CN110684844B - RBPJL基因的p.P476S突变作为PD-1抗体用药指导标志物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了RBPJL基因的p.P476S突变作为PD‑1抗体用药指导标志物中的应用。本发明通过对于管鳞癌患者在接受PD‑1抗体治疗后，出现的非常特殊的应答模式的渗入研究，发现了RBPJL基因的p.P476S突变位点作会影响

在鳞癌患者肝转移的治疗效果，从而利用RBPJL基因的p.P476S突变位点作为指导PD‑1抗体治疗的标志物，能够有效指导发生肝转移的管鳞癌患者的PD‑1抗体治疗方案，使得患者治疗效果能够大幅度提升。本发明具有很好的应用前景和价值。

Description

RBPJL基因的p.P476S突变作为PD-1抗体用药指导标志物中的 应用

技术领域

本发明涉及癌症的治疗技术领域，更具体地，涉及RBPJL基因的p.P476S突变作为PD-1抗体用药指导标志物中的应用。

背景技术

食管癌的传统疗法包括手术、放疗、化疗等一定程度地改善了患者的预后。目前，肿瘤的治疗已经进入了免疫治疗的新纪元。其中，PD-1疗法在多种肿瘤中已证实能够显著延长患者生存期，并且食管鳞癌中PD-L1表达与患者总生存期密切相关，提示靶向PD-1/PD-L1治疗可能都是具有很好的治疗效果。肿瘤微环境中T细胞的激活与分型对于肿瘤的发生发展及预后有着密切关系。

但是，虽然研究显示免疫细胞与抗肿瘤效应的相关性，仅有少部分患者存在自体有效的T细胞激活及募集，从而促进PD-1的治疗效果。目前缺乏对食管鳞状细胞癌(ESCC)患者的治疗应答和治疗抵抗机制的关键预测因子。因此，研究食管鳞癌中PD-1抗体治疗有效及耐药的预测指标具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种RBPJL基因的p.P476S突变作为PD-1抗体用药指导标志物中的应用。

本发明的第一个目的是

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：

(JS001)是一种国产人源化的PD-1抗体，是CFDA在临床研究中批准的第一种抗PD-1抗体。其Ia期研究和Ib/II期研究均在中山大学附属肿瘤医院进行。在发明人研究中发现食管鳞癌患者在接受PD-1抗体治疗后，出现了非常特殊的应答模式：食管原发灶缩小、大部分肺转移病灶缩小、以及肝转移灶的进展，为明确其肝转移灶的治疗抵抗的作用机制，采用治疗前后的肿瘤活组织进行测序分析和体外实验的转化研究。首次报道RBPJL的p.P476S突变显着参与ESCC患者的PD1治疗的肝转移灶抵抗。证实了RBPJL的p.P476S突变抑制了NF-κB-IL16途径进而降低RBPJL对T细胞趋化、增殖和Th1/Th2分化的影响。本发明通过对特殊应答的患者不同组织基因突变情况进行对比，寻找到了肝转移灶特异的基因突变，并进一步研究发现RBPJL(p.P476S)突变导致食管癌治疗患者肝转移灶对PD1治疗产生抵抗，对寻找食管鳞癌行PD-1抗体治疗的潜在的疗效预测指标有着重要的意义。

因此本发明要求保护RBPJL基因的p.P476S突变作为PD-1抗体药物治疗食管鳞癌用药指导标志物中的应用。

RBPJL基因的p.P476S突变为RBPJL的第476位氨基酸从脯氨酸突变为丝氨酸。

优选地，所述PD-1抗体药物为

优选地，所述食管鳞癌为发生了肝转移的食管鳞癌。

优选地，RBPJL基因发生p.P476S突变发生，PD-1抗体药物不适于发生肝转移的食管鳞癌。

一种指导食管鳞癌PD-1抗体药物用药的试剂盒，包括检测RBPJL基因发生p.P476S突变的试剂。

优选地，所述PD-1抗体药物为

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明通过对于管鳞癌患者在接受PD-1抗体治疗后，出现的非常特殊的应答模式的渗入研究，发现了RBPJL基因的p.P476S突变位点作会影响

在鳞癌患者肝转移的治疗效果，从而利用RBPJL基因的p.P476S突变位点作为指导PD-1抗体治疗的标志物，能够有效指导发生肝转移的管鳞癌患者的PD-1抗体治疗方案，使得患者治疗效果能够大幅度提升。本发明具有很好的应用前景和价值。

附图说明

图1为食管鳞癌患者接受Toripalimab治疗前后的肿瘤应答及免疫细胞浸润情况。

图2分别过表达四个目的基因及相应的突变体后诱导的条件培养基对PD-L1表达以及CD14+单核细胞的趋化没有明显变化。

图3为为过表达RBPJL(p.P476S)显著抑制过表达RBPJL诱导的条件培养基对T细胞的趋化以及增殖作用。

图4为为分别过表达四个目的基因及相应的突变体后诱导的条件培养基对PBMC诱导的巨噬细胞分型没有明显改变。

图5为过表达RBPJL(p.P476S)显著抑制过表达RBPJL诱导的条件培养基对Th1的分化作用，同时促进T细胞向对Th2分化。

图6为过表达RBPJL(p.P476S)显著减少过表达RBPJL诱的导NF-κB的激活以及下游的IL16细胞因子的释放。

图7为食管癌细胞系中过表达NC,RBPJL和RBPJL(p.P476S)后上清中细胞因子芯片的检测结果。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1临床患者toripalimab治疗情况

一、患者及治疗情况

该患者最初诊断为食管中下部位的IV期中度分化食管癌，2016-3-11、2016-04-06铂类和紫杉醇方案化疗2个疗程，疗效评价为PD(肿瘤进展)。2016-05-07至2016-8-8予的伊立替康方案化疗7个疗程二线化疗，其中3个疗程后疗效评价SD，7个疗程后疗效评价为PD(肿瘤进展)。之后，患者在中山大学肿瘤防治中心进行了6个周期的Toripalimab治疗(1mg/kg，q2w)的I期临床试验(NCT02857166)。

患者PD1治疗过程的流程图见图1A.

二、CT扫描

1、实验方法

每六周用CT扫描评估原发灶和转移灶的治疗后应答的情况(2016-4-18，2016-10-14，2016-12-1)。

2、实验结果

代表性CT扫描图见图1B，尽管在3个周期的toripalimab治疗后CT扫描显示食管和肺转移灶的大小增加(红色箭头)虽然这很可能被描述为假性进展，但在6个周期的toripalimab治疗后肿瘤显着减少，观察到治疗后肝转移灶的持续增加。

三、肿瘤微环境中主要的免疫细胞浸润

1、实验方法

免疫组化研究肿瘤微环境中主要的免疫细胞浸润，具体操作：

将固定后的患者治疗前后的原发灶及转移灶组织进行石蜡包埋并切片(厚度为5μm)，切片后操作步骤如下：

(1)62℃烘箱，烘烤30-40min(石蜡熔化)；将烘好的玻片放在玻片架上冷却至室温(10min左右)后依次浸泡在放有100％的二甲苯①，二甲苯②，二甲苯③的玻璃缸中，每个缸浸泡8min左右(除石蜡)；

(2)玻片从二甲苯③玻璃缸中浸泡完后再依次放入100％酒精(5min)，90％酒精(5min)，80％酒精(5min)，70％酒精(5min)，再将玻片置于烧杯内，用自来水从侧面冲洗5-10min(复水)；

(3)PBS浸泡5min后，放在煮沸的柠檬酸修复液中进行抗原修复12min，自然冷却至室温；

(4)将冷却至室温的玻片再用新的PBS分别浸泡两次(5min/次)后置入含有3％H₂O₂的甲醇溶液中浸泡12min(去除过内源性氧化物酶)；

(5)新的PBS中浸泡三次(5min/次)后，将玻片上过多的水分用吸水纸擦去，加上100μl的山羊血清至组织上(可用免疫组化笔在组织周围画一个封闭的圆圈防止血清挥发)，室温孵育30min(封闭)；

(6)用吸水纸吸去过多的血清后加入相应的一抗(CD4,CD8,PDL1,CD68)，4℃孵育过夜，第二天室温复温45min后放置在新的PBS中浸泡并洗三次；

(7)吸去水分后，滴加HRP标记的二抗，37℃孵育30min，放置在新PBS中浸泡并洗三次；

(8)加入预先配制好的DAB显色液，显微镜上观察颜色的变化，待镜检出现黄色边缘时即可终止，用去离子水冲洗玻片终止显色实验；

(9)将终止显色的玻片用自来水冲洗5-10min，再用苏木素复染1-2min后继续用自来水冲洗复染过的玻片，期间将玻片取出用0.5％-1％的盐酸酒精分化1-2s，然后迅速放置流水里冲洗10min；

(10)冲洗结束后将玻片置于玻片架上再依次放入70％酒精(3min)，80％酒精(3min)，90％酒精(3min)，100％酒精(3min)，二甲苯(3min)，二甲苯(3min)，二甲苯(3min)，最后用中性树胶封片，晾干。

(11)通过显微镜识别并分析五个具有代表性的领域。在免疫组化分级中，每个区域的阳性染色分数分别为0(<25％)，1+(25％-50％)，2+(50％-75％)，3+(75％-100％)。染色强度由弱到强不等。

2、实验结果

显示患者治疗前组织中有明显的PD-L1表达，并在治疗前也存在一些CD4+和CD8+T细胞以及CD68+巨噬细胞(图1C和图1D、图1E)。在toripalimab治疗前后组织中没有发现PD-L1和CD68的表达差异，但在治疗后的原发灶和肺转移灶中出现明显的瘤内CD4+和CD8+T细胞浸润，但在肝转移病灶中未见。

实施例2肝转移灶特异性突变基因的筛选的

一、临床患者原发性和转移组织外显子组测序

1、实验方法

为了探索与患者肝转移组织对toripalimab治疗抵抗的基因组特征，从治疗后的原发性和转移组织中提取DNA并进行全外显子组测序。

从治疗后患者血浆及原发性和转移性肿瘤活检组织中提取总DNA，然后采用Illumina Hiseq 2000进行全外显子测序。在数据处理过程中，利用BWA-MEM.技术，同时对比校准UCSC中人类基因组(HG19)数据，从而鉴定出高质量基因数据。picard(v1.84；http://broadistitute.github.io/picard/)用于在PCR过程中对数据的重复读取进行标记和分类，再使用基因组分析工具包(gatk4，http://www.broadistitute.org/gatk)对BWA校准后的读取进行局部重新校准和基本质量分数重新校准。体细胞指标通常由MutTect2(v1.1.4)使用默认参数检测。根据常规程序，使用ANNOVAR对所有snv和indel进行注释，然后在2015年4月发布的1000基因组项目及ExAC数据库发布0.3数据库中以>0.01的频率过滤掉。

2、实验结果

测序结果发现所有活检组织均具有适度的整体突变负荷，原发灶中有107个非同义突变，肺转移灶中有53个，肝转移灶中有48个(图2A～图2C)。对比治疗前后组织基因，初步筛选出存在肝转移灶组织中的4个肝脏特异性突变基因，分别是DTX2，CLEC14A，RBPJL和GABPB1(图2D)。

二、差异表达基因与ESCC患者预后的相关性

1、实验方法

我们进一步分析了筛选出的4个候选基因(DTX2、RBPJL、CLEC14A、GAPB1)在食管癌患者(ESCC)中预后良好的前15％和预后不良的后15％之间的mRNA表达水平及相关性，并从GEPIA网站下载相关数据和预后值。

2、实验结果

没有观察到预后的统计学显着相关性(前15％预后良好，15％预后不良)(图3A)，但RBPJL高表达表现出与预后更好的预后相关性(差异未达到统计学显着水平)。基于以上数据，我们推测肿瘤细胞中这些基因的改变是否对某些免疫细胞功能有影响。

三、差异表达基因与ESCC患者预后的相关性

1、实验方法

由于检测到常规ESCC细胞系和组织中4种基因的表达丰度不高，我们选取表达中等的2种食管癌细胞系KYSE150和KYSE510进行体外实验的探索。

2、实验结果

如图3B所示，常规ESCC细胞系中4种基因的表达丰度均处于中低水平。

四、基因突变后的作用及机制

为后续的实验进行，我们选取表达中等的2种食管癌细胞系KYSE150和KYSE510进行接下来的探索。

1、实验方法

采用Obio Technology Inc.(中国上海)提供的DTX2、RBPJL、CLEC14A和GAPB1全长和突变及DTX2(p.A2V)，CLEC14A(p.G168S)，RBPJL(p.P476S)，及GABPB1(p.E118V)cDNA的表达载体，在体外合成RNA后使用Lipofectamine^TM3000转染试剂(Invitrogen)进行细胞转染。以24孔板为例步骤如下：

(1)将细胞以2×10⁵/ml的密度接种于板内(培养基中不含有抗生素)，待细胞融合到40％-50％的密度后，换成无FBS培养基培养一段时间后转染；

(2)shRNA-X-tremeGENE混合液的制备：

(a)取5ug质粒置于50ul无血清的Opti-MEM I中，轻轻混均，室温孵育5min；

(b)X-tremeGENE稀释：将1μl X-tremeGENE置于50ulOpti-MEM I中，轻轻混均，室温孵育5min；

c)将a)与b)缓慢混合后置于室温孵育10min(避免过度吹打或震荡)；

(3)将孔板从培养箱拿出，吸走培养基后用PBS轻轻洗涤一次，每孔加400μl培养基后，再将100μl的复合物缓慢滴加到培养板中，轻摇动，使转染复合物均匀；

(4)转染后，将培养板放在37℃5％，CO2培养箱中培养6h后，更换成正常培养基，继续培养到一定时间或进行后续实验。

五、野生型和突变后的PD-L1表达

1、实验方法

由于DTX2，RBPJL，CLEC14A和GABPB1该四个基因是从PD1治疗抵抗中筛选出了的，分析了这四种野生型和突变后的PD-L1表达。具体实验步骤如下：

(1)细胞总RNA的提取：

(a)细胞处理到一定时间后，向每个处理组培养孔中加入TRIzol(每10cm2培养孔面积加入1ml TRIzol)裂解细胞，移液枪反复吹打，转至1.5ml无酶EP管中，室温放置10min，使核酸蛋白复合物完全分离；

(b)静置结束后，向每个EP管中加入适量的氯仿(每1ml TRNzol加入200μl氯仿)，于涡旋仪上振荡30s，室温放置10min；

(c)4℃，12000rpm，15min后，样品会分成三层：有机相层，中间层及上层无色的水相层，RNA主要存在于水相中，用200μl无酶枪头小心吸取水相层(约400μl)转移到新无酶EP管中；

(d)加入等体积异丙醇，轻轻混匀，室温放置10min；

(e)4℃，12000rpm，10min，弃上清，此时可观察到管底有白色的胶状沉淀；

(f)沉淀中加入1ml 75％乙醇进行洗涤，4℃，12000rpm，离心5min；

(g)小心倒出液体，剩余少量液体用枪头缓慢吸出；

(h)室温放置晾干后，加入20-40μl RNase-free ddH2O，反复吹打混匀至RNA完全溶解，纯度及浓度测定或-80℃保存。

(2)细胞内总RNA纯度及浓度的检测

取2μl的总RNA用于酶标仪检测RNA纯度，A260/A280比值在1.8-2.0范围内表符合纯度的要求，同时读取RNA的浓度，用于后续的反转录；

(3)RNA的逆转录合成cDNA

采用PrimeScript RT Master Mix体系逆转录合成cDNA；

(4)Real Time PCR反应

每个cDNA样品做3个复孔，将反应体系加到无酶的八连管中后离心，置于PCR仪进行反应。

(4)结果分析

待反应结束后查看样品的扩增曲线和溶解曲线保证结果的可靠性，再根据配套的IQ5软件分析系统，对每个样本进行相对的定量分析，检测表达差异。

2、实验结果

我们发现不同组间PD-L1表达没有明显差异，表明PD-L1表达不是该患者肝转移灶治疗抵抗的关键因素(图3E)。

六、RBPJL(p.P476S)对T细胞趋化性的影响

1、实验方法

分别提取过表达四种野生型及突变基因转染后的KYSE150和KYSE510细胞上清制备条件性培养基(CM)，并置于Transwell底部，同时将纯化的CD4+或CD8+T细胞接种在Transwell的上室中，研究四种基因条件性培养基对T细胞趋化性的影响。

2、实验结果

结果发现与对照CM相比，只有RBPJL(p.P476S)显着降低由RBPJL过表达CM诱导的CD4+和CD8+T细胞趋化性，而其他CM组未诱导该变化。同时我们针对四种基因对CD14+单核细胞趋化性进行研究发现其趋化不受任何CM组的影响(图3D)，这与在免疫组化结果中的发现一致。

七、CMs对T细胞增殖的影响

1、实验方法

采用Ficoll-Paque Plus梯度离心法分离PBMCs后用Pan T细胞分离试剂盒(miltenyi biotec)从PBMCs中通过阴性选择法纯化出T细胞，再用CD4或CD8T磁珠通过阳性选择法进一步纯化CD4+或CD8+T细胞。分别将CD4+或CD8+T细胞置于无血清ImmunoCult-XFT Cell Exp Medium中培养，并加入CD3/CD28和IL-2刺激T细胞的激活，再加入过表达各基因的条件培养基，标记CSFE探针并培养5天后通过流式细胞术检测其增殖水平。

2、实验结果

结果发现能RBPJL显着增加由CD3/CD28抗体活化的CD3+T细胞的增殖，这种增殖作用在RBPJL突变后被明显抑制，我们没在其他三组基因处理后的CM中发现T细胞的增殖差异(图2C和图2D)。

上述数据表明，RBPJL的(p.P476S)突变抑制了T细胞的趋化性和增殖，这可能与PD1治疗抵抗机制有关。

实施例3 RBPJL突变影响T细胞免疫调节能力

1、实验方法

进一步研究检测不同基因处理组CMs对CD4+T细胞分化的影响。具体实验步骤如下：

(1)采用Ficoll-Paque Plus梯度离心法分离PBMCs后用CD3磁珠进一步从PBMCs中通过阳选纯化出T细胞置于无血清ImmunoCult-XF T Cell ExpMedium中培养，并加入CD3/CD28和IL-2刺激T细胞的激活；

(2)分别在T细胞中加入过表达各基因的条件培养基并培养2天；细胞处理结束后，轻轻吸走培养基，并用预冷的PBS洗两遍，收集细胞；

(3)1000rpm，室温离心5min，用预热的PBS清洗3次，加入稀释好的流式抗体(CD4-PE,T-bet-PerCP/Cyanine5.5及GATA-3-Alexa

488)，并置于4℃冰箱避光孵育40min；

(4)孵育结束后，用预冷的PBS清洗3次，每次1000rpm，室温离心5min，加500μlPBS重悬细胞，即可进行流式检测。

2、实验结果

过表达RBPJL产生的CM明显促进Th1分化，反映在CD4+T-bet+T细胞数量增加以及TNFβ和IFN-γ浓度增加，同时Th2的分化被抑制，反映在CD4+GATA3+T细胞数量的减少及降低TGFβ、IL10表达的降低。这种Th2向Th1的转化作用在RBPJL突变后被明显抑制，反映在CD4+GATA3+T细胞数量增加和CD4+T-bet+T细胞数量减少，及TGFβ和IL10表达增加以及TNFβ和IFN-γ表达减少。我们未能检测到DTX2，RBPJL，CLEC14A，GABPB1与相应突变基因处理后CMs对T细胞分化的差异(图4)。同时，四种基因处理的CMs对CD14+PBMC诱导的巨噬细胞表型影响的，也没有发现明显的变化(图5)，显示RBPJL突变可能是影响T细胞免疫调节能力的主要因素。

实施例4 RBPJL突变影响T细胞免疫调节能力

1、实验方法

采用细胞因子阵列分析定量测量NC，过量表达RBPJL和过表达RBPJL(p.P476S)处理KYSE150细胞后分泌的细胞因子表达差异。

2、实验结果

结果显示，与其他细胞因子相比，RBPJL过表达显着增加IL16表达和分泌，而RBPJL(p.P476S)过表达则逆转IL16的升高(图6A-C，图7)，此外，GO及KEGG分析显示，TNF-NF-κB信号通路与RBPJL过表达诱导的T细胞功能调控密切相关。我们进一步通过WB结果分析发现与NC相比，RBPJL显着增加磷酸化的IκBa和NF-κB/p65的表达(图6D)，其促进NF-κB核转位，而RBPJL突变后减弱了导致IkBa和NF-kB/p65磷酸化降低，这些数据表明RBPJL(p.P476S)突变通过抑制NF-κB/p65的易位活性来抑制IL16的表达和分泌。

Claims (1)

1.检测RBPJL基因编码的蛋白是否发生p.P476S突变的试剂在制备指导治疗食管鳞癌PD-1抗体药物用药的试剂盒中的应用；

所述RBPJL基因编码的蛋白发生p.P476S突变为RBPJL的第476位氨基酸从脯氨酸突变为丝氨酸；

所述PD-1抗体药物为Toripalimab；

所述食管鳞癌为发生了肝转移的食管鳞癌；

所述RBPJL基因编码的蛋白发生p.P476S突变，PD-1药物不适用于发生肝转移的食管鳞癌。

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