KR20100093538A - 편평세포 폐암의 예후를 예측하는 방법 - Google Patents

편평세포 폐암의 예후를 예측하는 방법 Download PDF

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레슬리 에스텔 도시
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베리덱스, 엘엘씨
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Abstract

본 명세서에는 선별된 miRNA 서열의 조절 변화를 관찰함으로써 편평세포 폐암의 예후를 예측하는 방법이 기술된다. 이들 서열에는 hsa-mir-146b, hsa-mir-191, hsa-mir-206, hsa-mir-299-3p, hsa-mir-155, hsa-mir-15a, hsa-mir-122a, hsa-mir-513, hsa-mir-184, hsa-mir-511, hsa-mir-100, hsa-mir-10a, hsa-mir-453, hsa-mir-379, hsa-mir-202, hsa-mir-21, hsa-mir-126, hsa-mir-494, hsa-mir-432, hsa-mir-370, 및 이들 서열의 조합이 포함될 수도 있다.

Description

편평세포 폐암의 예후를 예측하는 방법{Process for predicting the prognosis of squamous cell lung cancer}
관련 출원과의 상호 참조
본 출원은 그 전체가 참고로 본 명세서에 포함되는, 2007년 10월 30일자로 출원된 공계류 중인 미국 가특허 출원 제60/983,756호에 기초한 우선권을 주장하고 그의 이익을 청구한다.
서열목록, 표, 또는 프로그램 목록에 대한 참조
본 출원은 그 전체가 참고로 본 명세서에 포함되는, "Sequence listing.txt" (6 kb, 2008년 10월 29일자로 작성됨)로 표제된 전자 문서로 제공되는 하기에 열거된 "서열목록"을 참조한다.
본 발명은, 일 실시 형태에서, 선별된 마이크로 RNA (miRNA) 서열들에 있어서 생산의 조절 변화를 관찰함으로써 편평세포 폐암의 예후를 제공하는 방법에 관한 것이다. 특정된 서열들의 상향 조절 또는 하향 조절의 관찰에 의해, 암세포의 존재뿐만 아니라 암의 예후도 결정될 수 있다.
폐암은 전세계적으로 암 관련 사망의 가장 일반적인 원인이고, 비소세포 폐암 (NSCLC)은 기관지원성 암종의 가장 빈번한 유형을 나타낸다. NSCLC는 미국에서 모든 폐암 사망 원인의 80%에 해당하며 주로 샘암종, 및 편평세포 암종 (SSC), 그리고 부차적으로 대세포암으로 구성된다. 완치에 이를 수 있는 수술에도 불구하고 대략 40%의 환자들은 5년 이내에 재발할 것이다. NSCLC의 게놈 프로파일링이 최근에 이 질환에 걸린 환자의 예후를 예측하는 데 중요한 정보를 제공하고 있다. 이러한 게놈 분류요소(classifier)는 외과적 절제술 외에 화학요법으로 효과를 볼 수 있는 초기 NSCLC 환자의 확인을 위해 최대 수백 개의 유전자들을 포함할 수 있다.
본 발명은, 그의 일 형태에서, 세포 시료에서 편평세포 폐암의 존재를 검출하는 방법을 포함한다. 출원인은 야생형 세포와 비교하여 편평세포 폐암에서 차등적으로 조절되는 소정의 miRNA들을 발견하였다. 이러한 miRNA들에서 조절 변화의 정도를 측정함으로써, 조직 시료가 편평세포 폐암 세포를 포함하고 있는지 여부를 결정할 수 있다.
다른 형태에서, 본 발명은 편평세포 폐암의 예후를 예측하는 방법이다. 출원인은 편평세포 폐암 환자에 대해 예후를 예측하는 것을 가능케 하는 소정의 다른 miRNA들을 발견하였다. 이러한 miRNA들을 모니터링함에 의해, 더욱 정확한 예후가 제공될 수도 있다.
본 발명은 첨부 도면을 참고로 하여 개시된다:
<도 1a>
도 1a는 관심 miRNA 서열들의 개수를 예측 예후와 상호 관련시키는 그래프.
<도 1b>
도 1b는 두 가지 상이한 수준의 miR-146b 발현에 대해 생존율을 시간과 상호 관련시키는 그래프.
상응하는 참조 문자는 여러 도면 전체에서 상응하는 부분을 나타낸다. 본 명세서에 개시된 예는 발명의 여러 실시 형태를 예시할 뿐 어떠한 방식으로든 발명의 범주를 제한하는 것으로 간주되어서는 안 된다.
정의
"조절 변화"라는 어구는 야생형 세포 내 동일한 세포 성분의 존재량과 비교하여 어느 세포 성분, 예컨대 miRNA의 존재량에 있어서의 변화를 지칭한다. "하향 조절"이라는 어구는 문제의 세포 성분의 존재량에 있어서의 감소를 지칭하는 반면, "상향 조절"이라는 어구는 이 성분의 존재량에 있어서의 증가를 지칭한다.
차등 miRNA 조절에 의한 편평세포 폐암의 동정
편평세포 폐암 조직을 야생형 조직과 비교하여 15개의 차등 발현된 miRNA들을 동정하였다(표 1). 조직 시료에는 세포주 및 임상 시료가 모두 포함되었다. 총 RNA를 통상적인 기술에 따라서 세포 시료로부터 추출하였다. 예를 들어, 스냅-냉동(snap-frozen) 시료용 mirVana 단리 키트(앰비온(Ambion)) 및 포르말린-고정, 파라핀-포매된(FFPE) 시료용 리커버올(RecoverAll)(상표명) 총 핵산 단리 키트(앰비온)가 사용될 수도 있다. 다른 통상적인 RNA 추출 방법들이 또한 사용될 수도 있다. 일단 총 RNA가 추출되면, 소형 (뉴클레오티드 40개 미만) RNA를 젤 전기영동에 의해 단리할 수도 있다. 시료들을 분석하여 특정 miRNA 서열들의 동정 및 존재량을 결정한다. 제한적인 것은 아니지만, 구매가능한 miRNA 키트, 예컨대 mirVana 바이오어레이(Bioarray)(앰비온)와 같은 임의의 적합한 기술이 동정 및 존재량을 결정하기 위해 사용될 수 있다. 야생형 시료와 비교하여 현저히 달라진 발현을 보이는 15개의 차등 발현된 miRNA들을 편평세포 폐암 세포에서 동정하였다. 이러한 서열들이 표 1에 나타나 있다.
Figure pct00001
발명의 일 실시 형태에서, 시료를 분석하여 표 1에 제시된 특정 miRNA 서열의 존재량을 결정한다. 시료는 조직 시료, 예컨대 외과적 처치 중에 수득된 시료일 수도 있다. 대안적으로, 시료는 예를 들어, 혈액 시료 또는 유사한 원료로부터 비-침습적으로 수득될 수도 있다. 시료 내 특정 miRNA의 존재량을 결정하고 조절 변화를 평균적인 시료와 비교하여 관찰한다. miRNA는 세포 외부에서도 파괴되지 않고 존재하는 것으로 알려져 있기 때문에, 유리(free) miRNA는 편평세포 폐암에 대한 스크리닝 방법을 제공할 수 있다. 이러한 스크리닝은 비침습성 시료추출 기술, 예컨대 단순 혈액 검사를 이용해 수행될 수 있다. 이러한 방식으로 고위험군의 환자들을 정기적으로 검사하여 암의 초기 진행을 쉽게 확인할 수 있다.
다른 실시 형태에서, miRNA 존재량은 편평세포 폐암을 샘암종과 구별하기 위해 관찰된다. miRNA 발현에서 조절 변화를 관찰함에 의해, 이러한 구별은 조직 형태가 불명확한 경우에도 이루어질 수 있다.
폐 편평세포 암종의 예후
폐 편평세포 암종의 예후를 예측하는 것을 허용하는 추가의 miRNA 서열들을 발견하였다. 20개의 miRNA 서열들이 편평세포 폐 암종 예후와 밀접하게 관련된 것으로 동정되었다. 임상 시료를 1991년 10월과 2002년 7월 사이에 수집하였다. 또한 환자들 각각의 병력을 수집하고 변경된 조절을 보인 miRNA들과 환자 예후 사이의 상관관계를 작성하였다. 이 상관분석 과정의 상세한 설명은 본 명세서의 다른 부분에서 논의된다. 이러한 방식으로, 환자 예후에 강력하게 영향을 미치는 miRNA 서열들을 동정하였다. 동정된 서열들이 표 2에 나타나 있다.
Figure pct00002
5겹 교차 검증(five-fold cross validation)을 이용했을 때, 3년 내 전체 생존율을 예측하기 위한 가장 높은 평균 값은 miR-146b (서열번호: 15)를 단독 이용하는 경우의 78%인 것으로 나타났다. 3개 이상의 추가 miRNA들이 선형으로 miR-146b에 부가되는 경우, 예측 정확도는 대략 68%로 하락하였지만, 그 이후에는 안정화되었다. 도 1a를 참고하라. 고도의 miR-146 상향 조절을 보이는 환자들은 저수준 miRNA-146b 그룹 (95개월)에 비해 현저히 열악한 전체 생존율 (26개월)을 나타내었다. 도 1b를 참고하라. 도 1b에서, "고수준" miRNA-146 그룹 (두 선 중 더 낮은 것)은 정중값(median value)보다 높은 miRNA-146 수준을 갖는 것들로 정의하였다. "저수준" miRNA-146 그룹(두 선 중 더 높은 것)은 정중값보다 낮은 miRNA-146을 갖는 것들로 정의하였다.
특정 miRNA 서열들의 존재량을 측정함에 의해, 예측된 예후가 환자에게 제공될 수 있다. 예를 들어, 특정 서열의 miRNA 존재량을 시간의 함수로서 환자 생존가능성에 연관시키는 통계적 데이터를 수집할 수도 있다. 예를 들어, 소정의 miRNA 서열에 있어 큰 조절 변화를 보이는 환자의 경우, 데이터는 이후의 3년 이내에 78% 가능성으로 관해(remission)되는 것을 나타낼 수도 있다. 이렇게 예측된 예후는 환자에게 제공될 수도 있다. 도 1b는 miR-146b에 대한 표본 데이터를 제공하지만, 이러한 데이터가 제한적인 것으로 해석되어서는 안 된다. 폭넓은 통계적 정보가 수집될 수 있도록 환자의 인구통계적 정보와 같은 부가적인 데이터가 고려될 수도 있다.
miRNA는 통상적인 기술을 이용해 조직 시료로부터 추출될 수도 있다. 이러한 시료는 외과적 처치 도중에 수득될 수도 있다. 대안적으로, miRNA는 비조직 시료로부터 단리될 수도 있다. 예를 들어, miRNA는 혈액, 대변, 소변 또는 다른 생물학적 시료로부터 단리될 수도 있다. 시료에서 발견된 특정 miRNA의 존재량을 정상 시료와 비교한다. 상향 조절되거나 하향 조절된 miRNA 존재량은 암을 나타내는 것일 수 있다.
특정된 miRNA 서열(들)의 존재량은 임의의 공지된 기술에 따라 결정될 수 있다. 제한이 아니라 실례로서, QPCR이 사용될 수도 있다.
첨부된 서열목록 내 miRNA 서열들은 통상적으로 단리되는 miRNA 서열들을 나타낸다. 열거된 서열들의 말단에서의 변경은 당해 분야에 공지되어 있으며 만일 잔기들이 95% 이상 상동성이라면 본 발명의 범주 내에 속한다.
발명이 특정 실시 형태를 참고로 설명되었다고 하더라도, 다양한 변화가 이루어질 수도 있고 등가물이 발명의 범주로부터 벗어나지 않으면서 특정 상황에 적합하도록 발명의 구성요소에 대해 치환될 수도 있음을 당해 분야의 숙련자는 이해할 것이다. 따라서, 발명은 설명된 특정 실시 형태 또는 이 발명을 수행하기 위해 고려된 특정 방식에 제한되는 것이 아니라, 첨부된 특허청구범위의 범주 및 사상 내에 속하는 모든 실시 형태를 포함하는 것으로 의도된다.
방법
임상 시료
전체로, 61개의 스냅-냉동 폐 SCC 및 10개의 매칭된(matched) 정상 인접 폐 조직 시료를 miRNA 발현에 대해 평가하였다. 이들 시료는 1991년 10월과 2002년 7월 사이에 환자의 동의 및 임상시험심의위원회(Institutional Review Board) 승인을 얻어 미시건 대학병원의 환자들로부터 수집하였다. 분석을 위해 선택된 시료는 70%를 초과하는 종양 세포를 포함하고 있었다. 61개의 종양 시료 중에서 57개는 충분한 추적조사(follow up) 임상 정보를 가지고 있어 예후 분석에 사용하였다. 57개 중 54개는 이에 앞서 어피메트릭스(Affymetrix) U133A 유전자칩(GeneChip)(GSE4573)을 사용해 프로파일링되었다.
앰비온 miRNA 발현 프로파일링
328개의 인간 miRNA 탐침을 포함하는 mirVana 바이오어레이(앰비온, 버전 2)를 사용하여 폐 SCC miRNA 특이적 발현양상을 동정하였다. 총 RNA를 트리졸(Trizol)을 이용해 단리하였다. mirVana 단리 키트(앰비온)를 사용해 4 ug의 총 RNA로부터 miRNA를 단리하였다. 이어서, 모든 시료를 폴리아크릴아미드 젤 전기영동(플래쉬-페이지 앰비온(Flash-Page Ambion))으로 분획화하고 선형 아크릴아미드를 이용한 에탄올 침전에 의해 소형 RNA(< 40 nt)를 회수하였다. miR-16의 정량적 RT-PCR(qPCR)을 이용하여 miRNA 어레이 분석 전에 miRNA 농축을 확인하였다. 만약 miR-16의 Ct 값이 25를 초과한다면, miRNA 단리는 실패한 것으로 간주하였다.
소형 RNA 시료에 대해 아민 개질된 유리딘이 도입되는 폴리(A) 중합 효소 반응(앰비온)을 수행하였다. 이어서 테일 형성된 시료를 아민-반응성 Cy3(인비트로젠)을 이용해 형광 표지하였다. 상기에 언급된 표지 기술은 가능한 방법 중 하나에 불과하다. 다른 적합한 표지 기술은 본 명세서를 읽고 나면 그에 비추어 당해 분야의 숙련자에게 자명할 것이다. 이러한 대안적인 방법은 본 명세서와 함께 사용할 수 있는 것으로 상정된다. 형광 표지된 RNA를 유리섬유 필터를 사용해 정제하고 용출하였다(앰비온). 이어서 각 시료를 42oC에서 14시간 동안 바이오어레이 슬라이드(앰비온)에 혼성화하였다. 이 어레이를 세척하고 애질리언트(Agilent) 2505B 동초점 레이저 마이크로어레이 스캐너(애질리언트)를 사용해 스캔한 후 데이터를 발현 분석 소프트웨어(Expression Analysis software)(코드링크(Codelink), 버전 4.2)를 사용해 수집하였다.
miRNA 정량적 PCR
ABI miRNA 택맨 시약(Taqman reagent)을 사용해 정량적 PCR (QPCR)을 수행하여 miRNA 발현 프로파일을 확인하였다. 고용량 DNA 아카이브 키트(High Capacity DNA Archive kit) 및 3 ul의 5x RT 프라이머를 제조사(앰비온)의 지침에 따라서 사용해 10 ng의 총 RNA를 cDNA로 전환시켰다. 15 ㎕의 반응물을 16℃에서 30분, 42에서 30분, 85℃에서 5분간 열 순환기(thermocycler)에서 인큐베이션하고 4℃로 유지하였다. 모든 역전사효소 반응물은 주형 대조군을 포함하고 있지 않았다. 표준 택맨(등록상표) PCR 키트 프로토콜을 이용해 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems) 7900HT 서열 검출 시스템 상에서 QPCR을 수행하였다. 10 ㎕의 PCR 반응물은 0.66 ㎕ RT 생성물, 1 ㎕ 택맨 miRNA 분석 프라이머 및 탐침 믹스, 5 ㎕ 택맨 2x 유니버셜 PCR 마스터 믹스(앰퍼라제(Amperase) UNG 무함유) 및 3.34 ㎕ 물을 포함하였다. 반응물을 95℃에서 10분간 384 웰 플레이트 내에서 인큐베이션하고, 이어서 95℃에서 15초, 및 60℃에서 2분의 주기를 40회 반복하였다. 모든 QPCR 반응은 cDNA 무함유 대조군을 포함하였고 모든 반응은 3회 병렬 수행하였다.
miRNA 통계적 분석
발현 분석 소프트웨어에 의해 표시된(flagged) 탐침을 먼저 제거하고 배경 정중값을 스팟 평균(spot mean)으로부터 공제하였다. 만약 표시된 탐침의 개수가 칩당 표시된 탐침의 표준 편차를 공제한 평균보다 작다면 비정상 시료로 확인하고 제거하였다. 0보다 작은 스팟 강도 값을 0.5로 설정하였고 그 후에 이 데이터를 변위치(quantile) 정규화하였다. 중간 강도의 정중값과 대비하여 모든 시료에 걸쳐 반복된 탐침들의 상관관계를 플롯팅함으로써 6의 배경 컷오프(log2 정규화)를 확인하였다. 따라서, 만약 정규화된 신호 강도가 어느 한 비교 그룹에서 6보다 작다면 miRNA를 추가의 분석으로부터 제외하였다. 이 컷오프는, 이 값 아래에서는 반복된 탐침들의 상관관계가 급격하게 하락하였기 때문에 선택하였다.
마이크로어레이 분석 유의성(Significance of Microarray Analysis, SAM) 알고리즘 (문헌[Tusher VG, Tibshirani R, Chu G. Significance analysis of microarrays applied to the ionizing radiation response. Proc Natl Acad Sci U S A 2001;98(9):5116-21])을 이용해 생존율 분석을 수행하였다. 만약 대응표본 t-검정(paired t-test) p-값이 0.05보다 작고 ROC 분석(receiver operator characteristic analysis)으로부터의 곡선하면적(area under the curve, AUC)이 3년 컷오프를 이용해 0.65보다 크다면 해당 miRNA가 전체 생존율과 유의하게 관련된 것으로 선택하였다. 이 집단 내 재발할 환자들의 대부분이 3년 이내에 그렇게 될 것이기 때문에 최대 3년 추적검사를 이용하였다. 또한 이러한 환자들 중 다수가 고령이고 암과 무관한 질병으로 인한 사망이 3년 후에 증가할 가능성이 컸다. 예후 분류요소를 구성하기 위해 사용되는 miRNA의 최소 개수를 결정하기 위해, 순위에 따라 한 번에 하나씩 유전자를 부가함으로써 유전자 발현 마커들의 조합을 검사하였다. 유전자 개수가 증가하는 각 특이적 발현 양상에 대해, 100회 5겹 교차 검증에서, 한정점(defining point)으로 3년 이내 사망을 사용하는 ROC (Receiver Operating Characteristic) 분석을 수행하여 평균 곡선하면적(AUC)을 계산하였다.
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Claims (15)

  1. 야생형 폐 조직 시료 내의 동일한 마이크로RNA와 비교하여 추출된 RNA 내 마이크로RNA - 여기서, 마이크로RNA는 서열번호: 15, 서열번호: 16, 서열번호: 17, 서열번호: 18, 서열번호: 19, 서열번호: 20, 서열번호: 21, 서열번호: 22, 서열번호: 23, 서열번호: 24, 서열번호: 25, 서열번호: 26, 서열번호: 27, 서열번호: 28, 서열번호: 29, 서열번호: 30, 서열번호: 31, 서열번호: 32, 서열번호: 33, 서열번호: 34, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택됨 - 의 조절 변화를 관찰하는 단계; 및
    관찰에 기초하여 편평세포 폐 암종의 예후를 예측하는 단계를 포함하는, 인간에서 편평세포 폐 암종의 예후를 예측하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 조절 변화를 관찰하는 단계 전에 40개보다 많은 뉴클레오티드를 갖는 RNA를 제거하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 마이크로RNA가 서열번호: 15, 서열번호: 16, 서열번호: 19, 서열번호: 20, 서열번호: 24, 서열번호: 25, 서열번호: 26, 서열번호: 30, 서열번호: 31, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상향 조절이 관찰되는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 마이크로RNA가 서열번호: 17, 서열번호: 18, 서열번호: 21, 서열번호: 22, 서열번호: 23, 서열번호: 27, 서열번호: 28, 서열번호: 29, 서열번호: 32, 서열번호: 33, 서열번호: 34 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 하향 조절이 관찰되는 방법.
  7. 야생형 폐 조직 시료 내의 동일한 마이크로RNA와 비교하여 추출된 RNA 내 서열번호: 15의 조절 변화를 관찰하는 단계; 및
    관찰에 기초하여 편평세포 폐 암종의 예후를 예측하는 단계를 포함하는, 인간에서 편평세포 폐 암종의 예후를 예측하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 폐 조직 시료로부터 총 RNA를 추출하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  9. 제7항에 있어서, 관찰 단계가 정량적 중합 효소 연쇄 반응을 수행하는 단계를 포함하는 방법.
  10. 시료 내 서열번호: 15의 존재량(abundance)을 관찰하는 단계; 및
    관찰에 기초하여 편평세포 폐 암종의 예후를 예측하는 단계를 포함하는, 인간에서 편평세포 폐 암종의 예후를 예측하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 존재량을 관찰하는 단계가 시료 내 서열번호: 15의 존재량을 야생형 시료 내 서열번호: 15의 존재량과 비교하는 단계를 포함하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 비교가 이루어질 때, 서열번호: 15의 상향 조절이 발견되는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상향 조절이 발견될 때, 적어도 1.5배의 변화가 발견되는 방법.
  14. 제10항에 있어서, 서열번호: 15가 관찰되는 유일한 마이크로RNA인 방법.
  15. 제10항에 있어서, 관찰 단계가 정량적 중합 효소 연쇄 반응을 수행하는 단계를 포함하는 방법.
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