CN112159848B - 一种环状rna作为胃癌诊断生物标志物及预后评价试剂中的用途 - Google Patents

一种环状rna作为胃癌诊断生物标志物及预后评价试剂中的用途 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物医药、肿瘤分子生物学技术领域，提供环状RNA circ:chr7:11101418‑11151094作为胃癌诊断生物标志物在检测胃癌组织的试剂中的应用，以及该环状RNA在制备预后评价胃癌患者试剂中的应用。所述环状RNA的核苷酸序列如SEQ NO:1所示，该环状RNA位于人类的第7号染色体上，全长291bp；所述环状RNA在胃癌患者癌组织中特异性表达水平上调。通过研究证实该环状RNA在胃癌组织中表达上调，高表达的胃癌患者比低表达的胃癌患者预后差，因此将该环状RNA的表达用于胃癌患者的预后预测，可以为胃癌患者的预后提供强有力的分子生物学依据，具有深远的临床意义和推广性。

Description

一种环状RNA作为胃癌诊断生物标志物及预后评价试剂中的 用途
技术领域
本发明属于生物医药、肿瘤分子生物学技术领域，涉及一种环状RNA作为胃癌诊断生物标志物及预后评价试剂中的用途，具体涉及环状RNA circ:chr7:11101418-11151094作为胃癌诊断生物标志物在检测胃癌组织的试剂中的应用，及其在制备预后评价胃癌患者试剂中的应用。
背景技术
胃癌是人类最常见的恶性肿瘤之一，胃癌的发病率居于恶性肿瘤发病率的前列，其死亡率更是高居第3位。尽管胃癌发病率在许多国家呈现下降趋势，但在我国仍处于高发趋势。目前，虽然针对胃癌有许多的治疗策略，如手术切除、化疗、放疗以及免疫治疗，但是我国胃癌的发病率、死亡率仍居消化道肿瘤的第一位，晚期胃癌患者更是五年生存率不超过20%，因此迫切需要寻找新的预后分子靶标。肿瘤靶向治疗研究在近几年取得了突破性的进展，但针对胃癌的有效治疗干预靶点及其临床应用仍然十分有限，并没有从根本上改变胃癌高死亡率的现状。因此，寻找新的有效的胃癌发生发展的靶点，对于胃癌的诊断和治疗、提高患者的生存率和生活质量具有重要的实际意义。
环状RNA(circRNA)是广泛并稳定存在于真核细胞中的一类不具有5’末端帽子和3’末端poly (A)尾巴，并以共价键形成封闭环状结构的新型内源性非编码RNA分子。circRNA曾一度被当做基因转录后加工过程中的错误产物。
近年来随着测序技术尤其是RNA-seq等新一代测序技术的发展，越来越多的circRNA被人们发现，并已经通过研究揭示了部分circ RNA在众多的生命活动中都发挥着重要的作用。circRNA在恶性肿瘤中发挥着竞争性内源RNA、与RNA结合蛋白相互作用、翻译蛋白等生物学功能，影响着恶性肿瘤的生长、转移，从而促进或抑制恶性肿瘤的发生、发展，很可能成为一种新的生物标志物用于临床疾病的早期诊断和预后评估。
发明内容
本发明的目的在于：提供环状RNA circ:chr7:11101418-11151094作为胃癌诊断生物标志物在检测胃癌组织的试剂中的应用，以及该环状RNA在制备预后评价胃癌患者试剂中的应用。
本发明由如下技术方案实现的：一种环状RNA作为胃癌诊断生物标志物在检测胃癌组织的试剂中的应用，所述环状RNA circ:chr7:11101418-11151094的核苷酸序列如SEQNO:1所示，该环状 RNA位于人类的第7号染色体上，全长291bp；所述环状RNA circ:chr7:11101418-11151094在胃癌患者癌组织中特异性表达水平上调。
所述试剂为实时荧光定量检测试剂，该试剂中包含用于检测胃癌组织中circ:chr7:11101418-111510945表达的引物序列：
上游引物如SEQ NO:2所示，为：5’- GTGATTCTTCATCTTCCAAGAGAAC-3’；
下游引物如SEQ NO:3所示，为：5’- TGCAACACAGACTGTCTTTGTCTTC -3’。
所述实时荧光定量检测试剂为试剂盒，还包含内参基因GAPDH特异性PCR引物：
上游引物如SEQ NO:4所示，为：5’- GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT -3’；
下游引物如SEQ NO:5所示，为：5’- GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG -3’。
所述试剂盒中还包含：（1）从胃癌组织中抽提总RNA所用试剂，包括RNA稳定溶液、Trizol试剂、三氯甲烷、异丙醇、无酶水；(2)以总RNA为模板将circ:chr7:11101418-11151094逆转录为cDNA所用试剂，包括逆转录缓冲液、三磷酸碱基脱氧核苷酸、RNA酶抑制剂、MMLV逆转录酶以及随机引物；(3)将cDNA实时定量PCR所用试剂，包括实时荧光定量SYBR染料、无酶水。
一种环状RNA作为胃癌诊断生物标志物在制备预后评价胃癌患者试剂中的应用，所述环状RNA circ:chr7:11101418-11151094低表达的胃癌患者平均生存时间长于高表达的患者。
我们在胃癌细胞的RNA-seq中检测到长度291bp的circ:chr7:11101418-11151094，通过试验发现该环状RNA与胃癌的发生发展存在关联，有可能作为胃癌辅助诊断和预后判断。
经检验验证，发现环状RNA circ:chr7:11101418-11151094在胃癌组织中表达上调，与正常组织中的表达差异显著。对胃癌组织中circ:chr7:11101418-11151094的表达与病人的生存时间和状态进行的生存分析，发现：circ:chr7:11101418-11151094表达水平不同的胃癌患者中预后存在明显差异, 低表达circ:chr7:11101418-11151094的胃癌患者平均生存时间明显长于circ:chr7:11101418-11151094表达较高的患者。说明circ:chr7:11101418-11151094是一个与胃癌预后相关的分子标记，circ:chr7:11101418-11151094表达低或不表达，病人预后好。本发明为胃癌患者的预后提供了强有力的分子生物学工具，具有深远的临床意义和重要的推广应用前景。
附图说明
图1为实时荧光定量PCR分析circ:chr7:11101418-11151094在胃癌组织与正常组织中的表达差异；
图2为circ:chr7:11101418-11151094与胃癌患者预后的关系；
图3为RNA测序的文库构建；
图4为鉴定出的环状RNA circ:chr7:11101418-11151094。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例；基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明所用的正常组织和胃癌组织标本均来自中南大学附属肿瘤医院治疗的初诊患者，未经放化疗和手术治疗。新鲜胃癌组织采集好后，立即放入液氮罐中保存，随后搜集所有病人的相关临床资料。所有实验用组织样本采集均获得中南大学伦理委员会授权和病人同意。
本发明通过RNA-seq发现了环状RNA circ:chr7:11101418-11151094，具体操作流程为：采用抽提的Total RNA 起始，经探针去除 rRNA， RNase R 去除线性 RNA 后，委托瑞博生物公司构建环状 RNA 文库。如图 3所示。瑞博生物公司采用 CIRI2、CIRCexplorer2两款软件进行环状 RNA 的鉴定分析，并筛选出两款软件同时预测出的环状 RNA 作为最终预测结果。两款软件同时进行预测，可以显著降低软件预测的假阳性结果，更精确的鉴定出环状 RNA。比如CIRI2 软件鉴定以 bwa mem 软件比对到基因组的结果文件为输入文件，针对每个样本， CIRI2 软件预测形成环状 RNA 的前后位置信息，并进一步鉴定候选circRNA。具体分析流程是：完成 bwamem 比对后， CIRI2 对所得的 sam 文件进行两次处理。第一次，通过 PCC（ paired chiastic clipping，交错比对信号）信号检测 junctionreads。利用 PEM（ paired-end mapping，双末端比对）和GT-AG 序列特征进行初步过滤，得到候选 circRNA。第二次，再次检测额外的 junction reads，并进一步过滤掉假阳性的候选 circ。我们鉴定出了大小为291bp的circ:chr7:11101418-11151094，包含PHF14基因的1到3号外显子。如图4所示。环状RNA的引物与线性RNA引物的设计不同，其是根据拼接位点两侧设计，最终的引物设计与合成工作，委托瑞博生物公司广州合成部合成。
其中：内参基因GAPDH特异性PCR引物为：
上游引物：5’- GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT -3’
下游引物：5’- GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG -3’。
环状RNA circ:chr7:11101418-11151094实时定量PCR引物为：
上游引物：5’- GTGATTCTTCATCTTCCAAGAGAAC-3’；
下游引物：5’- TGCAACACAGACTGTCTTTGTCTTC -3’。
实施例1：制备circ:chr7:11101418-11151094用于胃癌患者预后的实时荧光定量检测试剂盒（50次反应）：异丙醇100ml、三氯甲烷100ml、RNA稳定溶液50ml、Trizol 50ml、无酶水10ml、逆转录缓冲溶液200ml、逆转录随机引物50μl、三磷酸碱基脱氧核苷酸100μl、RNA酶抑制剂50μl、MMLV逆转录酶50μl、Premix Ex Taq 50μl、circ:chr7:11101418-11151094特异性引物30μl：（上游引物：5’-GTGATTCTTCATCTTCCAAGAGAAC-3’；下游引物：5’-TGCAACACAGACTGTCTTTGTCTTC -3’）；GAPDH特异性引物30μl（上游引物：5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT -3’；下游引物：5’- GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG -3’）。
实施例2：胃癌组织中circ:chr7:11101418-11151094的检测
胃癌组织的保存：收集待测胃癌组织存放于盛有RNA稳定溶液的冻存管中，放至-80℃冰箱备用；
准备工作：研钵用洗涤剂清洗后浸泡于3％的双氧水中4小时以上，冲刷数次，用双蒸水洗一次，用锡箔纸覆盖研钵置于180℃干燥箱中干烤6小时以上。
RNA抽提：在研钵中先加入液氮预冷，取冻存管中保存的组织，加入液氮快速研磨，直到将组织磨成粉末状加入1ml的Trizol进一步研磨成液体状后移至Tube管，每1ml含Trizol的裂解液添加200μl预冷的氯仿，震荡约15-30s进行混匀，4℃，12,000rpm离心15分钟，取上层水相以1:1的比例加入预冷的异丙醇中，上下颠倒混匀数次，室温静置10分钟，4℃，12,000rpm离心10分钟，弃上清，加入500μl用DEPC水配置的75％乙醇，洗涤RNA沉淀。然后4℃、7500rpm离心5分钟，重复洗涤两次，最后用移液枪尽量弃去上清，室温干燥10～15分钟，加入10-20μl DECP水，保存于-80℃。
circ:chr7:11101418-11151094的逆转录(依据Thermo公司的实验说明手册操作)，逆转录反应体系如表1，逆转录第一步反应条件：65℃，5分钟，逆转录反应第二步的反应体系如表2所示，逆转录第二步反应程序：25℃、5分钟，42℃、60分钟，70℃、5分钟。待反应结束后，-20℃保存产物备用。
表1：逆转录反应体系
Figure RE-950065DEST_PATH_IMAGE001
表2：逆转录反应第2步的反应体系
Figure RE-667486DEST_PATH_IMAGE002
实时荧光定量PCR（依据Takara公司生产的qPCR试剂盒的实验说明手册操作）：先将逆转录反应产物稀释10倍，20μl反应体系如表3所示。实时荧光定量PCR反应条件如下：95℃、3分钟，40个循环，95℃、10秒，60℃、30秒。
Bio-Rad实时荧光定量PCR仪进行上述反应完成后，与内参基因GAPDH标准化，以2-ΔΔCT值显示目标基因的相对表达值，判定基因的表达差异并计算P-value值。分析发现，circ:chr7:11101418-11151094与正常组织中的表达相比，胃癌患者中的表达明显上调，差异有显著性。
如图1所示，逆转录后进行实时荧光定量分析的表达，与17例正常上皮组织(用做对照)相比，circ:chr7:11101418-11151094在35例胃癌组织中明显高表达，在胃癌组中circ:chr7:11101418-11151094表达水平大约是正常上皮的2倍，两组数据的差异具有统计学意义(P＝0.0207)，结果见图1。因此，circ:chr7:11101418-11151094在胃癌组织中高表达，circ:chr7:11101418-11151094对胃癌的发生发展可能具有重要的生物学功能。
表3：实时荧光定量PCR
Figure RE-938061DEST_PATH_IMAGE003
实施例3：预后分析：对42例胃癌患者进行了电话随访，详细询问了他们的首发时间、治疗情况、有无复发、有无再患其他疾病、复发及死亡时间等，并登记了生存时间和状态，并对胃癌组织中circ:chr7:11101418-11151094的表达与病人的生存时间和状态进行的生存分析，发现circ:chr7:11101418-11151094表达水平不同的胃癌患者中预后存在明显差异，对其进行Kaplan-Meier生存分析，分析结果如图2所示，由图2可以看出：24例胃癌组织中高表达circ:chr7:11101418-11151094的患者平均生存时间明显短于18例circ:chr7:11101418-11151094表达较低的患者，两组数据的差异具有统计学意义(P＝0.0106)，结果见图2。说明circ:chr7:11101418-11151094是一个与胃癌预后相关的分子标记，表明circ:chr7:11101418-11151094高表达的患者预后较低表达的患者预后差， circ:chr7:11101418-11151094的高表达是胃癌患者预后风险预测的独立危险因素。
序列表
<110> 长治医学院
<120> 一种环状RNA作为胃癌诊断生物标志物及预后评价试剂中的用途
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 291
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agaaccagag gacgaaaacg aagcuucguu ccugaggaag aaaaacauga ggaaagaguu 60
ccuagagaga gaagacaaag acagucugug uugcaaaaga agcccaaggc ugaagauuua 120
agaacugaau gugcaacuug caagggaacu ggagacaaug aaaaucuugu caggugugau 180
gaaugcagac ucugcuacca uuuuggcugu uuggauccuc cuuugaaaaa gucuccuaaa 240
cagacaggcu acggauggau augucaggaa ugugauucuu caucuuccaa g 291
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtgattcttc atcttccaag agaac 25
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgcaacacag actgtctttg tcttc 25
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggagcgagat ccctccaaaa t 21
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ggctgttgtc atacttctca tgg 23

Claims (5)

1.一种环状RNA作为胃癌诊断生物标志物在制备检测胃癌组织的试剂中的应用，其特征在于：所述环状RNA circ:chr7:11101418-11151094的核苷酸序列如SEQ NO:1所示，该环状 RNA位于人类的第7号染色体上，全长291bp；所述环状RNA circ:chr7:11101418-11151094在胃癌患者癌组织中特异性表达水平上调。
2.根据权利要求1所述的一种环状RNA作为胃癌诊断生物标志物在制备检测胃癌组织的试剂中的应用，其特征在于：所述试剂为实时荧光定量检测试剂，该试剂中包含用于检测胃癌组织中circ:chr7:11101418-111510945表达的引物序列：
上游引物：5’- GTGATTCTTCATCTTCCAAGAGAAC-3’；
下游引物：5’- TGCAACACAGACTGTCTTTGTCTTC -3’。
3.根据权利要求2所述的一种环状RNA作为胃癌诊断生物标志物在制备检测胃癌组织的试剂中的应用，其特征在于：所述实时荧光定量检测试剂为试剂盒，还包含内参基因GAPDH特异性PCR引物：
上游引物：5’- GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT -3’；
下游引物：5’- GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG -3’。
4.根据权利要求3所述的一种环状RNA作为胃癌诊断生物标志物在制备检测胃癌组织的试剂中的应用，其特征在于：所述试剂盒中还包含：（1）从胃癌组织中抽提总RNA所用试剂，包括RNA稳定溶液、Trizol试剂、三氯甲烷、异丙醇、无酶水；(2)以总RNA为模板将circ:chr7:11101418-11151094逆转录为cDNA所用试剂，包括逆转录缓冲液、三磷酸碱基脱氧核苷酸、RNA酶抑制剂、MMLV逆转录酶以及随机引物；(3)将cDNA实时定量PCR所用试剂，包括实时荧光定量SYBR染料、无酶水。
5.一种环状RNA作为胃癌诊断生物标志物在制备预后评价胃癌患者试剂中的应用，其特征在于：所述环状RNA circ:chr7:11101418-11151094的核苷酸序列如SEQ NO:1所示，该环状RNA circ:chr7:11101418-11151094低表达的胃癌患者平均生存时间长于高表达的患者。
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