長鏈胜肽；當指稱短鏈胜肽時，其在本領域中通常也稱為肽、寡肽和寡聚物，當指稱長鏈胜肽時，其在本領域通常又稱為蛋白，其中存在有很多種類。舉例而言，「多肽」包括生物活性片段、本質上同源的多肽、寡肽、同二聚體、異二聚體、多肽的變體、修飾的多肽、衍生物、類似物、融合蛋白等等。多肽包括天然肽、重組肽、合成肽或其組合。
本文術語「特異性結合」使用在抗體上時，是指該抗體在一樣品中會識別特定抗原但本質上不會識別或結合其他分子。舉例而言，一個能特異性結合來自一種物種抗原的抗體，也可以結合來自一種或多種物種的該抗原。但是，這種跨物種反應性本身並不改變抗體的特異性分類。在另一個實施例中，一個特異性結合抗原的抗體也可以結合該抗原的不同等位形式。然而，這種交叉反應本身並不改變抗體的特異性分類。在一些情況下，術語「特異性結合」可用於指抗體、蛋白或肽與第二化學物質的相互作用，而意指該相互作用是取決於該化學物質上存在一特定結構的（例如，抗原決定簇（antigenic determinant）或表位）。舉例而言，抗體通常辨識並結合蛋白的特定結構而不是蛋白本身。如果一抗體對表位「A」具有特異性，則在抗體與含有經標記的「A」的反應中，含有表位A的分子（或游離且未標記的A）其存在將減少抗體與經標記的A的結合量。
術語「刺激」是指由一刺激分子（例如TCR/CD3複合體）與其同源配體結合而誘發的初級反應，從而介導訊息傳遞事件，例如但不限於經由TCR/CD3複合體的訊息傳遞。刺激可以介導某些分子的表現（例如TGF-β的下調和/或細胞骨架結構的重組等等）。
本文所用的「刺激性分子」是指在T細胞上的一分子，其特異性結合至存在於抗原呈現細胞上的同源刺激性配體。
本文所用的「刺激性配體」是指一種配體，當其存在於抗原呈現細胞（例如，人造抗原呈現細胞、樹突細胞、B細胞等）上時可以與T細胞上的同源結合配體（在本文中稱為「刺激分子」）特異性結合，從而藉由T細胞介導初級反應，該初級反應包括但不限於活化、啟動免疫反應、增殖等。刺激性配體在本領域中是眾所皆知的，而其特別可以是裝載有肽的MHC I型分子、抗CD3抗體、超促效劑抗CD28抗體、和超促效劑抗CD2抗體。
術語「個體」旨在包括可被引發免疫反應的生物活體（例如，哺乳動物）。本文使用的「個體」或「病患」可以是人類或非人類哺乳動物。舉例而言，非人類哺乳動物包括家畜和寵物（例如綿羊、牛、豬、犬科動物、貓科動物和鼠類哺乳動物），較佳地，該個體是人。
「目標點（target site）」或「目標序列（target sequence）」是指一基因組核酸序列，其定義出結合分子在足以發生結合的條件下可特異性地結合的核酸的一部分。
本文所用的術語「T細胞受體」或「TCR」是指一種膜蛋白複合體，其響應抗原的呈現而參與T細胞的活化。TCR負責辨識結合至主要組織相容性複合體分子的抗原。TCR係由α和β鏈的異二聚體所構成，儘管在一些細胞中TCR係由γ和δ（γ/δ）鏈所構成。TCR可能以α/β及γ/δ的形式存在，兩種結構類似但具有不同的結構位置（anatomical locations）和功能。每條鏈由兩個細胞外結構域組成，分別為一個變異結構域和恆定結構域。在一些實施例中，可以在任何包括有TCR的細胞上修飾TCR，舉例而言，輔助性T細胞、細胞毒性T細胞、記憶性T細胞、調節性T細胞、天然殺手性T細胞和γ/δT細胞。
本文使用的術語「治療性」是指治療和/或預防。治療效果係藉由抑制、緩解或根除疾病狀態所獲得。
「移植物」是指要被移植的生物相容性晶格（biocompatible lattice）或捐贈者的組織、器官或細胞。舉例來說，移植物可以包括但不限於皮膚細胞或組織、骨髓和實體器官（例如，心臟、胰腺、腎、肺和肝）。移植物也可以指任何要導入宿主的材料。例如，移植物可以指核酸或蛋白。
本文所用的術語「轉染」、「轉形」或「轉導」是指將外源核酸轉移或導入宿主細胞中的過程。經「轉染」、「轉形」或「轉導」的細胞是已經用外源核酸轉染、轉形或轉導的細胞。該細胞包括主要目標細胞及其後代。
本文所用的「治療」一疾病，是指降低個體所經歷的疾病或至少一種失衡體徵或症狀其頻率或嚴重程度。
「載體」是一種物質的組合物，其包括分離的核酸且可被用於將分離的核酸傳遞至細胞內部。本領域有許多已知的載體，其中包括但不限於線性多核苷酸、與離子或兩親化合物相連的多核苷酸、質粒和病毒。因此，術語「載體」包括自主複製的質粒或病毒。該術語也應解釋為包括促進核酸轉移進入細胞的非質粒化合物和非病毒化合物（例如，聚離胺酸化合物、微脂體等）。病毒載體的例子包括但不限於仙台病毒載體、腺病毒載體、腺病毒相關載體、反轉錄病毒載體，慢病毒載體等。
範圍：在本文中，本發明的多個實施例可用數值範圍形式呈現。應該理解的是，數值範圍的描述僅僅是出於方便和簡潔的目的，並且不應被解釋為對於本發明範疇的僵化限制。因此，範圍的描述應被視為已具體公開了所有可能的子範圍以及該範圍內的個別數值。舉例而言，範圍1至6的描述應該視為具有特定揭露的子範圍，例如從1至3、從1至4、從1至5、從2至4、從2至6、從3至6等，以及在該範圍內的個別數值，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。且不管該範圍的幅度如何，都適用這樣的解釋。
B. T 細胞受體
本發明提供了經修飾的免疫細胞或其前驅細胞（例如，經修飾的T細胞）的組合物和方法，其包括外源性T細胞受體（TCR）。因此，在一些實施例中，目標細胞已被改變為含有特定的T細胞受體（TCR）基因（例如，TRAC和TRBC基因）。T細胞受體或其抗原結合部分包括識別目標多肽的肽表位或T細胞表位的那些部位，例如腫瘤、病毒或自身免疫蛋白的抗原。在一些實施例中，T細胞受體對腫瘤相關抗原（例如，人類NY-ESO-1）會有特異性結合。
T細胞受體是一種雙硫鍵連接的異二聚體蛋白，其由六種不同的膜結合鏈所組成，這些膜結合鏈參與T細胞響應於抗原的活化。T細胞受體有α/β和γ/δ兩種類別。α/β型的T細胞受體包括α鏈和β鏈。表現具有α鏈和β鏈的T細胞受體的T細胞通常稱為α/β T細胞。γ/δ型的T細胞受體包括γ鏈和δ鏈。表現包括γ鏈和δ鏈的T細胞受體的T細胞通常稱為γ/δ T細胞。本發明的T細胞受體為包括α鏈和β鏈的T細胞受體。
T細胞受體的α鏈和β鏈各別由兩個細胞外結構域、可變區和恆定區所組成。T細胞受體α鏈可變區和T細胞受體β鏈可變區是T細胞受體對目標抗原的親和力所不可或缺的部分。每個可變區包括三個高度變異區或互補性決定區（complementarity-determining regions，CDR），這些高度變異區或互補性決定區用於結合目標抗原。T細胞受體其α鏈的恆定區和β鏈的恆定區鄰近細胞膜。T細胞受體更包括跨膜區和短胞質尾端。CD3分子與T細胞受體異二聚體組合在一起。CD3分子包括會酪胺酸磷酸化的特徵性序列基序（sequence motif），稱為免疫受體酪胺酸活化基序（immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM）。
T細胞受體的刺激係由抗原呈現細胞上的主要組織相容性複合體分子（MHC）觸發，所述抗原呈現細胞將抗原肽呈現給T細胞並與T細胞受體相互作用以誘導一系列的細胞內信號傳導級聯反應。T細胞受體的接合啟動正向和負向信號級聯，導致細胞增生、細胞因子產生和/或活化誘導的細胞死亡。
本發明的T細胞受體可以是野生型T細胞受體、高親和力T細胞受體和/或嵌合T細胞受體。高親和力T細胞受體可以是修飾野生型T細胞受體的結果，其與野生型T細胞受體相比，賦予對目標抗原的更高的親和力。高親和力T細胞受體可以是親和力成熟的T細胞受體。修飾T細胞受體和/或T細胞受體的親和力成熟的方法為本領域技術人員所已知的。改造和表現T細胞受體的技術包括但不限於T細胞受體異二聚體的產生，其包括連接對應次單元的天然二硫橋（Garboczi等人，（1996），Nature 384（6605）：134-41）；Garboczi等，（1996），J Immunol 157（12）：5403-10；Chang等人，（1994），PNAS USA 91：11408-11412；Davodeau等人（1993），J.Biol.Chem.268（21）：15455-15460；Golden等人（1997），J. Imm. Meth. 206：163-169；美國專利號6,080,840）。
在一些實施例中，外源性T細胞受體是全長的T細胞受體或其抗原結合部分或其抗原結合片段。在一些實施例中，T細胞受體是完整或全長的T細胞受體，包括αβ形式或γδ形式。在一些實施例中，T細胞受體是抗原結合部分，所述抗原結合部分會小於全長T細胞受體但會與結合至MHC分子中的特定肽相結合，例如結合MHC-肽複合體。在一些情況下，T細胞受體的抗原結合部分或片段可以僅包括全長或完整T細胞受體其結構域的一部分，但是能夠結合完整T細胞受體所結合的肽表位（例如，MHC-肽複合體）。在一些情況下，抗原結合部分含有T細胞受體的可變結構域（例如T細胞受體的α鏈可變區和β鏈可變區），足以形成用於結合特定MHC-肽複合體的結合位點。通常，T細胞受體的可變鏈含有互補性決定區（CDR），其參與肽、MHC和/或MHC-肽複合體的辨識。
在一些實施例中，T細胞受體的可變結構域含有高度變異環或CDR，該些區域通常是主要負責抗原識別和結合能力和特異性的部分。在一些實施例中，T細胞受體的CDR或其組合形成給定TCR分子的全部或基本上全部的抗原結合位點。在T細胞受體鏈的可變區內不同CDR通常被框架區（framework region，FR）所分開，與CDR相比，所述框架區（FR）在T細胞受體分子中通常其變異度較低（參見，例如，Jores等人，Proc.Nat'l Acad. Sci.USA 87：9138, 1990；Chothia等人，EMBO J.7：3745,1988；另參見Lefranc等人，Dev.Comp.Immunol.27：55,2003）。在一些實施例中，CDR3是主要負責抗原結合或特異性的CDR，或者是一給定T細胞受體裡用來識別抗原和/或與肽-MHC複合體上經加工肽部分產生相互作用的可變區中三個CDR裡最重要的一個。在一些情況下，α鏈的CDR1可以與一些抗原肽的胺基端（N端）部分相互作用。在一些情況下，β鏈的CDR1可以與肽的羧基端（C端）部分相互作用。在一些情況下，CDR2對MHC-肽複合體中MHC部分有最強的相互作用或識別能力，也可以說CDR2是主要負責與MHC-肽複合體中MHC部分產生相互作用或進行識別的CDR。在一些實施例中，β-鏈的可變區可含有另外的高度變異區（CDR4或HVR4），其通常參與超級抗原（superantigen binding）結合而非抗原識別（Kotb（1995）Clinical Microbiology Reviews，8：411-426）。
在一些實施方式中，T細胞受體含有α可變結構域（Vα ）和/或β可變結構域（Vβ ）或其抗原結合片段。在一些實施例中，T細胞受體的α鏈和/或β鏈還可含有恆定結構域、跨膜結構域和/或短胞質尾端（參見，例如，Janeway等人，Immunobiology：The Immune System in Health and Disease，第3版，Current Biology Publications，p.4：33,1997）。在一些實施例中，α鏈恆定結構域係由TRAC基因（IMGT命名法）所編碼或者是其變異型。在一些實施例中，β鏈恆定結構域由TRBC1或TRBC2編碼基因（IMGT命名法）或是其變異型。在一些實施例中，恆定結構域與細胞膜相鄰。舉例而言，在一些情況下，由兩條鏈所形成的T細胞受體其的細胞外部分含有兩個靠近膜的恆定結構域和兩個遠離膜的可變結構域，其中每個可變結構域均含有複數個CDR。
本領域普通技術人員均有能力確定或鑑定T細胞受體的各種結構域或區域。在一些方面，T細胞受體的殘基是已知的或是可以根據國際免疫遺傳學資訊系統（IMGT）編號系統來鑑定（參見例如www.imgt.org；另見Lefranc等人，（2003）Developmental and Comparative Immunology，2＆；55-77；和T Cell Factsbook第2版，Lefranc和LeFranc Academic Press 2001）。使用這個系統，T細胞受體Vα 鏈和/或Vβ 鏈的CDR1序列對應於殘基編號27-38（包括端值）之間所存在的胺基酸，T細胞受體Vα 鏈和/或Vβ 鏈的CDR2序列對應於殘基編號56-65（包括端值）之間所存在的胺基酸，且T細胞受體Vα 鏈和/或Vβ 鏈的CDR3序列對應於殘基編號105-117（包括端值）之間所存在的胺基酸。
在一些實施例中，T細胞受體可以是α和β兩個鏈（或γ和δ）的異二聚體，其藉由例如單個雙硫鍵或多個雙硫鍵彼此連接。在一些實施例中，T細胞受體的恆定結構域可含有短連接序列，其中半胱胺酸殘基形成雙硫鍵，從而連接T細胞受體的兩鏈。在一些實施例中，T細胞受體可以在每一個α和β鏈中具有額外的半胱胺酸殘基，使得T細胞受體在恆定結構域中含有兩個雙硫鍵。在一些實施例中，恆定和可變結構域中的任一個都含有由半胱胺酸殘基所形成的雙硫鍵。
在一些實施例中，如所述的用來改造細胞的T細胞受體是從已知的T細胞受體序列（例如Vα 、Vβ 鏈的序列）所產生，對於所述序列，基本上全長的編碼序列是容易獲得的。從細胞來源獲取T細胞受體的全長序列（包括V鏈序列）其方法是眾所周知的。在一些實施例中，編碼T細胞受體的核酸可以從多種來源獲得，例如藉由對給定單個或多個細胞中的，或從給定單個或多個細胞所分離出來的，T細胞受體編碼核酸進行聚合酶鏈反應（PCR）擴增，或合成可公開獲得的T細胞受體DNA序列。在一些實施例中，T細胞受體係來自生物來源，例如來自細胞（舉例來說，來自如細胞毒殺T細胞等T細胞、T細胞雜交瘤，或其他可公開獲得的來源）。在一些實施例中，T細胞可以從體內分離的細胞中獲得。在一些實施例中，T細胞可以是經培養的T細胞雜交瘤或細胞株（clone）。在一些實施例中，T細胞受體或其抗原結合部分可以合成已知的序列來產生。在一些實施例中，係找出對目標抗原（例如，癌抗原）有高親和力的T細胞株，並從病患分離出來，再導入細胞中。在一些實施例中，表現針對目標抗原的T細胞受體的細胞株係利用經人類免疫系統基因（例如，人類白血球抗原系統，或稱HLA）改造的轉基因小鼠來產生。參見，例如，腫瘤抗原（參見，例如，Parkhurst等人（2009）Clin Cancer Res.15：169-180和Cohen等人（2005）J Immunol.175：5799-5808。在一些實施例中，本文係利用噬菌體呈現技術（phage display）來分離針對目標抗原的T細胞受體（參見，例如，Varela-Rohena等人（2008）Nat Med.14：1390-1395和Li（2005）Nat Biotechnol.23：349-354。
在一些實施例中，T細胞受體或其抗原結合部分是經過修飾或改造的部分。在一些實施例中，利用定向進化方法（directed evolution method）來產生帶有變異後性質的T細胞受體，例如對特定MHC-肽複合體有更高的親和力。在一些實施例中，定向進化係藉由呈現方法（display method）所達成，所述呈現方法包括但不限於酵母菌呈現（Holler等人（2003）Nat Immunol，4,55-62；Holler等人（2000）Proc Natl Acad Sci USA， 97,5387-92）、噬菌體呈現（Li等人（2005）Nat Biotechnol，23,349-54）、或T細胞呈現（Chervin等人（2008）J Immunol Methods，339,175-84）。在一些實施例中，可將野生型的T細胞受體當作產生誘變T細胞受體的模板，其中一或多個CDRs的殘基被突變，並選擇帶有所需變異後特性的突變體（例如，對所欲針對的目標抗原有高親和力）。
在如本文所述的一些實施例中，T細胞受體可含有被導入的單個或多個雙硫鍵。在一些實施例中，T細胞受體不具有天然雙硫鍵。在一些實施例中，形成天然鏈間雙硫鍵的一或多個天然半胱胺酸（例如，位在α鏈和β鏈的恆定結構域中）係被另一個殘基所取代，例如被絲胺酸或丙胺酸取代。在一些實施例中，可以藉由將α鏈和β鏈上的非半胱胺酸殘基（例如，在α鏈和β鏈的恆定結構域中的非半胱胺酸殘基）突變為半胱胺酸來形成導入的雙硫鍵。T細胞受體其示例性非天然雙硫鍵係描述於國際專利合作條約公開號WO2006/000830和WO2006037960的公開說明書中。在一些實施例中，半胱胺酸可以在α鏈的殘基Thr48和β鏈的Ser57處、在α鏈的殘基Thr45處和β鏈的Ser77處、在α鏈的殘基Tyr10處和β鏈的Ser17處、在α鏈的殘基Thr45處和β鏈的Asp59處和/或α的殘基Ser15處和β鏈的Glu15處導入。在一些實施例中，重組T細胞受體中的非天然半胱胺酸殘基的存在（例如，產生一或多個非天然雙硫鍵）可有利於在細胞中產生所需的重組T細胞受體，該細胞係被導入並過表現有包括天然T細胞受體鏈的錯配T細胞受體。
在一些實施例中，T細胞受體鏈含有跨膜結構域。在一些實施例中，跨膜結構域帶正電荷。在一些情況下，T細胞受體鏈含有胞質尾端。在一些方面，T細胞受體的每條鏈（例如，α或β鏈）可具有一個胺基端免疫球蛋白可變結構域、一個免疫球蛋白恆定結構域、跨膜區和位在羧基端的短胞質尾端。在一些實施例中，T細胞受體，例如透過胞質尾端，係與參與介導信號傳遞的CD3複合體其不變蛋白靠在一起。在一些情況下，這個結構使T細胞受體與其他分子（如CD3及其次單元）相聯繫。舉例而言，含有帶跨膜區的恆定結構域的T細胞受體可以將蛋白錨定在細胞膜上，並與CD3信號傳導單元或複合體的不變次單元相聯繫。CD3信號傳導次單元的胞內尾端（例如CD3γ、CD3δ、CD3ε和CD3ζ鏈）包括一或多個免疫受體酪胺酸活化基序（又稱ITAM），其與T細胞受器複合體的訊息傳遞能力（signaling capacity）有關。
在一些實施例中，T細胞受體是全長的T細胞受體。在一些實施例中，T細胞受體是抗原結合部分。在一些實施例中，T細胞受體是二聚體T細胞受體（dTCR）。在一些實施例中，T細胞受體是單鏈T細胞受體（sc-TCR）。T細胞受體可以是細胞結合的或可溶的形式。在一些實施例中，為了所提供的方法，T細胞受體是在細胞表面上表現的細胞結合形式。在一些實施例中，dTCR含有第一多肽和第二多肽，在所述第一多肽中對應於TCR α鏈可變區的序列融合至對應於TCR α鏈恆定區細胞外序列的N端，在所述第二多肽中對應於TCR β鏈可變區的序列融合至對應於TCR β鏈恆定區細胞外序列的N端，第一多肽和第二多肽係藉由雙硫鍵連接。在一些實施例中，所述的分子鍵可以對應於αβ型T細胞受體天然二聚體中存在的天然鏈間雙硫鍵。在一些實施例中，所述的鏈間雙硫鍵不存在於天然TCR中。舉例而言，在一些實施例中，可以將一或多個半胱胺酸併入dTCR多肽對的恆定區細胞外序列中。在一些情況下，本文的T細胞受體可能希望帶有天然的和非天然的雙硫鍵。在一些實施例中，T細胞受體含有跨膜序列以錨定在膜上。在一些實施例中，dTCR含有TCR α鏈以及TCRβ鏈，所述TCR α鏈含有可變區域、恆定區域和第一二聚化基序，所述第一二聚化基序連接至α鏈恆定區域的羧基端（C端），所述TCRβ鏈包括可變β結構域、恆定β結構域和第一二聚化基序，所述第一二聚化基序連接至恆定β結構域的羧基端（C端），其中第一二聚化基序和第二二聚化基序容易相互作用，以在第一二聚化基序和第二二聚化基序中的胺基酸之間形成共價鍵，而將TCR α鏈和TCRβ連結在一起。
在一些實施例中，T細胞受體是單鏈T細胞受體（sc-TCR），其是單個胺基酸鏈，含有能夠結合MHC-肽複合體的α鏈和β鏈。通常，scTCR可以使用本領域技術人員已知的方法所產生，參見例如國際專利合作條約公開號WO 96/13593、WO 96/18105、WO99/18129、WO04/033685、WO2006/037960、WO2011/044186等的公開說明書；美國專利號7,569,664；和Schlueter，C.J.等人，J. Mol. Biol. 256,859（1996）。在一些實施例中，scTCR含有對應於TCR α鏈可變區的胺基酸序列所構成的第一區段、對應於TCR β鏈可變區的胺基酸序列與對應於TCR β鏈細胞外恆定域的胺基酸序列所構成的第二區段，以及一連接子序列，而對應於所述TCR β鏈可變區的胺基酸序列融合至對應於TCR β鏈細胞外恆定域的胺基酸序列的N端，所述連接子序列連接第一區段的C端和第二區段的N端。在一些實施例中，scTCR含有對應於TCR β鏈可變區的胺基酸序列所構成的第一區段、對應於TCR α鏈可變區的胺基酸序列與對應於TCR α鏈細胞外恆定域的胺基酸序列所構成的第二區段，以及可選的連接子序列，所述對應於TCR　α鏈可變區的胺基酸序列融合至對應於TCR α鏈細胞外恆定域的胺基酸序列的N端，連接子序列連接第一區段的C端和第二區段的N端。在一些實施例中，scTCR含有α鏈可變區序列與α鏈細胞外恆定域序列所構成的第一區段、β鏈可變區序列與β鏈細胞外恆定域及跨膜區序列所構成的第二區段，以及可選的連接子序列，而所述α鏈可變區序列融合至α鏈細胞外恆定域序列的N端，所述β鏈可變區序列融合至β鏈細胞外恆定域及跨膜區序列的N端，連接子序列連接第一區段的C端和第二區段的N端。在一些實施例中，scTCR含有TCR β鏈可變區序列與β鏈細胞外恆定域序列所構成的第一區段、α鏈可變區序列與α鏈細胞外恆定域及跨膜區序列所構成的第二區段，以及可選的連接子序列，所述TCR β鏈可變區序列融合至β鏈細胞外恆定域序列的N端，所述α鏈可變區序列融合至α鏈細胞外恆定域及跨膜區序列，連接子序列連接第一區段的C端和第二區段的N端。在一些實施例中，為了讓scTCR結合至MHC-肽複合體，a和β鏈必須配成一對，致使其可變區序列係被排成進行這種結合。促進scTCR中α鏈和β鏈配對的各種方法是本領域熟知的。在一些實施例中，本文的TCR包括連接子序列，其連接α和β鏈以形成單條多肽鏈。在一些實施例中，連接子應具有足夠的長度以連接α鏈的C端和β鏈的N端之間（反之亦然）的距離，同時也該讓連接子長度不致太長而使其阻礙或降低scTCR與目標肽-MHC複合體的結合。在一些實施例中，連接第一TCR區段和第二TCR區段的scTCR連接子可以是任何能夠形成單條多肽鏈，同時保留TCR結合特異性的連接子。在一些實施例中，舉例而言，連接子序列可以具有化學式-P-AA-P-，其中P是脯胺酸，而AA代表一胺基酸序列，其中胺基酸單體可以是甘胺酸或絲胺酸。在一些實施例中，第一區段係與和第二區段配對，使其可變區序列被排成進行這樣的結合。因此，在一些情況下，連接子具有足夠的長度以跨越第一區段的C端和第二區段的N端（反之亦然）的距離，同時又不會太長而使其阻礙或降低scTCR與目標配體的結合。在一些實施例中，連接子可含有約10至約45個胺基酸，例如10至30個胺基酸或26至41個胺基酸殘基，例如29、30、31或32個胺基酸。在一些實施例中，scTCR在其單條胺基酸鏈的殘基之間含有雙硫鍵，在一些情況下，其可以促進單鏈分子的α和β區之間的配對穩定性（參見例如美國專利號7,569,664）。在一些實施例中，scTCR含有共價雙硫鍵，其將α鏈恆定域其免疫球蛋白區上的殘基連接至單鏈分子其β鏈恆定域的免疫球蛋白區的殘基。在一些實施例中，其雙硫鍵對應於天然dTCR中存在的天然雙硫鍵。在一些實施例中，天然TCR中不存在雙硫鍵。在一些實施例中，其雙硫鍵是一被導入的非天然雙硫鍵，例如，將一或多個半胱胺酸併入scTCR多肽的第一鏈區和第二鏈區的細胞外恆定區序列。示例性的半胱胺酸突變包括任何如上所述的突變。在一些情況下，本文的TCR可存在天然和非天然雙硫鍵。
在一些實施例中，本文的任一種TCR（包括dTCR或scTCR）可以與在T細胞表面上產生活性TCR的信號傳導結構域連接。在一些實施例中，本文的TCR是表現在細胞表面上。在一些實施例中，本文的TCR確實含有對應於跨膜序列的序列。在一些實施例中，跨膜結構域可以是Ca或CP跨膜結構域。在一些實施例中，跨膜結構域可以來自非TCR來源，例如來自CD3z、CD28或B7.1的跨膜區。在一些實施例中，本文的TCR確實含有對應於細胞質序列的序列。在一些實施例中，本文的TCR含有CD3z信號傳導結構域。在一些實施例中，本文的TCR能夠與CD3形成TCR複合體。在一些實施例中，本文的TCR或其抗原結合部分可以是經重組產生的天然蛋白或其突變形式，其一或多種性質（例如，結合特性）已被改變。在一些實施例中，本文的TCR可以衍生自各種動物物種之一，例如人類、小鼠、大鼠或其他哺乳動物。
在一些實施例中，本文的TCR具有對目標細胞上的目標抗原的親和力。目標抗原可包括任何與目標細胞相關的蛋白類型或其表位。舉例而言，本文的TCR可以具有對目標細胞上目標抗原的親和力，所述目標抗原代表所述目標細胞處於特定疾病狀態。在一些實施例中，目標抗原由MHC所加工並呈現。
在一個示例性實施例中，目標細胞抗原是紐約食道-1（NY-ESO-1）肽。NY-ESO-1屬於癌症 - 睪丸（CT）抗原蛋白組。NY-ESO-1在體外（in vitro）是高度免疫原性的抗原，且透過MHC呈現給T細胞。識別A2所呈現的表位NY-ESO157-165 ，即SLLMWITQC（SEQ ID NO：1）的毒殺性T細胞（CTL）係從骨髓瘤病患的血液和淋巴結發育。對所述表位具特異性的T細胞株會殺死腫瘤細胞。識別NY-ESO157-165 表位的高親和力TCR可識別HLA-A2陽性、NY-ESO-1陽性的細胞株（但不識別缺乏HLA-A2或NY-ESO的細胞）。因此，本發明的TCR可以是HLA-A2受限的NY-ESO-1（SLLMWITQC；SEQ ID NO：1）特異性TCR。在一個實施例中，本發明的NY-ESO-1 TCR是野生型NY-ESO-1 TCR。野生型NY-ESO-1 TCR可包括但不限於8F NY-ESO-1 TCR（本文又稱為“8F”或“8F TCR”）和1G4 NY-ESO-1 TCR（本文又稱為1G4”或“1G4 TCR”）。在一個實施例中，本發明的NY-ESO-1 TCR是親和力增強的1G4 TCR，又稱為Ly95。1G4 TCR和親和力增強的1G4 TCR已描述於美國專利號8,143,376中。
如本文所述，本發明的TCR可包括TCRα鏈和TCRβ鏈。舉例而言，對NY-ESO-1具有親和力的TCR包括TCRα鏈和TCRβ鏈，這兩鏈有助於TCR對NY-ESO-1的親和力。在一個實施例中，對NY-ESO-1具有親和力的TCR包括8F TCRα鏈，所述8F TCRα鏈包括8F TCRα鏈可變區，其包括下述胺基酸序列：EEDPQALSIQEGENATMNCSCSKKININLQWYRQNSGRGLVHLILIRSNEREKHSGRLRVTLDTSKKSSSLLITASRAADTASYFCATDGAGKSTFGDGTTLTVKPN（SEQ ID NO：2），前述序列由下述核酸序列編碼：GAGGAGGACCCCCAGGCCCTGTCCATCCAGGAGGGGGAGAATGCCACCATGAATTGCAGTTACAAGACTTCCATAAACAACCTGCAGTGGTACCGCCAGAACTCCGGCCGCGGCCTGGTGCACCTGATCCTCATCCGGTCGAATGAAAGGGAAAAGCACTCGGGACGCCTGCGAGTGACTCTGGACACGTCCAAGAAGTCGTCCAGTCTCTTAATCACCGCCTCTCGCGCAGCCGATACCGCATCGTACTTCTGTGCAACCGACGGGGCGGGCAAGAGTACATTCGGCGACGGCACTACCCTGACCGTGAAGCCAAAT（SEQ ID NO：3）。
本領域技術人員已知對NY-ESO-1具有親和力的TCR的8F TCRα鏈可以具有維持對NY-ESO-1的親和力的可容許變異。舉例而言，對NY-ESO-1具有親和力的TCR包括8F TCRα鏈可變區，該8F TCRα鏈可變區包括一胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO：2所示之8F TCR α鏈可變區胺基酸序列的序列一致性為至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％。在一個實施例中，對NY-ESO-1具有親和力的TCR包括8F TCRα鏈可變區，該8F TCR α鏈可變區包括SEQ ID NO：2所示之胺基酸序列。
對NY-ESO-1具有親和力的TCR可以包括由一核酸序列所編碼的8F TCR α鏈可變區，該胺基酸序列與SEQ ID NO：3所示之8F TCR α鏈可變區胺基酸序列的序列一致性為至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少82％、至少84％、至少86％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％。在一個實施例中，對NY-ESO-1具有親和力的TCR包括8F TCR α鏈可變區，該8F TCR α鏈可變區包括SEQ ID NO：3中所示之核酸序列。
對NY-ESO-1具有親和力的TCR其TCR α鏈可變區包括三個互補性決定區（complementarity-determining region，CDR）。本文所用的「互補性決定區」或「CDR」是指結合特定抗原的抗原結合分子（例如免疫球蛋白和TCR）其變異鏈上的區域。因此，對NY-ESO-1具有親和力的TCR可包括8F TCR α鏈可變區，該8F TCR α鏈可變區包括由胺基酸序列TSINN（SEQ ID NO：4）所代表的CDR1、由胺基酸序列IRS所代表的CDR2，和由胺基酸序列ATD所代表的CDR3。對於本領域技術人員來說，對NY-ESO-1具有親和力的TCR其TCR α鏈的CDR已知可以具有維持對NY-ESO-1的親和力的可容許變異。舉例而言，對NY-ESO-1具有親和力的TCR包括8F TCRα鏈可變區，該8F TCRα鏈可變區包括CDR1，該CDR1包括一胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO：4所示之CDR1胺基酸序列的序列一致性為至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％。舉例而言，對NY-ESO-1具有親和力的TCR可以包括8F TCRα鏈可變區，該8F TCRα鏈可變區包括CDR2，該CDR2包括一胺基酸序列，該胺基酸序列與IRS所代表的CDR2胺基酸序列的序列一致性為至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％。舉例而言，對NY-ESO-1具有親和力的TCR可包括8F TCRα鏈可變區，該8F TCRα鏈可變區包括CDR3，該CDR3包括一胺基酸序列，該胺基酸序列與ATD所代表的CDR3胺基酸序列的序列一致性為至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％。在一個實施例中，對NY-ESO-1具有親和力的TCR其TCR α鏈可變區包括8F TCRα鏈可變區的上述三個互補性決定區（CDRs）。
對NY-ESO-1具有親和力的TCR的8F TCRα鏈可以包括以下所示的胺基酸序列：METLLGVSLVILWLQLARVNSQQGEEDPQALSIQEGENATMNCSYKTSINNLQWYRQNSGRGLVHLILIRSNEREKHSGRLRVTLDTSKKSSSLLITASRAADTASYFCATDGAGKSTFGDGTTLTVKPNIQKPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPADTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS（SEQ ID NO：5），其由下列核酸序列編碼：ATGGACTCGTGGACCTTATGCTGCGTGTCCCTGTGCATACTGGTTGCCAAGCACACAGACGCCGGGGTGATCCAGAGCCCCCGGCACGAAGTTACCGAGATGGGCCAGGAGGTGACGCTCCGATGCAAGCCCATCAGTGGCCACGATTATCTCTTCTGGTACCGCCAAACCATGATGCGCGGCTTGGAACTCCTCATCTACTTCAACAACAACGTCCCCATCGATGACTCCGGCATGCCTGAGGACAGGTTCAGTGCGAAGATGCCGAATGCATCCTTCTCCACCCTGAAGATACAGCCGAGTGAGCCCCGCGACTCCGCTGTGTACTTCTGCGCCTCTACTATCGGCGCCCAGCCTCAACATTTCGGCGACGGCACGCGCCTCAGTATCCTGGAGGACCTGAACAAGGTGTTCCCTCCGGAAGTGGCTGTGTTTGAGCCCTCCGAGGCAGAAATCTCACACACACAGAAGGCAACCCTCGTGTGTCTGGCAACAGGTTTCTTCCCAGATCACGTGGAGCTGAGTTGGTGGGTCAACGGCAAGGAGGTCCATAGCGGGGTGAGTACCGACCCACAGCCTCTCAAGGAGCAGCCTGCCCTCAACGACAGTAGGTACTGCCTGTCCTCGCGCCTCCGCGTGTCCGCAACGTTCTGGCAGAATCCCCGCAACCACTTCCGGTGCCAGGTCCAATTCTACGGCCTGAGTGAGAACGATGAGTGGACACAGGATAGGGCCAAGCCCGTGACCCAGATCGTGTCCGCCGAGGCCTGGGGCCGCGCTGACTGCGGCTTCACCTCCGTGTCGTATCAGCAGGGCGTATTATCAGCCACCATTCTTTACGAAATCCTCCTCGGCAAGGCCACACTATACGCCGTGCTGGTGTCGGCGCTGGTGTTAATGGCGATGGTCAAGCGAAAGGATTAA（SEQ ID NO：6）。
對NY-ESO-1具有親和力的8F TCRα鏈可以包括一胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO：5所示之8F TCR α鏈可變區胺基酸序列的序列一致性為至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％。在一個實施例中，對NY-ESO-1具有親和力的TCR包括8F TCRα鏈，該8F TCRα鏈可以包括如SEQ ID NO：5所示的一胺基酸序列。對NY-ESO-1具有親和力的TCR包括8F TCRα鏈，該8F TCRα鏈由一胺基酸序列所編碼，該胺基酸序列與SEQ ID NO：6所示之8F TCR α鏈胺基酸序列的序列一致性為至少60％，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少82％、至少84％、至少86％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％。在一個實施例中，對NY-ESO-1具有親和力的TCR包括8F TCRα鏈，該8F TCRα鏈包括SEQ ID NO：6所示之核酸序列。
如本文所述，本發明的TCR可包括TCRα鏈和TCRβ鏈。在一個實施例中，對NY-ESO-1具有親和力TCR包括8F TCRβ鏈，該8F TCRβ鏈包括8F TCRβ鏈可變區，該8F TCRβ鏈可變區包括以下所述的胺基酸序列：VIQSPRHEVTEMGQEVTLRCKPISGHDYLFWYRQTMMRGLELLIYFNNNVPIDDSGMPEDRFSAKMPNASFSTLKIQPSEPRDSAVYFCASTIGAQPQHFGDGTRLSILE（SEQ ID NO：7），其由下列核酸序列編碼：GTGATCCAGAGCCCCCGGCACGAAGTTACCGAGATGGGCCAGGAGGTGACGCTCCGATGCAAGCCCATCAGTGGCCACGATTATCTCTTCTGGTACCGCCAAACCATGATGCGCGGCTTGGAACTCCTCATCTACTTCAACAACAACGTCCCCATCGATGACTCCGGCATGCCTGAGGACAGGTTCAGTGCGAAGATGCCGAATGCATCCTTCTCCACCCTGAAGATACAGCCGAGTGAGCCCCGCGACTCCGCTGTGTACTTCTGCGCCTCTACTATCGGCGCCCAGCCTCAACATTTCGGCGACGGCACGCGCCTCAGTATCCTGGAG（SEQ ID NO：8）。
對於本領域技術人員來說，對NY-ESO-1具有親和力的TCR其 TCRα鏈已知可以具有維持對NY-ESO-1的親和力的可容許變異。舉例而言，對NY-ESO-1具有親和力的TCR包括8F TCRα鏈可變區，該8F TCRα鏈可變區包括一胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO：7所示之8F TCRβ 鏈可變區胺基酸序列的序列一致性為至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少82％、至少84％、至少86％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％。在一個實施例中，對NY-ESO-1具有親和力的TCR包括8F TCRβ鏈可變區，該8F TCRβ鏈可變區包括SEQ ID NO：7所示之胺基酸序列。
對NY-ESO-1具有親和力的TCR可以包括8F TCR β鏈可變區，該8F TCRβ鏈可變區由一胺基酸序列所編碼，該胺基酸序列與SEQ ID NO：8所示之8F TCR β鏈可變區胺基酸序列的序列一致性為至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少82％、至少84％、至少86％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％。在一個實施例中，對NY-ESO-1具有親和力的TCR包括8F TCRβ鏈可變區，該8F TCRβ鏈可變區包括SEQ ID NO：8所示之核酸序列。
對NY-ESO-1具有親和力的TCR的TCR β鏈可變區包括三個互補性決定區（CDR）。因此，對NY-ESO-1具有親和力TCR可以包括具有胺基酸序列SGHDY（SEQ ID NO：9）代表之CDR1、胺基酸序列FNNNVP（SEQ ID NO：10）代表之CDR2，和由胺基酸序列ASTI（SEQ ID NO：11）代表之CDR3的8F TCR β鏈可變區。對於本領域技術人員來說，對NY-ESO-1具有親和力的TCR其TCRβ鏈可變區的CDR已知可以具有維持對NY-ESO-1親和力的可容許變異。舉例而言，對NY-ESO-1具有親和力的TCR包括8F TCRβ鏈可變區，該8F TCRβ鏈可變區包括CDR1，該CDR1包括一胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO：9所示之CDR1胺基酸序列的序列一致性為至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％。舉例而言，對NY-ESO-1具有親和力的TCR包括8F TCRβ鏈可變區，該8F TCRβ鏈可變區包括CDR2，該CDR2包括一胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO：10所示之CDR2胺基酸序列的序列一致性為至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％。舉例而言，對NY-ESO-1具有親和力的TCR包括8F TCRβ鏈可變區，該8F TCRβ鏈可變區包括CDR3，該CDR3包括一胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO：11所示之CDR3胺基酸序列的序列一致性為至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％。在一個實施例中，對NY-ESO-1具有親和力的8F TCR其TCR β鏈可變區包括TCR β鏈可變區的上述三個互補性決定區（CDRs）。
對NY-ESO-1具有親和力TCR的8F TCRβ鏈可以包括以下所示的胺基酸序列：METLLGVSLVILWLQLARVNSQQGEEDPQALSIQEGENATMNCSYKTSINNLQWYRQNSGRGLVHLILIRSNEREKHSGRLRVTLDTSKKSSSLLITASRAADTASYFCATDGAGKSTFGDGTTLTVKPNIQKPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPADTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS（SEQ ID NO：12），其由下列核酸序列編碼：ATGGAGACCCTGCTCGGGGTCTCACTGGTCATCCTGTGGCTGCAGCTGGCCAGGGTGAACTCGCAGCAGGGGGAGGAGGACCCCCAGGCCCTGTCCATCCAGGAGGGGGAGAATGCCACCATGAATTGCAGTTACAAGACTTCCATAAACAACCTGCAGTGGTACCGCCAGAACTCCGGCCGCGGCCTGGTGCACCTGATCCTCATCCGGTCGAATGAAAGGGAAAAGCACTCGGGACGCCTGCGAGTGACTCTGGACACGTCCAAGAAGTCGTCCAGTCTCTTAATCACCGCCTCTCGCGCAGCCGATACCGCATCGTACTTCTGTGCAACCGACGGGGCGGGCAAGAGTACATTCGGCGACGGCACTACCCTGACCGTGAAGCCAAATATCCAGAAGCCTGATCCAGCTGTCTATCAGTTGCGCGATTCCAAATCGTCTGACAAATCTGTGTGCCTGTTCACCGACTTCGACTCCCAGACGAACGTGTCCCAGAGTAAAGACAGCGACGTGTACATCACTGATAAGACCGTGCTGGACATGCGCTCCATGGACTTTAAAAGTAACAGCGCTGTAGCGTGGAGCAACAAGAGTGACTTCGCCTGCGCCAACGCCTTCAATAACTCTATCATACCTGCCGATACCTTCTTCCCGAGCCCCGAATCCAGTTGCGACGTGAAGCTCGTGGAGAAGAGCTTTGAGACAGACACCAACCTGAACTTCCAAAACCTGTCCGTCATTGGCTTCAGGATCCTCCTCCTCAAGGTGGCCGGCTTCAACTTGCTCATGACGCTGAGACTCTGGAGTTCA（SEQ ID NO:13）。
對NY-ESO-1具有親和力的8F TCR β鏈可以包括一胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO：12所示之8F TCR β鏈可變區胺基酸序列的序列一致性為至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％。在一個實施例中，對NY-ESO-1具有親和力的TCR包括8F TCRβ鏈，該8F TCRβ鏈可以包括由SEQ ID NO：12所示之胺基酸序列。對NY-ESO-1具有親和力的TCR可以包括8F TCRβ鏈，該8F TCRβ鏈由一胺基酸序列所編碼，該胺基酸序列與SEQ ID NO：12所示之8F TCR β鏈可變區胺基酸序列的序列一致性為至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％。在一個實施例中，對NY-ESO-1具有親和力的TCR包括8F TCR β鏈，該8F TCR β鏈包括SEQ ID NO：13所示之核酸序列。
C. 切換受體
本發明提供用於本發明的經修飾細胞的切換受體。本文所用的術語「切換受體」或「嵌合切換受體」是指設計用來將負向信號轉導信號轉換為正向信號的分子。在一些實施例中，切換受體是嵌合蛋白，該嵌合蛋白包括與負向信號相關的第一蛋白或其片段，以及與正向信號相關的第二蛋白或其片段。與負向信號相關的蛋白的實例包括但不限於CTLA-4、PD-1、BTLA、TIM-3等。與正向信號相關的蛋白的實例包括但不限於CD28、ICOS、4-1BB、TGFβR等。
因此，當切換受體在細胞（例如，哺乳動物細胞）中表現時，會在該細胞中將負向信號轉換成正向信號。在一些實施例中，本發明的切換受體包括第一結構域和第二結構域，該第一結構域衍生自遞送負向信號的蛋白或其片段，該第二結構域衍生自遞送正向信號的蛋白或其片段。
衍生自遞送負向信號的蛋白或其片段的適合第一結構域包括野生型CTLA-4的變異型或衍生物。在一個實施例中，切換受體的第一結構域包括CTLA-4蛋白其細胞外結構域的至少一部分，特別是與CTLA-4天然配體結合所必需的細胞外結構域的那一部分。本文也涵蓋前述細胞外結構域其野生型的變異型，或是負責與CTLA-4其天然配體結合的細胞外結構域的部分。衍生自遞送負向信號的蛋白或其片段的適合第一結構域包括野生型PD-1的變異型或衍生物。在一個實施例中，切換受體的第一結構域包括PD-1蛋白其細胞外結構域的至少一部分，特別是與PD-1其天然配體結合所必需的細胞外結構域的那一部分。本文也涵蓋前述細胞外結構域其野生型形式的變異型，或是負責與PD-1其天然配體結合的細胞外結構域的部分。舉例而言，在本發明中包括PD1細胞外結構域的變異型，該PD1細胞外結構域的變異型在相對於PD1其全長胺基酸序列中的第132個胺基酸由丙胺酸被取代為白胺酸（A132L）。適合的第一結構域衍生自遞送負信號的蛋白或其片段，且適合的第一結構域包括野生型BTLA的變異型或衍生物。在一個實施例中，切換受體的第一結構域包括BTLA蛋白其細胞外結構域的至少一部分，特別是結合BTLA其天然配體所必需的細胞外結構域的那一部分。細胞外結構域其野生型形式的變異型，或是負責結合BTLA的天然配體的細胞外結構域的部分也包括在本發明中。衍生自遞送負向信號的蛋白或其片段的適合的第一結構域包括野生型TGF βR的變異型或衍生物（例如，TGFβRI或TGFβRII）。在一個實施例中，切換受體的第一結構域包括TGFβR蛋白其細胞外結構域的至少一部分（例如，TGFβRI或TGFβRII），特別是結合TGFβR天然配體（例如，TGFβRI或TGFβRII）所必需的細胞外結構域的那一部分。細胞外結構域其野生型形式的變異型，或負責結合TGFβR其天然配體的細胞外結構域的部分（例如，TGFβRI或TGFβRII）也包括在本發明中。衍生自遞送負向信號的蛋白或其片段的適合第一結構域包括野生型TIM3的變異型或衍生物。在一個實施例中，切換受體的第一結構域包括TIM3蛋白其細胞外結構域的至少一部分，特別是結合TIM3天然配體所必需的細胞外結構域部分。細胞外結構域其野生型形式的變異型，或負責結合TIM3其天然配體的細胞外結構域的部分也包括在本發明中。
衍生自遞送負向信號的蛋白或其片段的適合第二結構域包括ICOS蛋白的變異型或衍生物。在一個實施例中，切換受體的第二結構域包括ICOS蛋白的細胞內結構域（也稱為內結構域或細胞質結構域）的至少一部分，特別是對細胞的細胞內組分觸發信號所必需的部分。ICOS蛋白的細胞內結構域其野生型形式的變異型，或是負責信號傳導的細胞內結構域的部分也包括在本發明中。衍生自遞送負向信號的蛋白或其片段的適合第二結構域包括CD28蛋白的變異型或衍生物。在一個實施例中，切換受體的第二結構域包括CD28蛋白的細胞內結構域（也稱為結構域或細胞質結構域）的至少一部分，特別是對細胞的細胞內組分觸發信號所必需的部分。CD28蛋白的細胞內結構域其野生型形式的變異型，或是負責信號傳導的細胞內結構域的部分也包括在本發明中。衍生自遞送負向信號的蛋白或其片段的適合第二結構域包括IL-12R的變異型或衍生物（例如，IL-12Rβ1或IL-12Rβ2）。在一個實施例中，切換受體的第二結構域包括IL-12R（例如，IL-12Rβ1或IL-12Rβ2）的細胞內結構域（也稱為內結構域或細胞質結構域）的至少一部分，特別是對細胞的細胞內組分觸發信號來說必需的部分。IL-12R的細胞內結構域其野生型變異型（如IL-12Rβ1或IL-12Rβ2），或負責信號傳導的細胞內結構域的部分也包括在本發明中。衍生自遞送負向信號的蛋白或其片段的適合第二結構域包括4-1BB蛋白的變異型或衍生物。在一個實施例中，切換受體的第二結構域包括4-1BB蛋白的細胞內結構域（也稱為結構域或細胞質結構域）的至少一部分，特別是對細胞內組分觸發信號所必需的部分。4-1BB蛋白的細胞內結構域其野生型形式的變異型，或是負責信號傳導的細胞內結構域的部分也包括在本發明中。
適用於本發明的切換受體包括對應於細胞質結構域、跨膜結構域和細胞外結構域的多肽，以及對應於細胞質結構域，跨膜結構域和細胞外結構域其較小部分的多肽。在一個實施例中，切換受體包括遞送負向信號的蛋白其跨膜結構域或其片段。在另一個實施例中，切換受體包括遞送正向信號的蛋白其跨膜結構域或其片段。
在一個實施例中，適用於本發明的切換受體是PD1-CD28切換受體。PD1-CD28切換受體包括PD1細胞外結構域的變異型、CD28跨膜結構域和CD28細胞質結構域。在一個實施例中，PD1-CD28切換受體包括下列胺基酸序列：MQIPQAPWPVVWAVLQLGWRPGWFLDSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQTLVFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS（SEQ ID NO：14），由下列核酸序列編碼：ATGCAGATCCCACAGGCGCCCTGGCCAGTCGTCTGGGCGGTGCTACAACTGGGCTGGCGGCCAGGATGGTTCTTAGACTCCCCAGACAGGCCCTGGAACCCCCCCACCTTCTCCCCAGCCCTGCTCGTGGTGACCGAAGGGGACAACGCCACCTTCACCTGCAGCTTCTCCAACACATCGGAGAGCTTCGTGCTAAACTGGTACCGCATGAGCCCCAGCAACCAGACGGACAAGCTGGCCGCCTTCCCCGAGGACCGCAGCCAGCCCGGCCAGGACTGCCGCTTCCGTGTCACACAACTGCCCAACGGGCGTGACTTCCACATGAGCGTGGTCAGGGCCCGGCGCAATGACAGCGGCACCTACCTCTGTGGGGCCATCTCCCTGGCCCCCAAGGCGCAGATCAAAGAGAGCCTGCGGGCAGAGCTCAGGGTGACAGAGAGAAGGGCAGAAGTGCCCACAGCCCACCCCAGCCCCTCACCCAGGCCAGCCGGCCAGTTCCAAACCCTGGTGTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC（SEQ ID NO：15）。
對於本領域技術人員來說，PD1-CD28切換受體已知可以具有維持其預期的生物活性（例如，當在細胞中表現時，將負向PD1信號轉換為正向CD28信號）的可容許變異。因此，本發明的PD1-CD28切換受體可包括一胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO：14所示之PD1-CD28切換受體胺基酸序列其序列一致性為至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％。因此，本發明的PD1-CD28切換受體可以由一核酸所編碼，該核酸包括一核酸序列，該核酸序列與SEQ ID NO：15所示之PD1-CD28切換受體胺基酸序列其序列一致性為至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％。
在一個實施例中，適合本發明的切換受體是TIM3-CD28切換受體。TIM3-CD28切換受體包括TIM3細胞外結構域、CD28跨膜結構域和CD28細胞質結構域。在一個實施例中，TIM3-CD28切換受體包括下列胺基酸序列：MFSHLPFDCVLLLLLLLLTRSSEVEYRAEVGQNAYLPCFYTPAAPGNLVPVCWGKGACPVFECGNVVLRTDERDVNYWTSRYWLNGDFRKGDVSLTIENVTLADSGIYCCRIQIPGIMNDEKFNLKLVIKPAKVTPAPTRQRDFTAAFPRMLTTRGHGPAETQTLGSLPDINLTQISTLANELRDSRLANDLRDSGATIRFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS（SEQ ID NO：132），其由下列核酸序列編碼：ATGTTTTCACATCTTCCCTTTGACTGTGTCCTGCTGCTGCTGCTGCTACTACTTACAAGGTCCTCAGAAGTGGAATACAGAGCGGAGGTCGGTCAGAATGCCTATCTGCCCTGCTTCTACACCCCAGCCGCCCCAGGGAACCTCGTGCCCGTCTGCTGGGGCAAAGGAGCCTGTCCTGTGTTTGAATGTGGCAACGTGGTGCTCAGGACTGATGAAAGGGATGTGAATTATTGGACATCCAGATACTGGCTAAATGGGGATTTCCGCAAAGGAGATGTGTCCCTGACCATAGAGAATGTGACTCTAGCAGACAGTGGGATCTACTGCTGCCGAATCCAAATCCCAGGCATAATGAATGATGAAAAATTTAACCTGAAGTTGGTCATCAAACCAGCCAAGGTCACCCCTGCACCGACTCGGCAGAGAGACTTCACTGCAGCCTTTCCAAGGATGCTTACCACCAGGGGACATGGCCCAGCAGAGACACAGACACTGGGGAGCCTCCCTGACATAAATCTAACACAAATATCCACATTGGCCAATGAGTTACGGGACTCTAGGTTGGCCAATGACTTACGGGACTCCGGAGCAACCATCAGATTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTACTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC（SEQ ID NO：133)。
對於本領域技術人員來說，TIM3-CD28切換受體已知可以具有維持其預期的生物活性（例如，當在細胞中表現時，將負向TIM3信號轉換為正向CD28信號）的可容許變異。因此，本發明的TIM3-CD28切換受體可包括一胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO：132所示之TIM3-CD28切換受體胺基酸序列其序列一致性為至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％。因此，本發明的TIM3-CD28切換受體可以由一核酸所編碼，該核酸包括一核酸序列，該核酸序列與SEQ ID NO：133所示之PD1-CD28切換受體胺基酸序列其序列一致性為至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％。
在一個實施例中，適合本發明的切換受體是PD1-41BB切換受體（在本發明中也稱為PD1.BB）。PD1-41BB切換受體包括PD1細胞外結構域、CD8α跨膜結構域和4-1BB細胞質結構域。在一個實施例中，PD1-41BB切換受體包括下述胺基酸序列：MQIPQAPWPVVWAVLQLGWRPGWFLDSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQTLVIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL（SEQ ID NO：134），其由下列核酸序列編碼：ATGCAGATCCCACAGGCGCCCTGGCCAGTCGTCTGGGCGGTGCTACAACTGGGCTGGCGGCCAGGATGGTTCTTAGACTCCCCAGACAGGCCCTGGAACCCCCCCACCTTCTCCCCAGCCCTGCTCGTGGTGACCGAAGGGGACAACGCCACCTTCACCTGCAGCTTCTCCAACACATCGGAGAGCTTCGTGCTAAACTGGTACCGCATGAGCCCCAGCAACCAGACGGACAAGCTGGCCGCCTTCCCCGAGGACCGCAGCCAGCCCGGCCAGGACTGCCGCTTCCGTGTCACACAACTGCCCAACGGGCGTGACTTCCACATGAGCGTGGTCAGGGCCCGGCGCAATGACAGCGGCACCTACCTCTGTGGGGCCATCTCCCTGGCCCCCAAGGCGCAGATCAAAGAGAGCCTGCGGGCAGAGCTCAGGGTGACAGAGAGAAGGGCAGAAGTGCCCACAGCCCACCCCAGCCCCTCACCCAGGCCAGCCGGCCAGTTCCAAACCCTGGTTATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAAAAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG（SEQ ID NO：135）。
對於本領域技術人員來說，PD1-41BB切換受體已知可以具有維持其預期的生物活性（例如，當在細胞中表現時，將負向PD1信號轉換為正向4-1BB信號）的可容許變異。因此，本發明的PD1-41BB切換受體可包括一胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO：134所示之，PD1-41BB切換受體胺基酸序列其序列一致性為至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％。因此，本發明的PD1-41BB切換受體可以由一核酸所編碼，該核酸包括一核酸序列，該核酸序列與SEQ ID NO：135所示之PD1-41BB切換受體胺基酸序列的序列一致性為至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％。
在一個實施例中，適合本發明的切換受體是PD1A132L -41BB切換受體（在本文中也稱為PD1A132L PTM.BB或PD1*.BB）。PD1A132L -41BB切換受體包括PD1細胞外結構域變異型，其在相對於PD1全長胺基酸序列上的第132個胺基酸由丙胺酸被取代為白胺酸（A132L）、CD8α跨膜結構域和4-1BB細胞質結構域。PD1的A132L取代增加其與PD-L1的親和力。舉例而言，參見，Zhang等人，Immunity 2004, 20:337-347。在一個實施例中，PD1A132L -41BB切換受體包括如下所示的胺基酸序列：MQIPQAPWPVVWAVLQLGWRPGWFLDSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGT YLCGAISLAPKLQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQTLVIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL（SEQ ID NO：136），其由下列核酸序列編碼：ATGCAGATCCCACAGGCGCCCTGGCCAGTCGTCTGGGCGGTGCTACAACTGGGCTGGCGGCCAGGATGGTTCTTAGACTCCCCAGACAGGCCCTGGAACCCCCCCACCTTCTCCCCAGCCCTGCTCGTGGTGACCGAAGGGGACAACGCCACCTTCACCTGCAGCTTCTCCAACACATCGGAGAGCTTCGTGCTAAACTGGTACCGCATGAGCCCCAGCAACCAGACGGACAAGCTGGCCGCCTTCCCCGAGGACCGCAGCCAGCCCGGCCAGGACTGCCGCTTCCGTGTCACACAACTGCCCAACGGGCGTGACTTCCACATGAGCGTGGTCAGGGCCCGGCGCAATGACAGCGGCACCTACCTCTGTGGGGCCATCTCCCTGGCCCCCAAGCTGCAGATCAAAGAGAGCCTGCGGGCAGAGCTCAGGGTGACAGAGAGAAGGGCAGAAGTGCCCACAGCCCACCCCAGCCCCTCACCCAGGCCAGCCGGCCAGTTCCAAACCCTGGTTATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAAAAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG（SEQ ID NO：137）。
對於本領域技術人員來說，PD1A132L -41BB切換受體已知可以具有維持其預期的生物活性（例如，當在細胞中表現時，將負向PD1信號轉換為正向41BB信號）的可容許變異。因此，本發明的PD1A132L -41BB切換受體可包括一胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO：136所示之PD1A132L -41BB切換受體胺基酸序列其序列一致性為至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％。因此，本發明的PD1A132L -41BB切換受體可以由一核酸所編碼，該核酸包括一核酸序列，該核酸序列與SEQ ID NO：137所示之PD1A132L -41BB切換受體胺基酸序列其序列一致性為至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％。
在一個實施例中，適合本發明的切換受體是PD1A132L -CD28切換受體（本文中也稱為PD1A132L PTM.CD28或PD1*.CD28）。PD1A132L -CD28切換受體包括PD1細胞外結構域變異型，其相對於PD1全長胺基酸序列上的第132個胺基酸由丙胺酸被取代為白胺酸（A132L）、CD28跨膜結構域和CD28細胞質結構域。PD1的A132L取代增加其與PD-L1的親和力。舉例而言，參見，Zhang等人，Immunity 2004, 20:337-347。在一個實施例中，PD1A132L -CD28切換受體包括下列胺基酸序列：MQIPQAPWPVVWAVLQLGWRPGWFLDSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKLQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQTLVFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS（SEQ ID NO：138），其由下列核酸序列編碼：ATGCAGATCCCACAGGCGCCCTGGCCAGTCGTCTGGGCGGTGCTACAACTGGGCTGGCGGCCAGGATGGTTCTTAGACTCCCCAGACAGGCCCTGGAACCCCCCCACCTTCTCCCCAGCCCTGCTCGTGGTGACCGAAGGGGACAACGCCACCTTCACCTGCAGCTTCTCCAACACATCGGAGAGCTTCGTGCTAAACTGGTACCGCATGAGCCCCAGCAACCAGACGGACAAGCTGGCCGCCTTCCCCGAGGACCGCAGCCAGCCCGGCCAGGACTGCCGCTTCCGTGTCACACAACTGCCCAACGGGCGTGACTTCCACATGAGCGTGGTCAGGGCCCGGCGCAATGACAGCGGCACCTACCTCTGTGGGGCCATCTCCCTGGCCCCCAAGCTGCAGATCAAAGAGAGCCTGCGGGCAGAGCTCAGGGTGACAGAGAGAAGGGCAGAAGTGCCCACAGCCCACCCCAGCCCCTCACCCAGGCCAGCCGGCCAGTTCCAAACCCTGGTGTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC（SEQ ID NO：139）。
對於本領域技術人員來說，PD1A132L -CD28切換受體已知可以具有維持其預期的生物活性（例如，當在細胞中表現時，將負向PD1信號轉換為正向CD28信號）的可容許變異。因此，本發明的PD1A132L -CD28切換受體可包括一胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO：138所示之PD1A132L -CD28切換受體胺基酸序列其序列一致性為至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％。因此，本發明的PD1A132L -CD28切換受體可以由一核酸所編碼，該核酸包括一核酸序列，該核酸序列與SEQ ID NO：139所示之PD1A132L -CD28切換受體胺基酸序列其序列一致性為至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％。
在一個實施例中，適合本發明中切換受體是TGFβRI-IL-12Rβ1受體切換受體。在一個實施例中，TGFβRI-IL-12Rβ1切換受體包括下列胺基酸序列：LEAAVAAPRPRLLLLVLAAAAAAAAALLPGATALQCFCHLCTKDNFTCVTDGLCFVSVTETTDKVIHNSMCIAEIDLIPRDRPFVCAPSSKTGSVTTTYCCNQDHCNKIELPTTVKSSPGLGPVELAAVIAGPVCFVCISLMLMVYIRAARHLCPPLPTPCASSAIEFPGGKETWQWINPVDFQEEASLQEALVVEMSWDKGERTEPLEKTELPEGAPELALDTELSLEDGDRCKAKM（SEQ ID NO：16），其由下列核酸序列編碼：CTGGAGGCGGCGGTCGCTGCTCCGCGTCCCCGGCTGCTCCTCCTCGTGCTGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGCTGCTCCCGGGGGCGACGGCGTTACAGTGTTTCTGCCACCTCTGTACAAAAGACAATTTTACTTGTGTGACAGATGGGCTCTGCTTTGTCTCTGTCACAGAGACCACAGACAAAGTTATACACAACAGCATGTGTATAGCTGAAATTGACTTAATTCCTCGAGATAGGCCGTTTGTATGTGCACCCTCTTCAAAAACTGGGTCTGTGACTACAACATATTGCTGCAATCAGGACCATTGCAATAAAATAGAACTTCCAACTACTGTAAAGTCATCACCTGGCCTTGGTCCTGTGGAACTGGCAGCTGTCATTGCTGGACCAGTGTGCTTCGTCTGCATCTCACTCATGTTGATGGTCTATATCAGGGCCGCACGGCACCTGTGCCCGCCGCTGCCCACACCCTGTGCCAGCTCCGCCATTGAGTTCCCTGGAGGGAAGGAGACTTGGCAGTGGATCAACCCAGTGGACTTCCAGGAAGAGGCATCCCTGCAGGAGGCCCTGGTGGTAGAGATGTCCTGGGACAAAGGCGAGAGGACTGAGCCTCTCGAGAAGACAGAGCTACCTGAGGGTGCCCCTGAGCTGGCCCTGGATACAGAGTTGTCCTTGGAGGATGGAGACAGGTGCAAGGCCAAGATGTGA（SEQ ID NO：17）。
對於本領域技術人員來說，TGFβRI-IL-12Rβ1切換受體已知可以具有維持其預期的生物活性（例如，當在細胞中表現時，將負向TGFβ信號轉換為正向IL-12信號）的可容許變異。因此，本發明的TGFβRI-IL-12Rβ1切換受體可包括一胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO：16所示之TGFβRI-IL-12Rβ1切換受體胺基酸序列其序列一致性為至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％。因此，本發明的TGFβRI-IL-12Rβ1切換受體可以由一核酸所編碼，該核酸包括一核酸序列，該核酸序列與SEQ ID NO：17所示之TGFβRI-IL-12Rβ1切換受體胺基酸序列其序列一致性為至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％。
在一個實施例中，適合本發明的切換受體是TGFβRII-IL-12Rβ2切換受體。在一個實施例中，TGFβRII-IL-12Rβ2切換受體包括下列胺基酸序列：MGRGLLRGLWPLHIVLWTRIASTIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDLLLVIFQVTGISLLPPLGVAISVIIIFYQQKVFVLLAALRPQWCSREIPDPANSTCAKKYPIAEEKTQLPLDRLLIDWPTPEDPEPLVISEVLHQVTPVFRHPPCSNWPQREKGIQGHQASEKDMMHSASSPPPPRALQAESRQLVDLYKVLESRGSDPKPENPACPWTVLPAGDLPTHDGYLPSNIDDLPSHEAPLADSLEELEPQHISLSVFPSSSLHPLTFSCGDKLTLDQLKMRCDSLML（SEQ ID NO：18），其由下列核酸序列編碼：ATGGGTCGGGGGCTGCTCAGGGGCCTGTGGCCGCTGCACATCGTCCTGTGGACGCGTATCGCCAGCACGATCCCACCGCACGTTCAGAAGTCGGTTAATAACGACATGATAGTCACTGACAACAACGGTGCAGTCAAGTTTCCACAACTGTGTAAATTTTGTGATGTGAGATTTTCCACCTGTGACAACCAGAAATCCTGCATGAGCAACTGCAGCATCACCTCCATCTGTGAGAAGCCACAGGAAGTCTGTGTGGCTGTATGGAGAAAGAATGACGAGAACATAACACTAGAGACAGTTTGCCATGACCCCAAGCTCCCCTACCATGACTTTATTCTGGAAGATGCTGCTTCTCCAAAGTGCATTATGAAGGAAAAAAAAAAGCCTGGTGAGACTTTCTTCATGTGTTCCTGTAGCTCTGATGAGTGCAATGACAACATCATCTTCTCAGAAGAATATAACACCAGCAATCCTGACTTGTTGCTAGTCATATTTCAAGTGACAGGCATCAGCCTCCTGCCACCACTGGGAGTTGCCATATCTGTCATCATCATCTTCTACCAGCAAAAGGTGTTTGTTCTCCTAGCAGCCCTCAGACCTCAGTGGTGTAGCAGAGAAATTCCAGATCCAGCAAATAGCACTTGCGCTAAGAAATATCCCATTGCAGAGGAGAAGACACAGCTGCCCTTGGACAGGCTCCTGATAGACTGGCCCACGCCTGAAGATCCTGAACCGCTGGTCATCAGTGAAGTCCTTCATCAAGTGACCCCAGTTTTCAGACATCCCCCCTGCTCCAACTGGCCACAAAGGGAAAAAGGAATCCAAGGTCATCAGGCCTCTGAGAAAGACATGATGCACAGTGCCTCAAGCCCACCACCTCCAAGAGCTCTCCAAGCTGAGAGCAGACAACTGGTGGATCTGTACAAGGTGCTGGAGAGCAGGGGCTCCGACCCAAAGCCAGAAAACCCAGCCTGTCCCTGGACGGTGCTCCCAGCAGGTGACCTTCCCACCCATGATGGCTACTTACCCTCCAACATAGATGACCTCCCCTCACATGAGGCACCTCTCGCTGACTCTCTGGAAGAACTGGAGCCTCAGCACATCTCCCTTTCTGTTTTCCCCTCAAGTTCTCTTCACCCACTCACCTTCTCCTGTGGTGATAAGCTGACTCTGGATCAGTTAAAGATGAGGTGTGACTCCCTCATGCTCTGA（SEQ ID NO：19）。
對於本領域技術人員來說，TGFβRII-IL-12Rβ2切換受體已知可以具有維持其預期的生物活性（例如，當在細胞中表現時，將負向TGFβ信號轉換為正向IL-12信號）的可容許變異。因此，本發明的TGFβRII-IL-12Rβ2切換受體可包括一胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO：18所示之TGFβRII-IL-12Rβ2切換受體胺基酸序列其序列一致性為至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％。因此，本發明的TGFβRII-IL-12Rβ2切換受體可以由一核酸所編碼，該核酸包括一核酸序列，該核酸序列與SEQ ID NO：19所示之TGFβRII-IL-12Rβ2切換受體胺基酸序列其序列一致性為至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％。
其他TGFβ信號轉換體或抑制劑均適用於本發明。在一個實施例中，顯性抑制型的TGFβRII「切換受體」（TGFβRIIDN）適用於本發明。在這些實施例中，切換受體是與負向信號（例如，TGFβRII）相關聯蛋白的截短變異型。在一個實施例中，TGFβRIIDN包括如下所示的胺基酸序列：MGRGLLRGLWPLHIVLWTRIASTIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDLLLVIFQVTGISLLPPLGVAISVIIIFYCYRVNRQQKLSSSG（SEQ ID NO：20），其由下列核酸序列編碼：ATGGGTCGGGGGCTGCTCAGGGGCCTGTGGCCGCTGCACATCGTCCTGTGGACGCGTATCGCCAGCACGATCCCACCGCACGTTCAGAAGTCGGTTAATAACGACATGATAGTCACTGACAACAACGGTGCAGTCAAGTTTCCACAACTGTGTAAATTTTGTGATGTGAGATTTTCCACCTGTGACAACCAGAAATCCTGCATGAGCAACTGCAGCATCACCTCCATCTGTGAGAAGCCACAGGAAGTCTGTGTGGCTGTATGGAGAAAGAATGACGAGAACATAACACTAGAGACAGTTTGCCATGACCCCAAGCTCCCCTACCATGACTTTATTCTGGAAGATGCTGCTTCTCCAAAGTGCATTATGAAGGAAAAAAAAAAGCCTGGTGAGACTTTCTTCATGTGTTCCTGTAGCTCTGATGAGTGCAATGACAACATCATCTTCTCAGAAGAATATAACACCAGCAATCCTGACTTGTTGCTAGTCATATTTCAAGTGACAGGCATCAGCCTCCTGCCACCACTGGGAGTTGCCATATCTGTCATCATCATCTTCTACTGCTACCGCGTTAACCGGCAGCAGAAGCTGAGTTCATCCGGA（SEQ ID NO：21）。
對於本領域技術人員來說，TGFβRIIDN切換受體已知可以具有維持其預期的生物活性的可容許變異。因此，本發明的TGFβRIIDN切換受體可包括一胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO：20所示之TGFβRIIDN切換受體胺基酸序列其序列一致性為至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％。因此，本發明的TGFβRIIDN切換受體可以由一核酸所編碼，該核酸包括一核酸序列，該核酸序列與SEQ ID NO：21所示之TGFβRIIDN切換受體胺基酸序列其序列一致性為至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％。
公開號為WO2013019615A2的PCT申請案公開說明書中描述了其他適用於本發明的切換受體，其公開內容以引用方式納入本文。
D. 核酸和表現載體
本發明提供了編碼有外源性T細胞受體和/或切換受體的核酸。在一個實施例中，本發明的核酸包括編碼有外源性T細胞受體的核酸序列（例如，NY-ESO-1 TCR）。在一個實施例中，本發明的核酸包括編碼有切換受體（例如，PD1-CD28切換受體）的核酸序列。
在一些實施例中，本文的核酸係用來產生如本文所述的T細胞受體（例如，在哺乳動物細胞中產生）。在一些實施例中，本文的核酸係用來擴增編碼有T細胞受體的核酸。
如本文所述，本文的T細胞受體包括TCRα鏈和TCRβ鏈。因此，本文提供了編碼有TCRα鏈的核酸和編碼有TCRβ鏈的核酸。在一些實施例中，編碼TCRα鏈的核酸與編碼TCRβ鏈的核酸係分開的兩條。在一個示例性實施例中，編碼TCRα鏈的核酸和編碼TCRβ鏈的核酸位於相同的核酸上。
在一些實施例中，本文的核酸包括含有TCRα鏈編碼序列的核酸和含有TCRβ鏈編碼序列的核酸。在一些實施例中，本發明的核酸包括由連接子所分開的含有TCRα鏈編碼序列核酸和TCRβ鏈編碼序列核酸。本文的連接子讓複數個蛋白可以由同一條核酸序列（例如，多順反子（multicistronic）或雙順反子（bicistronic）序列）所編碼，該條核酸序列會被轉譯為多蛋白，而該多蛋白分離為獨立的蛋白單元。舉例而言，本文核酸的連接子包括TCRα鏈編碼序列和TCRβ鏈編碼序列，其讓TCRα鏈和TCRβ鏈被轉譯成一個多蛋白，所述多蛋白會分離成獨立的TCRα鏈和TCRβ鏈單元。
在一些實施例中，連接子包括一核酸序列，其編碼有內部核糖體進入位點（IRES）。本文所用的「內部核糖體進入位點」或「IRES」是指促進內部核糖體於蛋白編碼區起始密碼子（例如ATG）上的直接進入，從而導致基因進行端帽不依賴性（cap-independent）的轉譯。各種內部核糖體進入位點是本領域技術人員已知的，其包括但不限於，可從病毒或細胞mRNA來源獲得的IRES，例如免疫球蛋白重鏈結合蛋白（binding protein，BiP）、血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、纖維母細胞生長因子2（fibroblast growth factor 2）、類胰島素生長因子（insulin-like growth factor）、轉譯起始因子eIF4G、酵母轉錄因子TFIID和HAP4，以及可從例如心臟病毒、鼻病毒、口蹄疫病毒、C型肝炎病毒、弗里德小鼠白血病病毒（Friend murine leukemia virus，FrMLV）和莫洛尼鼠白血病病毒（Moloney murine leukemia virus，MoMLV）所獲得的IRES。本領域技術人員將能夠選擇適用於本發明的IRES。
在一些實施例中，連接子包括編碼有自我切割肽的核酸序列。本文所用的「自我切割肽」或「2A肽」是指一種寡肽，其能使多個蛋白被編碼成多蛋白，其在轉譯過程時會分離成單元蛋白。術語「自切割」的使用並不代表其暗示蛋白水解切割反應。各種自切割或2A肽是本領域技術人員已知的，包括但不限於在小核糖核酸病毒科成員中所發現的那些自切割肽或2A肽，小核糖核酸病毒科的成員例如是口蹄疫病毒（FMDV）、馬鼻炎A病毒（ERAV0）、明脉扁刺蛾病毒（Thosea asigna virus，TaV）和豬鐵士古病毒-1（porcine tescho virus-1，PTV-1），和如泰勒病毒（Theilovirus）和腦心肌炎病毒（encephalomyocarditis virus）等的心病毒（Cardiovirus）。來自FMDV、ERAV、PTV-1和TaV的2A肽在本文中分別稱為「F2A」、「E2A」、「P2A」和「T2A」。本領域技術人員將能夠選擇適合用於本發明的自我切割肽。
在一些實施例中，連接子更包括編碼弗林蛋白酶（furin）切割位點的核酸序列。弗林蛋白酶是一種普遍表現的蛋白酶，且存在於反式高基氏體中，並在蛋白分泌前對其前驅體加工。弗林蛋白酶在其共有（concensus）識別序列的COOH-末端進行切割。各種弗林蛋白酶共有識別序列（或稱「弗林蛋白酶切割位點」）是本領域技術人員已知的，其包括但不限於Arg-X-Lys-Arg（SEQ ID NO：22）或Arg-X-Arg-Arg（SEQ ID NO ：23）、（Lys/Arg）-Arg-X-（Lys/Arg）-Arg（SEQ ID NO：24）和Arg-X-X-Arg（SEQ ID NO：25，例如Arg -Gln-Lys-Arg（SEQ ID NO：26）），其中X是任何天然存在的胺基酸。本領域技術人員將能夠選擇適用於本發明的弗林蛋白酶切割位點。
在一些實施例中，連接子包括一核酸序列，其編碼有弗林蛋白酶切割位點和2A肽的組合。連接子的實例包括但不限於，編碼有弗林蛋白酶和F2A的核酸序列、編碼有弗林蛋白酶和E2A的核酸序列、編碼有弗林蛋白酶和P2A的核酸序列、編碼有弗林蛋白酶和T2A的核酸序列。本領域技術人員將能夠選擇適用於本發明的組合。在這些實施例中，連接子在弗林蛋白酶和2A肽之間可進一步包括有一間隔序列。各種間隔序列為本領域已知，包括但不限於甘胺酸絲胺酸（GS）間隔物—例如(GS)n、(GSGGS)n（SEQ ID NO：27）和(GGGS)n（SEQ ID NO：28），其中n表示至少為1的整數。示例性的間隔序列可包括一胺基酸序列，該胺基酸序列包括但不限於GGSG（SEQ ID NO：29）、GGSGG（SEQ ID NO：30）、GSGSG（SEQ ID NO：31）、GSGGG（SEQ ID NO：32）、GGGSG（SEQ ID NO：33）、GSSSG（SEQ ID NO：34）等。本領域技術人員將能夠選擇適合用於本發明的間隔序列。
在一個示例性實施例中，本發明的核酸包括一核酸序列，所述核酸序列包括TCRα鏈編碼序列、TCRβ鏈編碼序列，以及一連接子，TCRα鏈編碼序列和TCRβ鏈編碼序列之間由連接子分開，該連接子的序列為弗林蛋白酶-(G4S)2-T2A（F-GS2-T2A）。F-GS2-T2A連接子可以由核酸序列CGTGCGAAGAGGGGCGGCGGGGGCTCCGGCGGGGGAGGCAGTGAGGGCCGCGGCTCCCTGCTGACCTGCGGAGATGTAGAAGAGAACCCAGGCCCC（SEQ ID NO：35）所編碼，並且可以包括胺基酸序列RAKRGGGGSGGGGSEGRGSLLTCGDVEENPGP（SEQ ID NO：36）。本領域技術人員將理解，本發明的連接子可包括可容許的序列變異。
在一些實施例中，本文提供了一核酸，其包括一核酸序列，所述核酸序列編碼有如本文所述的切換受體。在一些實施例中，核酸包括編碼有切換受體的核酸序列以及編碼有T細胞受體（例如是NY-ESO-1 TCR）的核酸序列。在一個實施例中，編碼切換受體的核酸序列和編碼T細胞受體的核酸序列存在於不同的核酸上。在一個實施例中，編碼切換受體的核酸序列和編碼T細胞受體的核酸序列存在於同一條核酸上。在這樣的實施例中，編碼切換受體的核酸序列和編碼T細胞受體的核酸序列係藉由如本文所述的連接子分開。
舉例而言，本文的核酸可包括編碼有切換受體的核酸序列、連接子和編碼有T細胞受體的核酸序列。在一個實施例中，連接子包括編碼有2A肽（例如，F2A）的核酸序列。在一個示例性實施例中，本文的核酸可包括編碼有切換受體的核酸序列和編碼有T細胞受體的核酸序列，兩組核酸序列被編碼有F2A的核酸序列分開。在一個示例性實施例中，編碼T細胞受體的核酸序列包括TCRα鏈編碼序列和TCRβ鏈編碼序列，且TCRα鏈編碼序列和TCRβ鏈編碼序列被編碼有F-GS2-T2A的核酸序列分開。
因此，在一個實施例中，本文的核酸從5'端至3'端包括：編碼切換受體的核酸序列、編碼連接子的核酸序列、以及編碼T細胞受體的核酸序列。在一個實施例中，本文的核酸從5'端至3'端包括：編碼T細胞受體的核酸序列、編碼連接子的核酸序列、以及編碼切換受體的核酸序列。在一個示例性實施例中，本文的核酸從5'端至3'端包括：編碼切換受體的核酸序列、編碼F2A的核酸序列、以及編碼T細胞受體的核酸序列。在另一個示例性實施例中，本發明的核酸從5'端至3'端包括：編碼切換受體的核酸序列、編碼F2A的核酸序列、編碼TCRα鏈的核酸序列、編碼F-GS2-T2A的核酸序列，以及編碼TCRβ鏈的核酸序列。
在一些實施例中，本文的核酸可以可操作地連接至轉錄控制單元（例如，啟動子和促進子（enhancer）等）。適合的啟動子和促進子是本領域技術人員已知的。
為了在細菌中表現，適合的啟動子包括但不限於lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λP和trc。為了在真核細胞中表現，適合的啟動子包括但不限於輕鏈和/或重鏈免疫球蛋白基因啟動子和增強子單元、巨細胞病毒立即早期啟動子（cytomegalovirus immediate early promoter）、單純皰疹病毒胸苷激酶啟動子（herpes simplex virus thymidine kinase promoter）、早期和晚期SV40啟動子、反轉錄病毒其長末端重複中的啟動子、小鼠金屬硫蛋白-I啟動子，以及各種本領域已知的組織特異性啟動子。適合的可逆啟動子（reversible promoter），包括可逆誘導型啟動子（reversible inducible promoter），在本領域中係為已知。前述的可逆啟動子可分離自並源自於許多生物體（例如，真核生物和原核生物）。對源自於第一生物的可逆啟動子進行修飾以用於第二生物（例如，第一生物為原核生物而第二生物為真核生物、或是一第一生物為真核生物而第二生物為原核生物等），為本領域中所熟知。此類可逆啟動子，及基於此類可逆啟動子且亦包括其他控制蛋白之系統，其包括但不限於：醇調節之啟動子（例如，醇脫氫酶I（alcA）基因啟動子、對醇反式活化蛋白（alcohol transactivator protein，AlcR）具有反應性之啟動子等）、四環素調節之啟動子（例如，包括TetActivators、TetON、TetOFF等啟動子系統）、類固醇調節之啟動子（例如，大鼠糖皮質激素受體啟動子系統、人類雌激素受體啟動子系統、類視黃素啟動子系統、甲狀腺啟動子系統、蛻皮激素啟動子系統、米非司酮（mifepristone）啟動子系統等）、金屬調節之啟動子（例如，金屬硫蛋白啟動子系統等）、相關病原調節之啟動子（例如，水楊酸調節之啟動子、乙烯調節之啟動子、苯並噻二唑調節之啟動子等）、溫度調節之啟動子（例如，熱休克可誘導啟動子（例如，HSP-70、HSP-90、大豆熱休克啟動子等））、光調節之啟動子、合成誘導型啟動子及前述啟動子的類似物。
在一些實施例中，啟動子是CD8細胞特異性啟動子、CD4細胞特異性啟動子、嗜中性球特異性啟動子或NK細胞特異性啟動子。舉例而言，啟動子可以是CD4基因啟動子；參見例如Salmon等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90:7739；Marodon等人，(2003) Blood 101:3416。另一個例子，啟動子可以是CD8基因啟動子。NK細胞的特異性表現可以藉由使用NcrI（p46）啟動子來達成；參見例如Eckelhart等人，Blood (2011) 117:1565。
為了在酵母菌中表現，適合的啟動子是組成型的啟動子，例如ADH1啟動子、PGK1啟動子、ENO啟動子、PYK1啟動子及其類似物，或者是例如GAL1啟動子、GAL10啟動子、ADH2啟動子、PHOS啟動子、CUP1啟動子、GALT啟動子、MET25啟動子、MET3啟動子、CYC1啟動子、HIS3啟動子、ADH1啟動子、PGK啟動子、GAPDH啟動子、ADC1啟動子、TRP1啟動子、URA3啟動子、LEU2啟動子、ENO啟動子、TP1啟動子和AOX1（例如，用於畢赤酵母）等可調節的啟動子。本領域普通技術人員完全有能力選擇合適載體和啟動子。適用於原核宿主細胞的啟動子包括但不限於噬菌體T7 RNA聚合酶啟動子、trp啟動子、lac操縱子啟動子、雜合啟動子（例如，lac/tac雜合啟動子、tac/trc雜合啟動子、trp/lac啟動子、T7/lac啟動子、trc啟動子、tac啟動子等）、araBAD啟動子、體內調節啟動子（例如，ssaG啟動子或相關啟動子，參見例如美國專利公開號20040131637）、pagC啟動子（Pulkkinen及Miller，J. Bacteriol. (1991) 173(1): 86-93；Alpuche-Aranda等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89(21): 10079-83）、nirB啟動子（Harborne等人，Mol. Micro. (1992) 6:2805-2813）及其類似物（參見例如Dunstan等人，Infect. Immun. (1999) 67:5133-5141；McKelvie等人，Vaccine (2004) 22:3243-3255；以及Chatfield等人，Biotechnol. (1992) 10:888-892)）、sigma70啟動子（例如，共同sigma70啟動子，參見例如GenBank登錄號AX798980、AX798961和AX798183）、固定相啟動子（例如，dps啟動子、spv啟動子等）、源自致病島SPI-2的啟動子（參見例如WO96/17951）、actA啟動子（參見例如，Shetron-Rama等人，Infect. Immun. (2002) 70:1087-1096）、rpsM啟動子（參見例如Valdivia和Falkow，Mol. Microbiol. (1996). 22:367）、tet啟動子（參見例如Hillen,W.及Wissmann,A.(1989)In Saenger,W.及Heinemann,U.(編)，Topics in Molecular and Structural Biology,Protein-Nucleic Acid Interaction.Macmillan，倫敦，英國，第10卷，第143至162頁）、SP6啟動子（參見例如Melton等人，Nucl. Acids Res. (1984) 12:7035)）等。適用於原核生物（例如大腸桿菌）的強效啟動子包括但不限於Trc、Tac、T5、T7和PLambda。用於細菌宿主細胞的操縱子其非限制性實例包括乳糖啟動操縱子（當與乳糖接觸時，LacI抑制蛋白的構型改變，從而阻止Lad抑制蛋白與操縱子結合）、色胺酸啟動操縱子（當其與色胺酸複合時，TrpR抑制蛋白具有與操縱子結合的構象；在不存在色胺酸的情況下，TrpR抑制蛋白具有不與操縱子結合的構象），以及tac啟動操縱子（參見例如deBoer等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1983) 80:21-25）。
其他啟動子的適例，包括立即早期巨細胞病毒（CMV）啟動子序列。此啟動子序列為強效組成型啟動子序列，係能夠驅動任何與其可操作地連接之多核苷酸序列有高表現量。亦可使用其他組成型啟動子序列，包括但不限於猿猴病毒40（simian virus 40，SV40）早期啟動子、小鼠乳癌病毒（mouse mammary tumor virus，MMTV）、人類免疫缺陷病毒（HIV）長末端重複序列（long terminal repeat，LTR）啟動子、MoMuLV啟動子、禽類白血病病毒啟動子、鼻咽癌病毒（Epstein-Barr virus）立即早期啟動子、勞斯肉瘤病毒（Rous sarcoma virus）啟動子、EF-1α啟動子、以及人類基因啟動子（例如但不限於肌動蛋白啟動子、肌凝蛋白啟動子、血紅素啟動子及肌酸激酶啟動子）。此外，本發明應不限於使用組成型啟動子。本發明亦涵蓋誘導型啟動子。誘導型啟動子可以作為一種分子開關，在有需要時，可用來啟動與其可操作地連接的多核苷酸序列的表現，或是在不想要發生這種表現時，用來關閉與其可操作地連接的多核苷酸序列的表現。誘導型啟動子之例子包括但不限於金屬硫蛋白啟動子、醣皮質素啟動子、黃體素啟動子及四環素啟動子。
在某些實施例中，含有適當啟動子的基因座或構築體或轉基因，是經由對可誘導系統的誘導來進行不可逆切換。適合誘發不可逆轉換的系統是本領域眾所周知的。舉例來說，不可逆切轉的誘發可利用Cre-lox介導的重組（參見例如Fuhrmann-Benzakein等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 28:e99，前述文獻的整體內容經由引用而納為本文的一部份）。任何本領域中已知的重組酶、內切核酸酶、連接酶、重組位點等的適合組合，皆可用於產生不可逆切換之啟動子。本文其他地方所描述的進行位點特異性重組之方法、機制及要求，可用來產生不可逆切換之啟動子，並且其為本領域中眾所周知的，參見例如Grindley等人，Annual Review of Biochemistry (2006) 567-605 及Tropp Molecular Biology (2012) (Jones & Bartlett Publishers, Sudbury, Mass.)，前述文獻的整體內容經由引用而納為本文的一部份。
在一些實施例中，本文的核酸進一步包括編碼有T細胞受體誘導型表現盒的核酸序列。在一個實施例中，T細胞受體誘導型表現盒係用來在T細胞受體信號傳遞後產生並釋放一轉殖基因多肽產物。參見例如Chmielewski和Abken，Expert Opin. Biol. Ther. (2015) 15(8): 1145-1154；和Abken，Immunotherapy (2015) 7(5): 535-544。在一些實施例中，本文的核酸進一步包括可操作地連接至T細胞活化響應啟動子且編碼有細胞激素的核酸序列。在一些實施例中，可操作地連接至T細胞活化響應性啟動子的細胞激素存在於另一條核酸序列上。在一個實施例中，細胞激素是IL-12。
本文的核苷酸序列可存在於表現載體及/或選殖載體中。表現載體可包括一篩選標記、複製起始序列及其他提供載體複製功能及/或維持載體的元件。適當的表現載體包括例如質粒體、病毒載體，及前述載體的類似物。許多適當載體及啟動子皆為本領域技術人員所熟知；許多產生目標重組構築體的載體及啟動子是可購得的。以下提供的載體僅為適例，其不應用來限制本發明。細菌載體：pBs、phagescript、PsiXl74、pBluescript SK、pBs KS、pNH8a、pNH16a、pNH18a、pNH46a（Stratagene，La Jolla，CA，USA）、pTrc99A、pKK223-3、pKK233-3、pDR540，及pRIT5（Pharmacia，Uppsala，Sweden）。真核生物載體：pWLneo、pSV2cat、pOG44、PXRl、Psg（Stratagene）pSVK3、pBPV、pMSG，及pSVL（Pharmacia）。
表現載體於啟動子序列附近通常具有方便切割位點（convenient restriction site），讓編碼有異源蛋白的核酸序列得以插入。表現宿主可具有操作性的可篩選標記。適合之表現載體包括但不限於病毒載體（例如，基於下列病毒之病毒載體：牛痘病毒、脊髓灰質炎病毒、腺病毒（參見例如Li等人，Invest. Opthalmol. Vis. Sci. (1994) 35: 2543-2549；Borras等人，Gene Ther. (1999) 6: 515-524；Li及Davidson，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92: 7700-7704；Sakamoto等人，H. Gene Ther. (1999) 5: 1088-1097；WO 94/12649、WO 93/03769、WO 93/19191；WO 94/28938；WO 95/11984及WO 95/00655）、腺相關病毒（參見例如Ali等人，Hum. Gene Ther. (1998) 9: 81-86、Flannery等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1997) 94: 6916-6921；Bennett等人，Invest. Opthalmol. Vis. Sci. (1997) 38: 2857-2863；Jomary等人，Gene Ther. (1997) 4:683 690；Rolling等人，Hum. Gene Ther. (1999) 10: 641-648；Ali等人，Hum. Mol. Genet. (1996) 5: 591-594；Srivastava的WO 93/09239，Samulski等人，J. Vir. (1989) 63: 3822-3828；Mendelson等人，Virol. (1988) 166: 154-165；及Flotte等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90: 10613-10617）、SV40、單純皰疹病毒、人類免疫缺陷病毒（參見例如Miyoshi等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1997) 94: 10319-23；Takahashi等人，J. Virol. (1999) 73: 7812-7816）、反轉錄病毒載體（例如，小鼠白血病病毒、脾壞死病毒及源自於例如羅斯肉瘤病毒、哈維肉瘤病毒（Harvey Sarcoma Virus）、禽白血病病毒、人類免疫缺陷病毒、骨髓增生性肉瘤病毒及乳腺癌病毒之反轉錄病毒載體），及前述病毒載體的類似物。
其它適合的表現載體例如但不限於慢病毒載體、γ反轉錄病毒載體、泡沫病毒載體、腺相關病毒載體、腺病毒載體、痘病毒載體、皰疹病毒載體、經過改造的雜合病毒載體、轉座子介導的載體，及前述載體的類似物。病毒載體技術在本領域中是眾所周知的，並且在例如Sambrook等人，2012，分子選殖：實驗室手冊，第1-4卷，Cold Spring Harbor Press，NY、以及其他病毒學和分子學生物學手冊中有相關說明。可用作載體的病毒包括但不限於反轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、皰疹病毒和慢病毒。
通常，適合的載體含有可在至少一種生物體中發揮功能的複製起始序列、啟動子序列、限制性核酸內切酶的方便切割位點及一或多個篩選標記物（例如WO 01/96584；WO 01/29058；及美國專利第6,326,193號）。
在一些實施例中，可以使用表現載體（例如，慢病毒載體）將T細胞受體和/或切換受體導入免疫細胞或其前驅細胞（例如，T細胞）中。相應地，本文的表現載體（例如，慢病毒載體）可以包括編碼有T細胞受體和/或切換受體的核酸。在一些實施例中，表現載體（例如，慢病毒載體）將包括其他能夠協助由前述核酸序列所編碼的TCR和/或切換受體其功能性表現的單元。在一些實施例中，表現載體包括編碼有TCR和/或切換受體的核酸，且表現載體還包括哺乳動物啟動子。在一個實施例中，載體進一步包括延伸因子-1α啟動子（EF-1α啟動子）。使用EF-1α啟動子可以提高下游轉基因（例如，編碼TCR和/或切換受體之核酸序列）的表現效率。生理啟動子（例如，EF-1α啟動子）較不可能會誘發由嵌入所介導的遺傳毒性，並可消除反轉錄病毒載體轉形幹細胞的能力。適用於載體（例如，慢病毒載體）的其他生理啟動子是本領域技術人員已知的，並且可以將其併入本發明的載體中。在一些實施例中，載體（例如，慢病毒載體）還包括非必需順式作用序列（non-requisite cis acting sequence），其可改善效價和基因表現。非必需順式作用序列的一個非限制性適例是中心多嘌呤管道和中心終止序列（central polypurine tract and central termination sequence，cPPT/CTS），其對於有效反轉錄和核輸入來說是重要的。其他非必需順式作用序列是本領域技術人員所習知，並且可以併入本發明的載體（例如，慢病毒載體）中。在一些實施例中，載體還包括轉錄後調節元件。轉錄後調節元件可以增加RNA的轉譯、提高轉基因表現，並穩定RNA轉錄物。轉錄後調節元件的一個適例是土撥鼠肝炎病毒轉錄後調節元件（WPRE）。相應地，在一些實施例中，本發明的載體還包括WPRE序列。許多不同的轉錄後調節元件是本領域技術人員習知的，並且可以併入本發明的載體（例如，慢病毒載體）中。本發明的載體可以進一步包括其他元件，例如用於RNA運送的rev反應元件（RRE）、包裝序列（packaging sequences）、和5'和3'長末端重複序列（LTRs）。術語「長末端重複」或「LTR」是指位於反轉錄病毒DNA末端的鹼基對結構域，其包括U3、R和U5區域。LTRs通常提供表現反轉錄病毒基因的所需功能（例如，基因轉錄本其轉錄啟動、轉錄物的轉譯起始和聚腺苷酸化）和病毒複製的所需功能。在一個實施例中，本發明的載體（例如，慢病毒載體）包括3'端U3缺失的LTR。因此，本發明的載體（例如，慢病毒載體）可包括本文所述元件的任何組合，以增強轉基因的功能性表現效率。舉例而言，除包括編碼有Ｔ細胞受體和/或切換受體的核酸外，本發明的載體（例如，慢病毒載體）可包括WPRE序列、cPPT序列、RRE序列、5'LTR、3'U3缺失的LTR'。
本發明的載體可以是自我失活型載體。本文所用術語「自我失活型載體（self-inactivating vectors）」是指其中3'端的LTR增強子啟動子區（U3區）已被修飾（例如，藉由缺失或取代）的載體。自我失活型載體可以在病毒第一次複製後阻止病毒轉錄。因此，自我失活型載體僅可以感染並然後嵌入至宿主基因組（例如，哺乳動物基因組）中一次，不能進一步散播。因此，自我失活型載體可以大幅降低產生出具有複製能力病毒的風險。
在一些實施例中，本發明的核酸可以是RNA（例如，體外合成的RNA）。體外合成RNA的方法是本領域技術人員所習知的。可以使用任何已知的方法來合成包括編碼有本文T細胞受體和/或切換受體序列的RNA。將RNA導入宿主細胞的方法是本領域所習知的。參見例如Zhao等人，Cancer Res. (2010) 15: 9053。可以以體外（in vitro）、離體（ex vivo）或體內（in vivo）方式將包括編碼有本文T細胞受體和/或切換受體核苷酸序列的RNA導入宿主細胞。舉例而言，可以將包括編碼有本文T細胞受體和/或切換受體核苷酸序列的RNA以體外方式或離體方式利用電穿孔將其導入宿主細胞（例如，NK細胞、細胞毒性T淋巴細胞等）中。
為分析多肽或其部分之表現，待導入細胞的表現載體亦可含有篩選標記基因或報導基因，或兩者皆有，使得在被被病毒載體所轉染或感染之細胞群體中，可以鑑定及篩選出表現細胞。在其他實施例中，篩選標記可被攜載於另一條DNA片段上且以共轉染程序送入細胞。篩選標記及報導基因的前後均可接有適當的調節序列，以使其能夠在宿主細胞中表現。篩選標記的適例包括但不限於抗生素抗藥基因。
報導基因係用來識別可能被轉染的細胞及分析調節序列的功能。一般而言，報導基因為受體生物體或組織中不存在或不表現的基因，且其編碼有一多肽，該多肽於表現時會展現某些易於偵測的特性（例如，酵素活性）。在將DNA導入接受體細胞中後，於適合時間分析報導基因的表現。適合的報導基因可包括但不限於編碼螢光素酶、β-半乳糖苷酶、氯黴素乙醯基轉移酶、分泌的鹼性磷酸酶之基因、或綠色螢光蛋白基因（例如，Ui-Tei等人，2000 FEBS Letters 479: 79-82）。
E. 經修飾的免疫細胞
本文提供了經修飾的免疫細胞或其前驅細胞（例如，T細胞），其包括如本文所述的外源性T細胞受體和/或切換受體。因此，這種經修飾的細胞具有由其所表現的T細胞受體來導向的特異性。舉例而言，本文包括NY-ESO-1 TCR的經修飾細胞對目標細胞上的NY-ESO-1具有特異性。
在一些實施例中，本文的經修飾的細胞包括外源性T細胞受體。在一個實施例中，本文的經修飾細胞包括外源性T細胞受體，其對目標細胞上的NY-ESO-1具有親和力。在一些實施例中，本文的經修飾的細胞包括外源性T細胞受體和切換受體。在一個實施例中，本發明的經修飾的細胞包括外源性T細胞受體及切換受體，前述外源性T細胞受體對目標細胞上的NY-ESO-1具有親和力。本文具有切換受體的經修飾細胞，能夠藉由切換受體的第一結構域來活化微環境中的抑制性配體，並藉由透過切換受體第二結構域的信號傳遞將修飾細胞的抑制性信號轉換為正向信號。
在一個示例性實施例中，本文的經修飾細胞包括外源性T細胞受體（例如，對目標細胞上的NY-ESO-1具有親和力的T細胞受體）和PD1-CD28切換受體。這種經修飾的細胞（例如，經修飾的T細胞）除了對目標細胞上的NY-ESO-1具有親和力之外，也能夠將來自它們所處的微環境的抑制信號在T細胞中轉換成活化信號。具有PD1-CD28切換受體的經修飾T細胞能夠透過切換受體上CD28結構域的信號傳遞，將微環境中的抑制性PD-1配體轉換為活化信號。因此，具有外源性T細胞受體的經修飾細胞（對目標細胞上的抗原有親和力）以及本文的切換受體具有對目標細胞上的抗原的特異性，並且可以躲過任何存在於目標細胞所在微環境中的抑制性、免疫抑制性信號。在一個示例性實施例中，經修飾的細胞（例如，T細胞）具有對腫瘤細胞上的NY-ESO-1有親和力的外源性T細胞受體以及PD1-CD28切換受體，前述PD1-CD28切換受體能將腫瘤微環境的抑制性、免疫抑制PD1配體在修飾細胞中轉變為活化信號（產生活化的修飾細胞）。本文所用的「活化的修飾細胞」或「活化的修飾T細胞」尤指正在進行細胞分裂的經修飾細胞。活化還可有關於產生免疫反應以及產生可測得的非調節性表面標誌物。表面標誌物的上調（例如，CD25，IL-2受體）啟動了涉及p561ck的磷酸化級聯反應，引發細胞激素和介白素的釋放，增加DNA合成，並導致細胞增生。
在一個示例性實施例中，本文經修飾的細胞具有外源性T細胞受體（例如，對目標細胞上的NY-ESO-1具有親和力的T細胞受體）以及TIM3-CD28切換受體。在一個示例性實施例中，經修飾的細胞（例如，T細胞）具有對腫瘤細胞上的NY-ESO-1具有親和力的外源性T細胞受體和TIM3-CD28切換受體。
在一個示例性實施例中，本文經修飾的細胞具有外源性T細胞受體（例如，對目標細胞上的NY-ESO-1具有親和力的T細胞受體）和PD1-41BB切換受體。在一個示例性實施例中，經修飾的細胞（例如，T細胞）具有對腫瘤細胞上的NY-ESO-1具有親和力的外源性T細胞受體、和PD1-41BB切換受體。
在一個示例性實施例中，本文的經修飾細胞包括有外源性T細胞受體（例如，對目標細胞上的NY-ESO-1具有親和力的T細胞受體）和PD1A132L -41BB切換受體。在一個示例性實施例中，經修飾的細胞（例如，T細胞）包括有對腫瘤細胞上的NY-ESO-1具有親和力的外源性T細胞受體和PD1A132L -41BB切換受體。
在一個示例性實施例中，本文的經修飾細胞包括有外源性T細胞受體（例如，對目標細胞上的NY-ESO-1具有親和力的T細胞受體）和PD1A132L- CD28切換受體。在一個示例性實施例中，經修飾細胞（例如，T細胞）包括有對腫瘤細胞上的NY-ESO-1具有親和力的外源性T細胞受體和PD1A132L- CD28切換受體。
在一個示例性實施例中，本文的經修飾細胞包括有外源性T細胞受體（例如，對目標細胞上的NY-ESO-1具有親和力的T細胞受體）、和TGFβRI-IL-12Rβ1切換受體。在一個示例性實施例中，經修飾細胞（例如，T細胞）包括有對腫瘤細胞上的NY-ESO-1具有親和力的外源性T細胞受體和TGFβRI-IL-12Rβ1切換受體。
在一個示例性實施例中，本文的經修飾細胞包括有外源性T細胞受體（例如，對目標細胞上的NY-ESO-1具有親和力的T細胞受體）、和TGFβRII-IL-12Rβ2切換受體。在一個示例性實施例中，經修飾細胞（例如，T細胞）包括有對腫瘤細胞上的NY-ESO-1具有親和力的外源性T細胞受體和TGFβRII-IL-12Rβ2切換受體。
在一個示例性實施例中，本文的經修飾細胞包括有外源性T細胞受體（例如，對目標細胞上的NY-ESO-1具有親和力的T細胞受體）和TGFβRIIDN「切換受體」。在示例性實施例中，經修飾細胞（例如，T細胞）包括有對腫瘤細胞上的NY-ESO-1具有親和力的外源性T細胞受體和TGFβRIIDN「切換受體」。
經基因編輯的免疫細胞
本文提供了經基因編輯的修飾細胞。在一些實施例中，本文經修飾的細胞（例如，包括有外源性T細胞受體和/或切換受體的經修飾細胞）係經基因編輯以破壞一或多個內源表現基因的表現。在一些實施例中，經基因編輯的免疫細胞（例如，T細胞）其內源性受體（例如，內源性T細胞受體或免疫檢查點蛋白）的表現有減少、缺失、消除、剔除或破壞之情形。
在一些實施例中，本文的經修飾細胞係經基因編輯以破壞內源性T細胞受體基因產物（例如，TRAC和TRBC的基因產物）的表現。不受任何理論束縛，破壞TRAC和/或TRBC的表現會1）減少內源性TCR和外源性TCR（例如，NY-ESO-1 TCR）的錯配，從而降低自身反應的風險；2）增強細胞表面的外源性TCR表現，其係藉由減少與內源性T細胞受體的錯配而產生，從而提高經修飾細胞的療效。在一個實施例中，本文的經修飾細胞係經基因編輯以破壞內源性PDCD1基因產物（程序死亡1受體，PD-1）的表現。破壞內源性PD-1的表現可以產生對「檢查點」具抗性的經修飾細胞，致使提高對腫瘤生長情況的控制。也可以藉由破壞例如但不限於腺苷A2A受體（A2AR）、B7-H3（CD276）、B7-H4（VTCN1）、B和T淋巴細胞弱化蛋白（ BTLA/CD272）、CD96、細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4（CTLA-4/CD152）、吲哚胺2,3-雙加氧酶（IDO）、殺傷細胞免疫球蛋白樣受體（KIR）、淋巴細胞活化基因-3（LAG3）、具有免疫球蛋白（Ig）和免疫受體酪氨酸抑制基序（Immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif，ITIM）結構域的T細胞免疫受體（TIGIT）、T細胞免疫球蛋白結構域和黏蛋白結構域3（TIM-3）、或T細胞活化的V結構域免疫球蛋白抑制劑（VISTA）的表現來產生對檢查點具抗性的經修飾細胞。因此，在一個實施例中，本文的經修飾細胞係經基因編輯以破壞內源性CTLA-4的表現。
在一些實施例中，本文的經修飾細胞包括一外源性T細胞受體，且該細胞係經基因編輯以破壞一或多種內源表現基因的表現。在一個實施例中，本文的經修飾細胞包括對目標細胞上的NY-ESO-1具有親和力的外源性T細胞受體，其中一或多種內源基因的表現被下調。在一個實施例中，本文的經修飾細胞是經修飾的T細胞，其具有對目標細胞上的NY-ESO-1有親和力的外源性T細胞受體，其中A2AR、B7-H3（CD276）、B7-H4（VTCN1）、BTLA（CD272）、CD96、CTLA-4（CD152）、IDO、KIR、LAG3、TIGIT、TIM-3和/或VISTA基因產物中有一或多種表現被下調。在一個示例性實施例中，本文的經修飾細胞是經修飾的T細胞，其具有對目標細胞上的NY-ESO-1有親和力的外源性T細胞受體，其中TRAC、TRBC和PDCD1基因產物的表現被下調。
在一些實施例中，本文的經修飾細胞包括外源性T細胞受體和切換受體，且前述經修飾細胞係經基因編輯以破壞一或多種內源表現基因的表現。在一個實施例中，本文的經修飾細胞具有對目標細胞上的NY-ESO-1有親和力的外源性T細胞受體和切換受體，其中一或多種內源基因的表現被下調。在一個實施例中，本文的經修飾細胞是經修飾的T細胞，其具有對目標細胞上的NY-ESO-1有親和力的外源性T細胞受體、和切換受體，其中A2AR、B7-H3（CD276）、B7-H4（VTCN1）、BTLA（CD272）、CD96、CTLA-4（CD152）、IDO、KIR、LAG3、TIGIT、TIM-3和/或VISTA中有一或多個基因產物被下調。在一個實施例中，本文的經修飾細胞是經修飾的T細胞，其具有對目標細胞上的NY-ESO-1有親和力的外源性T細胞受體和切換受體，其中TRAC和TRBC基因產物的表現被下調。在一個示例性實施例中，本文的經修飾細胞是經修飾的T細胞，其具有對目標細胞上的NY-ESO-1有親和力的外源性T細胞受體和PD1-CD28切換受體，其中TRAC和TRBC基因的表現產物被下調。在一個示例性實施例中，本文的經修飾細胞是經修飾的T細胞，其具有對目標細胞上的NY-ESO-1有親和力的外源性T細胞受體和PD1-CD28切換受體，其中TRAC、TRBC和TIM-3基因產物的表現被下調。
本文的經修飾細胞可以包括各種本文他處所描述的切換受體，例如：PD1-CD28、TIM3-CD28、PD1-41BB、PD1A132L -41BB、PD1A132L -CD28、TGFβRI-IL-12Rβ1、TGFβRII-IL- 2Rβ2、TGFβRIIDN。A modified cell of the present disclosure can comprise various switch receptors described elsewhere herein, e.g., PD1-CD28, TIM3-CD28, PD1-41BB, PD1A132L -41BB, PD1A132L -CD28, TGFβRI-IL-12Rβ1, TGFβRII-IL-12Rβ2, TGFβRIIDN.
各種基因編輯技術是本領域技術人員已知的。基因編輯技術包括但不限於歸巢內切核酸酶（homing endonucleases）、鋅指核酸酶（zinc-finger nucleases，ZFN）、類轉錄活化因子作用子核酸酶（transcription activator-like effector nucleases，TALEN）和常間回文重複序列叢集（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）系統（例如，CRISPR/CRISPR相關蛋白9，Cas9）。歸巢內切核酸酶通常將其DNA受質切割為二聚體，且沒有不同的結合和切割結構域。鋅指核酸酶識別由兩個鋅指結合位點以及接在前述兩個結合位點之間長度為5至7個鹼基對（base pair，bp）的間隔區序列所組成的目標位置，前述長度為5至7個鹼基對的間隔區序列被FokI切割結構域所識別。類轉錄活化因子作用子核酸酶會識別由二個類轉錄活化因子作用子DNA結合位點以及接在前述二個結合位點之間長度為12至20個鹼基對的間隔區序列所組成的目標位置，前述長度為12至20個鹼基對的間隔區序列被FokI切割結構域所識別。Cas9核酸酶則以與位於其單股引導RNA（gRNA）中的靶向序列所互補的DNA序列為識別目標，所述與靶向序列互補的DNA序列是緊鄰於相容的前間隔區相鄰基序（protospacer adjacent motif，PAM）的上游。因此，本領域技術人員將能夠為本發明選擇適合的基因編輯技術。
在某些實施態樣中，前述破壞係藉由使用RNA引導的核酸酶（例如，常間回文重複序列叢集核酸（CRISPR）-Cas系統，例如CRISPR/Cas9系統）進行的基因編輯來進行，所述RNA引導的核酸酶對被破壞的基因（例如，TRAC、TRBC、PDCD1或TIM3）有特異性。在一些實施例中，將含有Cas9（例如，Cas9 RNA）和含有靶向結構域的引導RNA（gRNA）的媒介物導入細胞中，所述靶向結構域靶向遺傳基因座的一區域。在一些實施例中，前述媒介物是（或含有）Cas9和引導RNA的核糖核蛋白（RNP）複合體（Cas9/gRNA RNP），所述引導RNA含有針對該基因的靶向結構域。在一些實施例中，前述的導入包括於試管內使前述媒介物或其部分與細胞接觸，前述的與細胞接觸可包括將細胞和媒介物一起培養或孵育達24、36或48小時，或者達3、4、5、6、7或8天。在一些實施例中，前述導入還可以包括將媒介物遞送至細胞中。在各種實施例中，根據本文所揭露的方法、組合物和細胞係將Cas9和引導RNA的核糖核蛋白（RNP）複合體直接遞送至細胞（例如，藉由電穿孔）。在一些實施例中，RNP複合體包括已被修飾為包括3'端多聚腺苷酸尾部和5'端抗-反向端帽類似物（Anti-Reverse Cap Analog，ARCA）端帽的gRNA。
CRISPR/Cas9系統是一種簡單又有效的系統，用來誘發目標基因的改變。Cas9蛋白的目標識別需要位在引導RNA（gRNA）中的「種子」序列，以及位在gRNA結合區上游而含有保守雙核苷酸的前間隔區相鄰基序（protospacer adjacent motif，PAM）序列。因此，可以藉由重新改造細胞株（例如，293T細胞）、原代細胞和TCR T細胞中的gRNA來改造CRISPR/Cas9系統，以切割幾乎任何DNA序列。藉由共表現單個Cas9蛋白與兩個或更多個的gRNA，CRISPR/Cas9系統得以同時靶向多個基因組基因座，使得所述系統適於進行多基因編輯或目標基因的協同活化。
Cas9蛋白和引導RNA形成識別和切割目標序列的複合體。Cas9係由六個結構域組成：分別為REC I、REC II、橋式螺旋（Bridge Helix）、PAM相互作用、HNH和RuvC。RecI結構域會結合引導RNA，而橋式螺旋係結合至目標DNA。HNH和RuvC結構域為核酸酶結構域。引導RNA被改造成具有與目標DNA序列互補的5'末端。在引導RNA結合Cas9蛋白後，其構形發生改變，活化了蛋白。一旦活化，Cas9會藉由與其前間隔區相鄰基序（PAM）序列匹配的序列相結合來尋找目標DNA。PAM是一個長度為兩或三個核苷酸鹼基的序列，這個兩或三個核苷酸鹼基序列緊接於與引導RNA互補區域的下游。在一個非限制性實例中，PAM序列是5'-NGG-3'。當Cas9蛋白發現帶有適當PAM的目標序列時，會將PAM上游的鹼基解鏈並將它們與引導RNA上的互補區域進行配對。接著RuvC和HNH核酸酶結構域會在PAM上游第三個核苷酸鹼基的後方對目標DNA進行切割。
美國專利申請公開號US20140068797描述了用來抑制基因表現的CRISPR/Cas系統的一個非限制性實例，即CRISPRi。CRISPRi係誘發永久性的基因破壞，其利用RNA引導的Cas9內切核酸酶來造成DNA雙股斷裂，而觸發易誤修復（error-prone repair）途徑以導致框移突變（frame shift mutations）。不具催化活性（catalytically dead）的Cas9缺乏內切核酸酶活性。當與引導RNA共表現時，會產生一DNA識別複合體，其特異性地干擾轉錄延伸（transcriptional elongation）、RNA聚合酶結合、或轉錄因子結合。這個CRISPRi系統能有效抑制目標基因的表現。
當對目標基因具特異性的引導核酸序列和Cas內切核酸酶被導入細胞，並形成能夠使Cas內切核酸酶在目標基因處導入雙股斷裂的複合體時，會產生CRISPR/Cas基因破壞。在一些實施例中，CRISPR/Cas系統包括表現載體，例如但不限於pAd5F35-CRISPR載體。在其他實施例中，Cas表現載體會誘發Cas9內切核酸酶的表現。其他內切核酸酶也可以用於本文所揭露的系統中，其包括但不限於T7、Cas3、Cas8a、Cas8b、Cas10d、Cse1、Csy1、Csn2、Cas4、Cas10、Csm2、Cmr5、Fok1、以及其他本領域已知的核酸酶及其任何組合。
在一些實施例中，誘導Cas表現載體的過程包括將細胞暴露於會活化Cas表現載體其誘導型啟動子的媒介物之中。在此些實施例中，Cas表現載體包括誘導型啟動子，例如是藉由暴露於抗生素（例如，藉由四環素或四環素的衍生物，如去氧羥四環素）來誘導的啟動子。也可以使用其他本領域技術人員已知的誘導型啟動子。誘導劑可以是選擇性條件（例如，暴露於如抗生素等試劑），其會造成誘導型啟動子的誘發，這將導致Cas表現載體的表現。
引導RNA對目標基因組區域有特異性，且靶向Cas內切核酸酶所誘發的雙股斷裂區域。引導RNA序列的目標序列，可以位在基因的基因座內，或位在基因組的非編碼區域中。在一些實施例中，引導核酸序列的長度至少為10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、30 31、32、33、34、35、36、37、38、39、40或更多個核苷酸。
引導RNA（gRNA），又稱為「短引導RNA」或「sgRNA」，為Cas9核酸酶提供了目標特異性和支架/結合能力。gRNA可以是由源自於內源性細菌crRNA和tracrRNA的目標序列和支架序列所組成的合成RNA。在基因組改造實驗中，gRNA用來將Cas9靶向特定的基因組基因座。可以使用本領域所熟知的標準工具來設計引導RNA。
在形成CRISPR複合體的情況下，「目標序列」是指一序列，而引導序列係被設計為對該序列具有一些互補性。目標序列和引導序列之間的雜交會促進CRISPR複合體的形成。如果有足夠的互補性以引起雜交並促進CRISPR複合體的形成，則兩者不一定需要完全互補。目標序列可包括任何的多核苷酸，例如DNA或RNA多核苷酸。在一些實施例中，目標序列係位於細胞的細胞核或細胞質中。在其他實施例中，目標序列可以位在真核細胞的胞器內，例如線粒體或細胞核。一般來說，在使用內源性CRISPR系統的情況下，CRISPR複合體的形成（包括引導序列與目標序列雜交並與一或多種Cas蛋白複合）會導致目標序列其單股或兩股被切割，或是導致在目標序列附近（例如，在約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50或更多個鹼基對內）出現單股或雙股切割。與前述目標序列一樣，如果能發揮作用，則前述切割不需要完全互補。
在一些實施例中，係將驅動CRISPR系統的一或多種元件表現的一或多種載體導入宿主細胞中，使得CRISPR系統的元件的表現會導向在一或多個目標位點形成有CRISPR複合體。舉例而言，Cas酶、與tracr-mate序列連結的引導序列、以及tracr序列能各自與獨立載體上的個別調節元件為可操作地連接。或者，可以將由相同或不同調節元件所表現的兩種或更多種元件組合在單一載體中，而有一或多個額外載體以提供任何不為第一載體的CRISPR系統所含括的組分。組合在單一載體中的CRISPR系統元件可以以任何適合的方向排列，例如一個元件相對於第二元件位於其5'端（在其「下游」），或相對於第二元件位於其3'端（在其「上游」）。一個元件的編碼序列可與第二元件的編碼序列位於同一股或另一股上，並以相同或相反的方向排列。在一些實施例中，單個啟動子會驅動下列單元的表現：編碼有CRISPR酶的轉錄物與一或多個引導序列、tracr-mate序列（其選擇性地並可操作地連接至引導序列），以及嵌入至一或多個內含子序列中的tracr序列（例如，各序列嵌在不同的內含子中、至少一個內含子中嵌有兩個或更多個序列，或全部序列都嵌在同一個內含子中）。
在一些實施例中，CRISPR酶是一融合蛋白的一部分，前述融合蛋白包括一或多個異源性蛋白結構域（例如，除了CRISPR酶之外還有約1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個或更多個結構域）。CRISPR酶融合蛋白可以包括任何額外的蛋白序列，並且視情況在任意兩個結構域之間具有一連接子序列。可以融合至CRISPR酶的蛋白結構域其實例包括但不限於表位標籤、報告基因序列、以及具有以下一或多種活性的蛋白結構域：甲基化酶活性、去甲基化酶活性、轉錄活化活性、轉錄抑制活性、轉錄釋放因子活性、組蛋白修飾活性、RNA切割活性以及核酸結合活性。其他可以形成包含有CRISPR酶的融合蛋白的結構域，係描述於US20110059502，在此藉由引用併入本文。在一些實施例中，經標記的CRISPR酶用來找出目標序列的位置。
常規基於病毒和非病毒的基因轉移方法，可以將核酸導入哺乳動物及非哺乳動物細胞或目標組織。此類方法可編碼有CRISPR系統單元的核酸施用於培養中的細胞或宿主生物體中。非病毒載體遞送系統包括DNA質粒、RNA（例如，本文所述的載體其轉錄物）、裸核酸、以及與遞送載體（如微脂體）複合的核酸。病毒載體遞送系統包括DNA和RNA病毒，該等病毒在遞送至細胞後具有附加型基因組或嵌入型基因組。（Anderson，1992，Science 256：808-813；和Yu等人，1994，Gene Therapy 1：13-26）。
在一些實施例中，CRISPR/Cas衍生自第II型CRISPR/Cas系統。在其他實施例中，CRISPR/Cas系統衍生自Cas9蛋白。Cas9蛋白可以來自化膿性鏈球菌、嗜熱鏈球菌或其他物種。
通常來說，Cas蛋白包括至少一個RNA識別和/或RNA結合結構域。RNA識別和/或RNA結合結構域會與引導RNA相互作用。Cas蛋白還可以包括核酸酶結構域（即，DNase或RNase結構域）、DNA結合結構域、解旋酶結構域、RNA酶結構域、蛋白-蛋白相互作用結構域、二聚化結構域以及其他結構域。Cas蛋白可經修飾以增加核酸結合親和力和/或特異性、改變酶活性、和/或改變蛋白的另一性質。在一些實施例中，融合蛋白中的類Cas蛋白可以衍生自野生型Cas9蛋白或其片段。在其他實施例中，Cas蛋白可以衍生自經修飾的Cas9蛋白。舉例而言， Cas9蛋白的胺基酸序列可經修飾以改變蛋白的一或多種性質（例如，核酸酶活性、親和力、穩定性等）。或者，可以從蛋白中除去不參與RNA所引導的切割的Cas9蛋白結構域，使得經修飾的Cas9蛋白小於野生型Cas9蛋白。通常來說，Cas9蛋白包括至少兩個核酸酶（即，DNase）結構域。舉例而言，Cas9蛋白可包括類RuvC核酸酶結構域和類HNH核酸酶結構域。RuvC和HNH結構域一起作用以切割單股，進而在DNA中形成雙股斷裂（Jinek等人，2012，Science，337：816-821）。在一些實施例中，可以將Cas9衍生的蛋白修飾為僅含有一個功能性核酸酶結構域（類RuvC或類HNH核酸酶結構域）。舉例而言，Cas9衍生蛋白可經修飾以使得一個核酸酶結構域發生缺失或突變而不再具有功能性（即，無核酸酶活性）。在一些實施例中，其中一個核酸酶結構域無活性時，Cas9衍生蛋白能夠將切口（nick）導入雙股核酸中（這種蛋白被稱為「切口酶（nickase）」），但不能切割雙股DNA。在任何上述實施例中，可以使用已知方法（例如，定點誘變、PCR介導的誘變、及總基因合成，以及其他本領域已知的方法）透過一或多個缺失突變、插入突變和/或取代突變來使任何或所有的核酸酶結構域去活化。
在一個非限制性實施例中，載體會驅動CRISPR系統的表現。本領域有各種適用於本發明的載體，所用的載體適合在真核細胞中複製，並且適合選擇性地嵌入真核細胞中。典型的載體含有轉錄和轉譯終止子、起始序列，和調節期望核酸序列表現的啟動子。本發明的載體也可用於核酸標準基因遞送方法。基因遞送的方法是本領域已知的（美國專利號5,399,346、5,580,859和5,589,466，其全部內容藉由引用併入本文）。
此外，載體可以以病毒載體的形式提供給細胞。病毒載體技術在本領域中是眾所周知的，並且在例如Sambrook等人（2012，分子選殖：實驗室手冊，第1-4卷，Cold Spring Harbor Press，NY）、以及其他病毒學和分子學生物學手冊中有相關說明。可用作載體的病毒包括但不限於反轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、皰疹病毒、辛德畢斯病毒、γ反轉錄病毒和慢病毒。通常，適合的載體含有可在至少一種生物體中發揮功能的複製起始序列、啟動子序列、方便的限制性核酸內切酶位點及一或多個篩選標記物（例如WO 01/96584；WO 01/29058；及美國專利第6,326,193號）。
在一些實施例中，引導RNA和Cas9可以以核糖核蛋白（RNP）複合體（例如，Cas9/RNA-蛋白複合體）的形式遞送至細胞中。純化的Cas9蛋白與gRNA複合而形成核糖核蛋白，其係已知為本領域能夠有效的被遞送至多種類型細胞中，該些細胞包括但不限於幹細胞和免疫細胞（Addgene，Cambridge，MA，Mirus Bio LLC，Madison，WI）。在一些實施例中，係藉由電穿孔將Cas9/RNA-蛋白複合體遞送至細胞中。
在一些實施例中，本文的基因編輯修飾細胞係以CRISPR/Cas9進行編輯來破壞經修飾細胞（例如，經修飾的T細胞）中的一或多個內源基因。在一些實施例中，係使用CRISPR/Cas9來破壞內源性TRAC、TRBC、PDCD1、A2AR、B7-H3（CD276）、B7-H4（VTCN1）、BTLA（CD272）、CD96、CTLA-4（CD152）、IDO、KIR、LAG3、TIGIT、TIM-3和/或VISTA基因座中的一或多個，從而導致TRAC、TRBC、PD-1、A2AR、B7-H3（CD276）、B7-H4（VTCN1）、BTLA（CD272）、CD96、CTLA-4（CD152）、IDO、KIR、LAG3、TIGIT、TIM-3和/或VISTA被下調。在一些實施例中，係使用CRISPR/Cas9來破壞內源性TRAC、TRBC、PDCD1和/或TIM-3中的一或多個。適合用於破壞內源性TRAC、TRBC、PDCD1和/或TIM-3中的一或多個的gRNA係顯示於表1中。
表1：
適合用於破壞內源性TRAC、TRBC和/或PDCD1中的一或多個的gRNA在表列在表2中，並分為第I組gRNA和第II組gRNA。在一個示例性實施例中，本文經基因編輯的修飾細胞係使用靶向TRAC、TRBC和PD1的第I組gRNA中的任何一個來編輯。在一個示例性實施例中，本文基因修飾細胞係使用靶向TRAC、TRBC和PD1的第II組gRNA中的任何一個來編輯。
表2：
因此，對本文的經修飾細胞進行基因編輯的方法包括向細胞中導入一或多個核酸，這些一或多個核酸能下調選自TRAC、TRBC、PDCD1、A2AR、B7-H3（CD276）、B7-H4（VTCN1）、BTLA（CD272）、CD96、CTLA-4（CD152）、IDO、KIR、LAG3、TIGIT、TIM-3和VISTA中的一或多個內源基因的表現。在一個實施例中，對本文的經修飾細胞進行基因編輯的方法包括向細胞中導入一或多個核酸，這些一或多個核酸能下調選自TRAC、TRBC、PDCD1和TIM-3中的一或多個內源基因的基因表現。在一個實施例中，產生本文修飾細胞的方法包括1）將一核酸導入細胞中，該核酸包括編碼有外源性T細胞受體的核酸序列；以及2）將一或多個能夠下調選自TRAC、TRBC、PDCD1、A2AR、B7-H3（CD276）、B7-H4（VTCN1）、BTLA（CD272）、CD96、CTLA-4（CD152）、IDO、KIR、LAG3、TIGIT、TIM-3和VISTA中的一或多個內源基因的基因表現的核酸導入細胞中。在一個實施例中，產生本文修飾細胞的方法包括1）將一核酸導入細胞中，該核酸包括編碼有外源性T細胞受體的核酸序列；以及2）將一或多個能夠下調選自TRAC、TRBC、PDCD1和TIM-3中的一或多個內源基因的基因表現的核酸導入細胞中。在一個示例性實施例中，產生本文修飾T細胞的方法包括1）將一核酸導入T細胞中，該核酸包括編碼有外源性T細胞受體的核酸序列，所述外源性T細胞受體對目標細胞上的NY-ESO-1具有親和力；2）將能下調TRAC基因表現的核酸（例如，SEQ ID NO：37-49）導入細胞中；3）將能下調TRBC的基因表現的核酸（例如，SEQ ID NO：50-73或131）導入細胞中；以及，4）將能下調PDCD1的基因表現（例如，SEQ ID NO：74-97或127）的核酸導入細胞中。在示例性實施例中，產生本文修飾T細胞的方法包括1）將一核酸導入T細胞中，該核酸包括編碼有外源性T細胞受體的核酸序列，所述外源性T細胞受體對目標細胞上的NY-ESO-1具有親和力；2）將能下調TRAC基因表現的核酸（例如，SEQ ID NOs：37-49導入細胞中；3）將能下調TRBC的基因表現的核酸（例如，SEQ ID NOs：50-73或131）導入細胞中；以及，4）將能下調TIM-3的基因表現的核酸（例如，SEQ ID NOs：98-126）導入細胞中。
在一個實施例中，產生本文修飾細胞的方法包括1）將一核酸導入細胞中，前述核酸包括編碼有外源性T細胞受體的核酸序列以及編碼有切換受體的核酸序列；以及，2）將一或多個能夠下調選自TRAC、TRBC、PDCD1和TIM-3中的一或多個內源基因的基因表現的核酸導入細胞中。在一個示例性實施例中，產生本文修飾T細胞的方法包括1）將一核酸導入T細胞中，該核酸包括編碼有外源性T細胞受體的核酸序列，所述外源性T細胞受體對目標細胞上的NY-ESO-1具有親和力；2）將能下調TRAC基因表現的核酸（例如，SEQ ID NOs：37-49）導入細胞中；3）將能下調TRBC的基因表現的核酸（例如，SEQ ID NOs：50-73或131）導入細胞中。 在一個示例性實施例中，產生本文修飾T細胞的方法包括1）將一核酸導入T細胞中，該核酸包括編碼有外源性T細胞受體的核酸序列，所述外源性T細胞受體對目標細胞上的NY-ESO-1具有親和力；2）將能下調TRAC基因表現的核酸（例如，SEQ ID NOs：37-49導入細胞中；3）將能下調TRBC的基因表現的核酸（例如，SEQ ID NOs：50-73或131）導入細胞中；以及，4）將能下調TIM-3的基因表現的核酸（例如，SEQ ID NOs：98-126）導入細胞中。
在一些實施例中，本文的基因編輯修飾細胞在內源性TIM-3編碼序列中具有至少一個核苷酸取代、缺失、插入和/或插入/缺失。在一些實施例中，本文的基因編輯修飾細胞係藉由任一個本文描述的TIM-3靶向核酸（例如，SEQ ID NOs：98-126）所編輯。
在一些實施例中，本文的基因編輯修飾細胞在內源性TCRα鏈編碼序列（TRAC）中具有至少一個核苷酸取代、缺失、插入和/或插入/缺失。在一些實施例中，本文的基因編輯修飾細胞係藉由任何一種本文所述的TRAC靶向核酸所編輯（例如SEQ ID NOs：37-49）。在一些實施例中，本文的基因編輯修飾細胞係藉由本文所描述的一個第I組的或第II組的TRAC靶向核酸所編輯。在一個示例性實施例中，本文的基因編輯修飾細胞係藉由藉由一第I組TRAC靶向核酸所編輯，且其內源性TCRα鏈編碼序列（TRAC）具有至少一個核苷酸取代、缺失、插入和/或插入/缺失而使內源性TCRα鏈的表現被下調，該內源性TCRα鏈編碼序列（TRAC）具有以下序列：AACAAATGTGTCACAAAGTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAGACAAAACTGTGCTAGACATGAGGTCTATGGACTTCAAGAGCAACAGTGCTGTGGCCT（SEQ ID NO：128）。舉例而言，本文的基因編輯修飾細胞係藉由一第I組TRAC靶向核酸所編輯，且可包括任何一種如圖1中所示的經編輯的內源性TRAC編碼序列。
在一些實施例中，本文的基因編輯修飾細胞在內源TCRβ鏈編碼序列（TRBC）中具有至少一個核苷酸取代、缺失、插入和/或插入/缺失。在一些實施例中，本文的基因編輯修飾細胞係藉由任何一個本文所述的TRBC靶向核酸所編輯（例如SEQ ID NOs：50-73或131）。在一些實施例中，本文的基因編輯修飾細胞係藉由本文所描述的一個第I組的或第II組的TRAC靶向核酸所編輯。在一個示例性實施例中，本文的基因編輯修飾細胞係藉由一第I組TRBC靶向核酸所編輯，且在內源性TCRβ編碼序列（TRBC）中具有至少一個核苷酸取代、缺失、插入和/或插入/缺失，導致內源性TCRβ鏈表現被下調，上述內源性TCRβ編碼序列包括以下核酸序列：GCAGAACCCCCGCAACCACTTCCGCTGTCAAGTCCAGTTCTACGGGCTCTCGGAGAATGACGAGTGGACCCAGGATAGGGCCAAACCTGTCACCCAGATCG（SEQ ID NO：129）。舉例而言，本文的基因編輯修飾細胞係藉由一第I組TRBC靶向核酸所編輯，且可包括任何一個如圖2中所示的經編輯的內源性TRBC編碼序列。
在一些實施例中，本文的基因編輯修飾細胞在內源性PD1編碼序列中具有至少一個核苷酸取代、缺失、插入和/或插入/缺失。在一些實施例中，本文的基因編輯修飾細胞係藉由任何一個本文描述的PD1靶向核酸（例如，SEQ ID NOs：74-97或127）所編輯。在一些實施例中，本文的基因編輯修飾細胞係藉由一個本文所述的第I組或第II組PD1靶向核酸所編輯。在一個示例性實施例中，本文的基因編輯修飾細胞係藉由一第I組PD1靶向核酸所編輯，且在該PD1編碼序列中具有至少一個核苷酸取代、缺失、插入和/或插入/缺失，導致內源性PD1表現的下調，上述PD1編碼序列包括下列核酸序列：GCTGCTCCAGGCATGCAGATCCCACAGGCGCCCTGGCCAGTCGTCTGGGCGGTGCTACAACTGGGCTGGCGGCCAGGATGGTTCTTAGGTAGGTGGGGTCG（SEQ ID NO：130）。舉例而言，本文的基因編碼修飾細胞係藉由一第I組PD1靶向核酸所編輯，且可包括任何一個如圖3中所示的經編輯的內源性PD1編碼序列。
在一些實施例中，本文的基因編輯修飾細胞在一個具有如SEQ ID NO：128所示核酸序列的內源性TCRα鏈編碼序列（TRAC）、具有如SEQ ID NO：129所示核酸序列的內源性TCR的β鏈編碼序列（TRBC），及可選擇的在具有如SEQ ID NO：130所示核酸序列的內源性PD1編碼序列（PDCD1）中具有至少一個核苷酸取代、缺失、插入和/或插入/缺失，導致內源性TCRα鏈、內源性TCRβ鏈和內源性PD1的表現被下調。
在一個實施方案中，本文的經修飾細胞包括外源性T細胞受體，其中內源性TCRα鏈編碼序列、內源性TCRβ鏈編碼序列和內源性PD1編碼序列的表現被下調。在一個示例性實施例中，本文的經修飾細胞係經修飾的T細胞，其具有對目標細胞上的NY-ESO-1有親和力的外源性T細胞受體，其中內源性TCRα鏈編碼序列、內源性TCRβ鏈編碼序列和內源性PD1編碼序列的表現被下調。在另一個示例性實施例中，本文的經修飾細胞是經修飾的T細胞，其具有對目標細胞上的NY-ESO-1有親和力的外源性T細胞受體，在如包括如SEQ ID NO：128所示核酸序列的內源性TCRα鏈編碼序列中具有至少一個核苷酸取代、缺失、插入和/或插入/缺失，在包括如SEQ ID NO：129所示核酸序列的內源性TCRβ鏈編碼序列中有至少一個核苷酸取代、缺失、插入和/或插入/缺失，且在包括如SEQ ID NO：130所示核酸序列的內源性PD1編碼序列中有至少一核苷酸取代、缺失、插入和/或插入/缺失，從而導致內源性TCRα鏈、內源性TCRβ鏈和內源性PD1的表現被下調。
在一個實施例中，本文的經修飾細胞包括外源性T細胞受體和切換受體（例如，PD1-CD28切換受體），其中內源性TCRα鏈編碼序列和內源性TCRβ鏈編碼序列的表現被下調。在一個示例性實施例中，本文的經修飾細胞是經修飾的T細胞，其具有對目標細胞上的NY-ESO-1有親和力的外源性T細胞受體和切換受體（例如，PD1-CD28切換受體），其中內源性TCRα鏈編碼序列和內源性TCRβ鏈編碼序列的表現被下調。在另一個示例性實施例中，本文的經修飾細胞是經修飾的T細胞，其具有對目標細胞上的NY-ESO-1有親和力的外源性T細胞受體和切換受體（例如，PD1-CD28切換受體），其中包括如SEQ ID NO：128所示核酸序列的內源性TCRα鏈編碼序列中具有至少一核苷酸取代、缺失、插入和/或插入/缺失，且其中包括如SEQ ID NO：129所示核酸序列的內源性TCRβ鏈編碼序列中具有至少一核苷酸取代、缺失、插入和/或插入/缺失，從而導致內源性TCRα鏈和內源性TCRβ鏈表現被下調。
在一些實施態樣中，本文所提供的組合物和方法包含那些具有至少或多於約50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的免疫細胞帶有所需的基因修飾的細胞組合物。舉例而言，在細胞組合物中約有50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的免疫細胞，有導入剔除或破壞內源性基因（如TRAC、TRBC、PDCD1或TIM3）的媒介物（例如gRNA/Cas9），使這些細胞具有基因破壞的情況、不表現目標內源性多肽、或不含有連續的和/或有功能的目標基因複本。在一些實施例中，根據本文所揭露的方法、組合物和細胞，其包含那些具有至少或多於約50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％細胞導入有剔除或破壞目標基因的媒介物（例如gRNA/Cas9）的細胞組合物，這些細胞不表現目標多肽（例如不表現在免疫細胞表面）。在一些實施例中，細胞組合物中有至少或大於約50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的細胞，有導入剔除或破壞目標基因的媒介物（例如gRNA/Cas9），使目標基因的兩個等位基因都被剔除，亦即有上述比例的細胞帶有雙等位基因缺失。
在一些實施例中，本文提供了組合物和方法，在被導入一媒介物（例如gRNA/Cas9）以剔除或破壞目標基因的細胞組合物中，在目標基因上或在鄰近目標基因（例如，在切割位點上游或下游的100個鹼基對內或約100個鹼基對內、在50個鹼基對內或約50個鹼基對內、在25個鹼基對內約25個鹼基對內、或在10個鹼基對內或約10個鹼基對內）中的位置上由前述Cas9所介導進行之切割效率（％插入/缺失）為至少或大於約50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的細胞。
在一些實施例中，本文所提供的細胞、組合物和方法會導致在細胞組合物中有至少或大於約50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的細胞其內源性基因傳遞信號被減少或被破壞，其中這些這些細胞被導入剔除或破壞目標基因的媒介物（例如gRNA/Cas9）。
在一些實施例中，本文所提供的組合物包括以重組受體改造的細胞，且其內源性受體表現具有減少、缺失消除、剔除或破壞（例如，TRBC，TRAC或免疫檢查點基因的基因破壞），而在相同的條件下評估時，與那些對應或參照組合物改造的細胞所表現的受體相較（其基因未被破壞或表現該多肽），該受體仍有功能或活性。在一些實施例中，在相同條件下評估時，對應或參照組合物改造的細胞所表現的受體相較（該細胞係以重組受體改造但不具有基因破壞或表現目標多肽），本文提供的組合物改造的細胞保留功能特性或活性。在一些實施例中，與對應或參考組合物相比，上述細胞保留細胞毒性、增生能力、存活特性或細胞激素分泌能力。
在一些實施例中，在相同條件下評估時，相較於對應或參考組合物的細胞表型，本文組合物中的免疫細胞保留一或多個免疫細胞的表型。在一些實施例中，組合物中的細胞包括初級細胞、作用記憶細胞、中樞記憶細胞，幹細胞型中樞記憶細胞、作用記憶細胞和長期存活型作用記憶細胞。在一些實施例中，前述百分比部分的T細胞，或者表現有重組受體（例如，NY-ESO-1 TCR）且其目標基因（例如，TRAC、TRBC、PDCD1或TIM3）被破壞的T細胞，展現出非活化型、長期存活型的記憶或中央記憶表型，這種表型與以重組受體改造但不含基因破壞或不表現切換受體的相應或參考群體或細胞組合物相同或實質相同。在一些實施例中，這種性質、活性或表型可以在試管環境（in vitro）中進行測量，例如將該些細胞培育於存在有NY-ESO-1抗原、表現該抗原細胞和/或抗原受體活化物質的環境下。在一些實施例中，可以在進行電穿孔後或導入其他媒介物後的不同天數（例如，在3、4、5、6、7天之後或至這些天數）來評估活性、性質或表型。在一些實施例中，在相同條件下評估時，相較於含有重組受體改造細胞（但其目標基因未被破壞）的相應組合物的活性，本文組合物其細胞活性、性質或表型保留至少80％、85％、90％、95％或100％。
本文所用的「相應組合物」或「相應的免疫細胞群」（也稱為「參考組合物」或「參考細胞群」）係指在相同或實質上相同的條件下所獲得、分離、產生和/或孵育的免疫細胞（例如，T細胞），然前述免疫細胞或免疫細胞群不導入前述媒介物。在一些實施態樣中，除了沒有導入媒介物之外，這些免疫細胞與有導入媒介物的免疫細胞以相同或實質相同地方式處理，使得任何一或多種可以影響細胞活性或性質（包括抑制分子的上調或表現）的條件，除了媒介物的導入之外，在細胞間沒有變化或實質上沒有變化。
評估T細胞標誌物有無表現和/或表現量的方法和技術是本領域已知的。檢測這些標誌物的抗體和試劑是本領域熟知且容易獲得的。檢測這些標誌物的測定法和方法包括但不限於流式細胞術（包括細胞內流式細胞術）、ELISA、ELISPOT、磁珠陣列術（cytometric bead array）或其他多重方法、西方墨點法，以及其他基於免疫親和力的方法。在一些實施例中，可以藉由流式細胞術或其他基於免疫親和力的方法透過該細胞所特有的標記物來檢測有表現抗原受體（例如NY-ESO1 TCR）的細胞，接著可以將這些細胞以另一個或多個T細胞表面標記來共染色。
在一些實施例中，細胞、組合物和方法係用來將過繼轉移的免疫細胞（例如是經改造以表現外源性NY-ESO的細胞，例如T細胞）中目標基因的表現進行缺失、剔除、破壞或減少處理。在一些實施例中，所述方法以離體方式（ex vivo）在原代細胞上進行，所述原代細胞係例如來自一受試者的原代免疫細胞（例如，T細胞）。在一些實施態樣中，產生或製造此類基因改造T細胞的方法包括將一或多個編碼有重組受體（例如，外源性NY-ESO-1 TCR）的核酸，以及一或多個能破壞編碼目標內源性受體基因的媒介物導入至含有免疫細胞（例如，T細胞）的一群細胞中。本文所用的術語「導入」涵蓋各種以體外（in vitro）或體內（in vivo）方式將DNA導入細胞的方法，這些方法包括轉形、轉導、轉染（例如，電穿孔）和感染。載體有助於將DNA編碼分子導入細胞中。可能的載體包括質粒載體和病毒載體。病毒載體包括反轉錄病毒載體、慢病毒載體或其他載體（例如腺病毒載體或腺相關載體）。
含有T細胞的細胞群可以是從一受試者所獲得的細胞，例如從下列來源獲得：周邊血液單核細胞（PBMC）樣品、未分化的T細胞樣品、淋巴細胞樣品、白血球樣品、血液成分術產物、或白血球去除術產物。在一些實施例中，可以使用正向或負向篩選和富集方法來分離或篩選T細胞，以富集群體中的T細胞。在一些實施例中，所述群體含有CD4 +、CD8+或CD4 +和CD8 +T細胞。在一些實施例中，導入編碼基因改造抗原受體核酸的步驟以及導入媒介物（例如Cas9/gRNA RNP）的步驟可以同時或以任何順序發生。在一些實施例中，在導入外源性受體及一或多個基因編輯媒介物（例如Cas9/gRNA RNP）後，在一定條件下培養或孵育細胞以刺激細胞的擴增和/或增生。
因此，本文提供增強免疫細胞（例如，T細胞）的細胞、組合物和方法，其在過繼細胞療法中發揮作用，包括提供較佳的療效，其係例如藉由增加所施用的基因改造細胞其活性和效力（例如，抗NY-ESO-1），同時保持轉移細胞的持久性或長時暴露。在一些實施例中，與一些可用的方法相比，將經基因改造細胞以體內方式投與至個體時，前述基因改造細胞具有較高的擴增能力和/或持久性。在一些實施例中，當以體內方式投與至個體時，所提供的免疫細胞具有較高的持久性。在一些實施例中，與透過替代方法實現的基因改造免疫細胞（例如未引入媒介物以減少或破壞編碼內源受體基因表現的T細胞）相比，在施用於受試者時，本文的基因改造免疫細胞其持久性有提高。在一些實施例中，持久性增加至少或約至少1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、 10倍、20倍、30倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍或更多倍。
在一些實施例中，施用細胞其持久性的程度或範圍，可在施用於受試者後進行檢測或定量。例如，在一些實施例中，其係以定量PCR（qPCR）來評估在受試者血液或血清或器官或組織（例如，疾病部位）中表現有外源受體（例如，NY-ESO-1 TCR）細胞的數量。在一些實施例中，持久性被量化為每微克的DNA中編碼有外源受體的DNA或質體的拷貝數，或者是每微升樣品（例如血液或血清）中表現有受體的細胞數量，或在每微升樣品的總周邊血單核細胞（PBMC）數中每微升樣品的總白細胞數中，或每微升樣品的總T細胞數中，表現有受體的細胞數量。在一些實施例中，也可以用流式細胞分析來檢測表現受體的細胞，其係使用對受體具有專一性的抗體來進行。基於細胞的測定也可用來檢測功能細胞的數量或百分比，其例如是能夠結合及／或中和及／或誘導反應（例如細胞毒性反應、針對疾病或病症，或表現辨識抗原受體）的細胞。在任何前述實施例中，與外源受體（例如外源NY-ESO-1 TCR）相關的另一種標記物的表現程度或表現量可用來區分受試者中被施用的細胞與內源細胞。
F. 產生 基因修飾免疫細胞的方法
本文提供了產生或製造的本發明之經修飾免疫細胞或其前驅細胞（例如，T細胞）的方法，以進行腫瘤免疫療法（例如，過繼免疫療法）。其係通常藉由將一或多個編碼有所述外源性受體（例如，NY-ESO-1受體和/或一個切換受體）的基因改造核酸導入至細胞中，以改造細胞。在一些實施例中，還可同時或依次將編碼有外源性受體的核酸、能破壞目標基因（例如，編碼有TRAC，TRBC或編碼有如PD-1等免疫抑制分子的基因）的媒介物（例如，Cas9/gRNA RNP）導入至細胞。
在一些實施例中，是利用表現載體來將外源性受體（例如，TCR和/或切換受體）導入細胞中。本文提供了包括編碼有本發明T細胞受體和/或切換受體核酸的表現載體。適合的表現載體包括慢病毒載體、γ反轉錄病毒載體、泡沫病毒載體、腺相關病毒（AAV）載體、腺病毒載體、經改造的雜交病毒、裸DNA（包括但不限於轉座子所介導的載體，例如Sleeping Beauty轉座子、Piggybak轉座子和如Phi31等之嵌合酶）。其他適合的表現載體包括單純皰疹病毒（HSV）和反轉錄病毒表現載體。
腺病毒表現載體係以腺病毒為基礎，腺病毒嵌入至宿主基因組DNA中的能力不好，但轉染宿主細胞的效率很高。腺病毒表現載體含有腺病毒序列，其足以：（a）支持表現載體的包裝，以及（b）最終在宿主細胞中表現T細胞受體和/或切換受體。在一些實施例中，腺病毒基因組是大小為36kb、線性且為雙股的DNA，在腺病毒基因組中可以插入外源性的DNA序列（例如，編碼有T細胞受體和/或切換受體的核酸）來取代大片段的腺病毒DNA，以便產生本發明的表現載體（參見例如Danthinne和Imperiale，Gene Therapy (2000) 7(20): 1707-1714）。
另一種表現載體係以腺相關病毒（AAV）為基礎，其利用腺病毒偶合系統。AAV表現載體嵌入至宿主基因組中的頻率很高。它可以感染非分裂細胞，進而使其可用來將基因遞送至哺乳動物細胞中（例如，在組織培養或體內）。AAV載體能夠感染相當多種的宿主。關於AAV載體的產生和使用細節，係描述於美國專利第5,139,941號和第4,797,368號中。
反轉錄病毒表現載體能夠嵌入到宿主基因組中，遞送大量的外源遺傳物質，感染許多不同的物種和細胞類型，並且被包裝在特殊細胞株中。藉由將核酸（例如，編碼TCR和/或切換受體的核酸）插入病毒基因組的某些位置中來構築反轉錄病毒載體，藉此產生複製缺陷的病毒。儘管反轉錄病毒載體能夠感染多種細胞類型，但T細胞受體和/或切換受體的嵌入和穩定表現仍需要宿主細胞的分裂。
慢病毒載體係源自慢病毒，且慢病毒是複雜的反轉錄病毒，除了常見的反轉錄病毒基因gag、pol和env之外，其還含有其他具有調控或結構功能的基因（參見例如美國專利號6,013,516和5,994,136）。舉例來說，慢病毒可以是人類免疫缺陷病毒（HIV-1、HIV-2）或猿猴免疫缺陷病毒（SIV）。慢病毒載體係藉由將HIV之毒力基因進行多次減毒而產生。舉例而言，讓env、vif、vpr、vpu和nef等基因產生缺失，而使載體具備生物安全性。慢病毒載體能夠感染非分裂細胞並且可以用於體內和離體的基因轉移及表現（例如，編碼T細胞受體和/或切換受體的核酸，參見例如美國專利號5,994,136）。
含有本文所揭露的核酸的表現載體，可以藉由任何本領域技術人員所習知的方式導入宿主細胞。如有必要，表現載體可以包括轉染用的病毒序列。或者，表現載體可以藉由融合、電穿孔、基因槍法（biolistics）、轉染、脂質轉染等或其類似方式導入。宿主細胞在導入表現載體之前，可以在培養環境中生長和擴增，隨後進行適當處理以導入和嵌入載體。接著，可以將宿主細胞擴增，並可藉助存在於載體中的標記對宿主細胞進行篩選。可使用的各種標記是本領域所習知的，並且可以包括hprt、新黴素抗性、胸苷激酶、潮黴素抗性等。本文所用術語「細胞」、「細胞株」和「細胞培養物」可互換使用。在一些實施例中，宿主細胞是免疫細胞或其前驅細胞（例如，T細胞、NK細胞或NKT細胞）。
本發明還提供了包括並穩定表現有本發明的T細胞受體和/或切換受體的基因改造細胞。在一些實施例中，基因改造細胞是經基因改造的T淋巴細胞（T細胞）、初級T細胞（TN）、記憶T細胞（例如，中樞記憶T細胞（TCM）、作用記憶細胞（TEM））、天然殺手細胞（NK細胞）和能夠產生治療相關子代的巨噬細胞。在一個實施例中，基因改造細胞是自體細胞。
將具有本文所揭露的核酸的表現載體穩定的轉染至宿主細胞，可以用來產生修飾的細胞（例如，包括T細胞受體和/或切換受體的細胞）。其他產生本發明修飾細胞的方法，包括但不限於化學轉形方法（例如，使用磷酸鈣、樹枝狀聚合物、脂質體和/或陽離子聚合物）、非化學轉形方法（例如，電穿孔、光學轉形、基因電轉移和/或流體動力學遞送），和/或基於顆粒的方法（例如，使用基因槍和/或磁力轉染（magnetofection）進行的基因交付（impalefection））。表現本發明T細胞受體和/或切換受體的轉染細胞可以以離體方式（ex vivo）擴增。
以物理方式將表現載體導入至宿主細胞的方法，包括磷酸鈣沉澱、脂質轉染、基因槍法（particle bombardment）、顯微注射、電穿孔等或其類似方法。帶有載體和/或外源核酸的細胞其製備方法是本領域眾所周知的。參見例如Sambrook 等人。 （2001），分子選殖：實驗室手冊，Cold Spring Harbor Laboratory，New York。以化學方式將表現載體導入宿主細胞的方法，包括膠體分散體系統（例如，大分子複合體、奈米膠囊、微球體、珠子）和基於脂質的系統（包括，水包油乳液、微胞、混合微胞和微脂體）。
適用的脂質可由市面上購得。舉例而言，二肉豆蔻基磷脂醯膽鹼（dimyristyl phosphatidylcholine，「DMPC」）可購自Sigma，St.Louis，MO。磷酸三十二烷基酯（dicetyl phosphate，「DCP」）可購自K&K Laboratories（Plainview，NY）。膽固醇（cholesterol，「Choi」）可購自Calbiochem-Behring。二肉豆蔻基磷脂醯甘油（dimyristyl phosphatidylglycerol，「DMPG」）及其他脂質可購自Avanti Polar Lipids，Inc.（Birmingham, AL.）。脂質於氯仿或氯仿/甲醇中的儲備原液可儲存在約-20℃的環境下。氯仿係用作唯一的溶劑，因為其比甲醇更容易蒸發。「微脂體」係為一通稱，其係指因雙層脂質進行封閉生成或聚集而產生的各種單層及多層脂質載體。微脂體之特徵為具有囊泡結構，其具有雙層磷脂膜，而內部為水性介質。多層微脂體具有多個脂質層，其係藉由水性介質所分隔。當過量的磷脂懸浮於水溶液中時，它們會自動地形成。在形成封閉結構之前，脂質組分會進行自我重組，並在雙層脂質之間截留水及溶於水中的溶解物（Ghosh等人，1991 Glycobiology 5: 505-10）。然而，本實施例亦涵蓋在溶液中有與正常囊泡結構不同結構的組合物。舉例而言，脂質可呈現微胞結構（micellar structure）或僅以脂質分子之非均勻聚集物的形式存在。本實施例亦涵蓋脂染胺（lipofectamine）-核酸複合體。
不管是將外源性核酸導入宿主細胞中的方法，或是其他使細胞暴露於本發明抑制劑的方法，為了要確認宿主細胞中核酸序列之存在，可進行多種檢測。此類檢測包括例如本領域技術人員所熟知的「分子生物學」檢測（例如，南方及北方墨點法、RT-PCR及PCR）、例如偵測特定肽之存在或不存在的「生物化學」檢測（例如，藉由如ELISA及西方墨點法等免疫學手段）或藉由本發明所描述之檢測法來識別在本發明範疇內的試劑。
在一個實施例中，導入宿主細胞的核酸為RNA。在另一個實施例中，RNA是mRNA，其包括體外轉錄RNA或人工合成RNA。RNA是利用聚合酶鏈鏈鏈鎖反應（PCR）所產生的模板以體外轉錄方式所生成。任何來源的目標DNA可以藉由PCR直接轉化成模板，利用適合的引子和RNA聚合酶來進行體外mRNA合成。舉例而言，DNA的來源可以是基因組DNA、質粒DNA、噬菌體DNA、cDNA、合成DNA序列或任何其它適當的DNA來源。
可使用PCR產生mRNA體外轉錄用的模板，然後將其導入細胞中。進行PCR的方法在本領域是習知的。用於PCR之引子係經設計而具有與可作為PCR模板的DNA區域實質上互補的區域。本文中所用之「實質上互補」，係指引子序列中之大部分或全部鹼基為互補，或一或多個鹼基為不互補或不匹配。實質上互補的序列能夠在PCR之退火條件下與預期的DNA目標發生黏接或雜交。引子可經設計以與DNA模板的任何部分實質上互補。舉例而言，引子可經設計以擴增一基因在細胞中通常會發生轉錄的部分（開放閱讀框），其包括5'及3' UTR。引子亦可經設計以擴增基因的一部分，其係編碼有特定目標結構域。在一個實施例中，引子經設計以擴增人類cDNA的編碼區，包括全部或部分的5'及3' UTR。適用於PCR的引子，可藉由本領域所習知的合成方法來產生。「正向引子」是指含有一核苷酸片段的引子，前述核苷酸片段與待擴增DNA序列上游的DNA模板實質上互補。「上游」在本文中係指相對於編碼股的待擴增之DNA序列之5'位置。「反向引子」是指含有一核苷酸片段的引子，前述核苷酸片段與待擴增DNA序列下游的雙股DNA模板實質上互補。「下游」在本文中係指相對於編碼股的待擴增DNA序列之3'位置。
本文亦可利用能夠促進RNA穩定性及/或轉譯效率之化學結構。RNA較佳會具有5'及3' UTR。在一個實施例中，5'UTR的長度為0至3000個核苷酸。待添加至編碼區的5'及3' UTR序列之長度可以不同方法進行改變，包括但不限於設計會黏接至UTR之不同區域的PCR引子。使用此方法，本發明所屬技術領域具有通常知識者可在將轉染轉錄RNA後，修改能夠達到最佳轉譯效率所需的5'及3' UTR長度。
5'及3'UTR部分可以是目標基因天然存在的內源性5'及3' 端的UTR。或者，可以藉由在正向及反向引子中併入UTR序列，或藉由其他任何對模板的修飾，來添加對目標基因而言為非內源性的UTR序列。使用目標基因而言為非內源性的UTR序列，有助於調整RNA的穩定性及/或轉譯效率。舉例而言，目前已知3' UTR序列中的AU富含單元（AU-rich elements）會降低mRNA的穩定性。因此，根據本領域中所習知的UTRs特性來選擇及設計3'UTR，可以提高轉錄所得之RNA的穩定性。
在一個實施例中，5'UTR可含有內源性基因之克紮克序列（Kozak sequence）。或者，當利用如前文所述的以PCR添加對目標基因而言為非內源性之5' UTR時，可藉由添加5' UTR序列來重新設計共同克紮克序列。克紮克序列可提高某些RNA轉錄物的轉譯效率，但似乎並非所有的RNA都需要此種序列來進行有效率的轉譯。本領域中已知有許多mRNA需要克紮克序列。在其他實施例中，5' UTR可源自RNA病毒，其RNA基因組在細胞中為穩定存在。在其他實施例中，有許多種核苷酸類似物可用於3'或5' UTR，以阻礙mRNA被核酸外切酶降解。
為了能夠在無需基因選殖的情況下也能夠從DNA模板進行RNA的合成，轉錄啟動子應連接至待轉錄序列上游之DNA模板。當充當RNA聚合酶之啟動子的序列被添加至正向引子之5'端時，RNA聚合酶啟動子會併入PCR產物中待轉錄之開放閱讀框的上游。在一個實施例中，啟動子為如本文別處所述之T7聚合酶啟動子。其他適用啟動子包括但不限於T3及SP6 RNA聚合酶啟動子。T7、T3及SP6啟動子的共同核苷酸序列則為本領域中所習知。
在一實施例中，mRNA在5'端具有端帽及3'端具有聚腺苷酸尾（poly(A) tail），其係決定核糖體結合、轉譯起始及細胞中mRNA的穩定性。在環狀DNA模板上，例如質體DNA，RNA聚合酶會產生不適於在真核細胞中表現的長多聯體（concatemeric）產物。質體DNA的轉錄物，於其3' UTR之末端線性化後會產生正常尺寸之mRNA，其即使在轉錄後經聚腺苷酸化，轉染至真核細胞後亦不會發生作用。
在線性DNA模板上，噬菌體T7 RNA聚合酶可使轉錄物之3'端延伸超出模板之最後一個鹼基（Schenborn及Mierendorf, Nuc Acids Res., 13:6223-36 (1985)；Nacheva及Berzal-Herranz,Eur.J. Eur. J. Biochem., 270:1485-65 (2003)）。
在PCR期間使用含有聚胸腺苷酸尾（例如，100個胸腺苷酸所聚合而成，尺寸可為50至5000個胸腺苷酸）之反向引子，或在PCR之後藉由其他任何方法－包括但不限於DNA接合或體外重組，可以在轉錄用DNA模板上成生polyA/T區段。聚腺苷酸尾也讓RNA穩定且減少其降解。一般而言，聚腺苷酸尾的長度與經轉錄RNA之穩定性呈正相關。在一個實施例中，聚腺苷酸尾為100至5000個腺苷。
RNA的聚腺苷酸尾在使用聚腺苷酸聚合酶（例如，大腸桿菌聚腺苷酸聚合酶，E-PAP）體外轉錄之後可進一步延長。在一個實施例中，將聚腺苷酸尾的長度由100個核苷酸增至300至400個核苷酸，會讓RNA的轉譯效率提高約兩倍。此外，不同化學基團與3'端之連接可提高mRNA穩定性。此類連接可含有經修飾的/人造的核苷酸、適體（aptamers）及其他化合物。舉例而言，可使用聚腺苷酸聚合酶將ATP類似物併入聚腺苷酸尾中。ATP類似物可進一步提高RNA穩定性。
5'端帽也為RNA分子提供穩定性。在一較佳實施例中，本文揭示之方法所產生的RNA包括5'端帽。提供5'端帽的方法是本領域已知的，且描述於下列文獻中：Cougot等人，Trends in Biochem. Sci., 29:436-444 (2001)；Stepinski, 等人., RNA, 7:1468-95 (2001)；Elango等人，Biochim. Biophys. Res. Commun., 330:958-966 (2005)。
在一些實施例中，RNA—例如是體外轉錄之RNA—係以電穿孔方式被導入細胞中。過程中可加入任何適於細胞電穿孔的溶解物，其可含有有助於細胞滲透性及活性的因子，例如糖、肽、脂質、蛋白、抗氧化劑及界面活性劑。
在一些實施例中，編碼有本文的Ｔ細胞受體和/或切換受體的核酸將是RNA（例如，體外合成的RNA）。體外合成RNA的方法是本領域技術人員所習知的，可以使用任何已知的方法來合成包括編碼有T細胞受體和/或切換受體的RNA。將RNA導入宿主細胞的方法是本領域所習知的。參見例如Zhao等人，Cancer Res. (2010) 15: 9053。可以以體外（in vitro）、離體（ex vivo）或體內（in vivo）方式將包括編碼有T細胞受體和/或切換受體的核苷酸序列的RNA導入宿主細胞。舉例而言，可以將包括編碼有T細胞受體和/或切換受體核苷酸序列的RNA以體外方式或離體方式利用電穿孔將其導入宿主細胞（例如，NK細胞、細胞毒性T淋巴細胞等）中。
本文所揭露的方法可以應用於基礎研究和治療領域中關於宿主細胞活性之調節。基礎研究和治療領域涵蓋癌症、幹細胞、急性與慢性感染及自體免疫疾病，包括分析經基因修飾的宿主細胞殺死目標癌細胞之能力。
該些方法亦能大範圍地控制表現量，其係藉改變例如啟動子或RNA輸入量，使其能個別調節表現量。此外，以PCR為基礎的mRNA生產技術，對於設計出具有不同結構和其結構域組合之mRNA有很大的幫助。
本發明RNA轉染方法其中一個優勢為，RNA轉染原則上係暫時性的且不需載體。RNA轉基因可被輸送至淋巴球，並於簡短的體外細胞活化後於其中表現，其係作為最小表現匣而不須任何額外病毒序列。於該些條件下，轉基因不會嵌入宿主細胞的基因體。基於RNA的轉染效率及其一致性地修飾整體淋巴球群體的能力，故無須進行細胞選殖。
以體外轉錄之RNA（IVT-RNA）進行T細胞的基因改造，係使用兩種不同策略，兩種皆已成功地於多個動物模式中測試過。以體外轉錄之RNA來轉染細胞，係藉由脂質轉染或電穿孔的手段。為了延長轉移的IVT-RNA的表現，可使用各種修飾來穩定IVT-RNA。
文獻中已知有某些IVT載體，其以標準化方式作為體外轉錄之模板，且其係以產生穩定之RNA轉錄物的方式進行基因改造。目前，本領域所使用的方式係基於具下列結構的質體載體：能使RNA轉錄之5' RNA聚合酶啟動子，其後是目標基因（其3'及/或5'端接有未轉譯區（UTR））、以及，含有50至70個腺苷酸的3'端多腺苷酸卡匣。在體外轉錄前，環狀質體藉由第II型限制酶在多腺苷酸匣下游進行線性化（識別序列對應於切割位點）。因此，多腺苷酸匣對應於轉錄物後之聚腺苷酸序列。此程序之結果為，一些核苷酸於線性化後仍為酵素切割位點之一部分，且延伸或遮蔽3'端之聚腺苷酸序列。目前尚不清楚的是，這種非生理性突出物（overhang）是否會影響此構築於體細胞內所產生的蛋白量。
在另一實施態樣中，RNA構築體可藉由電穿孔傳遞入細胞。舉例而言，參見，如US 2004/0014645、US 2005/0052630A1、US 2005/0070841A1、US 2004/0059285A1、US 2004/0092907A1中所揭示的以電穿孔方式將核酸構築體送入哺乳動物細胞的製劑和方法。前述方式的各種參數，包括任何已知細胞類型所需的電穿孔電場強度，基本上已揭露於相關研究文獻以及本領域許多專利和申請案中。參見例如美國專利號6,678,556、美國專利號7,171,264和美國專利號7,173,116。用於治療的電穿孔裝置可以在市面上買到，例如，MedPulserTM DNA電穿孔療法系統（Inovio/Genetronics，San Diego，Calif.），並且其在例如美國專利號6,567,694、美國專利號6,516,223、美國專利號5,993,434、美國專利號6,181,964、美國專利號6,241,701和美國專利號6,233,482的專利中亦有描述。電穿孔也可用於體外轉染細胞，例如US20070128708A1中所描述。電穿孔也可用於體外傳遞核酸進入細胞。因此，由電穿孔所介導的將核酸（包括表現構築體）投予至細胞，係使用許多本領技術人員所習知的商售裝置與電穿孔系統中任一者所進行，且其是一種將目標RNA遞送至目標細胞令人振奮的新方法。
在一些實施例中，可以在導入編碼外源性受體（例如，外源性NY-ESO-1受體和/或切換受體）的核酸分子和基因編輯媒介物（例如，CRISPR系統、CRISPR/Cas9系統、Cas9/gRNA RNP）之前、期間和/或之後孵育或培養免疫細胞（例如T細胞）。在一些實施例中，可以在導入編碼外源性受體的核酸分子之前、期間或之後孵育或培養細胞（例如T細胞），例如將編碼外源性受體的病毒載體（例如慢病毒載體）轉導至細胞之前、期間或之後。在一些實施例中，可以在導入基因編輯媒介物（例如，Cas9/gRNA RNP）之前、期間或之後孵育或培養所述細胞（例如，T細胞），例如在媒介物接觸細胞之前、期間或之後，或是在將媒介物遞送至細胞中（例如，藉由電穿孔）之前、期間或之後。在一些實施例中，孵育可以在導入編碼外源性受體的核酸分子和導入基因編輯劑（例如，Cas9/gRNA RNP）的情況下進行。在一些實施例中，所述方法包括在導入編碼外源性受體的核酸分子和基因編輯媒介物（例如，Cas9/gRNA RNP）之前使用刺激媒介物或活化媒介物（例如，抗CD3/抗CD28抗體）來活化或刺激細胞。
在一些實施例中，基因編輯媒介物（例如，Cas9/gRNA RNP）的導入是在導入編碼外源性受體的核酸分子之後。在一些實施例中，在導入媒介物之前，細胞係為靜息狀態（例如，藉由除去任何刺激物或活化物）。在一些實施例中，在導入媒介物之前，不除去刺激物或活化物和/或細胞激素。
G. 免疫細胞的來源
在擴增之前，免疫細胞的來源是從一受試者獲得，以進行離體操作。舉例而言，用於離體處理的目標細胞來源還可以包括自體的或異體捐贈者的血液、臍帶血或骨髓。舉例而言，免疫細胞的來源可以來自待用本發明的修飾免疫細胞進行治療的受試者，例如是該受試者的血液、臍帶血或骨髓。受試者的非限制性實例包括人、狗、貓、小鼠、大鼠及其轉基因物種。較佳地，受試者為人類。
免疫細胞可以從多種來源獲得，包括血液、周邊血液單核細胞、骨髓、淋巴結組織、脾臟組織、臍帶、淋巴或淋巴器官。免疫細胞是免疫系統的細胞，例如先天性或適應性免疫的細胞，例如，骨髓或淋巴類（lymphoid）細胞（包括淋巴細胞，典型地是T細胞和/或NK細胞）。其他示例性細胞包括幹細胞（例如，多功能型幹細胞和多潛能型幹細胞，包括誘導性多功能型幹細胞：iPSC）。在一些方面，該些細胞是人類細胞。關於待治療的受試者，細胞可以屬於同種異體的和/或自體的。該些細胞通常是原代細胞，例如直接從受試者分離和/或從受試者分離並冷凍的細胞。
在某些實施例中，免疫細胞是T細胞，例如CD8+ T細胞（例如，CD8+初級T細胞、中樞記憶T細胞或作用記憶T細胞）、CD4 + T細胞、天然殺手T細胞（NKT細胞）、調節性T細胞（Treg）、幹細胞記憶性T細胞、淋巴類前驅細胞、造血幹細胞、自然殺手細胞（NK細胞）或樹突細胞。在一些實施例中，細胞是單核球或顆粒細胞，例如骨髓細胞、巨噬細胞、嗜中性球、樹突細胞、肥大細胞、嗜酸性球和/或嗜鹼性球。在一個實施例中，目標細胞是誘導性多功能型幹細胞（iPS cell）或源自iPS細胞的細胞，例如由一個體產生的iPS細胞，其經過操作以改變（例如，誘導突變）或操縱一或多個目標基因的表現，並分化成例如T細胞，例如是如CD8 +初級T細胞、中樞記憶T細胞或作用記憶T細胞等CD8+ T細胞、CD4 + T細胞、幹細胞型記憶T細胞、淋巴類前驅細胞或造血幹細胞。
在一些實施例中，細胞包括T細胞或其他細胞類型的一或多個亞組，例如整個T細胞群體、CD4+細胞、CD8+細胞，及前述細胞的亞群，前述亞群可例如藉由功能、活化狀態、成熟度、分化潛力、擴增、再循環、定位和/或持續能力、抗原特異性、抗原受體類型、在特定器官或腔室中的存在情況、標記或細胞激素分泌圖譜和/或分化程度所定義。T細胞和/或CD4+和/或CD8 + T細胞的亞型和亞群為初級T（TN）細胞、作用T細胞（TEFF）、記憶T細胞，及前述細胞的亞型。舉例來說，該細胞可為幹細胞型記憶T細胞（TSCM）、中樞記憶T細胞（TCM）、作用記憶T細胞（TEM），或終末分化作用記憶T細胞、腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）、未成熟T細胞、成熟T細胞、輔助T細胞、細胞毒性T細胞、黏膜相關不變T（MAIT）細胞、天然存在及適應調節性T（Treg）細胞、輔助T細胞（例如，TH1細胞、TH2細胞、TH3細胞、TH17細胞、TH9細胞、TH22細胞、濾泡輔助型T細胞）、α/βT細胞和δ/γT細胞。在某些實施例中，其可以使用本領域可得的任何數量的T細胞株。
在一些實施例中，所述方法包括從受試者分離免疫細胞，並製備、加工、培養和/或改造這些細胞。在一些實施例中，改造細胞的製備包括一或多個培養和/或製備步驟。以前述方式改造的細胞可以從一樣品分離（例如，生物樣品（例如，從受試者獲得或從源自受試者的樣品）。在一些實施例中，分離出細胞的受試者是患有疾病、患有病症，需要細胞治療，或將採用細胞治療的受試者。在一些實施例中，受試者是需要特定治療干預（例如，以經分離、加工和/或改造的細胞進行的過繼性細胞療法）的人類。因此，在一些實施例中的細胞是原代細胞（例如，原代人類細胞）。樣品包括直接從受試者取得的組織、體液和其他樣品，以及由一或多個處理步驟（例如分離、離心、用病毒載體進行轉導等基因工程、洗滌，和/或培育）所產生的樣品。生物樣品可以是直接從生物來源獲得的樣品或經處理的樣品。生物樣品包括但不限於體液（例如，血液、血漿、血清、腦脊髓液、滑囊液、尿液和汗液）、組織和器官樣品，包括由其等衍生的經處理樣品。
在一些實施態樣中，衍生出或分離出細胞的樣品是血液或血液衍生的樣品，或為或來自於血球分離術或白血球去除術所得的產品。舉例來說，樣品可以是全血、周邊血液單核球（PBMCs）、白血球、骨髓、胸腺、組織活檢體、腫瘤、白血病、淋巴瘤、淋巴結、腸相關淋巴組織、黏膜相關淋巴組織、脾臟、其他淋巴組織、肝、肺、胃、腸、結腸、腎、胰腺、乳房、骨、前列腺、子宮頸、睾丸、卵巢、扁桃體或其他器官、和/或來源於其之細胞。在細胞療法（例如，過繼性細胞療法）之情況下，樣品包括來自自體和同種異體來源的樣品。
在一些實施例中，細胞源自於細胞株（例如，T細胞株）。 在一些實施例中，細胞係取自異種來源（例如，來自小鼠、大鼠、非人類靈長類動物和豬）。在一些實施例中，該些細胞之分離包括一或多個製備步驟和/或基於非親和性之細胞分離步驟。在一些實例中，對細胞進行洗滌、離心，和/或在一或多種試劑存在下培育，以例如除去不合需要之組分、富集所需組分、溶解或除去對特定試劑敏感之細胞。在一些實例中，其係基於一或多種性質（例如，密度，黏附性質、大小、敏感性和/或對特定組分之抗性）所分離出的細胞。
在一些實例中，來自受試者循環血液的細胞係藉由例如血球分離術或白血球分離術而獲得。在某些情況，樣品含有淋巴細胞（包括T細胞、單核細胞、顆粒細胞、B細胞、其他有核的白血球細胞）、紅血球和/或血小板，且在某些情況下會包括紅血球和血小板以外的細胞。在一些實施例中，係對自受試者收集的血液細胞進行洗滌（例如，除去血漿部分，並將細胞置於適合的緩衝液或培養基中，以用於後續的處理步驟）。在一些實施例中，係使用磷酸鹽緩衝鹽水（PBS）洗滌細胞。在一些方面，根據製造商的說明書，洗滌步驟係藉由切向流過濾（tangential flow filtration，TFF）來完成。在一些實施例中，細胞在洗滌後會再懸浮於各種生物相容性緩衝液中。在某些實施例中，會移除血液細胞樣品的組分，並將細胞直接再懸浮於培養基中。在一些實施例中，該等方法包括基於密度之細胞分離方法，例如，溶解紅血球並通過Percoll或Ficoll梯度離心而從周邊血液製備白血球。
在一個實施例中，來自個體循環血液的免疫細胞，係藉由血球分離術或白血球分離術所得。血球分離術的產物通常含有淋巴細胞（包括T細胞、單核球、顆粒球、B細胞、其他有核白血球細胞）、紅血球和血小板。由血球分離術所收集的細胞可以經過洗滌來去除血漿部分，並將細胞置於適合的緩衝液或培養基中（例如，磷酸鹽緩衝液（PBS）、缺乏鈣且可能缺乏鎂的洗滌液，或缺乏鈣且不含大多數二價陽離子的洗滌液），以用於後續的處理步驟。洗滌後，可以將細胞再懸浮在各種生物相容的緩衝液中，例如無鈣、無鎂的PBS。或者，可以去除血球分離術樣品中不合期望的成分，並將細胞直接再懸浮在培養液中。
在一些實施例中，分離方法包括基於一種或多種特定分子在細胞中之表現或存在來分離不同類型的細胞。前述特定分子可例如為表面蛋白、細胞內標誌物或核酸等的表面標誌物。在一些實施例中，其可利用任何已知基於這些標記物的分離方法。在一些實施例中，分離係基於親和力或免疫親和力而進行。舉例而言，在某些情況下，分離包括根據一或多種標記物（通常為細胞表面標記物）於細胞是否表現或其表現量，來分離細胞和細胞群體。舉例來說，其係藉由會與這些標記物特異性結合的抗體或結合搭配物一起培育，隨後通常進行洗滌步驟，並將結合至抗體或結合搭配物的細胞與未結合至抗體或結合搭配物的細胞進行分離。
此類分離步驟可基於正向篩選和/或基於負向篩選，正向篩選會保留已與試劑結合的細胞以供進一步的使用，而負向篩選會保留未與抗體或結合搭配物結合的細胞。在一些實例中，兩種部分皆被保留，以供進一步使用。在一些方面，當無法取得能夠從一混雜群體中特異性地識別出單一細胞類型的抗體的情況下，此時負向篩選的方式特別好用，因此，分離所根據的標記物最好是非目標群體細胞所表現的標記物。分離率不需要到達100％，也不需要完全去除特定的細胞群體或表現有特定標記物的細胞。舉例而言，特定類型細胞（例如，該些表現有標記物的細胞）的正向篩選或富集，係指增加這些細胞的數量或百分比，但不表示完全去除不表現該標記的細胞。同樣地，特定類型細胞（例如，該些表現有標記物的細胞）的負向篩選、去除或耗乏，是指減少這些細胞的數量或百分比，但無須完全去除這些細胞。
在一些實例中，會進行多次分離步驟，其係將一步驟所得出的正向篩選或負向篩選部分進行另一次的分離步驟（例如，隨後的正向篩選或負向篩選）。在一些實例中，單次的分離步驟能同時剔除表現不同標記物的細胞，例如將細胞與多個抗體或結合搭配物孵育，每個抗體或結合搭配物能夠特異性地辨識出負向篩選用的標記物。同樣地，可以將細胞與多種在各種細胞類型上表現的抗體或結合搭配物一起孵育，同時對多種細胞類型進行正向篩選。
在一些實施例中，一或多種T細胞群體係富含有或被剔除一或多種特定標誌物（例如表面標誌物）為陽性（標誌物+）或表現高水平（標誌物high ）的細胞，或富含有或剔除掉一或多個標記物為陰性（標記物-）或表現相對較低水平（標記物low ）的細胞。舉例而言，在一些方面，其係藉由正向或負向篩選技術來分離出T細胞的特定亞群。舉例來說，其可以是，一或多種表面標誌物為陽性或高表現量的細胞，例如是CD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD4+、CD8+、CD45RA+和/或CD45RO+ T細胞）。在某些情況下，這些標記物在某些T細胞群（例如，非記憶細胞）上不存在或其表現量較低，但這些標記物存在於其他某些T細胞群（例如，記憶細胞）中或其表現量較高。在一個實施例中，細胞（例如，CD8 +細胞或T細胞，例如是CD3 +細胞）富含有（即正向篩選出）CD45RO、CCR7、CD28、CD27、CD44、CD127和/或CD62L為陽性或高表面表現量的細胞，和/或被剔除掉（例如，用負向篩選以去除）CD45RA為陽性或高表面表現量的細胞。在一些實施例中，細胞富含有或被剔除掉CD122、CD95、CD25、CD27和/或IL7-Ra（CD127）為陽性或高表面表現量的細胞。在一些實例中，CD8+T細胞富含有CD45RO為陽性（或CD45RA陰性）及CD62L為陽性的細胞。舉例而言，可使用CD3/CD28綴合的磁珠（例如，DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T細胞擴增儀）正向篩選CD3+、CD28+ T細胞。
在一些實施例中，將T細胞與PBMC樣品分離的方式係對不會在T細胞（例如，B細胞、單核球或其他白血球）上表現的標記物（例如，CD14）進行反向篩選。在一些方面，係使用CD4+或CD8+篩選步驟來分離出CD4 +輔助細胞與CD8+細胞毒性T細胞。藉由對在一或多個初始、記憶和/或作用T細胞亞群上有表現或表現量較高的標記物進行正向或反向篩選，以將這些CD4+和CD8+群體進一步分選成亞群。在一些實施例中，舉例而言，藉由以基於與相應亞群相關的表面抗原進行正向或反向篩選，CD8+細胞會進一步富含或剔除掉初始、中樞記憶、作用記憶和/或中樞記憶幹細胞。在一些實施例中，會對中樞記憶T（TCM）細胞進行富集，以增加療效，例如改善投與後的長期存活率、擴增程度和/或移植狀況，在某些方面，這些亞群的療效尤其顯著。在一些實施例中，將富含有TCM的CD8 + T細胞和CD4 + T細胞合併起來，會進一步增強療效。
在一些實施例中，記憶T細胞存在於CD8+周邊血液淋巴細胞的CD62L+和CD62L-這兩個亞群中。PBMC可富含有或被剔除掉CD62L-CD8 +和/或CD62L + CD8 +部分，例如使用抗CD8和抗CD62L抗體。在一些實施例中，CD4+ T細胞群體和/或CD8+ T群體（例如，亞群）會富含有中樞記憶（TCM）細胞。在一些實施例中，中樞記憶T（TCM）細胞之富集係基於CD45RO、CD62L、CCR7、CD28、CD3和/或CD127為陽性或有高表面表現量；在某些情況，前述細胞的富集係基於對表現或高度表現有CD45RA和/或顆粒酶B的細胞進行負向篩選。在某些情況下，其係藉由剔除掉表現有CD4、CD14、CD45RA的細胞以及對表現有CD62L的細胞進行正向篩選或富集，來分離出富含有TCM細胞的CD8+群體。在一個方面，中樞記憶T（TCM）細胞之富集是藉由以下方式進行：選出沒有CD4表現的細胞，將其作為起始物，接著以CD14和CD45RA的表現進行負向篩選，並且以CD62L進行正向篩選。在某些情況下，前述篩選是同時進行的，而在其他情況是依序進行，但其順序不拘。在一些方面，用在製備CD8+細胞群體或亞群過程中針對CD4表現進行篩選的相同步驟也會用在產生CD4+細胞群體或亞群的過程中，致使針對以CD4進行分離後，且視情況在一或多個進一步的正向或負向篩選步驟之後，陽性和陰性部分兩者都會保留下來，且其會用於所述方法的後續步驟中。
藉由鑑定具有細胞表面抗原的細胞群體來將CD4+T輔助細胞分選為初級、中樞記憶和作用細胞。CD4 +淋巴球可以藉由標準方法獲得。在一些實施例中，初級CD4+T淋巴球是CD45RO-、CD45RA +、CD62L +、CD4+T細胞。在一些實施例中，中樞記憶CD4 +細胞是CD62L +和CD45RO +。在一些實施例中，作用CD4 +細胞是CD62L-和CD45RO。在一個實例中，為了以負向篩選來富集出CD4 +細胞，所用的單株抗體混合物通常會包括抗-CD14、抗-CD20、抗-CD11b、抗-CD16、抗-HLA-DR和抗-CD8的抗體。在一些實施例中，抗體或結合搭配物係結合於固體載體或基質（例如，磁珠或順磁珠），以便在正向和/或負向篩選中分離細胞。
在一些實施例中，細胞在基因改造前或於基因改造過程中進行培育和/或培養。培育步驟可以包括培養（culture、cultivation）、刺激、活化和/或繁殖。在一些實施例中，組合物或細胞會孵育於具有刺激條件或刺激劑的環境下。孵育的條件包括經設計以誘導群體發生細胞增殖、擴增、活化和/或存活、經設計以模擬抗原暴露和/或使細胞俾便進行基因改造（例如，導入重組抗原受體）等條件。前述條件可以包括一或多種特定的培養基、溫度、氧氣含量、二氧化碳含量、時間、試劑（例如，營養素、胺基酸、抗生素、離子）和/或刺激因子（例如，細胞激素、趨化因子、抗原、結合搭配物、融合蛋白、重組的可溶性受體、和其他任何經設計用於活化細胞的試劑。在一些實施例中，刺激條件或試劑包括一或多種能夠活化T細胞受體複合體細胞其信號傳導結構域的試劑（例如，配位體）。在一些方面，試劑會開啟或起始T細胞中之TCR/CD3細胞內信號傳導級聯。此類試劑可以包括抗體和/或一種或多種細胞激素。前述抗體可以是對T細胞受體的單元和/或共刺激受體有特異性的抗體，例如，抗CD3、抗CD28抗體，且可例如結合於固體載體（如珠子）上。視情況，擴增方法可以進一步包括向培養液中添加抗CD3和/或抗CD28抗體（例如，以至少約0.5奈克（ng）/毫升（mL）之濃度添加）的步驟。在一些實施例中，刺激劑包括IL-2和/或IL-15。舉例來說，刺激劑包括濃度為至少約10個單位/毫升（mL）的IL-2。
在另一個實施例中，T細胞係以溶解紅血球並剔除單核球（例如藉由PERCOLLTM 梯度離心）的方式從周邊血液分離出來的。或者，T細胞可以從臍帶分離出來。無論如何，以正向或負向篩選技術可以進一步分離出來特定的T細胞亞群。
以前述方式所分離到的臍帶血單核球可以被剔除掉表現某些抗原的細胞，包括但不限於CD34，CD8，CD14，CD19和CD56。剔除掉這類細胞可以使用下列形式的抗體來達成：經分離的抗體、包含有抗體的生物樣品（如腹水）、與物理性支持物結合的抗體、以及，與細胞結合的抗體。
以負向篩選方式來富集T細胞群體，可以使用被負向篩選過的細胞所特有表面標記物的抗體組合。較佳的方法為以負向磁性免疫黏附或流式細胞儀來進行的細胞分流及/或篩選，其係使用一單株抗體混合物，而該單株抗體混合物係針對會表現於經負向選擇過的細胞其細胞表面標記物。舉例而言，為了以負向篩選方式來富集CD4+細胞，所使用的單株抗體混合物通常包括抗CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR及CD8之抗體。
為了要正向或負向選擇來分離出所需的細胞群體，可以使用不同的細胞及表面（例如珠子等顆粒物）之濃度。在某些實施例中，其可能會顯著降低珠粒及細胞混合後的體積（即增加細胞之濃度），以確保細胞與珠粒的接觸量最大化。舉例而言，在一實施例中，其係使用20億個細胞/毫升之濃度。在一實施例中，其係使用10億個細胞/毫升之濃度。在另一實施例中，其係使用大於100百萬個細胞/毫升之濃度。在另一實施例中，其係使用10百萬、15百萬、20百萬、25百萬、30百萬、35百萬、40百萬、45百萬或50百萬個細胞/毫升之細胞濃度。在又一實施例中，其係使用75百萬、80百萬、85百萬、90百萬、95百萬或100百萬個細胞/毫升之細胞濃度。在另一實施例中，其可使用125百萬或150百萬個細胞/毫升之濃度。利用高濃度可增加細胞產率、細胞活化程度提高及細胞擴增情況更好。
T細胞亦可在洗滌步驟後進行冷凍，且其中不需要移除單核球的步驟。不希望受限於理論，冷凍及後續解凍步驟藉由在細胞群體中移除顆粒球以及一定程度的單核球會提供更均勻之產物。在經過移除血漿及血小板之洗滌步驟後，可將細胞懸浮於冷凍溶液中。儘管許多冷凍溶液及參數為本領域所習知且可用於本文，但在非限制性實例中，其中一種方法係涉及利用含有20% DMSO及8%人類血清白蛋白之PBS，或含有其他適宜的細胞冷凍介質。之後，以1℃/分鐘之速率將細胞冷凍至-80℃，且將其儲存在液氮儲存罐之氣相中。前述細胞冷凍過程可使用其他經控制的冷凍方法，也可用不受控地在-20℃下或液氮中的立即冷凍法。
在一個實施例中，T細胞群體包含在例如周邊血單核球、臍帶血細胞，純化的T細胞群體及T細胞株等細胞內。在另一個實施例中，周邊血單核球包含T細胞群體。在又一個實施例中，純化的T細胞包含T細胞群體。
在某些實施例中，調節T細胞（Treg）可以從一樣品中分離出來。 該樣品可以包括但不限於臍帶血或周邊血。在某些實施例中，調節T細胞係藉由流式細胞術分選所分離到的。在分離之前，可藉由本領域已知的任何方式對樣品中的調節T細胞進行富集。經分離的調節T細胞可以在使用前進行冷凍保存和/或擴增。分離調節T細胞的方法係描述於美國專利號7,754,482、8,722,400和9,555,105以及美國專利申請號13/639,927中，這些文獻的整體內容以引用方式而納入本文。
H. 免疫細胞擴增
不論是在將細胞修飾以表現T細胞受體和/或切換受體之前或之後，該細胞可使用例如以下專利中所述之方法進行活化及擴增：美國專利號6,352,694、6,534,055、6,905,680、6,692,964、5,858,358、6,887,466、6,905,681、7,144,575、7,067,318、7,172,869、7,232,566、7,175,843、5,883,223、6,905,874、6,797,514、6,867,041，及美國專利申請公開案第20060121005號。舉例而言，本發明的T細胞可藉由與表面接觸來擴增，該表面附接有一介質與一配體，該介質會刺激CD3/TCR複合體相關信號，該配體會刺激T細胞表面上的共刺激分子。具體而言，T細胞群體可以如下方式刺激：藉由與抗CD3抗體或其抗原結合片段接觸，或固定在一表面上的抗CD2抗體接觸，或接觸與鈣離子載體（calcium ionophore）結合的蛋白激酶C活化劑（例如苔蘚蟲素，bryostatin）來刺激。為了要共刺激T細胞表面上的輔助分子，係使用結合輔助分子之配體。舉例而言，可在適於刺激免疫細胞增殖之條件下使T細胞群體與抗CD3抗體及抗CD28抗體接觸。抗CD28抗體之實例包括9.3、B-T3、XR-CD28 (Diaclone，Besançon，France)，其可用於本發明，而其他本領域通常已知的方法也同樣適用（見Berg等人，Transplant Proc. (1998) 30(8): 3975-3977；Haanen等人，J. Exp. Med. (1999) 190(9): 1319-1328；Garland等人，J. Immunol. Methods (1999) 227(1-2): 53-63）。
以本文所揭露了方法來擴增T細胞，其可增加約10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、2000倍、3000倍、4000倍、5000倍、6000倍、7000倍、8000倍、9000倍、10,000倍、100,000倍、1,000,000倍、10,000,000倍或更多，以及可以是前述數值間的任一、所有、全部，或部分整數之倍數。在一個實施例中，T細胞擴增範圍為約20倍至約50倍之間。
培養後，T細胞可以在培養裝置中的細胞培養基中培育一段時間，或者直到細胞達到匯合程度（confluency）或高細胞密度，以便在細胞繼代至另一個培養裝置之前達到最佳繼代。培養裝置可以是任何常用於體外培養細胞的培養裝置。較佳地，在將細胞繼代到另一個培養裝置之前，匯合程度為70％或更高。更佳地，匯合程度為90％或更高。一段時間可以是任何適合體外培養細胞的時間。於T細胞培養過程中，可在任何時間更換T細胞培養基。較佳地，每2至3天更換一次T細胞培養基。接著，從培養裝置中收取T細胞，然後T細胞可立即使用或冷凍保存以供以後使用。在一個實施例中，本發明包括冷凍經擴增的T細胞。在將核酸導入其中之前，冷凍保存的T細胞會預先解凍。
在另一個實施例中，本文的方法包括分離T細胞和擴增T細胞。在另一個實施例中，本發明進一步包括在擴增之前冷凍T細胞。在又一個實施例中，將低溫保存的T細胞解凍，以用於將編碼有T細胞受體和/或切換受體的RNA進行電穿孔。
另一種離體擴增細胞的方法，係描述於美國專利第5,199,942號中（以引用方式納入本文）。例如美國專利第5,199,942號中所描述的擴增方式可為本發明擴增方法的替代形式或與其他擴增方式一起使用。簡言之，T細胞之離體培養及擴增可包括添加例如美國專利第5,199,942號中所描述的細胞生長因子或其他因子，例如flt3-L、IL-1、IL-3及c-kit配體。在一個實施例中，T細胞之擴增包括將T細胞與選自於由flt3-L、IL-1、IL-3及c-kit所組成之群組的因子一起培養。
本文所述的培養步驟（與如本文所述的與試劑接觸或於電穿孔之後）時間可以非常短，舉例而言，小於24小時，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、或23小時。如本文進一步描述的培養步驟（與本文所述的試劑接觸）可以更長，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多天。
本文係使用各種術語來描述培養中的細胞。細胞培養通常意指從活生物體中取出並在受控條件下生長的細胞。原代細胞培養是直接從生物體中取出的細胞、組織或器官，並在進行第一次繼代培養之前的培養。當細胞在促進細胞生長和/或分裂的條件下置於生長培養基中時，它們會在培養中擴增，產生更大量的細胞。當細胞在培養中擴增時，細胞增殖速率通常藉由細胞數量翻倍所需的時間量來測量，又稱為倍增時間。
每一輪的繼代培養被稱為一次繼代。當細胞進行繼代培養時，它們被稱為已經繼代。特定的細胞群體或細胞株有時以其繼代的次數來稱呼或表徵。舉例而言，已經繼代十次的經培養細胞群體可以被稱為P10培養。原代培養，即從組織中分離細胞後的第一次培養被命名為P0。在第一次繼代培養之後，將細胞描述為次代培養（P1或第1代）。第二次繼代培養後，細胞成為第三代培養（P2或第2代）等等。本領域技術人員能理解，在繼代期間可能有許多次的群體倍增；因此培養的群體倍增次數大於繼代次數。繼代間細胞的擴增情況（即群體倍增次數）取決於許多因素，包括但不限於接種密度、基質、培養基和繼代間的時間。
在一實施例中，可將細胞培養若干小時（約3小時）至約14天或其間之任何整數的小時數。適用於T細胞培養之條件包括可含有增殖及存活所需因子之適當培養基（例如最小必需培養基或RPMI培養基1640或X-vivo 15 (Lonza)），該等因子包括血清（例如，胎牛或人類血清）、介白素-2（IL-2）、胰島素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGFβ及TNF-α，或其他任何熟習此項技術者已知用於細胞生長的添加劑。其他用於細胞生長的添加劑包括但不限於表面活性劑、血漿蛋白（plasmanate）及還原劑（例如N-乙醯基-半胱胺酸及2-巰基乙醇）。培養基可包括RPMI 1640、AIM-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo 15及X-Vivo 20、Optimizer、並含有胺基酸、丙酮酸鈉及維生素，且可不含血清，或可添加有適量血清（或血漿）、或一預設的激素群，及/或足使T細胞生長及擴增的細胞激素。抗生素（例如，青黴素及鏈黴素）僅在實驗培養物中添加，而不包括在欲輸注至受試者中之細胞培養物中。目標細胞被維持在支持生長所需之條件下，例如適宜溫度（例如，37℃）及氣體環境（例如，添加5% CO2 的空氣）。
用於培養T細胞的培養基可以包括可共刺激T細胞的試劑。舉例而言，可以刺激CD3的試劑是抗-CD3的抗體，可以刺激CD28的試劑是抗-CD28的抗體。經由本文公開的數據所證明，藉由本發明公開的方法所分離的細胞可以擴增約10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、2000倍、3000倍、4000倍、5000倍、6000倍、7000倍、8000倍、9000倍、10,000倍、100,000倍、1,000,000倍、10,000,000倍或更大。在一個實施例中，培養經過電穿孔處理的群體，T細胞擴增約20倍至約50倍，或更多。在一個實施例中，人類調節T細胞的擴增係藉由披載有抗CD3抗體的KT64.86人工抗原呈現細胞（aAPC）來進行。用於擴增活化T細胞的方法可以在美國專利號7,754,482、8,722,400和9,555,105中找到，此些文獻的整體內容以引用方式而納入本文。
在一個實施例中，擴增T細胞的方法可以進一步包括分離經擴增的T細胞，以供進一步應用。在另一個實施例中，擴增方法可以進一步包括將擴增過T細胞進行後續的電穿孔，然後進行培養。後續的電穿孔可以包括將編碼有介質的核酸導入到擴增的T細胞群中，例如，轉導擴增的T細胞、轉染擴增的T細胞、或以電穿孔的方式將核酸導入擴增的T細胞，其中所述介質會進一步刺激T細胞。試劑可以刺激T細胞，例如藉由刺激其進一步的擴增、效用功能或另一種T細胞功能。
I. 治療方法
本發明所述的經修飾免疫細胞（例如，T細胞）可以含括在用於免疫治療的組合物中。該組合物可以包括一醫藥組合物，並且還可包括一醫藥上可接受的載體。包括有經修飾T細胞的醫藥組合物，可以一治療有效量的方式進行投與。
在一個方面，本發明包括進行過繼性細胞轉移治療的方法，其包括將本發明的修飾T細胞投與至需要的個體（例如，T細胞）。另一方面，本發明包括治療個體疾病或病症的方法，其包括將經修飾T細胞群體投與至有需要的個體。
本發明更包括在有需要的一個體中治療疾病或病症的方法，包括將基因編輯修飾細胞（例如，基因編輯修飾的T細胞）投予至個體。在一個實施例中，在有需要的一個體中治療疾病或病症的方法包括將具有外源性T細胞受體的基因編輯修飾細胞（例如，基因編輯修飾的T細胞，其具有對目標細胞上的NY-ESO-1具有親和力的外源性T細胞受體）投予至個體。在一個實施例中，在有需要的一個體中治療疾病或病症的方法包括將具有外源性T細胞受體以及切換受體的基因編輯修飾細胞（例如，基因編輯修飾的T細胞，其具有對目標細胞上的NY-ESO-1具有親和力的外源性T細胞受體以及PD1-CD28切換受體）投予至個體。
本發明還提供了在有需要的一個體中治療癌症的方法，包括將含有任何本發明經修飾T細胞的組合物投予至個體。
在一實施例中，本發明包括一種在有需要的一個體中治療多發性骨髓瘤的方法。所述方法包括對個體施予淋巴細胞刪除性化療（lymphodepleting chemotherapy），包括有效量的環磷醯胺和經修飾的T細胞。經修飾的T細胞包括對目標細胞上的NY-ESO-1有親和力的外源性T細胞受體。外源性T細胞受體包括T細胞受體α鏈以及T細胞受體β鏈，所述T細胞受體α鏈包括SEQ ID NO：5所示之胺基酸序列，所述T細胞受體β鏈包括SEQ ID NO：12所示之胺基酸序列。所述T細胞在包括SEQ ID NO：128所示之核酸序列的一內源性T細胞受體α鏈的編碼序列中、在包括SEQ ID NO：129所示之核酸序列的一內源性T細胞受體β鏈的編碼序列中、以及在包括SEQ ID NO：130所示之核酸序列的一內源性PD1編碼序列中，也有至少一核苷酸取代、缺失、插入和/或插入/缺失。所述內源性T細胞受體α鏈的編碼序列、內源性T細胞受體β鏈的編碼序列和內源性PD1編碼序列的表現被下調。
在另一方面，本發明包括一種在有需要的一個體中治療黑色素瘤、滑膜肉瘤或黏液樣/圓形細胞脂肪肉瘤的方法。所述方法包括對個體施予淋巴細胞刪除性化療，包括有效量的環磷醯胺和有效量的氟達拉濱和經修飾的T細胞。經修飾的T細胞包括對目標細胞上的NY-ESO-1有親和力的外源性T細胞受體。外源性T細胞受體包括T細胞受體α鏈以及T細胞受體β鏈，所述T細胞受體α鏈包括SEQ ID NO：5所示之胺基酸序列，所述T細胞受體β鏈包括SEQ ID NO：12所示之胺基酸序列。T細胞在包括SEQ ID NO：128所示之核酸序列的一內源性T細胞受體α鏈的編碼序列中、在包括SEQ ID NO：129所示之核酸序列的一內源性T細胞受體β鏈的編碼序列中、以及在包括SEQ ID NO：130所示之核酸序列的一內源性PD1編碼序列中，也有至少一核苷酸取代、缺失、插入和/或插入/缺失。所述內源性T細胞受體α鏈的編碼序列、內源性T細胞受體β鏈的編碼序列和內源性PD1編碼序列的表現被下調。
過繼細胞療法的免疫細胞投予方法是已知的，並且可以與本發明提供的方法和組合物併用。舉例而言，過繼T細胞治療方法係描述於例如Gruenberg等人的美國專利申請公開號2003/0170238；Rosenberg的美國專利號4,690,915；Rosenberg（2011）Nat Rev Clin Oncol.8（10）：577-85。另參見，例如，Themeli等人，（2013）Nat Biotechnol.31（10）：928-933；Tsukahara等人，（2013）Biochem Biophys Res Commun 438（1）：84-9；Davila等人，（2013）PLoS ONE 8（4）：e61338。在一些實施例中，細胞療法（例如，過繼性T細胞療法）係藉由自體移植進行，其中細胞係從欲接受細胞療法的個體（或者來自個體的樣品中）中分離和/或以其他方式製備。因此，在一些方面，細胞係來自需要治療的個體（例如，病患），並且在分離和處理後將細胞投與至同一個體。
在一些實施例中，細胞療法（例如，過繼性T細胞療法）藉由異體移植進行，其中細胞係從欲接受或最終接受細胞治療的個體（例如，第一個體）以外的個體中分離和/或以其他方式製備。在這些實施例中，該細胞後來係被投與至相同物種的不同個體（例如，第二個體）。在一些實施例中，第一和第二個體在基因上是相同的。在一些實施例中，第一和第二個體在基因上是相似的。在一些實施例中，第二個體表現與第一個體相同的HLA類型或超類型。
在一些實施例中，在將細胞或含有細胞的組合物投與至個體之前，用針對該疾病或病症（例如，腫瘤）的治療劑治療個體。在一些方面，個體對其他治療劑有抗性或無反應。在一些實施例中，例如在用另一種治療干預治療後，個體患有持續性或複發性疾病，包括，化療、放療和/或造血幹細胞移植（HSCT，如異體HSCT）。在一些實施例中，儘管個體已對另一種療法產生抗性，但前述投與仍有效地治療了個體。
在一些實施例中，個體對其他治療劑有反應，且以該治療劑進行治療減少了疾病負擔。在一些方面，個體最初對治療劑有反應，但該疾病或病症隨著時間而復發。在一些實施例中，個體並未復發。在一些這樣的實施例中，個體被認定有復發風險（例如，高風險復發），因此以預防性的方式將細胞投與（例如，降低復發的可能性或防止複發）。在一些方面，個體未接受過另一種治療劑的預先治療。
在一些實施例中，例如在用另一種治療干預治療後，該個體患有持續性或複發性疾病，包括化療、放療和/或造血幹細胞移植（HSCT，如異體HSCT）。在一些實施例中，儘管個體已對另一種療法產生抗性，但前述投與仍有效地治療了個體。
本發明的經修飾的免疫細胞可被投與至動物以治療癌症，所述動物較佳為哺乳動物，更佳為人。此外，本發明的細胞可用來治療與癌症有關的任何病症，尤其是針對腫瘤細胞的細胞介導的免疫反應，其中需要的是治療或減輕疾病。用本發明的經修飾細胞或醫藥組合物治療的癌症類型包括上皮細胞癌（carcinoma）、胚細胞瘤（blastoma）和肉瘤（sarcoma），以及某些白血病或淋巴惡性腫瘤、良性和惡性腫瘤（malignant tumors/malignancies，例如肉瘤，上皮細胞癌和黑色素瘤）。其他示例性癌症包括但不限於乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、子宮頸癌、皮膚癌、胰腺癌、結腸直腸癌、腎癌、肝癌、腦癌、淋巴瘤、白血病、肺癌、甲狀腺癌等。癌症可以是非實體瘤（例如，血液腫瘤）或實體瘤。也包括成人腫瘤/癌症和兒科腫瘤/癌症。在一個實施例中，癌症是實體瘤或血液腫瘤。在一個實施例中，癌症是上皮細胞癌。在一個實施例中，癌症是肉瘤。在一個實施例中，癌症是白血病。在一個實施例中，癌症是實體瘤。
實體瘤是通常不包括囊腫或液體區域的異常組織塊。實體瘤可以是良性或惡性的。不同類型的實體瘤是以形成它們的細胞類型來命名（例如，肉瘤、上皮細胞癌和淋巴瘤）。諸如肉瘤和上皮細胞癌的實體瘤實例包括纖維肉瘤、黏液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、骨肉瘤和其他肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結腸癌、淋巴惡性腫瘤、胰腺癌、乳腺癌、肺癌症、卵巢癌、前列腺癌、肝細胞癌、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、甲狀腺髓樣癌、乳頭狀甲狀腺癌、嗜鉻細胞瘤皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、髓樣癌、支氣管癌、腎細胞癌、肝癌、膽管癌、絨毛膜癌、威爾姆氏腫瘤（Wilms' tumor）、子宮頸癌、睾丸腫瘤、精原細胞瘤、膀胱癌、黑色素瘤和中樞神經系統腫瘤（例如，如腦幹膠質瘤和混合膠質瘤等腦膠質瘤、膠質母細胞瘤—又稱多形性膠質母細胞瘤、星形細胞瘤、中樞神經系統淋巴瘤、生殖細胞瘤，神經管胚細胞瘤、神經鞘瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、血管母細胞瘤、聽神經瘤、寡突神經膠質瘤、血管瘤、神經母細胞瘤、視網膜母細胞瘤和腦轉移瘤）。
可藉由本文方法來治療的惡性腫瘤包括但不限於食道癌、肝細胞癌、基底細胞癌（一種皮膚癌）、鱗狀細胞癌（各種組織）、膀胱癌（包括過渡性上皮細胞癌，其為一種膀胱的惡性增生）、支氣管肺癌、結腸癌、結直腸癌、胃癌、肺癌（包括肺的小細胞癌和非小細胞癌）、腎上腺皮質癌、甲狀腺癌、胰腺癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓樣癌、腎細胞癌、原位導管癌或膽管癌、絨毛膜癌、精原細胞瘤、胚胎癌、腎母細胞瘤、子宮頸癌、子宮癌、睪丸癌、成骨癌、上皮癌和鼻咽癌。
在某些示例性實施例中，本發明的經修飾免疫細胞是用來治療骨髓瘤或與骨髓瘤相關的病症。骨髓瘤或與其相關病症的實例包括但不限於輕鏈骨髓瘤、非分泌性骨髓瘤、意義不明單株伽瑪球蛋白症（monoclonal gamopathy of undertermined significance，MGUS）、漿細胞瘤（例如，孤立性、多發性、髓外漿性細胞瘤）、澱粉樣變性和多發性骨髓瘤。在一個實施例中，本發明方法是用來治療多發性骨髓瘤。在一個實施例中，本發明的方法是用來治療難治性骨髓瘤（refractory myeloma）。在一個實施例中，本發明的方法是用來治療復發性骨髓瘤。
在某些示例性實施例中，本發明的經修飾免疫細胞是用來治療黑色素瘤或與黑色素瘤相關的病症。黑色素瘤或與其相關病症的實例包括但不限於表面擴散性黑色素瘤、結節性黑色素瘤、惡性雀斑樣黑色素瘤（lentigo maligna melanoma）、肢端黑色素瘤、無黑色素的黑色素瘤或皮膚黑色素瘤（例如，皮膚、眼睛、外陰部、陰道、直腸的黑色素瘤）。在一個實施例中，本發明的方法是用來治療皮膚黑色素瘤。在一個實施例中，本發明的方法是用來治療難治性黑色素瘤。在一個實施例中，本發明的方法是用來治療復發的黑色素瘤。
在其他另外的示例性實施例中，本發明的經修飾免疫細胞是用來治療肉瘤或與肉瘤相關的病症。肉瘤或與其相關病症的實例包括但不限於血管肉瘤、軟骨肉瘤、脊索瘤、尤因氏肉瘤、內皮細胞肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內皮肉瘤、纖維肉瘤、胃腸間質瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、間皮瘤、惡性周邊神經鞘瘤、黏液肉瘤、骨源性肉瘤、骨肉瘤、多形性肉瘤、橫紋肌肉瘤、滑膜肉瘤、滑膜瘤、和其他軟組織肉瘤。在一個實施例中，本發明的方法是用來治療滑膜肉瘤。在一個實施例中，本發明的方法是用於治療脂肪肉瘤（例如，黏液樣/圓形細胞脂肪肉瘤、分化/去分化脂肪肉瘤和多形性脂肪肉瘤）。在一個實施例中，本發明的方法是用於治療黏液樣/圓形細胞脂肪肉瘤。在一個實施例中，本發明的方法是用於治療難治性肉瘤。在一個實施例中，本發明的方法用於治療復發性肉瘤。
在一些實施例中，向個體提供二級治療。二級治療包括但不限於化療、放療、手術和藥物治療。
本發明的細胞可以以適當的臨床前和臨床實驗和試驗中所確定的劑量和途徑投與。細胞組合物可以在這些範圍內的劑量下多次投與。本發明細胞的投與可以如本領域技術人員所確定的與用來治療期望疾病或病症的其他方法併用。
就接受治療的個體而言，待投與的本發明的細胞可以是自體的。
本發明細胞的投與可以任何本領域技術人員已知的方便方式來進行。本發明的細胞可藉由氣霧吸入、注射、攝取、輸注、植入或移植的方式投與個體。本文所述的組合物可以經動脈、皮下、皮內、瘤內、結節內、髓內、肌內、靜脈內（i.v.）注射或腹膜內的方式投與。在其他情況下，本發明的細胞係直接注射到個體的發炎部位、個體的局部疾病部位、淋巴結、器官、腫瘤等。
在一些實施例中，細胞係以所需劑量投與，其在某些實施態樣中包括所需劑量或數量的細胞或細胞類型和/或所需比例的細胞類型。因此，在一些實施例中，細胞劑量是基於細胞總數（或每千克體重的數量）以及單一群體或亞型的所需比例（例如，CD4 +與CD8 +的比率）。在一些實施例中，細胞劑量是基於單一群體或單一細胞類型中所需的細胞總數（或每千克體重的數量）。在一些實施例中，劑量是基於以下這些特徵的組合，例如總細胞的所需數量、單一群體中所需比例和所需細胞總數。
在一些實施例中，細胞的群體或亞型（例如，CD8+ 和CD4+ T細胞）在總體細胞的期望劑量（例如，期望劑量的T細胞）的容許差異或容許差異之內投與。在一些方面，所需劑量是所需的細胞數目或被投與細胞的個體其每單位體重的所需細胞數目或所需數目的細胞（例如，細胞/公斤）。某些實施態樣中，所需劑量等於或高於最小細胞數或每單位體重的最小細胞數。在某些實施態樣中，在以所需劑量投與的總體細胞中，單一群體或亞型是以期望或接近期望的輸出比率（output ratio，例如CD4+ 與CD8+ 的比率）存在（例如，在一比率的特定容許差異或誤差內）。
在一些實施例中，該細胞是在一或多種單一群體或亞型細胞的所需劑量（例如，CD4+細胞的所需劑量和/或CD8 +細胞的所需劑量）的容許差異或容許差異之範圍內投予。某些實施態樣中，所需劑量是所需的亞型或群體細胞數目或被投與細胞的個體的每單位體重的所需的這些細胞數目（例如，細胞/千克）。在某些實施態樣中，所需劑量等於或高於群體或亞型的最小細胞數，或每單位體重的群體或亞型的最小細胞數。因此，在一些實施例中，劑量是基於總體細胞的所需固定劑量和所需比例、和/或是基於例如單一亞型或亞群體中的一或多個（例如，每個）的所需固定劑量。因此，在一些實施例中，劑量是基於T細胞的所需固定劑量或最小劑量和CD4+ 與CD8+ 細胞的所需比例、和/或是基於CD4+ 和/或CD8+ 細胞的所需固定劑量或最小劑量。
在一些實施例中，細胞或細胞亞型的單一群體是以約100萬至約1000億個細胞的範圍投與至個體，例如，100萬至約500億個細胞（例如，約500萬個細胞、約2500萬個細胞、約5億個細胞、約10億個細胞、約50億個細胞、約200億個細胞、約300億個細胞、約400億個細胞或者上述任兩個數值所定義的範圍），舉例來說，約1000萬至約1000億個細胞（例如，約2000萬個細胞、約3000萬個細胞、約4000萬個細胞、約6000萬個細胞、約7000萬個細胞、約8000萬個細胞、約9000萬個細胞、約100億個細胞、約250億個細胞、約500億個細胞、約750億個細胞、約900億個細胞或者上述何兩個數值所定義的範圍），且在一些情況下是約1億個細胞至約500億個細胞（例如，約1.2億個細胞、約2.5億個細胞、約3.5億個細胞、約4.5億個細胞、約6.5億個細胞、約8億個細胞、約9億個細胞、約30億個細胞、約300億個細胞、約450億個細胞），或這些範圍之間的任何數值。
在一些實施例中，總體細胞劑量和/或單一亞群的細胞劑量是在或約在1×105 個細胞/千克至約1×1011 個細胞/千克、104 和在或約在1011 個細胞/千克（kg）體重之間的範圍內，例如，105 個細胞/千克體重至106 個細胞/千克體重之間（例如，在或約在1×105 個細胞/千克、1.5×105 個細胞/千克、2×105 個細胞/千克、或1×106 個細胞/千克體重）。舉例而言，在一些實施例中，細胞係在或約在以下範圍之特定誤差範圍內的數量來投與，例如在約104 個T細胞/千克（kg）體重及約109 個T細胞/千克（kg）體重之間，例如105 個T細胞/千克體重及106 個T細胞/千克體重之間，例如在或約在1×105 個T細胞/千克、1.5×105 個T細胞/千克、2x105 個T細胞/千克、或1x106 個T細胞/千克。在其他示例性實施例中，用於本發明內容的方法的經修飾細胞的適合劑量範圍包括但不限於約1×105 個細胞/千克至約1×106 個細胞/千克、約1×106 個細胞/千克至約1×107 個細胞/千克、約1×107 個細胞/千克至約1×108 個細胞/千克、約1×108 個細胞/千克至約1×109 個細胞、約1×109 個細胞/千克至約1×1010 個細胞/千克、約1×1010 個細胞/千克至約1×1011 個細胞/千克。在一個示例性實施例中，用於本發明內容的方法的適合劑量為約1×108 個細胞/千克。在一個示例性實施例中，用於本發明內容的方法的適合劑量為約1×107 個細胞/千克。在其他實施例中，適合的劑量為約1×107 總細胞至約5×107 總細胞。在一些實施例中，適合的劑量為約1×108 總細胞至約5×108 總細胞。在一些實施例中，適合的劑量為約1.4×107 總細胞至約1.1×109 總細胞。在一個示例性實施例中，用於本文方法的適合劑量為約7×109 總細胞。
在一些實施例中，細胞係在或約在以下範圍的一定的誤差內投與，在或約在104 和109 之間的CD4+ 和/或CD8+ 細胞/千克（kg）體重，例如105 和106 之間個CD4+ 和/或CD8+ 細胞/千克體重，例如，約1×105 個CD4+ 和/或CD8+ 細胞/千克、1.5×105 個CD4+ 和/或CD8+ 細胞/千克、2×105 個CD4+ 和/或CD8+ 細胞/千克、或1×106 個CD4+ 和/或CD8+ 細胞/千克體重。在一些實施例中，細胞在一定誤差範圍內或大於、和/或至少約1×106 、約2.5×106 、約5×106 、約7.5×106 、9×106 個CD4+ 細胞和/或至少約1×106 、約2.5×106 、約5×106 、約7.5×106 、或約9×106 個CD8+細胞和/或至少約1×106 、約2.5×106 、約5×106 、約7.5×106 、或約9×106 個T細胞的劑量投與。在一些實施例中，細胞係在以下範圍的一定誤差範圍內投與，約108 和之間1012 之間、或大約1010 和1011 之間、約109 和1012 之間、或大約1010 和1011 之間個CD4+ 細胞和/或約108 至1012 之間或約1010 至1011 之間個CD8+ 細胞。
在一些實施例中，細胞在多種細胞群或亞型（例如，CD4+和CD8+細胞或亞型）的所需輸出比率或所需輸出比率的容許範圍內投與。在一些方面，所需比率可以是特定比率或可以是比率的一個範圍，舉例而言，在一些實施例中，所需比率（例如，CD4+ 與CD8+ 細胞的比率）為是在或約在5：1和5：1之間（或大於約1：5且小於約5：1）之間、或者在1：3和3：1之間或約1：3和3：1之間（或大於約1：3且小於約3：1），例如在2：1和1：5之間或約2：1和約1：5之間（或大於約1：5且小於約2：1）之間，例如約5：1、4.5：1、4：1、3.5：1、3：1、2.5：1、2：1、1.9：1、1.8：1、1.7：1、1.6：1、1.5：1 ，1.4：1、1.3：1、1.2：1、1.1：1、1：1、1：1.1、1：1.2、1：1.3、1：1.4、1：1.5、1：1.6、1：1.7、1 ：1.8、1：1.9：1：2、1：2.5、1：3、1：3.5、1：4、1：4.5或1：5。在某些方面，容許差異在所需的比率約1％、約2％、約3％、約4％、約5％、約10％、約15％、約20％、約25％、約30％、約35％、約40％、約45％、約50％內，包括這些範圍之間的任何數值。
在一些實施例中，將經修飾細胞的劑量以單次投藥或多次投藥的方式投與至有需要的個體。在一些實施例中，經修飾細胞的劑量係以多次投藥的方式投與，舉例而言，每一週一次或每7天一次、每二週一次或每14天一次、每三週一次或每21天一次、每四周一次或每28天一次。在一個示例性實施例中，係將單次劑量的經修飾細胞投與至有需要的個體。在一個示例性實施例中，單次劑量的經修飾細胞係藉由快速靜脈輸注投與至有需要的個體。
為了預防或治療疾病，適當劑量可取決於待治療的疾病類型、細胞或重組受體的類型、疾病的嚴重程度和病程、細胞之投與是否用於預防或治療目的、個體在治療之前的臨床病史和對細胞的反應、以及主治醫師的判斷。在一些實施例中，組合物和細胞適合以單次或在一系列治療中投與至個體。
在一些實施例中，該細胞是作為組合治療的一部分之方式投與，例如與同時或依次（以任何順序）與另一種治療干預（例如，抗體或經改造的細胞或受體或如細胞毒性劑或治療劑等試劑）。在一些實施例中，細胞與一或多種其他治療劑併用或與另一種治療干預併用，併用的方式可為同時或以任何順序依次投與。在一些情況下，細胞與另一種療法在接近的時間點併用，使得細胞群增強一或多種其他治療藥劑的功效（或反之亦然）。在一些實施例中，在使用一或多種其他治療藥劑之前投與細胞。在一些實施例中，在使用一或多種其他治療劑之後投與細胞。在一些實施例中，所述一或多種其他藥劑包括細胞激素（例如，IL-2），以增強持久性。在一些實施例中，所述方法包括投與化療藥劑。
在一些實施例中，投與前述細胞後，係測量經改造細胞群的生物活性，例如藉由許多已知方法中的任何一種。要評估的參數包括經改造或天然T細胞或其他免疫細胞與抗原在體內（例如，藉由顯微攝影技術評估）或離體（例如，藉由ELISA或流式細胞術所評估）的特異性結合情況。在一些實施例中，可以使用本領域已知的任何適合方法測量經改造細胞去破壞目標細胞的能力，例如在Kochenderfer等人，J.Immunotherapy，32（7）： 689-702（2009），和Herman等人。J. Immunological Methods，285（1）：25-40（2004）中所描述的細胞毒性測定。在一些實施例中，該細胞的生物活性係藉由測定一或多種細胞激素（例如，CD107a、IFNγ、IL-2和TNF）的表現和/或分泌來測量。在一些方面，生物活性係藉由評估臨床預後（例如腫瘤負荷或負載的降低）來測量。
在一些示例性實施例中，本發明的方法採用特定劑量方案來治療有需要的個體。在一個示例性實施例中，適合的個體是帶有表現出NY-ESO-1抗原的復發性或難治性腫瘤且為HLA-A*0201陽性成人病患。在一個實施例中，為了鑑定此類病患，可以使用籃型設計（basket design）以招募患有骨髓瘤、滑膜肉瘤和黏液樣/圓形細胞脂肪肉瘤（MRCL）和黑色素瘤病患。在一個實施例中，可首先納入患有多發性骨髓瘤和肉瘤的病患，一旦試驗之初始安全性建立後，就將病患群體擴大為包含黑色素瘤病患。
在一些示例性實施例中，適合的個體是帶有表現NY-ESO-1抗原的腫瘤且為HLA-A*0201陽性的病患。如本文所述，與HLA-A*0201複合的NY-ESO-1衍生肽是SLLMWITQC（NY-ESO157-165 ；SEQ ID NO：1）。癌症睪丸抗原LAGE-1與NY-ESO-1具有90％的同源性，並且具有兩種轉錄物變異型—LAGE-1S和LAGE-1L。LAGE-1S變異型轉錄物與NY-ESO-1共享相同的HLA-A* 0201表位SLLMWITQC（SEQ ID NO：1）。在一些示例性實施例中，LAGE-1 HLA-A*0201表位是NY-ESO-1定向治療（NY-ESO-1 directed therapy）的等效目標。因此，在一些示例性實施例中，適用NY-ESO-1定向治療的個體是具有表現LAGE-1抗原的腫瘤且為HLA-A*0201陽性的病患。參見例如Rapoport等人，Nature Medicine（2015）21（8）：914-921；Rimoldi等人，J.Immunology（2000）165（12）：7253-7261；和Purbhoo等人，J.Immunology（2006）176（12）：7308-7316。
在一些示例性實施例中，鑑定出適於治療的個體包括篩選出HLA-A*0201表現和NY-ESO-1和/或LAGE-1的表現。篩選方法為本領域已知的。舉例而言，可以進行PCR或RT-PCR以鑑定出NY-ESO-1和/或LAGE-1表現陽性的病患。在一些癌症中，例如多發性骨髓瘤，NY-ESO-1和LAGE-1均由癌細胞表現，並且通常LAGE-1的表現程度高於NY-ESO-1。在一些情況下，LAGE-1表現頻率大約是NY-ESO-1的兩倍。因此，在一些示例性實施例中，鑑定出適合的個體可以包括先對HLA-A*0201陽性的癌症病患篩選其LAGE-1表現，然後進一步對HLA-A*0201陽性及LAGE-1陽性的病患篩選其NY-ESO-1表現。
在一些實施例中，特定劑量方案包括將本發明的經修飾細胞投與至有需要的個體。在一個示例性實施例中，特定劑量方案包括將例如用慢病毒載體轉導以表現NY-ESO-1並以電穿孔導入Cas9和引導RNA以破壞內源性受體表現（例如，TRAC、TRBC和/或PD1）的自體T細胞投與至有需要的個體。
在一些實施例中，本發明的特定劑量方案包括在投與經修飾的T細胞之前進行淋巴細胞清除步驟。在一個示例性實施例中，淋巴細胞清除步驟包括投與環磷醯胺和/或氟達拉濱。在一個示例性實施例中，對於患有多發性骨髓瘤的個體，該個體在施用經修飾的T細胞之前接受淋巴清除化學療法。在一個示例性實施例中，對於患有多發性骨髓瘤的個體，該個體接受包括以靜脈輸注約1.5g/m2 的環磷醯胺進行的淋巴清除化學療法。在一個示例性實施例中，對於患有多發性骨髓瘤的個體，個體在施用經修飾的T細胞之前約2天（±1天）藉由靜脈內輸注接受包括約1.5g/m2 環磷醯胺的淋巴清除化學療法。在一個示例性實施例中，對於患有肉瘤或黑色素瘤的個體，個體在施用經修飾的T細胞之前接受淋巴清除化學療法。在一個示例性實施例中，對於患有肉瘤或黑色素瘤的個體，個體接受包括以靜脈輸注約300mg /m2 的環磷醯胺和30mg/m2 的氟達拉濱所進行的淋巴清除化學療法。在一個示例性實施例中，對於患有肉瘤或黑色素瘤的個體，個體接受包括在施用經修飾的T細胞之前的第4天、第3天和第2天以靜脈輸注約300mg/m2 環磷醯胺和30mg/m2 氟達拉濱所進行的淋巴清除化學療法。
在一些實施例中，本發明的方法涉及篩選和治療至少一先以癌症標準療程治療但失敗的個體。舉例而言，適合的個體可能已被確診為復發性及難治性多發性骨髓瘤、黑色素瘤、滑膜肉瘤或黏液樣/圓形細胞脂肪肉瘤（MRCL）。
在一個示例性實施例中，適合的個體是先前經IMWG標準已確診為活躍型骨髓瘤（active myeloma）的個體。在一個實施例中，適合的個體在以下任何一個程序處理後具有復發或難治性疾病：1）先前接受過至少3種治療方案，其必須含有烷化劑、蛋白酶體抑制劑和免疫調節劑（immunomodulatory agent，IMiD）；或2）先前接受過至少2個治療方案，如果該疾病對蛋白酶體抑制劑和免疫調節劑為「雙重難治」的話，「雙重難治」係定義為用這些藥劑治療後惡化，或在用這些藥劑治療後60天內惡化。在一些實施例中，若依順序投與誘導療法、幹細胞移植和維持療法而沒有對疾病進展造成干預，則應被視為1個「方案」。在一些實施例中，適合的個體為自自體幹細胞移植（若有執行）後至少90天。在一些實施例中，適合的個體可能經歷來自先前療法的毒性，除了可歸因於硼替佐米（bortezomib）的禿頭症或周圍神經病變。在這種情況下，根據CTC 4.0標準或個體的先前基準，先前療法的毒性必須已恢復到≤2級。在一個實施例中，適合的個體在研究開始時以IMWG標準具有可被測量到的疾病，其必須包括至少有以下一項：1）血清M-spike ≥ 0.5g/dL（IgA骨髓瘤病患，由於正常血清蛋白與β區域的副蛋白共同遷移，血清蛋白電泳的結果可能不可靠，因此只要總血清IgA水平升高至正常範圍以上，就是合格的）；2）24小時尿液M-spike≥200mg；3）所涉的血清游離輕鏈（FLC）≥50mg L，且比率異常；4）在檢查或成像時檢測出漿細胞瘤；5）骨髓漿細胞≥20％。
在一個示例性實施例中，適合的個體是先前已確診有黑色素瘤、在接受過至少2個療程（2 therapy lines）之後惡化，和/或依據RECIST 1.1具有可被測得的疾病以便評估抗腫瘤反應。在一個示例性實施例中，適合的個體是先前已確診有滑膜肉瘤或MRCL、以第一線治療方法治療失敗且經證實為轉移性疾病或無法進行手術的局部復發、和/或依據RECIST 1.1為可被測得的疾病，以便評估抗腫瘤反應。
在一些實施例中，適合的個體是ECOG表現狀態為0-2分的個體。
在一個示例性實施例中，適合的個體是在腫瘤組織上具有經記載的NY-ESO-1表現的個體。在一個示例性實施例中，適合的個體是HLA-A*201為陽性的個體。
在一些實施例中，適合的個體是其重要器官功能合格的個體，合格之定義如下：1）血清肌酸酐≤2.5或肌酸酐估計清除率≥30ml/ min且不仰賴透析；2）絕對嗜中性粒細胞計數≥1000/μl，且血小板計數≥50,000/μl（若多發性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）病患中的骨髓漿細胞佔細胞比例≥50％，則以血小板計數≥30,000/μl為標準）；3）SGOT≤正常上限的3倍，且總膽紅素≤2.0mg/dl（除非是其高膽紅素血症係歸因於Gilbert症候群的病患）；和/或4）左心室射血分數（left ventricular ejection fraction，LVEF）≥45％，其中LVEF評估係在病患被招募後8週內進行。
J. 醫藥組合物和配方
本文還提供了免疫細胞群體，及含有這些細胞且/或富集有這些細胞的組合物。舉例來說，表現重組受體的細胞占組合物內總細胞數的比例為，或占某特定類型的細胞（如T細胞或CD8+或CD4+細胞）的比例為，至少50％、60％、70％、80％、90％ 、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，或更多。這些組合物中包含適於投予的醫藥組合物和製劑，例如用於過繼性細胞療法。本文還提供了將細胞和組合物投予至個體（例如患者）的治療方法。
本文還提供了包括用於投予之細胞的組合物，其包括醫藥組合物和製劑，例如單位劑量形式的組合物，其包括於給定劑量或其部分中所投予的細胞數量。醫藥組合物和製劑通常包括一或多種可選的醫藥上可接受載體或賦形劑。在一些實施例中，組合物包括至少一種額外的治療試劑。
術語「醫藥製劑」係指一種調配物，其所呈形式允許所含活性成分其生物活性得以有效發揮，且不含有會對其所投予之個體產生不可接受毒性之其他成分。「醫藥上可接受之載體」是指醫藥製劑中除活性成分之外對個體無毒性的成分。醫藥上可接受之載體包括但不限於緩衝劑、賦形劑、穩定劑或防腐劑。在某些情況下，載體的選擇在某種程度上由特定細胞和/或投予方式決定。因此，有多種製劑係適合用於本發明。舉例而言，醫藥組合物可含有防腐劑。適合之防腐劑可以包括，舉例而言，對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、苯甲酸鈉和苯扎氯銨。在某些情況下，使用兩種或更多種防腐劑之混合物。防腐劑或其混合物通常佔總組合物重量之約0.0001％至約2％之重量。載體於例如Remington's Pharmaceutical Sciences第16版, Osol, A. Ed. (1980)中所描述。醫藥上可接受之載體通常在採用之劑量和濃度下對接受個體不具有毒性，且包括但不限於：緩衝劑（例如，磷酸鹽、檸檬酸鹽和其他有機酸）、抗氧化劑（包括抗壞血酸和甲硫胺酸）、防腐劑（例如，十八烷基二甲基芐基氯化銨、六甲雙銨氯化物、苯扎氯銨、芐索氯銨、苯酚、丁基或苯甲醇、對羥基苯甲酸烷基酯－例如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯、兒茶酚、間苯二酚、環己醇、3-戊醇，和間甲酚）、低分子量（少於約10個殘基）多肽、蛋白（例如，血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白）、親水聚合物（例如，聚乙烯吡咯烷酮）、胺基酸（例如，甘胺酸、麩醯胺酸、天門冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸）、單醣、雙糖和其他碳水化合物（包括葡萄糖、甘露糖或糊精）、螯合劑（例如，EDTA）、糖類（例如，蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇）、成鹽相對離子（例如，鈉）、金屬錯合物（例如，鋅-蛋白錯合物），和/或非離子表面活性劑（例如，聚乙二醇，PEG）。
在某些情況下，組合物中包括緩衝劑。適合的緩衝劑包括例如檸檬酸、檸檬酸鈉、磷酸、磷酸鉀，和其它各種酸和鹽。在某些情況下，本文會使用兩種或更多種緩衝劑之混合物。緩衝劑或其混合物的重量通常佔組合物總重量約0.001％至約4％。製備可投予醫藥組合物的方法為已知的。示例性方法係更仔細地描述於例如Remington：The Science and Practice of Pharmacy，Lippincott Williams＆Wilkins；第21版（2005年5月1日）中。
製劑可以包括水溶液。製劑或組合物亦可以含有多於一種適用以細胞治療的特定適應症、疾病或病症的活性成分；較佳係具有與細胞活性互補的活性成分，且其個別活性不會對彼此造成不良影響。這些活性成分適合以對預期目的有效之量共同存在。因此，在一些實施例中，醫藥組合物進一步包括其它醫藥活性劑或藥物，例如化學治療劑（例如，天冬醯胺酶、白消安、卡鉑、順鉑、柔紅黴素、阿黴素、氟尿嘧啶、吉西他濱、羥基脲、甲胺喋呤、紫杉醇、利妥昔單抗、長春鹼、和/或長春新鹼）。在一些實施例中，醫藥組合物含有可有效治療或預防疾病或病症的細胞量（例如治療有效量或預防有效量）。一些實施例中的治療或預防功效係藉由定期分析經治療個體來監測。所需劑量可以藉由單次推注（bolus）投予細胞、藉由多次推注投予細胞、或藉由連續輸注投與細胞來遞送。
製劑包括用於經口服、靜脈內、腹膜內、皮下、肺、經皮、肌肉內、鼻內、口腔、舌下或栓劑投予之製劑。在一些實施例中，其係非經腸胃來投予細胞群體。如本文所用之術語「非經腸胃」包括經靜脈內、肌肉內、皮下，直腸，陰道和腹膜內投藥。在一些實施例中，細胞係以周邊全身性遞送的方式，藉由靜脈內、腹膜內或皮下注射，向個體投予。在一些實施例中，組合物以無菌液體製劑形式提供，例如等張性水溶液、懸浮液、乳液、分散液或黏性組合物，在某些方面其可以緩衝至所選擇的pH值。液體製劑通常比凝膠、其他黏性組合物和固體組合物更容易製備。另外，液體組合物在某些程度上更便於投予，特別是藉由注射。另一方面，黏性組合物可以在適當黏度範圍內進行調配，使其能與特定組織接觸的更久。液體或黏性組合物可包括載劑，載劑可為溶劑或分散介質，其包括例如水、鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水、多元醇（例如甘油、丙二醇、液體聚乙二醇），及前述載劑的適當混合物。
無菌的注射溶液可藉由將細胞併入溶劑來製備，例如與適合載劑、稀釋劑或賦形劑（例如無菌水、生理鹽水、葡萄糖、右旋糖或其類似物）混合。根據給藥途徑和所需製備方式，組合物可含有輔助物質，例如濕潤劑、分散劑或乳化劑（例如甲基纖維素）、pH緩衝劑、膠凝或黏度增強添加劑、防腐劑、調味劑、顏料及類似物。在某些情況下，可查詢標準文書以製備適合製劑。
在本文的組合物中可添加增強組合物之穩定性及無菌性的各種添加劑，包括抗微生物防腐劑、抗氧化劑、螯合劑及緩衝劑。各種抗細菌劑及抗真菌劑（例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸）可用來確保防止微生物之作用。延長可注射醫藥形式之吸收，可藉由使用延遲吸收劑（例如，單硬脂酸鋁及明膠）來實現。
一般來說，用於活體內投予的製劑係為無菌。無菌性可藉由例如經由無菌過濾膜過濾來輕易地實現。
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儘管已參考本發明之具體實施例所描述的本發明，但是本領域技術人員應該明瞭，在不脫離本發明的真實精神和範圍的情況下，可以進行各種更動且可以替換等效物。對於本領域技術人員來說顯而易見的是，在不脫離本文所公開的實施例所涵蓋的範圍下，可使用適合的等效物對本文所描述的方法進行其他適合的修改及改變。另外，可進行許多修改以適應本發明之目標、精神和範圍的特定情況、材料、物質之組成、程序、程序步驟或步驟。所有此些修改旨在包括在所附申請專利範圍的範圍內。目前已詳細描述了某些實施例，通過參考以下實例將更清楚地理解這些實施例，且這些實例僅是為了說明的目的而被涵蓋而非用以限制本文。
實驗例
實驗例 1 ：製備破壞內源性 TRAC 、 TRBC 和 PDCD1 表現的 NY-ESO-1 TCR 自體 T 細胞（ NYCE T 細胞）
以三重剔除（triple knock-out）系統進行基因破壞的條件係在試管環境（in vitro）中進行測試，其係使用對TRAC、TRBC和PDCD1基因具特異性的Cas9 RNA和引導RNA（gRNA）來靶向TRAC、TRBC和PDCD1基因。以Ficoll萃取法從全血中分離來自兩個正常捐贈者的周邊血液單核球（PBMC），並使用Pan T細胞分離試劑盒II（Miltenyi Biotec）以陰性篩選方式從PBMC中分離出T細胞。將分離出的T細胞用Dynabeads人類T-Expander CD3/CD28珠粒以珠子：細胞為3：1的比率進行刺激過夜。接著以調節至MOI為1的病毒濃度，用編碼有NY-ESO-1 TCR的慢病毒載體（lentiviral vector，LV）來轉導T細胞，並孵育過夜。在慢病毒載體轉導後第3天，除去CD3/CD28珠粒並將Cas9 RNA以電穿孔方式導入已預先活化的T細胞，接著在第4天將對TCRα、TCRβ和PD1具特異性的gRNA（H、M和L）以三種不同濃度進行電穿孔。本發明對T細胞的擴增（圖 4 ）、基因破壞的效力（圖 5-8 ）、細胞功能（圖 9-11 ）和長期擴增（圖 12 和 13 ）進行了測試。
在以慢病毒載體轉導和以Cas9 mRNA和gRNA進行電穿孔後，在擴增期間每隔一天用新鮮培養液稀釋細胞以維持最佳生長。在多個時間點測量總細胞數並用總細胞數來確定T細胞的擴增倍數。圖 4 中的 數據代表來自兩個捐贈者的T細胞其擴增情況隨著gRNA濃度的增加而出現劑量依賴性的降低。
參考圖4，T細胞從正常健康的捐贈者（捐贈者1-ND307和捐贈者2-ND422）中分離，並在MOI = 1的濃度時使用（實心形狀）或不使用（空心圓圈）NY-ESO-1慢病毒載體轉導。在第3天時，將Cas9 RNA以電穿孔方式導入細胞，並在第4天將3種不同劑量的gRNA（L：低劑量，實心三角形、M：中等/標準劑量，實心圓形，和H：高劑量，實心菱形）以電穿孔方式導入細胞。細胞電穿孔係在1-3×108 /毫升的濃度範圍下進行。在培養的第3、10和12天計算活細胞數量（x軸），並計算T細胞擴增倍數（y軸）。
為了確定TCR內源性 的Cas9基因編輯的效率，係以流式細胞術來評估T細胞在培養第11天時NY-ESO-1 TCR和內源性TCR的細胞表面表現情況（圖 5 和 6 ）。細胞用對Vβ8（與NY-ESO-1 TCR結合）和CD3有專一性的單株抗體進行染色（圖 5 ）， 或以在NY-ESO-1表位周圍折疊的螢光標記HLA-A2多聚體（dextramer）進行染色（圖 6 ）。
分析係先對具有淋巴細胞散射分布的細胞進行選取（gating），然後測量CD3和Vβ8的表現來進行。結果顯示，在中， gRNA在一定濃度範圍下兩個捐贈者的NY-ESO-1特異性 TCR均維持有大量表現，其中一個捐贈者細胞其NY-ESO-1 TCR的表現落在45-49％的範圍區間，另一個捐贈者細胞其NY-ESO-1 TCR的表現落在60-62％的範圍區間。未轉導T細胞其內源性TCR的基因編輯程度為46％至90％，且係與gRNA濃度相關。從數據推斷，在給予中劑量gRNA的組別中，表現有NY-ESO-1 TCR的細胞約有70％缺乏內源性TCR（圖 5 ）。
參考圖5，來自兩個捐贈者（ND307和ND422）的細胞係經NY-ESO-1所轉導且以針對TCRα，TCRβ和PD1的gRNA於三種不同濃度（高、中、低劑量）下進行電穿孔，經擴增培養後於第11天收取T細胞，並以流式細胞術來分析其細胞表面上CD3和Vβ8的表現情況。先依淋巴細胞的散射光圖譜進行圈選，然後分析CD3（TCR表現的替代物； x軸）和Vβ8（與NY-ESO-1 TCR結合；y軸）。兩個捐贈者的細胞其Vβ8單抗染色結果均低至背景值；因此，這株單株抗體能有效地識別表現有NY-ESO-1 TCR的轉基因T細胞。
NY-ESO-1特異性T細胞的比例係利用帶有螢光標記的HLA-A2/NY-ESO-1多聚體以流式細胞術加以確認（圖 6 ，實心條）。轉導TCR鏈其細胞表面表現程度隨著gRNAs的濃度有顯著地提高，這代表當內源性TCR鏈被剔除時由該TCR所進行的抗原辨識情況有所提高，先前其它轉基因TCR的相關文獻實驗結果亦是如此。在gRNA為高濃度時，T細胞表現出NY-ESO-1 TCR的百分比等同於在圖 5 中以Vβ8 單株抗體所進行的NY-ESO-1表現評估結果。此外，轉導效率係藉由經過確效的土撥鼠肝炎病毒轉錄後調節元件（Woodchuck Hepatitis Virus Posttranscriptional Regulatory Element，WPRE，為NY-ESO-1 TCR慢病毒載體的一部分）qPCR來進行評估。這個分析揭示了每個細胞中嵌有一或更少個的NY-ESO-1病毒載體複本（圖 6 ，灰色條和右側y軸）。
參考圖6，來自捐贈者ND422的細胞，係以NY-ESO-1所轉導、並使用針對TCRα、TCRβ和PD1的gRNA以三種不同濃度（高、中、低劑量）進行電穿孔，於擴增培養後的第11天收取T細胞，利用在NY-ESO-1肽SLLMWITQC（灰色實心條；SEQ ID NO：1）周圍折疊的螢光綴合HLA-A*0201多聚體以流式細胞術來進行分析，也使用WPRE專一性的qPCR（灰色輪廓條）進行分析。所示結果為該TCR在總T細胞數中的表現情況。
為了確定PD1基因編輯的效率，將前述擴增培養後第11天所取得的細胞以CD3/CD28珠粒再次刺激3天，以誘發PD1表現（圖 7 ）。沒有進行再刺激的情況下，轉導有NY-ESO-1但未經基因編輯的細胞其PD1表現量與背景值相同（為14.7％）。在有刺激但沒有PD1基因編輯的情況下，於慢病毒載體轉導組（No CRISPR組）或非慢病毒載體轉導組（No TD No CRISPR組）中，有大於95％的CD3陽性細胞被誘發出PD1表現。經慢病毒載體轉染的T細胞，經gRNA電穿孔處理而缺乏PD1表現的百分比在低、中和高 gRNA濃度組別中分別降至35％、57％、74％。因此，在中等/標準劑量gRNA的組別中，有57％的NY-ESO-1+ T細胞欠缺表現PD1（PD1¯）的能力。
參見圖7，以NY-ESO-1進行轉導的細胞，將針對TCRα、TCRβ和PD1的gRNA以三種不同濃度（高劑量、標準劑量、低劑量）進行電穿孔處理，並於擴增培養後的第11天收取T細胞，進行流式細胞術分析。本實驗例還製備了未經慢病毒載體轉導NY-ESO-1（未轉導）但有用前述3種濃度的gRNA進行電穿孔處理的T細胞。針對每種轉導和未轉導的細胞群都製備有未進行電穿孔的細胞做為對照組。這些細胞群係用CD3/CD28珠粒（再刺激組，「Re-stim」）再刺激以誘導PD1表現或保持未刺激（未再刺激組，「No Re-stim」）。三天後，所有的細胞群用對CD3和PD1具專一性的單株抗體進行表面染色。先對淋巴細胞的散射光圖譜進行圈選，然後分析其CD3的表現（TCR表現的替代物； x軸）和PD1的表現（y軸）。
除了針對蛋白表現進行流式細胞術分析之外，本文還對培養後第12天之細胞進行核酸擴增後所取得的DNA進行錯配選擇性surveyor核酸酶測量，以分析其目標基因被破壞的頻率（圖 8 ）。在兩個捐贈者中都觀察到劑量反應，其基因編輯的百分比與所用gRNA的濃度有關聯。這個劑量反應出現在TCRα，TCRβ，和PD1這三個基因中，而兩個捐贈者具有不同的基因編輯程度。這個測定證明了捐贈者307中所有基因係被有效地破壞。至於捐贈者422的T細胞，TCRα的破壞並未達最佳化，但其他基因係被有效地破壞。
參考圖8，將針對每個基因（TCRα，TCRβ和PD1）的引子組用來進行一般的單次PCR反應。PCR產物係用內切核酸酶處理並在聚丙烯醯胺凝膠上運行（圖中左側區域）。測量兩個捐贈者的完整和經內切核酸酶處理後的條帶強度，並計算基因剔除的百分比（圖中右側區域：深灰色條為捐贈者307（ND307）的測試結果，淺灰色條為捐贈者（ND422）的測試結果）。計算如圖4描述方式所製備的細胞，以四種濃度的gRNA（高，中，低，無）處理後，其基因剔除的百分比。
經TCR內源性 和PD1基因編輯且轉導NY-ESO-1的T細胞係與表現NY-ESO-1的腫瘤細胞株共同培養，以測量其細胞脫粒能力（圖 9 ）、IL-2和IFNγ的釋放情況（圖 10 ）和裂解（圖 11 ）等功能。
為了確定轉導有NY-ESO-1的細胞在受到表現有Nalm6-HLA-A2並經NY-ESO-1轉染的腫瘤細胞株（Nalm6-ESO）刺激後所產生的脫粒能力，來自兩個捐贈者且經上述擴增培養後所取得的T細胞，係藉由流式細胞術分析其T細胞表面上的CD107a表現。在兩個捐贈者中，以CD107a的細胞表面表現情況來觀察，僅在轉經過NY-ESO-1所轉導的T細胞中出現脫粒現象。在經TCR內源性 和PD1基因編輯後，T細胞出現脫粒現象的比例增加，並且為劑量依賴（圖 9 ）。
參考圖9，如圖4描述方式所製備的T細胞，係與表現有NALM6-HLA-A2並經NY-ESO-1轉染的腫瘤細胞株（NamI6-ESO）或不表現NY-ESO-1的對照細胞株（NamI6）一併孵育。將細胞以對CD8和CD107a有專一性的單株抗體進行表面染色，並以流式細胞術分析。
接下來，本實驗例係針對轉導有NY-ESO-1且經TCR內源性 和PD1基因編輯的T細胞，評估其在環境中存有或未存有表現NY-ESO-1的腫瘤時，釋放IL-2和IFNγ的能力。轉導有NY-ESO-1的T細胞在受到表現有Nalm6-HLA-A2且經NY-ESO-1轉染的腫瘤細胞株（Nalm6-ESO）刺激時，以及受到表現有NY-ESO-1的黑色素瘤腫瘤細胞株刺激時，會對應釋放出IFNγ和IL-2，但是當與不表現NY-ESO-1的腫瘤細胞（Nalm6）一起孵育時則不會釋放出IFNγ和IL-2。此外，受基因編輯程度的影響，細胞激素的生成量出現明顯的劑量依賴性。從兩個捐贈者的結果可看出，相較於僅轉導NY-ESO-1的細胞，有TCR內源性 和PD1基因編輯的細胞有較大量的細胞激素生成，這代表經TCR內源性 和PD1基因編輯的細胞其功能性較佳。（圖 10 ）。
參照圖10，如圖4描述方式所製備經NY-ESO-1所轉導的T細胞（TD）或未經轉導的T細胞（沒有TD），係與表現有NALM6-HLA-A2並經NY-ESO-1轉染的腫瘤細胞株（Nalm6-ESO），或與沒有表現NY-ESO-1的對照細胞株（Nalm6），或與表現有NY-ESO-1的黑色素瘤細胞株（624mel）共同孵育過夜。收集培養物上清液，並以ELISA測量IFNγ或IL-2。本實驗例進一步針對在缺乏基因編輯（TD NO KO）的情況下，轉導有NY-ESO-1的T細胞在受到腫瘤刺激時，評估其釋放細胞激素的能力。所測試的T細胞係來自兩個捐贈者（307和422）並經擴增培養。
為了確定轉導有NY-ESO-1或未轉導的T細胞，在經過或未經過TCR內源性 和PD1基因編輯的情況下，殺死HLA-A2 NY-ESO-1腫瘤細胞株的能力，係進行腫瘤特異性裂解的發光測定。Nalm6-ESO-CBG細胞係以1×105 細胞/毫升的密度進行再懸浮，並在37℃下與不同比例的T細胞（例如30：1、15：1等）共同孵育過夜。將100μl混合物轉移到96孔白光光度計盤中，加入100μl受質並立即測定發光程度。相較於未轉導細胞（NO TD）或未經基因編輯但轉導有NY-ESO-1的細胞（TD NO KO），轉導有NY-ESO-1且經基因編輯的T細胞在所有E：T比例的條件下，對目標腫瘤細胞都展現出較高的裂解能力（圖 11 ）。
參照圖11，轉導有NY-ESO-1的T細胞（TD）或未經轉導（沒有TD）且有（實心三角形）或無（實心圓或X）進行TCR內源性 和PD1基因編輯的細胞，係與表現有Nalm6-HLA-A2且經NY-ESO-1轉染的腫瘤細胞株（NamI6-ESO）共同培養。以發光測定法測定腫瘤細胞裂解程度，並將結果表示為腫瘤特異性裂解程度（y軸）與作用細胞與目標比（E：T，x軸）的關係。對來自捐贈者307經擴增培養後第12天所取得的T細胞進行測試。結果係以毒殺百分比表示，其係以具有腫瘤但不具有T細胞的孔中所測得的螢光素酶活性為基準。（毒殺百分比=100-（（作用細胞和目標細胞共同培養的孔所測得的RLU）/（只有目標細胞的孔中所測得的RLU）×100））。
不受任何理論的束縛，這些數據代表轉導有NY-ESO-1 TCR且經三重編輯的細胞其功能活性優於僅轉導有NY-ESO-1 TCR的細胞，且目標基因被破壞並不會對其功能產生負面影響。
為了確定TCR內源性 和PD1基因編輯是否產生影響細胞增生的脫靶突變，將第12天的T細胞置於培養物中而不進行額外刺激。在初始擴張後，所有條件在第42天達到穩定或緊縮（plateaued or contracted）。細胞存活率係保持穩定或降低。細胞尺寸在所有條件下穩定下降（圖 12 ）。有TCR內源性 和PD1基因編輯且轉導有NY-ESO-1的T細胞群體，係預期與未修飾的細胞相似，會繼續生長到緊縮狀態。這些數據代表沒有與TCR內源性 和PD1基因編輯相關的轉形突變存在。
參考圖12，來自擴增培養後第12天所取得的帶有TCR內源性 和PD1基因編輯且轉導有NY-ESO-1的T細胞，係進行長期培養。於長期培養開始時，不同條件的細胞係以1×106 個細胞/mL的密度（細胞總數為2×107 個細胞）種植在含有IL-2（100 IU/ml）的RPMI10培養基中。在指定天數測量整個培養物的細胞數、細胞存活率和細胞大小。每隔一天用添加有IL-2的RPMI10培養基餵養細胞。
在第38天時使用上述HLA-A2/NYESO1多聚體進行染色，以再次評估NY-ESO-1 TCR的細胞表面表現情況。該數據（圖 13 ）代表在整個培養過程中此TCR在細胞表面上維持有大量的表現，且CD4+和CD8+T細胞相同，都表現有高比例的NYESO1專一性TCR，並與圖6所示者相同，也出現劑量效應。
參考圖13，使用圖6中描述的方法，以流式細胞術分析長期培養結束時（圖9中第38天）細胞群的NY-ESO-1 TCR表現。該圖顯示在兩個捐贈者的T細胞中，表現有NY-ESO-1的T細胞百分比（y軸）係為gRNA濃度（無、低、中、高；x軸）的函數。
不受任何理論的束縛，這些數據證實，上述三重CRISPR編輯系統與經過慢病毒轉導的T細胞結合後，成功地將T細胞重新定向（redirecting），並使其功能潛力優於僅經過慢病毒轉導的T細胞。在內源性TCR和PD-1基因位點進行編輯且表現有NY-ESO-1 TCR的T細胞，能在體外進行擴張、分泌細胞激素、脫粒並裂解抗原特異性目標細胞，這些結果都支持這些細胞具有所預期將的臨床應用。
假設性實施例 1 ：內源性 TRAC 、 TRBC 和 PDCD1 的表現被破壞的臨床 NY-ESO-1 TCR 的自體 T 細胞（ NYCE T 細胞）的製造
NYCE T細胞是自體的T細胞，其被重新定向為能辨識NY-ESO-1抗原（NY-ESO-1-redirected），並以CRISPR編輯其TCR內源性 和PD1基因。以慢病毒載體來改造自體T細胞，使其表現能專一性辨識NY-ESO-1胜肽片段的T細胞受體，NY-ESO-1胜肽片段（SLLMWITQC； SEQ ID NO：1）會與HLA-A * 0201形成複合體，該細胞的內源性TCR（α和β鏈）和PD1基因已被破壞。不受任何理論束縛，這預期會提高轉導T細胞對表現有NY-ESO-1的目標之效力，因為a）反向檢查點調節分子PD1已被剔除，且b）在細胞不表現TCR內源性 的情況下實現了轉基因TCR在細胞表面形成二聚體。此外，由於內源性的TCR鏈和導入的TCR鏈可以形成二聚體並產生新的但為不必要的專一性，因此剔除TCR內源性 將增強NYCE T細胞的安全性。
NYCE T細胞將在賓夕法尼亞大學的臨床細胞和疫苗生產設施（CVPF）中生產。在細胞培養結束時，將細胞冷凍保存在不熔性低溫培養液中。每個保存袋將分裝有適量的低溫培養液（其體積取決於劑量），該低溫培養液含有以下不熔性等級的試劑（單位：體積/體積百分比，％v/v）：31.25％血漿溶解物-A、31.25％葡萄糖（5％）、0.45％NaCl、7.5％DMSO、1 ％葡聚醣40、5％人類血清白蛋白。NYCE T細胞將以單次輸注的方式投予。目標劑量為1×108 總細胞/千克。
吸收、分佈和代謝。 淋巴細胞具有複雜的運輸和存活動力學，並且已證實在過繼轉移療法後可能會出現下列幾種情況：1）著邊現象（margination）；2）離開周邊血液並移動至淋巴組織；以及3）細胞凋亡導致細胞死亡。在靜脈內投予後，經反轉錄病毒修飾的過繼轉移T細胞會因為T細胞的複製能力而在免疫缺陷的SCID病患體內的循環系統中持續存在至少10年。人類CD8 毒殺T細胞（CTL）於輸注後在周邊血液的消除半衰期約為8天，而當給予低劑量的IL-2時，半衰期增加至約16天。在HIV感染病患體內，經單次輸注後，經慢病毒修飾的CD4 T細胞在5名病患的循環系統中其平均半衰期為23.5（±7.7）天。已知過繼轉移人類T細胞可以移動至腫瘤和次級淋巴組織。CD19 CAR T細胞（CART19）會在慢性淋巴性白血病和急性淋巴性白血病的病患體內持續存在超過5年。
藥物相互作用 。 不受任何理論的束縛，NYCE T細胞將會保留許多天然T細胞的特性。因此，它們將對如皮質類固醇等免疫抑制劑、如環孢菌素和他克莫司等鈣調神經磷酸酶抑制劑、包括甲氨蝶呤和黴酚酸酯的抗代謝藥物、如西羅莫司和依維莫司等mTOR抑制劑、以及包括阿崙單抗（alemtuzumab）、達克珠單抗（daclizumab）和地尼白介素（denileukin diftitox）的淋巴清除性抗體敏感。淋巴細胞也對那些常用於血液惡性腫瘤而的細胞毒性和化學治療劑敏感，例如環磷醯胺和氟達拉濱。
免疫消除 。 不受任何理論的束縛，經改造的NYCE T細胞可能具有免疫原性，並且病患將對指定細胞產生免疫反應，導致細胞被清除。免疫反應可能會針對NY-ESO-1轉基因TCR，但是在先前研究中未觀察到這種情況。免疫反應也可能是針對內源性TCR的基因編輯產物或針對經編輯的PD1。來自CRISPR/Cas9編輯過程的產物可能會有部分易位（partially translocated），且不會表現在細胞表面上，但仍會引發免疫反應。Cas9是源自鏈球菌的蛋白，其預期有免疫原性。由於經基因編輯的細胞在初始編輯後將大量增殖，因此Cas9蛋白產物可能以極低或無法檢測的量存在於輸注的細胞產物中。輸注產物的免疫原性將以次級相關性分析來監測。如果發現T細胞植入後存在時間延長，則免疫原性就不是主要問題。
淋巴細胞清除療法的原理 。 過繼性免疫治療方案可能可以利用T細胞穩態增殖，當初級T細胞的總數減少至低於某一閾值時，初級T細胞開始增生並分化成類記憶T（memory-like T）細胞。淋巴細胞清除會減少或消除調節性T細胞和充當「細胞激素池（cytokine sinks）」的免疫系統其他競爭單元，會提高那些可促進過繼轉移T細胞擴增的細胞激素（如IL-7和IL-15）其可用率。這個假設已經在臨床上對常規方式治療為難治型轉移性黑色素瘤的病患進行了測試。病患在植入過繼轉移T細胞之前，接受淋巴清除調理方案，其由環磷醯胺（60mg/kg×2天）和氟達拉濱（25mg/m2 ×5天）所組成。患有骨髓瘤和淋巴瘤的病患接受淋巴清除性化學療法治療後，在淋巴瘤患者體內觀察到其細胞植入結果有所改善，同樣地在骨髓瘤和神經母細胞瘤病患群的隨機化世代（randomized cohorts）研究也顯示其細胞植入結果係有所改善。在這實驗中，係將NYCE T細胞投予至因化療毒性而引起淋巴細胞減少的個體。用來進行淋巴細胞清除的化療方案會對疾病有特異性。
預計在產品製造過程中會產生的細胞群 。 由於細胞經過以慢病毒載體進行的NY-ESO-1 TCR基因轉移和以CRISPR/Cas9針對PDCD1、TRAC和TRBC基因進行基因編輯，在製造過程中可能會產生16種自體T細胞群（表2）。
表2。
經過NY-ESO-1四聚體、抗CD3和抗PD-1抗體染色檢測後，上述16種的細胞類型降低至至6種可能的細胞表面表型。根據細胞的NY-ESO-1 TCR、PD-1、TCRα和TCRβ表現情況，這6種可能的細胞表面表型具有不同的潛在安全性和療效。表3分別列出這些類型的詳細情況。
表3。
細胞群＃1是野生型T細胞，其在製造期間未經轉導或編輯。根據先前的試驗結果，據推測這些自體T細胞是安全的並且沒有抗腫瘤活性。細胞群＃2是帶有轉基因TCR和保有內源性TCR的T細胞。這些細胞經臨床測試後證實有安全性，並且對肉瘤、黑色素瘤和骨髓瘤有抗腫瘤功效。細胞群＃9是PD-1被破壞且保有其內源性TCR的T細胞。根據PD-1拮抗劑的全身治療數據，這些細胞的毒性風險應該是低的，但其可能會介導自身反應性。不受任何理論的束縛，這些細胞可能會促進針對腫瘤的新表位（neo-epitopes）所產生的抗腫瘤反應出現「抗原擴散（antigenic spreading）」。細胞群＃3、5、7、11、13和15是內源性TCR被破壞的T細胞。據推測這些細胞十分罕見，且具有低毒性性，並且在過繼轉移後不會持續存在，因為在實驗環境中T細胞存活需要TCR信號。細胞群＃10、12、14和16是PD-1被破壞且對NY-ESO-1有專一性的T細胞。這些細胞可能具有較高的效用功能，並且預期不易受PD-1表現影響而發生耗竭現象。這個實驗的主要原理是它是一個競爭性的種群恢復實驗（repopulation experiment）：其係注入大量細胞，並預計會發生免疫競爭，而腫瘤微環境將選出「獲勝者」，其係針對具有NY-ESO-1專一性和PD1被破壞的T細胞可能會有較強功能的這個假設所進行的測試。
假設性實施例 2 ：向病患投予 NYCE T 細胞
NYCE T細胞是自體T細胞，其係經NY-ESO-1重定向（NY-ESO-1-redirected）和以CRISPR進行TCR內源性 和PD1基因編輯。自體T細胞將以慢病毒載體進行改造，以表現會專一性辨識NY-ESO-1胜肽片段（SLLMWITQC；SEQ ID NO：1）的T細胞受體，該NY-ESO-1胜肽片段會與HLA-A*0201形成複合體，其中將進行先導性試驗（pilot trial）以確定是否輸注自體NYCE T細胞（經轉導以表現NY-ESO-1 TCR且缺乏內源性TCR和PD-1）是安全的。該試驗的主要目的是確定NYCE T細胞在復發性和/或難治性多發性骨髓瘤（MM）、肉瘤和黑色素瘤病患中的安全性。這個試驗包括一個開放性的先導型研究。一般的程序架構如圖 14 所示。
將詢問患者是否允許對他們的HLA-A*201狀態和他們的腫瘤表達NY-ESO-1進行測試，以作為知情同意的一部分。首先會確認患者HLA-A*201的狀態。接著，對HLA-A*201陽性病患檢測其腫瘤組織的NY-ESO-1表現情況。可對歷史樣本（若可用）測試其表現情況（有關其他詳細訊息，請參見第6.1節）。HLA-A* 201為陽性且其腫瘤樣本有表現NY-ESO-1的患者，可以進行下一步驟並對其提陳主要知情同意書以進行額外篩檢。
在研究中，將對參加的個體的疾病進行一般性的實驗室和影像學評估。符合條件的個體將進行穩態血球分離術，以獲得大量的周邊血液單核細胞（PBMC）以進行製造。進入研究前，先前從病患收集到的冷凍保存血球分離成分產物可用來製造下述細胞，只要該產物是由適當認證的血球分離術中心所收集的且該產物有足夠的單核細胞產量。若先前沒有收集過血球分離成分產物，將在研究開始後安排患者進行血球分離術。T細胞將從PBMC中純化，以慢病毒載體轉導來遞送重組型NY-ESO-1 TCR，並以電穿孔方式導入CRISPR/Cas9複合體，在試管環境下（in vitro）進行擴增，接著將其冷凍以進行未來的投予。與成功製造出細胞的受試者個數相比，T細胞收集不足、未完成擴增或製造不足的個體數量將被記錄。
從血球分離術起算到NYCE T細胞準備好輸注，製造細胞和放出產物需要4到5週。病患可以接受額外的專一性抗腫瘤治療，以便在此間隔期間根據醫生的判斷來控制病情。然而，在預計輸注的前2週內，病患必須停止所有的治療。
可招收最多18個可評估的個體：包括6名骨髓瘤個體、6名肉瘤個體和6名黑色素瘤個體。將先納入患有多發性骨髓瘤和肉瘤的病患，而預計在確認有初始安全性後，進行擴大編收以納入黑色素瘤病患。個體將被連續招收。每種疾病適應症的前2位個體其輸注將錯開28天，以觀察不良反應事件。
如果臨床目標劑量不適合特定個體，則該個體可選擇進行第二次血球分離術和細胞的製造。或者，可以用低於目標劑量的可用劑量來治療個體。在這種情況下，將針對個體的主要指標（安全性和可行性）進行評估，但不評估其療效次要指標。未接受NYCE T細胞植入的個體會被替換。
所有個體將定期進行評估、身體檢查和血液檢查，以評估NYCE T細胞的安全性和植入情況/持久性。
所有適應症均將在輸注後28天和第3個月進行疾病評估。
正式骨髓瘤反應評估將根據國際骨髓瘤工作小組（IMWG）標準在第14天和第28天進行，接著每月評估一次，直到第180天，接著每3個月一次最多直至第2年。對患有多發性骨髓瘤的個體會進行骨髓抽吸/切片檢查，以在第28天和第3個月評估其骨髓漿細胞負荷（burden）。
黑色素瘤反應評估將用以下方式完成：（i）對可見的皮膚腫瘤進行臨床檢查、（ii）依據RECIST 1.1標準進行放射攝影（電腦斷層掃描）、（iii）對切除下來的腫瘤組織進行病理學評估。
肉瘤反應評估將依據RECIST 1.1標準，使用放射攝影（電腦斷層掃描）來進行。針對滑膜肉瘤，是針對患者胸部進行電腦斷層掃描；針對黏液樣/圓形細胞脂肪肉瘤（MRCL），會針對患者胸部/腹部/骨盆進行電腦斷層掃描。如果在肢體或骨盆中有無法局部切除的疾病，將以MRI在有/無釓顯影劑的情況下進行評估（沒有適用於腫瘤進展的實驗室研究）。
將在第28天收集後續的活組織（腫瘤、骨髓），並根據主治醫師的判斷做出臨床指示；來自這些活組織切片的樣品可以提供給轉譯及相關性研究實驗室（Translational and Correlative Studies Laboratory，TCSL）以進行相關研究。
在主要追蹤階段中止後，將對個體進行長期追蹤，時間從NYCE細胞輸注起算長達5年。在長期追蹤期間，會監測個體可能發生的而與NYCE T細胞輸注相關的延遲性不良反應事件，以及其T細胞持續性和疾病進展（如果可行的話）。
實施例 2 ： PD1-CD28 切換受體會逃避腫瘤微環境的抑制來增強 NY-ESO-1 TCR T 細胞功能
對於使用TCR基因改造T細胞所進行之有效的過繼性癌症免疫治療來說，安全性和效力是其兩個主要訴求。目前使用TCR改造T細胞來治療癌症的療法（特別是對於實體腫瘤）係受限於T細胞功能不佳和T細胞持續性不佳，這主要是受到由腫瘤微環境所引起的T細胞功能減退和耗竭現象所影響，而導入的TCR與內源性TCR所產生的配對錯誤，或使用親和力經增強的TCR所可能產生的非預期脫靶毒性等安全性問題，亦皆會對使用TCR改造T細胞所進行的癌症治療有所限制。
在野生型NY-ESO-1 TCR轉移的T細胞使用CRSIPR/CAS9對 TRAC和TRBC等基因進行高效多重基因破壞後，結果發現不論在試管環境（in vitro）或體內環境（in vivo，為小鼠腫瘤模型）下均會對抗原特異性的T細胞改善其功能。
以電穿孔方式來轉移有8F NY-ESO-1 TCR的T細胞其分析結果如圖15A至圖15C所示。圖15A顯示TRAC/TRBC表現被破壞的CD3陰性 （CD3¯）T細胞其CD3和轉移TCR（VB8）的表現結果，所述T細胞係以電穿孔方式導入8F NY-ESO-1 TCR（TCR EP）的TCR α鏈和β鏈的RNA。圖15B顯示轉移有8F NY-ESO-1 TCR且其TRAC/TRBC經CRISPR/CAS9破壞的CD3陰性T細胞（TCR EP/CD3-）其裂解活性，其係與轉移有相同TCR但未經CRISPR/CAS9基因編輯的正常CD3陽性T細胞（TCR EP/CD3+）進行比較。圖15C顯示轉移有8F NY-ESO-1 TCR且其TRAC/TRBC經CRISPR/CAS9破壞的CD3陰性T細胞（TCR EP/CD3-）其細胞激素生成量，其係與轉移有相同TCR但未經CRISPR/CAS9基因編輯的正常CD3陽性T細胞（TCR EP/CD3+）進行比較。
以CRISPR進行基因編輯且轉導有NY-ESO-1 TCR 的T細胞所進行的壓力測試結果如圖16A至圖16B所示。圖16A顯示在有轉導（TD），或未轉導（NO TD有8F NY-ESO-1 TCR並以不同劑量CRISPR/CAS9 RNA所進行之基因編輯的T細胞，其TCR（VB8）、CD3和PD1的表現結果。圖16B顯示以不同劑量CRISPR/CAS9 RNA所進行之基因編輯的T細胞其擴增結果。
參照圖17，圖17顯示NY-ESO-1/HLA-A2陽性細胞株NALM6-ESO或624mel在經過T細胞刺激（該T細胞係轉導有8F NY-ESO-1 TCR（TCR TD）並以不同劑量的CAS9/gRNA進行TRAC/TRBC/PD1破壞）後，其細胞激素生成量。
針對轉導有不同TC的T細胞檢查其TRAC/TRBC的破壞結果（圖 18 ）。圖18顯示TRAC和TRBC被破壞的T細胞，其轉導TCR的表現情形以及四聚體染色結果，所述的TRAC和TRBC被破壞的T細胞係轉導有野生型NY-ESO-1 TCR（8F或1G4）或親和力增強的1G4 NY-ESO-1 TCR（Ly95）。
圖19顯示不同NY-ESO-1/HLA-A2陽性細胞系（Nalm6-ESO、624mel或A549-ESO）被TRAC和TRBC被破壞的T細胞刺激後的細胞因子產生水平，其中所述T細胞係被轉導野生型NY-ESO-1 TCR（8F或1G4）或親和力增強的1G4 NY-ESO-1 TCR（Ly95）。
圖20顯示TRAC和TRBC被破壞的T細胞其裂解活性，所述T細胞係被轉導野生型NY-ESO-1 TCR（8F或1G4）或親和力增強的1G4 NY-ESO-1 TCR（Ly95）以對抗A549-ESO腫瘤細胞株。
以CRISPR/CAS9破壞TRAC和TRBC，會提高轉導野生型和親和力增強的NY-ESO-1的T細胞功能，然而僅有轉導野生型TCR的T細胞維持其專一性（圖21A-21B）。圖21A顯示將不同量且於試管環境中轉錄出的HLA-A2 RNA以電穿孔方式導入K562細胞後，其HLA-A2的表現情況。圖21B顯示在TRAC和TRBC被破壞的T細胞中其CD107a的表現情況，所述T細胞係為野生型NY-ESO-1 TCR（8F或1G4）或親和力增強的1G4 NY-ESO-1 TCR（Ly95）所轉導，並受到下列細胞的刺激：NY-ESO-1/HLA-A2陽性腫瘤細胞株（624mel和A549-ESO）、NY-ESO-1/HLA-A2陰性腫瘤細胞A549、及NY-ESO-1陰性且以不同劑量的HLA-A2 RNA進行電穿孔的K562細胞。
為進一步提高轉移NY-ESO-1 TCR的T細胞的體內抗腫瘤活性，將一PD1切換受體（PD1-CD28）合併導入TRAC和TRBC被破壞的NY-ESO-1 T細胞，前述PD1切換受體具有部分缺失型態的（truncated）PD1細胞外結構域和CD28的跨膜及細胞質訊號結構域。
將NYESO-1 TCR和PD1-CD28切換受體轉殖到同一個慢病毒載體中。因此，如圖22所示，慢病毒載體含有NYESO-1 TCRα鏈、NYESO-1 TCRβ鏈和PD1-CD28切換受體、以及WPRE、cPPR和EF-1α啟動子等序列。
圖22為慢病毒載體圖譜。如圖所示，PD1-CD28序列藉由本發明所述的F2A序列與NY-ESO-1（8F）序列所區隔。NY-ESO-1（8F）α和β鏈序列被本發明所述的F-GS2-T2A序列所區隔。
對經CRISPR/CAS9基因編輯、轉導有NY-ESO-1 TCR（8F）且在有或沒有共表現PD1-CD28切換受體的T細胞，進行試管環境（in vitro）功能測試（圖23A-23B）。圖23顯示，在TCR KO T細胞中，其細胞激素生成量（圖23A）和腫瘤特異性裂解程度（圖23B）有顯著增加。
如圖24A至圖25C所示，相較於帶有TRAC/TRBC雙重破壞或TRAC/TRBC/PD1三重破壞的NY-ESO-1 T細胞，用共表現有PD1-CD28及NY-ESO-1的T細胞來治療荷瘤小鼠，將使其腫瘤體積顯著消退，這是由於以下原因所致：有較多的腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）出現、對腫瘤所誘發之功能減退的感受性降低、對於例如經由TGFβ、腺苷、吲哚胺2,3-雙加氧酶（Indoleamine 2,3-dioxygenase；IDO）、低氧和調節性T細胞（Treg）等分子所致之腫瘤衍生抑制出現抗性。
在第0天皮下注射A549.ESO.CBG（5×106 個細胞/小鼠）。在第9天靜脈注射腫瘤T細胞（1×107 個細胞/小鼠）（圖24A至圖25B）。圖24A顯示每週進行的BLI（生物冷光影像）。圖24B顯示在T細胞治療前一天和治療後的每週所測量到的腫瘤尺寸。以下說明圖24B中的各個術語，NTD：未轉導；8F PD1 KO：轉導8F且PD1被破壞的T細胞；8F DKO：轉導8F且TRAC和TRBC被破壞的T細胞；8F TKO：轉導8F且TRAC、TRBC和PD1被破壞的T細胞；PD1CD28.8F DKO：轉導8F和PD1-CD28切換受體且TRAC和TRBC被破壞的T細胞。
進行第二組的小鼠實驗（圖25A至圖25C）。圖25A為所實驗各組之表格，其中每組有10隻小鼠。圖25B顯示小鼠實驗的時間軸。圖25C為小鼠的BLI（生物冷光影像）。圖25D顯示在T細胞治療前一天和治療後的每一周所測量到的腫瘤尺寸折線圖。
進行篩選以鑑定出有效靶向TRAC、TRBC和PD1的gRNAs（圖26A至圖26C）。將帶有靶向TRAC，TRBC和PD1的gRNAs的CRISPR/CAS9 RNA分別以電穿孔方式遞送至T細胞中來進行篩選，其TRAC（圖26A）、TRBC（圖26B）和PD1（圖26C）基因破壞效率如圖26A至26C所示。
以Guide-seq來檢測脫靶情況（圖27A-27D）。圖27A所示的表格列示各組樣品的處理方式。圖27B顯示各樣品其T細胞的PD1和CD3表現情況。圖27C所示結果，係確認雙股寡脫氧核苷酸（double-stranded oligodeoxynucleotides，dsODN）已插入DNA雙鏈斷裂處（double strand breaks，DSBs）。圖27D為以Guide-seq進行之脫靶位點檢測結果的簡單描述。脫靶位點的百分比為：第I組引導RNA：1.7％；第II組引導RNA：0.19％。
在TRAC/TRBC被雙重破壞的PD1-CD28 NY-ESO-1 T細胞中額外破壞Tim-3，對小鼠大型確立實體瘤的控制展現出協同效應。如圖28A至圖28D所示，其係篩選出有效靶向免疫檢查點蛋白TIM-3的gRNAs。圖28A為了在篩檢中所使用的gRNA序列（SEQ ID NO：98至SEQ ID NO：126）。圖28B顯示由各TIM-3 gRNA所破壞的T細胞其TIM-3的表現。圖28C顯示各測試gRNA其TIM-3剔除/敲落的效率。圖28D顯示TRAC/TRBC/PD1/TIM-3被破壞的T細胞，以及TRAC/TRBC/PD1被破壞的T細胞其CD3、PD1或TIM-3的表現。
以CRISPR系統所進行的TIM-3破壞展現了進一步的功效（圖29A至圖29B）。圖29示出了受A549-ESO腫瘤（n = 5）挑戰的小鼠其腫瘤尺寸曲線圖，這些小鼠係經下列細胞所治療：轉導8F NY-ESO-1 TCR且TRAC/TRBC被破壞的T細胞（8F.DK）、轉導8F NY-ESO-1 TCR且TRAC/TRBC/PD1被破壞的T細胞（8F.TK-PD1）、轉導8F NY-ESO-1 TCR且TRAC/TRBC/TIM-3被破壞的T細胞（8F.TK-Tim3）、轉導8F NY-ESO-1 TCR且 TRAC/TRBC/PD1/TIM-3被破壞的T細胞（8F.QK）、轉導8F NY-ESO-1 TCR的T細胞（8F.TCR）、轉導8F NY-ESO-1 TCR 與PD1-CD28切換受體且TRAC/TRBC被破壞的T細胞（8F.DKS）或轉導8F NY-ESO-1 TCR和PD1-CD28切換受體且TRAC/TRBC/TIM-3被破壞的T細胞（8F.TKS），No TD：未轉導的T細胞。圖29B顯示經治療小鼠其生物冷光影像（BLI）。
結果發現，帶有PD1-CD28切換受體且轉導NY-ESO-1 TCR的T細胞，其抗腫瘤功能的改善與基因表現圖譜的顯著改變有關（圖30A至圖30C）。圖30A顯示從接受不同治療方式的小鼠（n = 3）所分離出來的腫瘤浸潤淋巴細胞（TILs）數量。圖中的術語請參照以下說明，Cont：控制組；DK：用轉導8F TCR且TRAC/TRBC被破壞的T細胞進行治療；TK：用轉導8F TC且TRAC/TRBC/PD1被破壞的T細胞進行治療；DKS：用轉導8F TCR和PD1-CD28切換受體且TRAC/TRBC被破壞的T細胞進行治療。圖30B顯示受A549-ESO腫瘤細胞株刺激的腫瘤浸潤淋巴細胞其CD137表現。圖30C顯示受A549-ESO腫瘤細胞株刺激的腫瘤浸潤淋巴細胞其IFN-γ分泌。
在TRAC/TRBC被雙重破壞的PD1-CD28 NY-ESO-1 T細胞中，其與T細胞活化和CD28共刺激信號傳導有關的大規模基因表現模式變化結果如圖31A至圖31F所示。圖31A提供了從RNA-seq結果所得的基因表現差異數一覽。圖31B顯示基因組富集分析，其比較了轉導8F和PD1-CD28切換受體且TRAC/TRBC被破壞的T細胞（DKS）以及轉導8F且TRAC/TRBC被破壞的T細胞（DK）。基因集富集分析顯示涉及362個基因組（gene sets）的1790個富集基因。圖31C的結果顯示，排名前20的途徑有免疫反應、T細胞活化、核酸代謝過程、基因合成/表現及細胞週期。圖31D顯示DK組對比DKS組的免疫系統處理途徑相關基因集合的富集分析結果。圖31E為CD28途徑相關基因其熱度圖（heat map）。圖31F為與T細胞功能相關的細胞激素受體其熱度圖。其中，TK代表轉導8F TCR且TRAC/TRBC/PD1被破壞的T細胞。
圖31G和31H顯示，表現NY-ESO-1TCR和PD1-CD28轉換受體的腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）有特殊的基因表現分佈。圖31G顯示A549腫瘤切片中圖中所指之各種腫瘤浸潤淋巴細胞的分佈情況。如圖所示，表現有PD1-CD28轉換受體的NY-ESO-1腫瘤浸潤淋巴細胞，在腫瘤切片的右側具有較高的分佈。底部圖像是所有四個分佈的疊加圖。圖中的術語請參照以下說明，DK：TRAC/TRBC被破壞的NY-ESO-1 TCR T細胞；TK-PD1：TRAC/TRBC/PDCD1被破壞的NY-ESO-1 TCR T細胞；DKS：TRAC/TRBC被破壞且表現PD1-CD28切換受體的NY-ESO-1 TCR T細胞；NTD：未轉導。圖31H顯示DK組對比DKS組的細胞活化調控、免疫系統過程、細胞-細胞黏附調控、T細胞受體信號傳導途徑、受體活性和信號轉導活性基因組的富集分析結果。
實施例 3 ： PD1-CD28 切換受體藉由逃避腫瘤微環境的抑制來增強 NY-ESO-1 TCR T 細胞功能
已知轉化生長因子β（TGFβ）和腺苷為存在於腫瘤微環境中的免疫抑制信號。如圖32A至圖32B所示，相較於未轉導PD1-CD28切換受體的T細胞，轉導NY-ESO-1 TCR（8F）和PD1-CD28切換受體的T細胞對TGFβ和腺苷的抗性更高。圖32A顯示出表現有NY-ESO-1 TCR的T細胞其TGFβ抑制抗性以及腺苷抑制抗性，圖32B顯示出在TGFβ或腺苷的存在下，受A549-ESO腫瘤細胞株刺激的不同T細胞其CD107a表現情況。圖中的術語請參照以下說明，8F DK：轉導8F TCR且TRAC/TRBC被破壞的T細胞；8F.TK.PD1：轉導8FTCR且TRAC/TRBC/PD1被破壞的T細胞；8F.TK.Tim3：轉導8FTCR 且TRAC/TRBC/TIM-3被破壞的T細胞；8F DKS：轉導8F TCR和PD1-CD28切換受體且TRAC/TRBC被破壞的T細胞；8F TKS.Tim3：轉導8F TCR和PD1-CD28切換受體且TRAC/TRBC/TIM-3被破壞的T細胞。
已知調節性T細胞（Tregs）會抑制T細胞的功能。如在圖33A至33B所示，相較於8F DK和8F.TK.PD1細胞，8F DKS細胞對調節性T細胞所造成的抑制有較高的抗性。圖33A顯示NY-ESO-1 TCR T細胞對調節性T細胞抑制的抗性。圖33B顯示在不同量的調節性T細胞存在下，不同T細胞受到A549-ESO腫瘤細胞株刺激後，其羧基琥珀醯亞胺酯（carboxyfluorescein succinimidyl ester，CFSE）稀釋情況。
PD1-CD28切換受體也被發現賦予了NY-ESO-1 TCR T細胞對缺氧抑制的抗性。圖33C藉由測量圖中所指之各種培養液中的IFNγ生成量，證實了圖中所指之各種8F T細胞（NY-ESO-1 TCR T細胞）對缺氧抑制有較高的抗性。8F.DK代表TRAC和TRBC被破壞的8F NY-ESO-1 TCR T細胞；8F.TK代表TRAC、TRBC和PDCD1被破壞的8F NY-ESO-1 TCR T細胞；8F.DKS代表TRAC和TRBC被破壞且額外表現切換受體的8F NY-ESO-1 TCR T細胞。
實施例 4 ： TGFβR-IL12R 切換受體
TGFβR-IL12R切換受體還進一步改善轉導有NY-ESO-1 TCR的T細胞功能。TGFβR-IL12R切換受體能促進T細胞的功能（圖34A-34B）。圖34A為所述TGFβR-IL12R切換受體的示意圖。存在或不存在TGFβI的情況下，轉移有NY-ESO-1 TCR且也共同轉移有TGFβR-IL12切換受體或顯性負性TGFβR（DN）的不同T細胞，其細胞激素生成量如圖34B所示。
實施例 5 ：高親和力 PD1 切換受體會提高 NY-ESO-1 TCR T 細胞的功能
幾種切換受體係使用本領域已知方法所產生，並使用本文他處所描述的序列。高親和力的PD1切換受體—PD1A132L -41BB，其包括變異型PD1細胞外結構域、CD8α跨膜結構域以及4-1BB胞質結構域，該變異型PD1細胞外結構域其相對於PD1全長胺基酸序列上的第132個胺基酸由丙胺酸被取代為白胺酸（A132L）。PD1的A132L取代會增加其對PD-L1的親和力。參見，例如，Zhang等人，Immunity 2004,20：337-347。PD1-41BB、TIM3-CD28和PD1A132L -CD28切換受體也是使用本領域已知方法以及本文他處所描述的序列所產生。
在Matrigel™中的5×106 個腫瘤（A549ESO）細胞係在第0天將其進行皮下注射。在第8天靜脈內注射10×106 個8F-Vβ8陽性的T細胞。每週以生物冷光影像（BLI）分析來監測腫瘤生長。NY-ESO-1 TCR（8F）陽性T細胞有以下表型：只表現有 NY-ESO-1 TCR（8F）；表現有NY-ESO-1 TCR（8F）和PD1.CD28切換受體（PD1-CD28）；表現有NY-ESO-1 TCR（8F）和PD1*.CD28切換受體（PD1A132L -CD28）；表現有NY-ESO-1 TCR（8F）和PD1.BB切換受體（PD1-41BB）；或表現有NY-ESO-1 TCR（8F）和PD1*.BB切換受體（PD1A132L -41BB）。未轉導的T細胞（UTD）係作為對照。在圖35A中，注射有圖中所指的T細胞的小鼠，其BLI分析結果顯示出高親和力的PD1切換受體（即，PD1*.CD28和PD1*.bb）會提升NY-ESO-1重定向T細胞的抗腫瘤活性。圖35B為圖中所指各組別其平均發光強度的定量結果。圖35C圖為注射不同組別的T細胞後每週所測量到的腫瘤尺寸圖。圖中的術語請參照以下說明，UTD：未轉導；CD28：轉導NY-ESO-1 TCR（8F）和PD1.CD28切換受體（PD1-CD28）；CD28＃：轉導NY-ESO-1 TCR（8F）和PD1*.CD28切換受體（PD1A132L -CD28）；BB：轉導NY-ESO-1 TCR（8F）和PD1.BB切換受體（PD1-41BB）；BB＃：轉導NY-ESO-1 TCR（8F）和PD1*.BB切換受體（PD1A132L -41BB）。
在圖36A中，注射有圖中所指T細胞的小鼠，其BLI分析結果顯示高親和力的PD1切換受體（即PD1*.CD28和PD1*.bb）會提升NY-ESO-1重定向T細胞的抗腫瘤活性。圖 36B 為圖中所指各組別其平均發光強度的定量結果。圖 36C 為注射不同組別的T細胞後每週所測量到的腫瘤尺寸曲線圖。由上至下的各組分別為：A：未轉導且TRAC/TRBC被破壞的T細胞（DKO UTD）；B：轉導NY-ESO-1 TCR（8F）且TRAC/TRBC被破壞的T細胞（8F DKO）；C：轉導NY-ESO-1 TCR（8F）且TRAC/TRBC/PDCD1/TIM3被破壞T細胞（8F DKO + PD1&Tim3KO）；D：轉導NY-ESO-1 TCR（8F）與TIM3-CD28切換受體且TRAC/TRBC被破壞的T細胞（Tim3CD28.8F DKO）；E：轉導NY-ESO-1 TCR（8F）與TIM3-CD28切換受體且TRAC/TRBC/PDCD1被破壞的T細胞（Tim3CD28.8F DKO + PD1 KO）；F：轉導NY-ESO-1 TCR（8F）與PD1A132L -41BB切換受體且TRAC/TRBC被破壞的T細胞（PD1* BB.8F DKO）；G：轉導NY-ESO-1 TCR（8F）與PD1A132L -41BB切換受體且TRAC/TRBC/TIM3被破壞的T細胞（PD1*BB.8F DKO + Tim3KO）；H：轉導NY-ESO-1 TCR（8F）、PD1A132L -41BB切換受體與TIM3-CD28切換受體且TRAC/TRBC被破壞的T細胞（PD1*BB.Tim3CD28.8F DKO）；和I：轉導NY-ESO-1 TCR（8F）與PD1-CD28切換受體且TRAC/TRBC/TIM3被破壞的T細胞（PD1CD28.8F DKO + Tim3KO）。圖36D顯示注射有圖中指定之T細胞小鼠其BLI影像，結果證實高親和力的PD1切換受體會提高8F NY-ESO-1 TCR重定向的抗腫瘤活性。圖36E為注射不同組別的T細胞後於不同時間點所測量到的腫瘤尺寸折線圖。以下為圖36D和36E中的術語說明：UTD：未轉導的T細胞；PD1.CD28.8F（圖36E中的CD28）：帶有PD1-CD28切換受體且轉導有8F NY-ESO-1 TCR的T細胞；PD1*.CD28.8F（圖36E中的CD28＃）：帶有PD1A132L- CD28切換受體且轉導有8F NY-ESO-1 TCR的T細胞；PD1.BB.8F（圖36E中的BB）：帶有PD1-41BB切換受體且轉導有8F NY-ESO-1 TCR的T細胞；PD1*.BB.8F（圖36E中的BB＃）：帶有PD1A132L -41BB切換受體且轉導有8F NY-ESO-1 TCR的T細胞；8F：轉導有8F NY-ESO-1 TCR的T細胞。
無。
從以下說明性實施例的詳細描述以及附圖，將更全面地理解本發明的前述和其他特徵和優點。
圖1顯示由第I組TRAC gRNA所靶向的細胞株中一部分內源性TRAC基因之定序結果。
圖2顯示由第I組TRBC gRNA所靶向的細胞株中一部分內源性TRBC基因之定序結果。
圖3顯示由第I組PD1 gRNA所靶向的細胞株中一部分內源性PD1基因之定序結果。
圖4顯示用不同濃度的Cas9 RNA加上針對TCRα、β和PD1的gRNA導入NY-ESO-1 TCR轉導T細胞後其擴增結果。
圖5顯示以流式細胞術來分析內源性TCR基因編輯效率的結果。
圖6顯示NY-ESO-1特異性TCR的表面表現隨著內源性TCR靶向gRNA的劑量增加而有所增強。
圖7顯示PD1基因編輯效率的流式細胞術分析結果。
圖8顯示以Surveyor檢測法所進行的基因編輯百分比的分析結果。
圖9為流式細胞術分析結果，其顯示經TCR內源性 和PD1基因編輯的NY-ESO-1轉導T細胞其響應腫瘤而脫粒的能力。
圖10顯示經TCR內源性 和PD1基因編輯之NY-ESO-1轉導T細胞其響應腫瘤而釋放IFNγ或IL-2的能力。
圖11顯示經TCR內源性 和PD1基因編輯之NY-ESO-1轉導T細胞其裂解NY-ESO-1表現腫瘤的能力。
圖12顯示經TCR內源性 和PD1基因編輯之NY-ESO-1轉導T細胞其長期培養結果。
圖13顯示長期培養結束時NY-ESO-1 TCR的表現。
圖14為一示意圖，其描述投予NYCE T細胞的一般流程。
圖15A至圖15C顯示以電穿孔來轉移8F NY-ESO-1 TCR的T細胞其特性分析結果。
圖16A至圖16B顯示經CRISPR基因編輯之NY-ESO-1 TCR轉導T細胞其壓力測試結果。
圖17顯示經基因編輯的T細胞受刺激後其細胞因子生成量。
圖18顯示8F、1G4或Ly95轉導的T細胞其流式細胞術分析結果。
圖19顯示不同NY-ESO-1/HLA-A2陽性細胞株其細胞因子生成量。
圖20顯示不同TRAC和TRBC破壞的T細胞其裂解活性。
圖21A至圖21B顯示TRAC和TRBC破壞會改善NY-ESO-1 TCR轉導T細胞的功能。
圖22為帶有NY-ESO-1 TCR和PD1-CD28切換受體的慢病毒圖譜。
圖23A至圖23B顯示經CRISPR/CAS9基因編輯的NY-ESO-1 TCR（8F）轉導T細胞其體外功能試驗（有或無共表現PD1-CD28切換受體）結果。
圖24A至圖24B顯示第一組的小鼠實驗其生物冷光影像和數據。
圖25A至圖25D顯示第二組的小鼠實驗其生物冷光影像和數據。圖25D顯示在T細胞治療前一天和治療後的每週所測量到的腫瘤尺寸。
圖26A至圖26C顯示T細胞的CRISPR/Cas9基因破壞效率的一系列檢測結果。
圖27A至圖27D顯示以Guide-seq.進行的gRNAs脫靶檢測結果。
圖28A至圖28D顯示T細胞的CRISPR/Cas9基因破壞效率的一系列檢測結果。
圖29A至圖29B顯示破壞TIM-3的進一步功效數據。
圖30A至圖30C所顯示的數據，代表NY-ESO-1 TCR轉導T細胞其抗腫瘤特性有所增進，所述NY-ESO-1 TCR轉導T細胞帶有PD1-CD28切換受體。
圖31A至圖31F所顯示數據，代表經轉導的T細胞中有大量基因其表現模式有改變。
圖31G至圖31H所顯示的數據，代表所示的各種T細胞中其基因表現分佈和模式改變結果。
圖32A至圖32B所顯示的數據，代表經NY-ESO-1 TCR（8F）和PD1-CD28切換受體所轉導的T細胞對TGFβ和腺苷的抗性有所增加。
圖33A至圖33B所顯示的數據，代表經NY-ESO-1 TCR（8F）和PD1-CD28切換受體轉導的T細胞展現出對Treg的抗性。
圖33C顯示所示的各種NY-ESO-1 TCR（8F）T細胞對缺氧抑制的抗性增加。
圖34A至圖34B顯示TGFβR-IL12R切換受體增進NY-ESO-1 TCR轉導T細胞的功能。
圖35A至圖35C顯示高親和力PD1切換受體增強NY-ESO-1 TCR的抗腫瘤活性。圖35A為生物冷光影像，圖35B顯示對應的輻射量化結果。圖35C顯示所示各組其腫瘤尺寸隨時間的變化結果。UTD：未轉導；CD28：NY-ESO-1 TCR（8F）和PD1.CD28切換受體（PD1-CD28）；CD28＃：NY-ESO-1 TCR（8F）和PD1*.CD28切換受體（PD1A132L -CD28）；BB：NY-ESO-1 TCR（8F）和PD1.BB切換受體（PD1-41BB）；BB＃：NY-ESO-1 TCR（8F）和PD1*.BB切換受體（PD1A132L -41BB）；8F：NY-ESO-1 TCR。
圖36A至圖36E顯示高親和力PD1切換受體增強NY-ESO-1 TCR的抗腫瘤活性。圖36A為生物冷光影像，圖35B顯示對應的輻射量化結果。圖36C顯示所示各組其腫瘤尺寸隨時間的變化結果。A：未經轉導的T細胞且其TRAC/TRBC被破壞（UTD DKO）；B：經NY-ESO-1 TCR（8F）轉導、TRAC/TRBC被破壞的T細胞（8F DKO）；C：經NY-ESO-1 TCR（8F）轉導、TRAC/TRBC/PDCD1/TIM3被破壞的T細胞（8F DKO+PD1和Tim3 KO）；D：經NY-ESO-1 TCR（8F）轉導、帶有TIM3-CD28切換受體、且其TRAC/TRBC被破壞的T細胞（Tim3CD28.8F DKO）；E：經NY-ESO-1 TCR（8F）轉導、帶有TIM3-CD28切換受體、且其TRAC/TRBC/PDCD1被破壞的T細胞（Tim3CD28.8F DKO+PD1 KO）；F：經NY-ESO-1 TCR（8F）轉導、帶有PD1A132L -41BB切換受體、且其TRAC/TRBC被破壞的T細胞（PD1*BB.8F DKO）；G：經NY-ESO-1 TCR（8F）轉導、帶有PD1A132L -41BB切換受體、且其TRAC/TRBC/TIM3被破壞的T細胞（PD1*BB.8F DKO+Tim3KO）；H：經NY-ESO-1 TCR（8F）轉導，帶有PD1A132L -41BB切換受體、帶有TIM3-CD28切換受體、且其TRAC/TRBC被破壞的T細胞（PD1*BB.Tim3CD28.8F DKO）；和I：經NY-ESO-1 TCR（8F）轉導、帶有PD1-CD28切換受體、且其TRAC/TRBC/TIM3被破壞的T細胞（PD1CD28.8F DKO+Tim3KO）。圖36D顯示被注射T細胞的小鼠的生物冷光影像（bioluminescence imaging，BLI）。圖36E顯示所示各組於注射T細胞後在所示不同時間點所測量到的腫瘤尺寸。在圖36D和36E中：UTD：未轉導的T細胞；PD1.CD28.8F（圖36E中的CD28）：具有PD1-CD28切換受體的8F NY-ESO-1 TCR 轉導T細胞；PD1*.CD28.8F（圖36E中的CD28＃）：具有PD1A132L -CD28切換受體的8F NY-ESO-1 TCR 轉導T細胞；PD1.BB.8F（圖36E中的BB）：具有PD1-41BB切換受體的8F NY-ESO-1 TCR 轉導T細胞；PD1*.BB.8F（圖36E中的BB＃）：具有PD1A132L -41BB切換受體的8F NY-ESO-1 TCR 轉導T細胞；8F：8F NY-ESO-1 TCR T細胞。

Claims (115)

  1. 一種經修飾的T細胞，包括一外源性T細胞受體（TCR），該外源性T細胞受體對一目標細胞上的NY-ESO-1有親和力，其中一內源性T細胞受體編碼序列和/或一內源性免疫檢查點編碼序列的表現被下調。
  2. 如申請專利範圍第1項的經修飾的T細胞，其中該免疫檢查點編碼序列編碼一免疫檢查點蛋白，該免疫檢查點蛋白係選自於由PD1、A2AR、B7-H3（CD276）、B7-H4（VTCN1）、BTLA（CD272）、CD96、CTLA-4（CD152）、IDO、KIR、LAG3、TIGIT、TIM-3和VISTA所組成之群組。
  3. 如前述申請專利範圍任一項所述的經修飾的T細胞，其中該內源性TCR編碼序列為TRAC或TRBC。
  4. 如前述申請專利範圍任一項所述的經修飾的T細胞，其中至少一核苷酸取代（substitution）、缺失（deletion）、插入（insertion）和/或插入/缺失係位在包括SEQ ID NO：128所示之核酸序列的該內源性T細胞受體的α鏈編碼序列中，從而導致該內源性T細胞受體的α鏈編碼序列的表現被下調。
  5. 如前述申請專利範圍任一項所述的經修飾的T細胞，其中至少一核苷酸取代、缺失、插入和/或插入/缺失係位在包括SEQ ID NO：129所示之核酸序列的該內源性T細胞受體的β鏈編碼序列中，從而導致內源性T細胞受體的β鏈編碼序列的表現被下調。
  6. 如前述申請專利範圍任一項所述的經修飾的T細胞，其中至少一核苷酸取代、缺失、插入和/或插入/缺失係位在包括SEQ ID NO：130所示之核酸序列的該內源性PD1鏈編碼序列中，從而導致內源性PD1編碼序列的表現被下調。
  7. 如前述申請專利範圍任一項所述的經修飾的T細胞，其中可選地，至少一核苷酸取代、缺失、插入和/或插入/缺失係位在該內源性編碼序列中，該內源性編碼序列係選自A2AR、B7-H3（CD276）、B7-H4（VTCN1）、BTLA（CD272）、CD96、CTLA-4（CD152）、IDO、KIR、LAG3、TIGIT、TIM-3和VISTA，從而導致內源性A2AR、B7-H3（CD276）、 B7-H4（VTCN1）、BTLA（CD272）、CD96、CTLA-4（CD152）、IDO、KIR、LAG3、TIGIT、TIM-3或VISTA編碼序列的表現被下調。
  8. 如前述申請專利範圍任一項所述的經修飾的T細胞，其中該外源性T細胞受體包括一T細胞受體α鏈，且該T細胞受體α鏈包括SEQ ID NO：5所示之胺基酸序列。
  9. 如前述申請專利範圍任一項所述的經修飾的T細胞，其中該外源性T細胞受體包括一T細胞受體β鏈，且該T細胞受體β鏈包括SEQ ID NO：12所示之胺基酸序列。
  10. 一種經修飾的T細胞，包括： a）一外源性T細胞受體（TCR），其對一目標細胞上的NY-ESO-1有親和力，其中該外源性T細胞受體包括： （i）T細胞受體α鏈，包括SEQ ID NO：5所示之胺基酸序列；以及 （ii）T細胞受體β鏈，包括SEQ ID NO：12 所示之胺基酸序列； b）在包括SEQ ID NO：128所示之核酸序列的一內源性T細胞受體α鏈的編碼序列中具有至少一核苷酸取代、缺失、插入和/或插入/缺失；以及 c）在包括SEQ ID NO：129所示之核酸序列的一內源性T細胞受體β鏈的編碼序列中有至少一核苷酸取代、缺失、插入和/或插入/缺失， 其中該內源性T細胞受體α鏈和該內源性T細胞受體β鏈的編碼序列表現被下調。
  11. 如申請專利範圍第10項所述的經修飾的T細胞，更包括至少一核苷酸取代、缺失、插入和/或插入/缺失位在一內源性編碼序列中，該內源性編碼序列係選自PD1、A2AR、B7-H3（CD276）、B7-H4（VTCN1）、BTLA（CD272）、CD96、CTLA-4（CD152）、IDO、KIR、LAG3、TIGIT、TIM-3和VISTA。
  12. 如申請專利範圍第10項所述的經修飾的T細胞，更包括 d）至少一核苷酸取代、缺失、插入和/或插入/缺失位在包括SEQ ID NO：130所示之核酸序列的一內源性PD1編碼序列中。
  13. 一種經修飾的T細胞，包括一外源性T細胞受體（TCR），該外源性T細胞受體對目標細胞上的NY-ESO-1有親和力，其中一內源性T細胞受體α鏈的編碼序列及一內源性T細胞受體β鏈的編碼序列的表現被下調。
  14. 如申請專利範圍第13項的經修飾的T細胞，其中至少一核苷酸取代、缺失、插入和/或插入/缺失係位在包括SEQ ID NO ：128所示核酸序列的內源性T細胞受體α鏈的編碼序列中，從而導致該內源性T細胞受體α鏈的編碼序列的表現被下調。
  15. 如申請專利範圍第13至14項中任一項所述的經修飾的T細胞，其中至少一核苷酸取代、缺失、插入和/或插入/缺失係位在包括SEQ ID NO 129所示之核酸序列的內源性T細胞受體β鏈的編碼序列中，從而導致該內源性T細胞受體β鏈的編碼序列的表現被下調。
  16. 如前述申請專利範圍任一項所述的經修飾的T細胞，其中該經修飾的T細胞為一自體T細胞。
  17. 如前述申請專利範圍任一項所述的經修飾的T細胞，其中該自體T細胞係衍生自人類。
  18. 如前述申請專利範圍任一項所述的經修飾的T細胞，其中該自體T細胞為CD3+ T細胞。
  19. 一種經修飾的T細胞，包括： a）一外源性T細胞受體（TCR），其對一目標細胞上的NY-ESO-1有親和力，其中該外源性T細胞受體包括： （i）T細胞受體α鏈，包括SEQ ID NO：5所示之胺基酸序列；以及 （ii）T細胞受體β鏈，包括SEQ ID NO：12所示之胺基酸序列； b）在包括SEQ ID NO：128所示之核酸序列的一內源性T細胞受體α鏈的編碼序列中有至少一核苷酸取代、缺失、插入和/或插入/缺失； c）在包括SEQ ID NO：129所示之核酸序列的一內源性T細胞受體β鏈的編碼序列中有至少一核苷酸取代、缺失、插入和/或插入/缺失；以及 d）在包括SEQ ID NO：130所示之核酸序列的一內源性PD1編碼序列中有至少一核苷酸取代、缺失、插入和/或插入/缺失； 其中該內源性T細胞受體α鏈的編碼序列、該內源性T細胞受體β鏈的編碼序列及該內源性PD1編碼序列的表現被下調。
  20. 如申請專利範圍第19項所述的經修飾的T細胞，更包括至少一核苷酸取代、缺失、插入和/或插入/缺失位在一內源性編碼序列中，該內源性編碼序列係選自A2AR、B7-H3（CD276）、B7-H4（VTCN1）、BTLA（CD272）、CD96、CTLA-4（CD152）、IDO、KIR、LAG3、PD1、TIGIT、TIM-3和VISTA。
  21. 如前述申請專利範圍任一項所述的經修飾的T細胞，更包括一切換受體（switch receptor）。
  22. 如申請專利範圍第21項所述的經修飾的T細胞，其中該切換受體包括： 一第一結構域，其中該第一結構域係衍生自一第一多肽，且該第一多肽與一負向信號（negative signal）相關聯；以及 一第二結構域，其中該第二結構域係衍生自一第二多肽，且該第二多肽與一正向信號（positive signal）相關聯。
  23. 如申請專利範圍第22項所述的經修飾的T細胞，其中該第一結構域包括該第一多肽的一細胞外結構域的至少一部分，該第一多肽與一負向信號相關聯，且其中該第二結構域包括與該第二多肽的一細胞內結構域的至少一部分，該第二多肽與一正向信號相關聯。
  24. 如申請專利範圍第21至23項中任一項所述的經修飾的T細胞，其中該切換受體更包括一切換受體跨膜結構域。
  25. 如申請專利範圍第24項所述的經修飾的T細胞，其中該切換受體跨膜結構域包括： 一第一多肽的一跨膜結構域，該第一多肽與一負向信號相關聯；或者 一第二多肽的一跨膜結構域，該第二多肽與一正向信號相關聯。
  26. 如申請專利範圍第22至25項中任一項所述的經修飾的T細胞，其中與一負向信號相關聯的該第一多肽係選自於由TIM-3、CTLA4、PD-1、BTLA和TGFβR所組成之群組。
  27. 如申請專利範圍第22至26項中任一項所述的經修飾的T細胞，其中與一正向信號相關聯的該第二多肽係選自於由4-1BB、CD28、ICOS和IL-12R所組成之群組。
  28. 如申請專利範圍第22至27項中任一項所述的經修飾的T細胞，其中與一負向信號相關聯的該第一多肽為一變異型PD-1，該變異型PD-1相對於野生型PD-1的胺基酸序列，在胺基酸位置132的丙胺酸被取代為亮胺酸。
  29. 如申請專利範圍第22至27項中任一項所述的經修飾的T細胞，其中該切換受體包括： 一第一結構域，包括PD1的細胞外結構域的至少一部分； 一第二結構域，包括一切換受體跨膜結構域，該切換受體跨膜結構域包括CD28的跨膜結構域的至少一部分；以及 一第三結構域，包括CD28的胞內結構域的至少一部分。
  30. 如申請專利範圍第21至28項中任一項所述的經修飾的T細胞，其中該切換受體包括： 一第一結構域，包括PD-1的胞外結構域的至少一部分，其中該PD-1為一變異型，該變異型PD-1相對於野生型PD-1的胺基酸序列，在胺基酸位置132的丙胺酸被取代為亮胺酸； 一第二結構域，包括一切換受體跨膜結構域，該切換受體跨膜結構域包括CD28的跨膜結構域的至少一部分；以及 一第三結構域，包括CD28的胞內結構域的至少一部分。
  31. 如申請專利範圍第21至27項中任一項所述的經修飾的T細胞，其中該切換受體包括： 一第一結構域，包括PD-1的胞外結構域的至少一部分； 一第二結構域，包括一切換受體跨膜結構域，其包括CD8α的跨膜結構域的至少一部分；以及 一第三結構域，包括4-1BB的胞內結構域的至少一部分。
  32. 如申請專利範圍第21至28項中任一項所述的經修飾的T細胞，其中該切換受體包括： 一第一結構域，包括PD-1的胞外結構域的至少一部分，其中該PD-1為一變異型，該變異型PD-1相對於野生型PD-1的胺基酸序列，在胺基酸位置132的丙胺酸被取代為亮胺酸； 一第二結構域，包括一切換受體跨膜結構域，該切換受體跨膜結構域包括CD8α的跨膜結構域的至少一部分；以及 一第三結構域，包括CD28的胞內結構域的至少一部分。
  33. 如申請專利範圍第21至28項中任一項所述的經修飾的T細胞，其中該切換受體包括SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：134、SEQ ID NO：136或SEQ ID NO：138中任一者所示之胺基酸序列。
  34. 如申請專利範圍第21至27項中任一項所述的經修飾的T細胞，其中該切換受體包括： 一第一結構域，包括TIM-3的胞外結構域的至少一部分； 一第二結構域，包括一切換受體跨膜結構域，該切換受體跨膜結構域包括CD28的跨膜結構域的至少一部分；以及 一第三結構域，包括CD28的胞內結構域的至少一部分。
  35. 如申請專利範圍第34項所述的經修飾的T細胞，其中該切換受體包括SEQ ID NO：132所示之胺基酸序列。
  36. 如申請專利範圍第21至27項中任一項所述的經修飾的T細胞，其中該切換受體包括： 一第一結構域，包括TGFβR的細胞外結構域的至少一部分； 一第二結構域，包括IL-12R的細胞內結構域的至少一部分。
  37. 如申請專利範圍第36項所述的經修飾的T細胞，其中該切換受體包括SEQ ID NO：16所示之胺基酸序列。
  38. 如申請專利範圍第36項所述的經修飾的T細胞，其中該切換受體包括SEQ ID NO：18所示之胺基酸序列。
  39. 如申請專利範圍第21至36項中任一項所述的經修飾的T細胞，其中該切換受體包括一野生型蛋白的一截短變異型（truncated variant），該野生型蛋白與一負向信號相關聯。
  40. 如申請專利範圍第39項所述的經修飾的T細胞，其中該切換受體包括SEQ ID NO：20所示之胺基酸序列。
  41. 一種經修飾的T細胞，包括： a）一外源性T細胞受體（TCR），其對一目標細胞上的NY-ESO-1有親和力，其中該外源性T細胞受體包括： （i）T細胞受體α鏈，包括SEQ ID NO：5所示之胺基酸序列；以及 （ii）T細胞受體β鏈，包括SEQ ID NO：12所示之胺基酸序列； b）在包括SEQ ID NO：128所示之核酸序列的一內源性T細胞受體α鏈的編碼序列中有至少一核苷酸取代、缺失、插入和/或插入/缺失； c）在包括SEQ ID NO：129所示之核酸序列的一內源性T細胞受體β鏈的編碼序列中有至少一核苷酸取代、缺失、插入和/或插入/缺失；以及 d）一切換受體，包括SEQ ID NO：14所示之胺基酸序列， 其中該內源性T細胞受體α鏈的編碼序列的表現以及該內源性T細胞受體β鏈的編碼序列的表現被下調。
  42. 一種經修飾的T細胞，包括： a）一外源性T細胞受體（TCR），其對一目標細胞上的NY-ESO-1有親和力，其中該外源性T細胞受體包括： （i）T細胞受體α鏈，包括SEQ ID NO：5所示之胺基酸序列；以及 （ii）T細胞受體β鏈，包括SEQ ID NO：12所示之胺基酸序列； b）在包括SEQ ID NO：128所示之核酸序列的一內源性T細胞受體α鏈的編碼序列中有至少一核苷酸取代、缺失、插入和/或插入/缺失； c）在包括SEQ ID NO：129所示之核酸序列的一內源性T細胞受體β鏈的編碼序列中有至少一核苷酸取代、缺失、插入和/或插入/缺失；以及 d）一切換受體，包括SEQ ID NO：136所示之胺基酸序列， 其中該內源性T細胞受體α鏈的編碼序列的表現以及該內源性T細胞受體β鏈的編碼序列的表現被下調。
  43. 一種經修飾的T細胞，包括： a）一外源性T細胞受體（TCR），其對一目標細胞上的NY-ESO-1有親和力，其中該外源性T細胞受體包括： （i）T細胞受體α鏈，包括SEQ ID NO：5所示之胺基酸序列；以及 （ii）T細胞受體β鏈，包括SEQ ID NO：12所示之胺基酸序列； b）在包括SEQ ID NO：128所示之核酸序列的一內源性T細胞受體α鏈的編碼序列中有至少一核苷酸取代、缺失、插入和/或插入/缺失； c）在包括SEQ ID NO：129所示之核酸序列的一內源性T細胞受體β鏈的編碼序列中有至少一核苷酸取代、缺失、插入和/或插入/缺失； d）在一內源性TIM-3編碼序列中有至少一核苷酸取代、缺失、插入和/或插入/缺失；以及 e）一切換受體，包括SEQ ID NO：14所示之胺基酸序列， 其中該內源性T細胞受體α鏈的編碼序列的表現、該內源性T細胞受體β鏈的編碼序列的表現和該內源性TIM-3編碼序列的表現被下調。
  44. 一種經修飾的T細胞，包括： a）一外源性T細胞受體（TCR），其對一目標細胞上的NY-ESO-1有親和力，其中該外源性T細胞受體包括： （i）T細胞受體α鏈，包括SEQ ID NO：5所示之胺基酸序列；以及 （ii）T細胞受體β鏈，包括SEQ ID NO：12所示之胺基酸序列； b）在包括SEQ ID NO：128所示之核酸序列的一內源性T細胞受體α鏈的編碼序列中有至少一核苷酸取代、缺失、插入和/或插入/缺失； c）在包括SEQ ID NO：129所示之核酸序列的一內源性T細胞受體β鏈的編碼序列中有至少一核苷酸取代、缺失、插入和/或插入/缺失； d）一內源性編碼序列中的至少一核苷酸取代、缺失、插入和/或插入/缺失，該內源性編碼序列係選自A2AR、B7-H3 (CD276)、B7-H4 (VTCN1)、BTLA (CD272)、CD96、CTLA-4 (CD152)、IDO、KIR、LAG3、PD1、TIGIT、TIM-3和VISTA；以及 e）一切換受體，包括SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：134、SEQ ID NO：136和SEQ ID NO：138中任一者所示之胺基酸序列， 其中該內源性T細胞受體α鏈的編碼序列、該內源性T細胞受體β鏈的編碼序列和/或選自A2AR、B7-H3（CD276）、B7-H4（VTCN1）、BTLA（CD272）、CD96、CTLA-4（CD152）、IDO、KIR、LAG3、PD1、TIGIT、TIM-3或VISTA的該內源性編碼序列的表現被下調。
  45. 一種產生經修飾的T細胞的方法，包括： a）將一第一核酸導入一T細胞中，該第一核酸包括編碼一外源性T細胞受體（TCR）的一核酸序列，該外源性T細胞受體對一目標細胞上的NY-ESO-1有親和力；以及 b）將一或多個核酸導入該T細胞中，該一或多個核酸具有下調一或多個內源性基因其基因表現的能力，該一或多個內源性基因係選自於由T細胞受體α鏈、T細胞受體β鏈、A2AR、B7-H3（CD276）、B7-H4（VTCN1）、BTLA（CD272）、CD96、CTLA-4（CD152）、IDO、KIR、LAG3、PD1、TIGIT、TIM-3和VISTA所組成之群組。
  46. 如申請專利範圍第45項所述的方法，其中該第一核酸包括一T細胞受體α鏈編碼序列和一T細胞受體β鏈編碼序列。
  47. 如申請專利範圍第45項所述的方法，其中該T細胞受體α鏈編碼序列和該T細胞受體β鏈編碼序列係藉由一連接子所分開。
  48. 如申請專利範圍第47項所述的方法，其中該連接子包括一核酸序列，該核酸序列編碼一內部核糖體進入位點（internal ribosome entry site，IRES）。
  49. 如申請專利範圍第47至48項中任一項所述的方法，其中該連接子包括一核酸序列，該核酸序列編碼一自我切割肽（self-cleaving peptide）。
  50. 如申請專利範圍第49項所述的方法，其中該自我切割肽為2A肽。
  51. 如申請專利範圍第50項所述的方法，其中該2A肽係選自於由豬鐵士古病毒-2A（porcine teschovirus-1 2A，P2A）、明脈扁刺蛾β四體病毒（Thoseaasigna virus 2A，T2A）、馬鼻病毒A 2A（equine rhinitis A virus 2A，E2A）和口蹄疫病毒2A（foot-and-mouth disease virus 2A，F2A）所組成之群組。
  52. 如申請專利範圍第50項所述的方法，其中該2A肽為T2A。
  53. 如申請專利範圍第47至52項中任一項所述的方法，其中該連接子包括弗林蛋白酶（furin）切割位點。
  54. 如申請專利範圍第53項所述的方法，其中該連接子包括弗林蛋白酶切割位點和T2A。
  55. 如申請專利範圍第47項所述的方法，其中該第一核酸從5'端至3'端依序包括該T細胞受體α鏈編碼序列、該連接子和該T細胞受體β鏈編碼序列。
  56. 如申請專利範圍第47項所述的方法，其中該第一核酸從5'端至3'端依序包括該T細胞受體β鏈編碼序列、該連接子和該T細胞受體α鏈編碼序列。
  57. 如申請專利範圍第45至56項中任一項所述的方法，其中該T細胞受體α鏈編碼序列包括SEQ ID NO：6所示之核酸序列。
  58. 如申請專利範圍第47至57項中任一項所述的方法，其中該T細胞受體β鏈編碼序列包括SEQ ID NO ：13所示之核酸序列。
  59. 如申請專利範圍第45項所述的方法，其中該第一核酸係藉由病毒轉導所導入。
  60. 如申請專利範圍第59項所述的方法，其中該病毒轉導包括使該細胞與一病毒載體接觸，該病毒載體包含該第一核酸。
  61. 如申請專利範圍第60項所述的方法，其中該病毒載體選自於由反轉錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體和腺相關病毒載體所組成之群組。
  62. 如申請專利範圍第60項所述的方法，其中該病毒載體為慢病毒載體。
  63. 如申請專利範圍第62項所述的方法，其中該慢病毒載體更包括EF-1α啟動子。
  64. 如申請專利範圍第62項所述的方法，其中該慢病毒載體更包括Rev響應元件（RRE）。
  65. 如申請專利範圍第62項所述的方法，其中該慢病毒載體更包括土撥鼠肝炎病毒轉錄後調控元件（woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element，WPRE）。
  66. 如申請專利範圍第62項所述的方法，其中該慢病毒載體更包括cPPT序列。
  67. 如申請專利範圍第62項所述的方法，其中該慢病毒載體更包括EF-1α啟動子、Rev響應元件（RRE）、土撥鼠肝炎病毒轉錄後調控元件（WPRE）和cPPT序列。
  68. 如申請專利範圍第62至67項中任一項所述的方法，其中該慢病毒載體為自我滅活（self-inactivating）的慢病毒載體。
  69. 如申請專利範圍第45項所述的方法，其中該一或多個具有下調基因表現能力的各個核酸包括反義核醣核酸（antisense RNA）、安塔夠妙核醣核酸（antagomir RNA）、小干擾核醣核酸（small interference RNA，siRNA）、小髮夾RNA（short hairpin RNA，shRNA）和常間回文重複序列叢集（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，CRISPR）系統，或其任意組合。
  70. 如申請專利範圍第69項所述的方法，其中該CRISPR系統包括一Cas9 RNA和一引導RNA（guide RNA，gRNA）。
  71. 如申請專利範圍第69項所述的方法，其中該CRISPR系統包括Cas9/gRNA核糖核蛋白（ribonucleoprotein，RNP）複合體。
  72. 如申請專利範圍第69至71項中任一項所述的方法，其中該CRISPR 系統包括gRNA，該gRNA包括SEQ ID NO：37至SEQ ID NO：127和SEQ ID NO：131中任一者所示之核酸序列。
  73. 如申請專利範圍第45項所述的方法，其中具有下調基因表現能力的該一或多個核酸中的每一者係藉由電穿孔所導入。
  74. 一種產生經修飾的T細胞的方法，包括： a）將一第一核酸導入一T細胞中，該第一核酸包括編碼一外源性T細胞受體（TCR）的一核酸序列，該外源性T細胞受體對一目標細胞上的NY-ESO-1有親和力；以及 b）將一或多個核酸導入該T細胞中，該一或多個核酸具有下調一或多個內源性基因的基因表現的能力，該一或多個內源性基因係選自於由T細胞受體α鏈及T細胞受體β鏈所組成之群組。
  75. 如申請專利範圍第74項所述的方法，其中該第一核酸更包括編碼一切換受體的核酸序列。
  76. 如申請專利範圍第75項所述的方法，其中編碼該切換受體的該核酸序列包括SEQ ID NO：15所示之核酸序列。
  77. 如申請專利範圍第75項所述的方法，其中編碼該切換受體的該核酸序列包括SEQ ID NO：137所示之核酸序列。
  78. 如申請專利範圍第75項所述的方法，其中編碼該切換受體的核酸序列包括SEQ ID NO：139所示之核酸序列。
  79. 如申請專利範圍第74至78項中任一項所述的方法，更包括： c）將一或多個核酸導入該T細胞中，該一或多個核酸具有下調一或多個內源性基因的基因表現的能力，該一或多個內源性基因係選自於由A2AR、B7-H3（CD276）、B7-H4（VTCN1）、BTLA（CD272）、CD96、CTLA-4（CD152）、IDO、KIR、LAG3、TIGIT、TIM-3和VISTA所組成之群組。
  80. 一種產生經修飾的T細胞的方法，包括： a）將一第一核酸導入一T細胞中，該第一核酸包括編碼一外源性T細胞受體（TCR）的一核酸序列以及編碼一切換受體的一核酸序列，該外源性T細胞受體對一目標細胞上的NY-ESO-1有親和力；以及 b）將一或多個核酸導入該T細胞中，該一或多個核酸具有下調一或多個內源性基因的基因表現的能力，該一或多個內源性基因係選自於由T細胞受體α鏈、T細胞受體β鏈、A2AR、B7-H3（CD276）、B7-H4（VTCN1）、BTLA（CD272）、CD96、CTLA-4（CD152）、IDO、KIR、LAG3、PD1、TIGIT、TIM-3和VISTA。
  81. 如申請專利範圍第80項所述的方法，其中編碼外源性T細胞受體的該核酸序列包括一T細胞受體α鏈的編碼序列和一T細胞受體β鏈的編碼序列。
  82. 如申請專利範圍第81項所述的方法，其中該T細胞受體α鏈的編碼序列包括SEQ ID NO：6所示之核酸序列。
  83. 如申請專利範圍第81至82項中任一項所述的方法，其中該T細胞受體β鏈的編碼序列包括SEQ ID NO：13所示之核酸序列。
  84. 如申請專利範圍第80項所述的方法，其中編碼切換受體的該核酸序列包括SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：135、SEQ ID NO：137或SEQ ID NO：139所示之核酸序列。
  85. 如申請專利範圍第80項所述的方法，其中編碼該外源性T細胞受體的該核酸序列和編碼該切換受體的該核酸序列係藉由一第一連接子所分開。
  86. 如申請專利範圍第81項所述的方法，其中該T細胞受體α鏈的編碼序列和該T細胞受體β鏈的編碼序列係藉由一第二連接子所分開。
  87. 如申請專利範圍第85至86項中任一項所述的方法，其中該第一連接子和該第二連接子各自獨立地包括一核酸序列，該核酸序列編碼一內部核糖體進入位點（IRES）。
  88. 如申請專利範圍第85至87項中任一項所述的方法，其中該第一連接子和該第二連接子各自獨立地包括編碼自我切割肽的一核酸序列。
  89. 如申請專利範圍第88項所述的方法，其中該自我切割肽為2A肽。
  90. 如申請專利範圍第89項所述的方法，其中該2A肽係選自於由豬鐵士古病毒-2A（porcine teschovirus-1 2A，P2A），明脈扁刺蛾β四體病毒（Thoseaasigna virus 2A，T2A）、馬鼻病毒A 2A（equine rhinitis A virus 2A，E2A）和口蹄疫病毒2A（foot-and-mouth disease virus 2A，F2A）所組成之群組。
  91. 如申請專利範圍第89項所述的方法，其中該2A肽為T2A。
  92. 如申請專利範圍第85至86項中任一項所述的方法，其中該第一連接子和該第二連接子為不相同的。
  93. 如申請專利範圍第86項所述的方法，其中該第二連接子包括一核酸序列，該核酸序列編碼弗林蛋白酶切割位點。
  94. 如申請專利範圍第93項所述的方法，其中該第二連接子包括一核酸序列，該核酸序列編碼弗林蛋白酶切割位點和T2A。
  95. 如申請專利範圍第85項所述的方法，其中該第一連接子包括一核酸序列，該核酸序列編碼F2A的核酸序列。
  96. 如申請專利範圍第80項所述的方法，其中該第一核酸從5'端至3'端依序包括編碼一切換受體的核酸序列、一第一連接子、一T細胞受體α鏈的編碼序列、一第二連接子和一T細胞受體β鏈的編碼序列。
  97. 如申請專利範圍第80項所述的方法，其中該第一核酸從5'端至3'端依序包括一T細胞受體β鏈的編碼序列、一第二連接子、一T細胞受體α鏈的編碼序列、一第一連接子和編碼該切換受體的一核酸序列。
  98. 如申請專利範圍第74至80項中任一項所述的方法，其中該第一核酸係藉由病毒轉導所導入。
  99. 如申請專利範圍第98項所述的方法，其中該病毒轉導包括使該細胞與一病毒載體接觸，該病毒載體包括該第一核酸。
  100. 如申請專利範圍第99項所述的方法，其中病毒載體選自於由反轉錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體和腺相關病毒載體所組成之群組。
  101. 如申請專利範圍第99項所述的方法，其中該病毒載體為慢病毒載體。
  102. 如申請專利範圍第101項所述的方法，其中該慢病毒載體更包括EF-1α啟動子。
  103. 如申請專利範圍第101項所述的方法，其中該慢病毒載體更包括Rev響應元件（RRE）。
  104. 如申請專利範圍第101項所述的方法，其中該慢病毒載體更包括土撥鼠肝炎病毒轉錄後調控元件（woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element，WPRE）。
  105. 如申請專利範圍第101項所述的方法，其中該慢病毒載體更包括cPPT序列。
  106. 如申請專利範圍第101項所述的方法，其中該慢病毒載體更包括EF-1α啟動子、Rev反應元件（RRE）、土撥鼠肝炎病毒轉錄後調控元件（WPRE）和cPPT序列。
  107. 如申請專利範圍第101至106項中任一項所述的方法，其中該慢病毒載體為自我滅活（self-inactivating）的慢病毒載體。
  108. 如前述申請專利範圍任一項所述的方法，其中該一或多個具有下調基因表現能力的各個核酸包括反義核醣核酸（antisense RNA）、安塔夠妙核醣核酸（antagomir RNA）、小干擾核醣核酸（small interference RNA，siRNA）、小髮夾RNA（short hairpin RNA，shRNA）和常間回文重複序列叢集（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，CRISPR）系統，或其任意組合。
  109. 如申請專利範圍第108項所述的方法，其中該CRISPR系統包括一Cas9 RNA和一引導RNA（guide RNA，gRNA）。
  110. 如申請專利範圍第108項所述的方法，其中該CRISPR 系統包括Cas9/gRNA核糖核蛋白（ribonucleoprotein，RNP）複合體。
  111. 如申請專利範圍第108至110項中任一項所述的方法，其中該CRISPR 系統包括gRNA，該gRNA包括SEQ ID NO：37至SEQ ID NO：127和SEQ ID NO：131中任一個所示之核酸序列。
  112. 如申請專利範圍第80項所述的方法，其中能夠下調基因表現的該一或多個核酸中的每一種係藉由電穿孔所導入。
  113. 一種在有需要的一個體中治療癌症的方法，包括將有治療效果的組合物投予至該個體，該有治療效果的組合物包括如申請專利範圍第1至44項中任一項所述的經修飾的T細胞。
  114. 一種在有需要的一個體中治療多發性骨髓瘤的方法，包括： a）對個體施予淋巴細胞刪除性化療（lymphodepleting chemotherapy），包括將一有效量的環磷醯胺（cyclophosphamide）投予該個體； b）將一經修飾的T細胞投與給該個體，包括： i）一外源性T細胞受體（TCR），其對一目標細胞上的NY-ESO-1有親和力，其中該外源性T細胞受體包括： （1）T細胞受體α鏈，包括SEQ ID NO：5所示之胺基酸序列；以及 （2）T細胞受體β鏈，包括SEQ ID NO：12所示之胺基酸序列； ii）在包括SEQ ID NO：128所示之核酸序列的一內源性T細胞受體α鏈的編碼序列中有至少一核苷酸取代、缺失、插入和/或插入/缺失； iii）在包括SEQ ID NO：129所示之核酸序列的一內源性T細胞受體β鏈的編碼序列中有至少一核苷酸取代、缺失、插入和/或插入/缺失；以及 iv）在包括SEQ ID NO：130所示之核酸序列的一內源性PD1編碼序列中有至少一核苷酸取代、缺失、插入和/或插入/缺失， 其中該內源性T細胞受體α鏈的編碼序列、該內源性T細胞受體β鏈的編碼序列和內源性PD1編碼序列的表現被下調。
  115. 一種在有需要的一個體中治療黑色素瘤、滑膜肉瘤（synovial sarcoma）或黏液樣/圓形細胞脂肪肉瘤（myxoid/round cell liposarcoma）的方法，包括： a）對個體施予淋巴細胞刪除性化療（lymphodepleting chemotherapy），包括將一有效量的環磷醯胺以及一有效量的氟達拉濱（fludarabine）投予該個體； b）將一經修飾的T細胞投與給該個體，包括： i）一外源性T細胞受體（TCR），其對一目標細胞上的NY-ESO-1有親和力，其中該外源性T細胞受體包括： （1）T細胞受體α鏈，包括SEQ ID NO：5所示之胺基酸序列；以及 （2）T細胞受體β鏈，包括SEQ ID NO：12所示之胺基酸序列； ii）在包括SEQ ID NO：128所示之核酸序列的一內源性T細胞受體α鏈的編碼序列中有至少一核苷酸取代、缺失、插入和/或插入/缺失； iii）在包括SEQ ID NO：129所示之核酸序列的一內源性T細胞受體β鏈的編碼序列中有至少一核苷酸取代、缺失、插入和/或插入/缺失；以及 iv）在包括SEQ ID NO：130所示之核酸序列的一內源性PD1編碼序列中有至少一核苷酸取代、缺失、插入和/或插入/缺失， 其中該內源性T細胞受體α鏈的編碼序列、該內源性T細胞受體β鏈的編碼序列和內源性PD1編碼序列的表現被下調。
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