CN108753982B

CN108753982B - 一种食管癌预后生物标志物及其检测方法与应用

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Publication number: CN108753982B
Application number: CN201810861806.8A
Authority: CN
Inventors: 徐建震; 杨德印; 赵星
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2018-08-01
Filing date: 2018-08-01
Publication date: 2022-05-06
Anticipated expiration: 2038-08-01
Also published as: CN108753982A

Abstract

本发明涉及一种食管癌预后生物标志物及其检测方法与应用，所述生物标志物为RNA结合蛋白TRA2A，氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；DNA序列如SEQ ID NO:2所示。所述食管癌预后生物标志物的检测方法，主要包括mRNA表达改变检测、mRNA表达改变检测结合基因变异的检测两种检测方法。检测的样品包括组织器官。可用于制备食管癌诊断试剂和/或药物。本发明的食管癌预后生物标志物对于食管腺癌和食管鳞癌两种主要的食管癌中通用，而且本发明对食管癌预后生物标志物的检测方便迅速，实验过程简单，结果明确。本发明所用试剂除了TRA2A引物外，大多为通用试剂，成本低廉。

Description

一种食管癌预后生物标志物及其检测方法与应用

技术领域

本发明属于生物技术及生物医学领域，涉及一种与食管癌预后相关的标志物及其应用。

背景技术

食管癌是常见的上消化道恶性肿瘤。我国是世界上最主要的食管癌高发国。统计数据表明食管癌发生率正在逐年快速增加。食管鳞癌在不同地区发生率差异很大，在土耳其、哈萨克斯坦、伊朗东北部，中国南部和中部这一亚洲带，每年发生率超过了1/1000，在非洲的南部和东部地区发生率也很高。食管癌病人五年生存率仅仅只有15％-25％。其中原因之一是食管癌的预后判断仍然处于以临床、病理等方法为基础，缺乏分子生物标志物。因此，寻找食管癌预后生物标志物对患者进行预后判断，从而提高患者术后生活质量，并相应地选择合理的后续治疗方案，提高生存率，是肿瘤科学领域亟待解决的研究任务。

近年来也出现了一些基于分子标志物的新型食管癌预后方法和技术，如：中国专利申请201510947274.6“检测食管癌的生物标志物”；发现凝血酶敏感蛋白1(TSP1)可单独作为生物标志物用于在血清或组织中诊断食管鳞癌或预测食管鳞癌的预后，包括：免疫组织化学或检测酶联免疫吸附法检测了食管鳞癌患者和健康对照样本中TSP1蛋白的表达情况。再如中国专利申请201711192088“一种食管癌的生物标志物及其应用”公开了一种在食管癌病人中检测肿瘤相关标志物的方法，包括：制备食管癌组织和正常组织进行组织微阵列检测，用特异性抗体和免疫组织化学法分析中胚叶特异性转录子(Mesoderm-specifictranscript，MEST)的表达蛋白，分析正常和肿瘤组织的差异，最终实现预后评价的目的。但上述方法的缺点是由于该方法涉及特异性抗体的制备、分离纯化以及免疫组织化学方法，检测过程耗时费力，检测成本很高，影响了在临床应用中的效果。这种缺陷的根本原因在于未能从基因水平上进行预后预测。

随着基因组技术的发展，可以通过二代测序等手段研究食管癌的基因组变异信息，为食管癌的预后提供新型的生物标志物。RNA结合蛋白TRA2A(transformer 2alphahomolog)是一种在果蝇性别决定中起重要作用的剪切调控子，它由一个RNA识别基序和位于基序两侧的两个精氨酸/丝氨酸结构域组成。位于人类7号染色体上。

发明内容

本发明的目的在于提供新型食管癌预后标志物及其检测方法，以解决现有方法的检测过程耗时费力检测成本高临床应用效果差等问题。

为解决上述问题，本发明提供了一种食管癌预后生物标志物，所述生物标志物为RNA结合蛋白TRA2A。

进一步的，所述生物标志物氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述生物标志物DNA序列如SEQ ID NO:2所示。

一种上述食管癌预后生物标志物的检测方法，主要包括mRNA表达改变检测、mRNA表达改变检测结合基因变异的检测两种检测方法。

进一步的，所述基因变异的检测包括基因拷贝数增加、删失。

进一步的，所述样品包括组织器官。

mRNA表达改变检测，主要包括以下步骤：

(1)收集器官组织样本，放在研钵中并加入液氮研磨至粉末状；

(2)Trizol试剂法提取组织RNA；

(3)将步骤(2)总RNA逆转录成cDNA；

(4)将步骤(3)按照Takara实时定量试剂盒(RR420A)说明书，使用TRA2A特异性引物，通过定量PCR实验检测TRA2A基因信使RNA的表达水平；分析相关数据。

进一步的，所述TRA2A特异性引物为：

5‘端引物CTCCAATGTCTAACCGGAGAAGA

3‘端引物TTGACACCACTCAATGGTCCA。

mRNA表达改变检测结合基因变异的检测，主要包括以下步骤：

(1)收集器官组织样本，提取肿瘤和癌旁正常组织DNA；

(2)Affymetrix SNP 6.0芯片平台检测基因拷贝数变异；RNA样品用IlluminaHiSeq2000平台检测mRNA表达改变。

一种将上述食管癌预后生物标志物用于制备食管癌诊断试剂和/或药物的应用。所述食管癌包括食管腺癌和食管鳞癌。

与现有技术相比，本发明的TRA2A的基因水平检测包括主要包括mRNA表达改变检测、mRNA表达改变检测结合基因变异的检测两种检测方法，与食管癌的预后有强烈的相关性，可以作为食管癌预后的分子标志物。主要具有以下优势：

1.适用范围广:本发明在两种主要的食管癌中通用，而现有方法仅适用于食管鳞癌。

2.检测方便迅速:本发明采用定量PCR方法检测组织中的TRA2A mRNA表达改变，实验过程简单，结果明确。而现有技术通过免疫组织化学方法，需要制备特异性抗体，过程耗时费力。

3.本发明所用试剂除了TRA2A引物外，大多为通用试剂，成本低廉；而现有方法检测成本很高，影响了临床应用的效果。

附图说明

图1是对GSE89102和GSE100942两套表达谱数据中TRA2A基因在食管癌肿瘤组织和癌旁组织的表达的分析图；

图2是对TCGA数据库的194例食管样本的数据中TRA2A mRNA在食管鳞癌(ESSC)、食管腺癌(EA)以及癌旁正常组织(Normal)中表达对比图；

图3食管癌病人中无病生存时间和生存时间分析对比图；

图4是样本中的RNA结合蛋白TRA2A的mRNA表达以及基因变异分析；

图5是TRA2A基因发生改变与病人无病生存和生存的关系图；

图6是定量PCR验证siRNA的干扰效率；

图7是转染TRA2A siRNA#1和siRNA#2抑制TE1细胞增殖效果对比图；

图8是在TE1细胞中进行细胞划痕后TRA2A siRNAs、TRA2A siRNA#1、TRA2AsiRNA#2细胞的愈合率对比图；

图9是TE1细胞中进行克隆形成实验，TRA2A siRNA#1、TRA2AsiRNA#2克隆形成率对比图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。

实施例1

从Gene Expression Omnibus数据库下载了两套基因表达谱数据(GSE89102和GSE100942)，GSE89102包含5个食管鳞癌病人样本及其癌旁组织表达谱数据，GSE100942包含4个食管鳞癌病人样本及其癌旁组织表达谱数据。经过对这两套表达谱的分析，发现TRA2A基因在食管鳞癌肿瘤组织中的表达明显比癌旁组织高(GSE89102p＝0.024；GSE100942，p＝0.064)(图1)。同时，分析了来自TCGA数据库的194例食管样本的数据(184例食管癌其中89例食管腺癌，95例食管鳞癌，10例癌旁)，同样的TRA2A mRNA表达在食管癌中高表达，在腺癌中表达更高(图2)。按照TRA2A的mRNA表达水平将病人按25％分成两组，进行无病生存和生存分析，在TRA2A mRNA表达水平高的25％食管癌病人中无病生存时间(p＝0.02)和生存时间(p＝0.007)明显减少(图3)。TRA2A在食管癌组织中mRNA表达水平明显升高，无病生存时间和生存时间明显减少，说明TRA2A基因表达可以作为一个潜在的食管癌预后指标。

实施例2

收集食管癌病人以及癌旁正常对照组织，用DNA/RNA AllPrep(Qiagen)试剂盒分别提取每例样品中的DNA和RNA。DNA总量大于7μg，RNA总量大于5μg。用RNA6000Nano assay(Agilent)检测RIN(RNA Integrity Number)≥7.0。DNA样品用Affymetrix SNP 6.0芯片平台检测，采用GISTIC 2.0算法分析基因拷贝数变异分析；RNA样品用IlluminaHiSeq2000PE75平台测序，采用BWA算法比对参考基因组，采用RPKM(每百万reads中来自于某基因每千碱基长度的reads数)代表基因表达量。

来自TCGA的184例食管癌样本都按上述实验方法获得数据。其中12％共23例病人发生了包括扩增、删失，mRNA上调的TRA2A基因改变。其中12例食管鳞癌包括6例扩增，4例mRNA上调，1例删失，1例多种改变；11例食管腺癌包括4例扩增，6例mRNA上调，1例多种改变，而且没有发生任何突变(图4)。在这些病人样本中，TRA2A拷贝数发生不同情况的变异，TRA2A mRNA表达水平也不同，尤其当扩增时TRA2A mRNA表达水平升高较多(图4)。进一步分析了TRA2A基因发生改变与病人无病生存和生存的关系。依据TRA2A基因发生改变和没有发生改变将食管癌病人分为两组进行无病生存和生存分析，发现TRA2A基因发生改变一组无病生存时间(p＝0.00575)和生存时间(p＝0.0163)相对TRA2A基因没有发生改变明显减少(图5)，说明TRA2A基因可以作为一个潜在的食管癌预后指标。

实施例3

干扰TRA2A抑制食管癌癌症进程

为了进一步的确认TRA2A在食管癌进程中扮演的角色，设计了TRA2AsiRNA#1、TRA2A siRNA#2两条siRNA，它们可以干扰TRA2A mRNA。同时在食管癌细胞TE1中瞬时转染siRNAs 48小时后，收集细胞，Trizol试剂法提取RNA，用Takara的PrimeScript逆转录试剂盒合成cDNA,再用Takara实时定量试剂盒(RR420A)以TRA2A特异性引物，通过Real time-PCR实验检测TRA2A基因信使RNA的表达水平，从而验证siRNA的干扰效率。

TRA2A特异性引物为：

5‘端引物CTCCAATGTCTAACCGGAGAAGA

3‘端引物TTGACACCACTCAATGGTCCA。

在TE1细胞中转染TRA2A siRNA#1，TRA2A mRNA表达量相对对照组为44％，干扰效率是56％，转染TRA2AsiRNA#2，TRA2A mRNA表达量相对对照组为38％，干扰效率是62％；72小时后，收集细胞用来提取蛋白，蛋白质凝胶电泳检测TRA2A蛋白表达水平，转染TRA2AsiRNAs后，TRA2A蛋白表达量相对对照组降低(图6)。将转染TRA2AsiRNAS的细胞第二天铺板到96孔板中进行CCK8实验，结果表明在TE1细胞中干扰TRA2A后细胞增殖速率明显减慢，抑制了细胞增殖，其中转染TRA2A siRNA#1组比siRNA#2组抑制TE1细胞增殖效果显著(图7)。进一步在TE1细胞中进行细胞划痕实验，TRA2AsiRNAs组相对对照组细胞愈合速率减慢，其中对照组细胞的愈合率是78％，TRA2A siRNA#1组细胞的愈合率是49％，相对对照组愈合率减慢了29％；TRA2A siRNA#2组细胞的愈合率是47％，相对对照组愈合率减慢了31％(图8)。通过划痕实验证实了在TE1细胞中干扰TRA2A后细胞迁移能力明显减慢。在TE1细胞中进行克隆形成实验，以对照组为参照，TRA2A siRNA#1组克隆形成率为55％，相对对照组来说增加了45％；TRA2A siRNA#2组克隆形成率为49％，相对对照组来说增加了51％(图9)，表明在TE1细胞中干扰TRA2A后减弱了TE1细胞的克隆形成能力。在TE1细胞干扰TRA2A会抑制细胞增殖，迁移以及克隆形成能力。

SEQUENCE LISTING

<110> 徐建震

<120> 一种食管癌预后生物标志物及其检测方法与应用

<130> 2018

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 282

<212> PRT

<213> 未知

<400> 1

Met Ser Asp Val Glu Glu Asn Asn Phe Glu Gly Arg Glu Ser Arg Ser

1 5 10 15

Gln Ser Lys Ser Pro Thr Gly Thr Pro Ala Arg Val Lys Ser Glu Ser

20 25 30

Arg Ser Gly Ser Arg Ser Pro Ser Arg Val Ser Lys His Ser Glu Ser

35 40 45

His Ser Arg Ser Arg Ser Lys Ser Arg Ser Arg Ser Arg Arg His Ser

50 55 60

His Arg Arg Tyr Thr Arg Ser Arg Ser His Ser His Ser His Arg Arg

65 70 75 80

Arg Ser Arg Ser Arg Ser Tyr Thr Pro Glu Tyr Arg Arg Arg Arg Ser

85 90 95

Arg Ser His Ser Pro Met Ser Asn Arg Arg Arg His Thr Gly Ser Arg

100 105 110

Ala Asn Pro Asp Pro Asn Thr Cys Leu Gly Val Phe Gly Leu Ser Leu

115 120 125

Tyr Thr Thr Glu Arg Asp Leu Arg Glu Val Phe Ser Arg Tyr Gly Pro

130 135 140

Leu Ser Gly Val Asn Val Val Tyr Asp Gln Arg Thr Gly Arg Ser Arg

145 150 155 160

Gly Phe Ala Phe Val Tyr Phe Glu Arg Ile Asp Asp Ser Lys Glu Ala

165 170 175

Met Glu Arg Ala Asn Gly Met Glu Leu Asp Gly Arg Arg Ile Arg Val

180 185 190

Asp Tyr Ser Ile Thr Lys Arg Ala His Thr Pro Thr Pro Gly Ile Tyr

195 200 205

Met Gly Arg Pro Thr His Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly

210 215 220

Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Arg Arg Arg Asp Ser Tyr Tyr Asp Arg

225 230 235 240

Gly Tyr Asp Arg Gly Tyr Asp Arg Tyr Glu Asp Tyr Asp Tyr Arg Tyr

245 250 255

Arg Arg Arg Ser Pro Ser Pro Tyr Tyr Ser Arg Tyr Arg Ser Arg Ser

260 265 270

Arg Ser Arg Ser Tyr Ser Pro Arg Arg Tyr

275 280

<210> 2

<211> 849

<212> DNA

<213> 未知

<400> 2

atgagtgatg tggaggaaaa caacttcgag ggcagagagt ctcgctctca gtcaaaatct 60

ccaacgggaa ctcctgctcg tgtaaaatcg gagagcaggt caggatctcg tagtccatca 120

agggtttcca aacactctga atcccattct cgatcaagat caaaatccag gtcgaggtca 180

aggagacatt ctcatagacg ttacactcga tccagatccc actctcactc tcataggaga 240

cgatctcgaa gtagatcata tacaccagaa taccggcggc gaaggagccg aagccattct 300

ccaatgtcta accggagaag acatactggc agcagggcaa atccagatcc caacacttgc 360

cttggagtgt ttggcctcag tttgtacaca acagagaggg atcttcgtga agtattttct 420

cgatatggac cattgagtgg tgtcaatgtg gtttatgatc agcgaactgg gcgatctcga 480

ggatttgctt ttgtgtattt tgagagaata gatgactcaa aggaggctat ggaaagggca 540

aatggaatgg agctggatgg tagaagaatt cgggtggatt attctataac caagagagcg 600

cacacaccaa caccaggcat ctacatgggc agaccaactc atagtggtgg gggtggtgga 660

ggaggcggcg gcggtggagg tggaggtggt ggcagacgtc gagattctta ctatgataga 720

ggatatgatc gtgggtatga cagatatgaa gactatgatt accgatacag aagacgatca 780

ccttctcctt attatagtcg atatagatca cgatcaagat ctcgttccta cagcccaaga 840

cgctattga 849

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 未知

<400> 3

ctccaatgtc taaccggaga aga 23

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 未知

<400> 4

ttgacaccac tcaatggtcc a 21

Claims

1.一种食管癌预后生物标志物用于制备食管癌诊断试剂的应用，其特征在于，所述生物标志物为RNA结合蛋白TRA2A。

2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述食管癌包括食管腺癌和食管鳞癌。