JP2018504915A - 尿中の前立腺癌の早期発見のためのmicroRNAに基づく方法 - Google Patents
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Abstract
Description
表現「microRNA」、「miRNA」および「miR」は、内在性遺伝子由来の約18〜25ヌクレオチド(nt)長の非コードRNAを指すために同義語として使用される。microRNAは、pre-miRと呼ばれるより長い(約75nt)ヘアピン様前駆体からプロセシングされる。microRNAは、miRNPと呼ばれる複合体で集合し、アンチセンス相補性によってその標的を認識する。microRNAがその標的と100%一致する場合、すなわち相補性が完全である場合、標的mRNAは切断され、miRはsiRNAのように作用する。一致が不完全である場合、すなわち相補性が部分的である場合、標的mRNAの翻訳はブロックされる。一般に、mirRの命名は、miRBaseの命名法(バージョン21)に従う(表1参照)。
サンプルは、デンマークのオーフス大学病院泌尿器科(1997〜2005年)または英国シェフィールドの医学部腫瘍学科で集められた。
T.G.テープは診断のスコアを提供する。それは、
AUC: 0,90-1 = 優
AUC: 0,80-0,90 = 良
AUC: 0,70-0,80 = 並
AUC: 0,60-0,70 = 可
AUC: 0,50-0,60 = 不可
(参考文献:Tape、Thomas G.: "診断検査の解釈"、http://gim.unmc.edu/dxtests/Default.htm)このスコアによれば、本発明の診断分類指標(またはパネル)は良〜優である。
実施例2は、そのようなアッセイを詳細に記載する。
である。
である。線形および他のタイプの両方の回帰が考えられる。
として計算される。または:
である。
の診断スコア(S)を有し、本発明の好ましい実施形態である。
健康な個体および前立腺癌患者(異なる病気のステージにわたり)からの無細胞尿サンプル中に存在する豊富なマイクロRNAを同定すること。
すべてのサンプルは、デンマークオーフス大学病院泌尿器科で収集した(1997〜2005年)。サンプルセットは、前立腺肥大症(BPH)からの12の非悪性サンプル、組織学的に確認された臨床的に局所化されたPC(RP)の治癒を意図した根治的前立腺切除術(RP)の前に33人の患者から採集したサンプル、および去勢抵抗性PC(CRPC)を有する8人の患者の繰り返しから成る。これらのうち34のサンプルは、コホート1(実施例2)に属する。
サンプル調製
尿試料を沈降させ、4,5mlの上清を5mLのCRYOチューブに移し、使用するまで-80℃で保存した。エキソソーム由来のRNAをmiRCURY(商標) RNA Isolation Kit (カタログ番号300102) - Exosome Isolation in combination with miRCURY(商標) RNA Isolation Kits - Cell & Plant (カタログ番号300110)、両方ともExiqon社より、を使用して製造元の説明書きに従い、尿上清3mlから抽出した。精製したRNAを使用するまで-80℃で保存した。
プロファイリングは、Exiqon社のmiRCURY LNA(商標)Universal RT microRNA PCRプラットフォームを2連(2つの別個の逆転写反応)で行った。すべての定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(qRT-PCR)実験およびデータ品質管理は、Exiqon Services、Vedbaek、Denmarkにより実施した。簡単に、miRCURY LNA(商標)マイクロRNA PCR、ユニバーサルcDNA合成キットII(カタログ番号203301)を使用して、2μlのRNAを10μlの反応で逆転写(RT)した。cDNAを100倍に希釈し、2μlを10μlのPCR反応のための投入量として使用した。相対microRNAレベルを384ウェルPCRプレート中で752の異なるmicroRNAをアッセイできるmicroRNA Ready-to-Use PCR, Human panel I+II, V3,Rを用い解析した。以前にmiRBase(バージョン19)の命名法に関連して「hsa-miR-210」と呼ばれていたものは、miRBAse(バージョン21)の命名法を採用するために「hsa-miR-210-3p」と呼ばれるべきであることを考慮する。同じ問題が「hsa-let-7c」と「hsa-let-7c-5p」およびhsa-miR-203aとhsa-miR-203a-3pにも適応される。本発明のmiRの概要およびそれらの配列を表11に示す。すべての分析について、ExiLENT SYBR(登録商標)Greenマスターミックス(カタログ番号203421)を使用した。逆転写反応からRNA鋳型を除いたネガティブコントロールを行い、平行してプロファイリングした。増幅は、LightCycler(登録商標)480 Real-Time PCR System(Roche)で行った。増幅曲線は、Roche LCソフトウェアを用いて、定量サイクル(Cp)値の決定および融解曲線分析の両方について分析した。
平均Cp値が36未満であり、少なくとも2つの試料で検出された全てのアッセイを、さらなる分析のために含めて考えた。ディスカバリー研究のために183のmicroRNAを選択した(実施例2)。
前立腺癌患者(PC)および健常コントロールからの尿試料中の診断バイオマーカーポテンシャルを有するmicroRNAを同定すること。
すべての尿サンプルは、デンマークオーフス大学病院泌尿器科で収集した(1997〜2005年)。トレーニングコホート(コホート1)は、BPH患者(コントロール)由来の8つの非悪性サンプル(NM)、組織学的に確認され、臨床的に位置が特定されたされたPCの治癒のために前立腺摘除(RP)を受けた患者由来の122のサンプル、及び、5つの去勢抵抗性前立腺癌(CRPC)のサンプルから構成される。コホートのサンプル構成の概要については、表2を参照。
サンプル調製
尿試料を沈降させ、4,5mlの上清を5mLのCRYOチューブに移し、使用するまで-80℃で保存した。エキソソーム由来のRNAをmiRCURY(商標) RNA Isolation Kit (カタログ番号300102) - Exosome Isolation in combination with miRCURY(商標) RNA Isolation Kits - Cell & Plant (カタログ番号300110)、両方ともExiqon社より、を使用して製造元の説明書きに従い、尿上清3mlから抽出した。精製したRNAを使用するまで-80℃で保存した。
プロファイリングは、Exiqon社のmiRCURY LNA(商標)Universal RT microRNA PCRプラットフォームを2連(2つの別個の逆転写反応)で行った。すべての定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(qRT-PCR)実験およびデータ品質管理は、Exiqon Services、Vedbaek、Denmarkにより実施した。簡単に、miRCURY LNA(商標)マイクロRNA PCR、ユニバーサルcDNA合成キットII(カタログ番号203301)を使用して、2μlのRNAを10μlの反応で逆転写(RT)した。cDNAを100倍に希釈し、2μlを10μlのPCR反応のための投入量として使用した。コホート1について、相対マイクロRNAレベルは183の選択されたmicroRNAアッセイ(実施例1)および4つのspike-inコントロールから成るmicroRNA Ready-Use PCR、Pick-and-Mix microRNA PCRパネル(カスタムメイド、品番20381)を使用し解析した。すべての分析について、ExiLENTSYBR(登録商標)Greenマスターミックス(カタログ番号203421)を用いた。逆転写反応からRNA鋳型を除いたネガティブコントロールを実施し、並行してプロファイリングした。増幅は、LightCycler(登録商標)480 Real-Time PCR System(Roche)で行った。増幅曲線は、Roche LCソフトウェアを用いて、定量サイクル(Cp)値の決定および融解曲線分析の両方について分析した。全てのサンプルにおいて全てのCp値が37を超えるmicroRNAを、さらなる解析から除外した。低品質サンプルを排除するために、検出数が100未満のmiRNAを有する任意のサンプルを除去した。
増幅効率は、LinRegソフトウェアと同様のアルゴリズムを用いて算出した。すべてのアッセイを明確な融解曲線について検査し、Tmをアッセイの既知の仕様内にあると確認した。さらに、ネガティブコントロールよりも3 Cps低く、データ分析にCp <37を含むアッセイを検出しなければならない。これらの基準を満たさなかったデータは、今後の分析から除外された。 Cpは2次導関数として計算された。低品質サンプルを排除するために、検出数が100未満のmiRNAを有する任意のサンプルを除去した。NormFinderを用いて、最良のノーマライザーは、すべてのサンプルにおいて検出されたアッセイの平均であることが見出された。すべてのデータは、すべてのサンプル(N = 23)(平均-アッセイCp)で検出されたアッセイの平均に対して正規化され、それは多数のアッセイを含むqRT-PCR研究のための最良の標準化であることが示された堅牢な方法である(13)。23のアッセイはhsa-let-7a-5p, hsa-let-7b-5p, hsa-let-7f-5p, hsa-let-7g-5p, hsa-miR-10b-5p, hsa-miR-125b-5p, hsa-miR-1260a, hsa-miR-141-3p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-19b-3p, hsa-miR-200b-3p, hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-204-5p, hsa-miR-23b-3p, hsa-miR-24-3p, hsa-miR-26a-5p, hsa-miR-27b-3p, hsa-miR-30a-5p, hsa-miR-30b-5p, hsa-miR-30c-5p, hsa-miR-99a-5pおよびhsa-miR-99b-5pである。
発現解析: すべての分析について、P値<0.05が統計的に有意であると考えられた。Shapiro Wilkテストを使用して、データが正常に配布されたかどうかを評価した。いくつかのmicroRNAは異なったため、ノンパラメトリック統計Wilcoxon signed-rank検定を、異なる群の間のmicroRNA発現のペアワイズ比較のために使用した。miRNA発現の診断ポテンシャルは、受信者操作特性(ROC)曲線分析によって評価した。
発現データ:
いくつかのmicroRNAが、Wilcoxon rank検定に基づいて有意に制御されることが見出され(P <0.01)、トップ20はhsa-miR-135b-5p, hsa-miR-140-3p, hsa-miR-141-3p, hsa-miR-146a-5p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-19a-3p, hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-205-5p, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-23a-3p, hsa-miR-24-3p, hsa-miR-27b-3p, hsa-miR-30a-3p, hsa-miR-30a-5p, hsa-miR-30b-5p, hsa-miR-30c-5p, hsa-miR-30e-5p, hsa-miR-31-5pおよびhsa-miR-362-5pである。
miRNAの診断可能性は、性能の尺度として曲線下面積(AUC)を用いて、受信者操作特性(ROC)によって評価することができる。これに関して、miRNA-31-5pは、ディスカバリーコホートにおいてAUCが0,92である最も高い可能性を示す。
122症例(RP)に対してわずか8コントロール(BPH)でのカテゴリーの不均一な分布にもかかわらず、85,7%の特異性および92,2%の感度を有するROC曲線下面積(AUC=0.92)によって決定されるように、優れた診断精度を有する強力な2 miR分類指標としてのmiR-31-5p対miR-30cの比を同定することができた。
PC患者からの尿サンプルのmiRNA発現パターンをコントロールと比較して確かめるため、および実施例2で同定された2つのmiR(Cp(miR- 31-5p)- Cp(miR-30c ))分類指標を検証するため。
すべての尿サンプルは泌尿器科で採取され、デンマークオーフス大学病院研究所から入手した(1997〜2005年)。すべての個体について、H&E染色ホルマリン固定パラフィン包埋組織試料の切片を、訓練された病理学者によって評価した。バリデーションコホート(コホート2)は、47の非悪性サンプル(コントロール:BPH患者)、組織学的に確認され臨床的に位置を突き止められたPCの治癒のための前立腺摘除(RP)を受けた患者由来の98のサンプル、および去勢抵抗性前立腺癌(CRPC)の3つのサンプルから構成される。コホートのサンプル構成の概要については、表2を参照のこと。
サンプル調製
1例として、
プロファイリングは実施例2と全く同じように行った。
データのフィルタリングおよび正規化は、実施例2と全く同じように行った。すべてのデータを、すべてのサンプル(N = 23)で検出されたアッセイの平均に対して正規化した。それは多数のアッセイを含むqRT-PCR研究のための最良の標準化であることが示された堅牢な方法である(14)。
発現解析: すべての分析について、P値<0.05が統計的に有意であると考えられた。Shapiro Wilkテストを使用して、データが正常に分布されたかどうかを評価した。いくつかのmicroRNAは異なったので、ノンパラメトリック統計Wilcoxon signed-rank検定を、異なる群の間のmicroRNA発現のペアワイズ比較のために使用した。Benjamini-Hochberg法(15)を用いて複数の検定のためにP値を補正した。miRNA発現の診断可能性は、受信者操作特性(ROC)によって評価された。
複数の検定(Benjamin Hochberg(BH)法)のために調整されたWilcoxon rank検定に基づいて、いくつかのmicroRNAが有意に調節されることが見出された(P<0,01)、トップ20は: hsa-miR-141-3p, hsa-miR-142-3p, hsa-miR-146a-5p, hsa-miR-151a-3p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-191-5p, hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-203a, hsa-miR-204-5p, hsa-miR-205-5p, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-223-3p, hsa-miR-24-3p, hsa-miR-30a-5p, hsa-miR-30c-5p, hsa-miR-31-3p, hsa-miR-31-5p, hsa-miR-320a, hsa-miR-93-5pおよびhsa-miR-99a-5pである。
miR-31-5p(正規化済)および2 miRNA(比)分類指標(miR-31-5p / miR-30c)の診断可能性は、コホート1において確立された同様のカットオフ値を用いて独立したバリデーションコホートにおいて首尾よく有効性が確認された。診断用の2 miRNA(miR-31-5p/miR-30c)分類指標の精度は高く(AUC = 0.86)、感受性は72.5%、特異性は84.1%であった。
2-miR分類指標の堅牢性、すなわち、かなり異なる方法論に従ってサンプリング、処理されたコホートであってもサンプルを癌症例およびコントロールに正確に分類するための診断ポテンシャルを試験するため。コホート3の試料は、コホート1および2と以下のパラメーターに関して異なる: 1)国籍(イギリス)、2)サンプリング(サンプリング前に前立腺をマッサージした)、3)RNA抽出技術(エキソソームの濃縮を伴わない全細胞フリーの尿からの抽出−異なるキットを使用した)。したがって、2つのmiRNAの実施例1および2に対する重複が有意に上方/下方制御されることは、堅牢性の証拠となる。
尿サンプルは、英国シェフィールドのオンコロジー医科学科によって提供された。バリデーションコホートは34の非悪性コントロールサンプル、限局性前立腺癌患者からの36サンプル、進行したPC患者からの20サンプルから構成される。Ambion、Life TechnologyのmirVana(商標)miRNA分離キット(カタログ番号:AM1560)を使用して、製造元の説明書に従い、細胞フリー尿画分(上清)からRNAを直接抽出した。精製したRNAを使用するまで-80℃で保存した。
プロファイリングは実施例3のように行った。コホート3について、相対microRNAレベルは48の選択されたmicroRNAアッセイと4-spike-inコントロールから成るカスタムメイドmicroRNA Ready-to-Use PCRを用いて解析された。測定された50%未満の48のmiRNAがサンプルセットから除去されたサンプル。コホート1およびコホート3の両方についてNormFinderアルゴリズム(40)を使用し、正規化遺伝子hsa-miR-103a-3pとして最も安定に発現されたmiRNAを両方のセットにおいて選択し、コホート3の標準化を行った。
2つのmiR分類指標(miR31-5p, 30c)はコホート1で確立されたカットオフ値と0,79 (CI: 0,69 to 0,90, p< <0,0001)のROC曲線下面積を用いることで感受性72.9%と特異性84.4%と共にコントロールから分類された。タブ4および図1c参照。
コホート3は異なる試料、採集、処理および標準化手順等でコホート1および2とは根本的に異なるのにもかかわらず、miR31の診断ポテンシャルが確認された。コホート1とコホート2で確立されたカットオフ値と同じものを使用して、この独立コホート(コホート3)で2 miR分類指標が首尾よく有効性が確認された。診断分類指標の精度は高く(AUC = 0,79)、感受性は72,9%、特異性は84,8%であった。
単一のmiRNAの発現レベル上で上下変動しない分類指標であるmiRNAのパネルを使用することが有利であり得る。診断ポテンシャルを有するmiRNAの同定検出力を高めるために、コホート1およびコホート2を1つの大きなディスカバリーコホートに併合する。併合されたデータセットは、分類指標を構築するための統計的アプローチに十分な力を有する。
併合されたコホート(実施例1のコホート1および実施例2のコホート2)は48の非悪性サンプル(NM; BPH患者から(コントロール)、組織学的に確認され臨床的に位置を突き止められたPCの治癒のための前立腺摘除を受けている患者からの205サンプル、去勢抵抗性前立腺癌(CRPC)の8サンプルから構成される。
データフィルタリングおよび正規化
ノーマライザの数を減らすために、バックグラウンドでフィルタリングされたデータ(すべてのサンプルで測定値が取得される)がNormfinderアルゴリズムに解析された(14)。Normfinderからの上位5種の最も安定なmiRNA(hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-30b-5p, hsa-let-7a-5p, hsa-miR-27b-3p, hsa-miR-23b-3p)は、各サンプルの平均正規化値を計算するために使用される。個々のサンプルの平均正規化値は、ΔCp値を得るために各個々のサンプルの生データCp値から減算される。2つの正規化手順(トップ5のmiRNAおよび全域平均正規化)は、差次的に発現されるmicroRNAの上位ならびにmicroRNAの全体的なランキングに関して非常に類似した結果をもたらし、その後の検証研究で正規化遺伝子として5 microRNAの妥当性を支持している。5 miR正規化法は、その後のすべての分析に使用される。
各miRNA分類指標は、モンテカルロサンプリングによって構築され、2つのグループ間の最も重要なmiRNAのトップ100からランダムに2〜20のmiRNAを抽出した(Benjamini-Hochbergに基づく調整されたWilcoxon test p-value)(17)。これを100万回実施し、ROC AUCまたはlog-rank検定p値をそれぞれ診断および予後分類器のスコアとして用いて、各分類指標の性能を試験した。次いで、分類指標は、分類指標を減らすために、leave-one-outクロスバリデーション(LOOCV)最尤分類器アプローチによって削減された(18)。
分類指標に基づく患者スコアは、以下のように計算した: RにおけるpROCパッケージによって決定されたROC曲線から最良の閾値(Youden's J statistic (Youden, 1950)) (17)に基づいて、所定のmiRNAについてカットオフ値(ΔCp値)を選択した。次に、各患者について、所与のmiRNAのΔCp値を調べ、患者ΔCp値がカットオフより大きい場合、ΔCp値がカットオフ未満であれば、miRNAは+1または-1のスコアを与えた。miRNAがアップレギュレートされているかダウンレギュレートされているかに応じて、操作上のサインをそれに応じて変更した。最後に、所定のmiRNAが検出限界内で発現されないことが判明した場合、スコアに0を割り当てた。この手順を各miRNAについて行い、結果を合計して各患者の総合的な分類スコアを得た。
この大きな併合サンプルセットにおいてBenjamin Hochbergによる複数の検査のために調整した後、表5に示すように、BPHとRPの間で有意に脱調節されることが見出されたトップ20のmiRNAは実施例3で検証された20個のmiRNAのうち15個が全てこのセットに含まれている。表6は、実施例5で見出された、BPHとRPとの間の全ての有意に脱調節されたmiRNAを示す。
「ΔΔCq」は、2-ΔΔCt法によって決定された対照(BPH)および症例(RP)間の遺伝子発現の相対的差の尺度である、(20)参照。
「Fold」は、コントロール(BPH)と症例(RP)との間の遺伝子発現の相対的差異であり、「-」は、miRが癌において下方制御されることを示す。
「Expressed」とは、測定可能な量のmiRを発現するサンプルのパーセンテージを示す。
miRNAの診断ポテンシャルは、性能の尺度として曲線下面積(AUC)を用いて、受信機動作特性(ROC)によって評価することができる。これに関して、miRNA-31-5pはディスカバリーコホートにおいて89.9%のAUCを有する最も高いポテンシャルを示す。
この実施例は、コントロールおよび限局性前立腺癌(RP患者)を有する患者の間の識別のポテンシャルを有するmiRNAを発見するための異なるアプローチを提示した。この分析により、20のmiRNAのリストが明らかとなり、ここで5つのmiRNAが実施例2および3で発見および検証された。診断スコアに最も大きな影響を与えるmiRNAは、miR-320およびmiR-31-5pであり、続いてmiR16-5pであった。
同定されたシグネチャーが前立腺癌に特異的であることを確認するため。
膀胱癌患者からの25サンプルおよび8つの個々の非膀胱癌患者コントロールサンプルからの尿サンプルのセット、実施例1、2および3に用いられた同じプロトコルに従ってサンプリングし処理した。
用いた方法は、実施例1,2および3で使用した方法と同一である。
コントロールと比較して膀胱癌において顕著に異常な発現を有する上位20のランキングマイクロRNAのうち、hsa-miR-16-5p、hsa-miR-320aおよびhsa-miR-10b-5pの3つのマイクロRNAのみがPCで同定されたものと重複している。強力なPC診断2-miR分類指標(miR-31-5p、miR-30c)のROCプロットは、膀胱癌対コントロールの図3に示されており、非常に低い識別値を示す。
この実施例では、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(qRT-PCR)技術を使用して、小さな非コードRNA分子を増幅および定量するためのUniRT法を簡単に説明する。さらなる説明は、EP2391736に見られる。
良性の状態と癌の状態を区別する診断能力を有するmicroRNAを同定すること。
すべての尿サンプルは、泌尿器科で採取され、デンマークオーフス大学病院研究所から入手した(1997〜2005年)。H&E染色ホルマリン固定パラフィン包埋組織標本のすべての個体について、訓練された病理学者によって評価した。トレーニングコホート(コホート4-(V))は、22の非悪性試料(NM; BPH患者(コントロール)由来)であり、組織学的に確認された臨床的に突き止められたPCaの治癒のための前立腺摘除を行った患者から200サンプルであった。
サンプル調製およびマイクロRNA発現プロファイリングを、実施例1に記載のように実施した。
全てのサンプルにおいて全てのCq値が37を超えたmicroRNAは、さらなる解析から除外した。低品質サンプルを排除するために、発現されたmiRNAの総数が潜在的最大値の50%を下回るサンプルを除去した。強く発現されたアッセイのみを選択するために、サンプルの80%未満で発現されるmicroRNAアッセイを除去し、35を上回る平均Cq値でのアッセイも同様に除去した。
2つのカテゴリー(良性および癌)が与えられた場合、ロジスティック回帰を使用して、所与の患者が特定のカテゴリーに属する確率をモデル化することが可能である。マルチブルロジスティック回帰モデルを用いることにより、一つ以上の予測因子を含めることができる(microRNAアッセイ測定)。
最適な診断ポテンシャルを有するmicroRNAパネルを同定するための統計的方法としてLasso回帰を用いた。十分なシグナル対ノイズ比を有するmicroRNAから選択するために、正常およびPCa被験体の間のディスカバリーセットにおいて少なくとも1,75倍の変化を示すmiRNAのみを含めた。ロジスティック回帰は完全なデータセットを必要とするため、欠損値を埋めるために複数の帰属法を使用した。補完はRパッケージの「mice」を用いて行った。
上位10位のmicroRNAを表9に示す。LASSO回帰は、3または7個の予測因子(microRNA)を用いることが最適であることを示した。
「PSA≦10」は、先の標準的な前立腺特異抗原(PSA)測定が、個々の患者(または対象)において血清PSAレベルが10ng / mLまたはそれ以下であることを示す。
良性状態および癌性状態を非常に高精度(AUC> 0.95)で区別するいくつかの新規診断バイオマーカーmicroRNAパネルを同定することができた。
実施例8で同定された10個のmiRバイオマーカーパネル(バイオマーカー分類器またはmiRシグネチャとも呼ばれる)の診断能力を検証するため。
サンプルは実施例8に記載したように収集、処理された。バリデーションコホートは22の非悪性サンプル(NM; BPH患者(コントロール)由来)、組織学的に確認され臨床的に位置を突き止められたPC(RP)の治癒のための前立腺摘除受けている患者からの205サンプルから構成される。
microRNA発現プロファイリング、標準化およびデータフィルタリング
実施例8と同様に、microRNA Ready-Use PCRの異なる生産ロットを使用する以外は、Pick-and-Mix microRNA PCRパネル(カスタムメイド;品番号174845)を使用する以外は実施例8と全く同様にした。
コホート4で定義されたパネル(または分類指標)の診断ポテンシャルは、コホート5でROC分析を用いて検証された。結果を表9bに示す(実施例8参照)。
コホート4で確立されたカットオフ値を用いて、独立した検証コホートにおいて、診断miR分類指標1〜10(診断miRシグネチャー、または診断バイオマーカーパネル番号1〜10)が首尾よく有効性が確認された。microRNAパネルのいくつかは、診断精度が0.86を超える生検検査の陽性転帰を予測することができた。最も適したmicroRNAバイオマーカーパネルは7-miR分類指標であった。診断検査の場合、診断検査の価格および複雑さのために、少数の検査が好ましい。したがって7miR分類指標とは別に、3miR(hsa-miR-31-5p, hsa-miR-141-3p,およびhsa-miR-24-3p)および4miR(hsa-miR-31-5p, hsa-miR-141-3p, hsa-miR-24-3p,およびhsa-miR-31-3p)分類指標は有望なバイオマーカーの候補である。
生検を行うか否かにかかわらず、先のPSA検査結果が「グレーゾーン領域」で10ng / mL未満の患者では、バイオマーカーパネルが、臨床決定を支持するために使用されることが意図されている。この試験の目的は、同定されたバイオマーカーパネルが、10ng / mL未満のPSAレベルを有する患者のサブポピュレーションに適用され得ることができ、さらに高い診断精度で良性および癌性状態を識別することができるかどうかを検証することであった。
コホートはバリデーションコホートのサブセットであった。19の非悪性サンプル(NM; BPH患者から(コントロール))、およびPSAレベルが10 ng/mLより低い、または同等(表8)の組織学的に確認され臨床的に突き止められた治癒のために前立腺摘除を受けた患者からの83サンプルから構成される。
microRNA発現プロファイリング、標準化およびデータフィルタリング
実施例9を参照。
コホート4で定義された分類指標の診断ポテンシャルは、ROC分析を使用して(PSA<10)コホート5のサブポピュレーションで検証された。結果は表9に示す。
10ng / mL未満のPSAレベルを有する患者で意図した用途ポピュレーションから構成される独立コホートにおいて、いくつかのmicroRNAパネルの診断バイオマーカーの可能性を検証した。いくつかのmicroRNAパネルは、診断精度が0.88以上の生検検査の良好な結果を予測することができた。
比率に基づくmicroRNAバイオマーカーシグネチャーは、正規化の必要性を回避することによって検出差を増加させる重要な利点を有し、それにより診断精度を得るために必要とされるアッセイの数を減少させる。この研究の目的は、良性状態よび癌性状態を識別するための診断ポテンシャルを有する比に基づく分類指標を発見することであった。
実施例8と同様(ディスカバリーコホート)。
microRNA発現プロファイリングおよびデータフィルタリング
実施例8からのデータ-標準化無し。
簡単に説明すると、92のプールからのすべての可能なmiRNA対が作成された(n = 4186)。次いで、全試料の少なくとも95%において発現されなかった対を除去し、残りの対(n = 823)の間の比についてAUCを計算した。上位10個のmicroRNA比の対から、可能なすべての3-miR比が作成された。
2-miR比に基づく分類指標を上回る診断力を追加した唯一の3-miR比に基づく分類指標は、感受性と特異性の両方がAUC0.96(感受性および特異性> 0,9、カットオフ2および感度88、特異性95、カットオフ> 6)を有する、hsa-miR-24-3p, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-30a-5p and hsa-miR-24-3p, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-30c-5p(表10参照)(図7)である。
良好な政権結果の予測において有望な診断ポテンシャルを有する2つの比率に基づくmicroRNA分類指標が同定された。
独立した患者コホートにおける2つの同定された3miR比に基づく分類指標のバイオマーカーポテンシャルの検証。
実施例9と同様(すなわちコホート5, 表8)
microRNA発現プロファイリングおよびデータフィルタリング
実施例9からのデータ-正規化無し。
コホート1において確立されたカットオフを有するhsa-miR-24-3p, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-30a-5pおよびhsa-miR-24-3p, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-30c-5pからの2つの3-miR比率に基づく分類指標の診断ポテンシャルはコホート2において、ROC分析を用いて検証された。2つの分類器のROC曲線下面積で定義された診断精度は、それぞれ、0,87(感受性0,89、特異性0,76、カットオフ> 2)および0,89(感受性0,78、特異性0,95 、カットオフ> 6)である(図8)。
2つの同定された比率に基づくmicroRNA分類指標の診断能力は、ディスカバリーコホートにおいて確立された同様のカットオフ値を用いて、独立したバリデーションコホートにおいて首尾よく有効性が確認された。診断3 miR分類指標の精度は、AUCが0.87以上で高くなった。
さらに、3miR分類指標について診断スコアSを計算し、患者のさらなる治療を決定するために使用することができると結論付けている。
この研究の目的は、識別された比率に基づく分類指標が10ng / mL以下のPSAレベルを有する患者意図した用途サブポピュレーションに適用できるかどうかを検証することであり、診断精度の高い良性および癌性の被験体を区別する。
コホート5からのデータ。
microRNA発現プロファイリングおよびデータフィルタリング
実施例9からのデータ-正規化無し。
2つの3miR比に基づく分類指標の診断バイオマーカーのポテンシャルは、コホート2の意図した用途サブポピュレーション(PSA≦10ng / mL)において、それぞれ0.88および0.91という高い診断精度で首尾よく有効性が確認された。臨床検体に適用される診断カットオフ値は、0.5から2(ダイナミックレンジ:[-3, +6]最初の3miR分類指標(hsa-miR-24-3p, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-30a-5pおよびhsa-miR-30a-5p))の間であり、4から6.5(ダイナミックレンジ:[1, 10]2番目の3miR分類指標(hsa-miR-24-3p, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-30c-5p))の間である。
2つの3-mir比に基づく分類器のロバスト性をテストするため、すなわち、実施例4に記載した根本的に異なる方法論に従ってサンプリングし処理したコホートであっても、サンプルを良性状態および癌性状態に正確に分離するそれらの診断ポテンシャルをテストするため。
実施例4を参照。
実施例4を参照。
3-miR分類指標(hsa-miR-24-3p, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-30c-5p)の一つは0.79(CI:0,68-0,87、p <<0,0001、感受性64%および特異性84%)の正確度(ROC曲線下面積)を有し癌状態から良性状態を分類した、図11参照。他の比率に基づく3miR分類指標(hsa-miR-24-3p, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-30a-5p)の診断ポテンシャルは確認できなかった(0.66のAUC)。
コホート3とディスカバリーコホート(コホート4)の間の根本的な違いに基づいて予想されることはないが; 試料の採取と処理の違いにより、比率に基づく分類指標の1つの診断ポテンシャルが確認された。この分類指標(hsa-miR-24-3p, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-30c-5p)は良性状態と癌状態の区別において0.79の診断正確性(AUC)を有しコホート3において首尾よく有効性が確認された。
Claims (42)
- 被験体が前立腺癌に罹患するリスクを評価するためのin vitro方法であって、前記被験体からの尿サンプルにおいて、hsa-let-7a-5p, hsa-let-7b-5p, hsa-let-7c-5p, hsa-let-7e-5p, hsa-let-7f-5p, hsa-let-7g-5p, hsa-miR-100-5p, hsa-miR-106a-5p, hsa-miR-10a-5p, hsa-miR-10b-5p, hsa-miR-1238-3p, hsa-miR-125b-5p, hsa-miR-1260a, hsa-miR-130a-3p, hsa-miR-132-3p, hsa-miR-135a-5p, hsa-miR-135b-5p, hsa-miR-136-5p, hsa-miR-140-3p, hsa-miR-141-3p, hsa-miR-142-3p, hsa-miR-146a-5p, hsa-miR-148a-3p, hsa-miR-151a-3p, hsa-miR-151a-5p, hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-191-5p, hsa-miR-1972, hsa-miR-19a-3p, hsa-miR-19b-3p, hsa-miR-200a-3p, hsa-miR-200b-3p, hsa-miR-200b-5p, hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-203a, hsa-miR-204-5p, hsa-miR-205-5p, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-210, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-223-3p, hsa-miR-22-5p, hsa-miR-23a-3p, hsa-miR-23b-3p, hsa-miR-24-3p, hsa-miR-25-3p, hsa-miR-26a-5p, hsa-miR-27b-3p, hsa-miR-29a-3p, hsa-miR-29b-3p, hsa-miR-29c-3p, hsa-miR-30a-3p, hsa-miR-30a-5p, hsa-miR-30b-5p, hsa-miR-30c-5p, hsa-miR-30e-5p, hsa-miR-31-3p, hsa-miR-31-5p, hsa-miR-320a, hsa-miR-320b, hsa-miR-320c, hsa-miR-331-3p, hsa-miR-362-3p, hsa-miR-362-5p, hsa-miR-363-3p, hsa-miR-375, hsa-miR-378a-3p, hsa-miR-425-3p, hsa-miR-425-5p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-490-3p, hsa-miR-660-5p, hsa-miR-93-5p, hsa-miR-99a-5pおよびhsa-miR-99b-5pからなるmiRの群から選択される少なくとも2つのmiRの発現レベルを測定することを含み、健康なドナーと比較して前記少なくとも2つのmiRの変化した発現レベルが、前記被験体が前立腺癌に罹患している確率が高いことを示す方法。
- 前記少なくとも2つのmiRが、hsa-let-7a-5p, hsa-let-7e-5p, hsa-miR-10b-5p, hsa-miR-1238-3p, hsa-miR-130a-3p, hsa-miR-135b-5p, hsa-miR-136-5p, hsa-miR-140-3p, hsa-miR-141-3p, hsa-miR-142-3p, hsa-miR-146a-5p, hsa-miR-151a-3p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-191-5p, hsa-miR-19a-3p, hsa-miR-200b-3p, hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-203a, hsa-miR-204-5p, hsa-miR-205-5p, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-223-3p, hsa-miR-22-5p, hsa-miR-23a-3p, hsa-miR-23b-3p, hsa-miR-24-3p, hsa-miR-27b-3p, hsa-miR-29a-3p, hsa-miR-29c-3p , hsa-miR-30a-3p, hsa-miR-30a-5p, hsa-miR-30b-5p, hsa-miR-30c-5p, hsa-miR-30e-5p, hsa-miR-31-3p, hsa-miR-31-5p, hsa-miR-320a, hsa-miR-362-5p, hsa-miR-378a-3p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-93-5pおよびhsa-miR-99a-5pからなるmiRの群から選択される、請求項1に記載のin vitro方法。
- 少なくとも2つのmiRが、hsa-miR-141-3p, hsa-miR-142-3p, hsa-miR-146a-5p, hsa-miR-151a-3p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-191-5p, hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-203a, hsa-miR-204-5p, hsa-miR-205-5p, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-223-3p, hsa-miR-24-3p, hsa-miR-30a-5p, hsa-miR-30c-5p, hsa-miR-31-3p, hsa-miR-31-5p, hsa-miR-320a, hsa-miR-93-5pおよびhsa-miR-99a-5pからなるmiRの群から選択される、請求項1または2に記載の方法。
- 少なくとも2つのmiRが、hsa-miR-141-3p, hsa-miR-146a-5p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-205-5p, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-24-3p, hsa-miR-30a-5p, hsa-miR-30c-5pおよびhsa-miR-31-5pからなるmiRの群から選択される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 少なくとも2つのmiRが、hsa-miR-141-3p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-205-5p, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-24-3p, hsa-miR-31-3p, hsa-miR-31-5p, hsa-miR-331-3p, hsa-miR-375およびhsa-miR-378a-3pからなるmiRの群から選択される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 少なくとも2つのmiRが、hsa-miR-141-3p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-24-3p, hsa-miR-31-3p, hsa-miR-31-5p, hsa-miR-331-3p, hsa-miR-375およびhsa-miR-378a-3pからなるmiRの群から選択される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 少なくとも2つのmiRが、hsa-miR-141-3p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-24-3p, hsa-miR-31-3p, hsa-miR-31-5p, hsa-miR-331-3pおよびhsa-miR-375からなるmiRの群から選択される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 少なくとも2つのmiRが、hsa-miR-141-3p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-24-3p, hsa-miR-31-3p, hsa-miR-31-5pおよびhsa-miR-331-3pからなるmiRの群から選択される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 少なくとも2つのmiRが、hsa-miR-146a-5p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-205-5p, hsa-miR-30c-5pおよびhsa-miR-31-5pからなるmiRの群から選択される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 少なくとも2つのmiRが、hsa-miR-141-3p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-24-3p, hsa-miR-31-3pおよびhsa-miR-31-5pからなるmiRの群から選択される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 少なくとも2つのmiRが、hsa-miR-141-3p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-24-3p, hsa-miR-31-3pおよびhsa-miR-31-5pからなるmiRの群から選択される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 少なくとも2つのmiRが、hsa-miR-141-3p, hsa-miR-24-3p, hsa-miR-31-3pおよびhsa-miR-31-5pからなるmiRの群から選択される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 少なくとも2つのmiRが、hsa-miR-141-3p, hsa-miR-24-3pおよびhsa-miR-31-5pからなるmiRの群から選択される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 少なくとも2つのmiRが3、4、5またはそれ以上のmiRである、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 少なくとも2つの選択されたmiRが、hsa-miR-30c-5p, hsa-miR-222-3pおよびhsa-miR-24-3pである、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 少なくとも2つの選択されたmiRが、hsa-miR-30a-5p, hsa-miR-222-3pおよびhsa-miR-24-3pである、請求項1−14のいずれかに記載の方法。
- 少なくとも2つの選択されたmiRが、hsa-miR-30c-5pおよびhsa-miR-31-5pである、請求項1−14のいずれかに記載の方法。
- 発現レベルが正規化された発現レベルである、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 発現レベルは正規化された発現レベルであり、正規化は、hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-30b-5p, hsa-let-7a-5p, hsa-miR-27b-3pおよびhsa-miR-23b-3pという5つのmiRsの平均正規化値を計算することによって行われる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 発現レベルは正規化された発現レベルであり、正規化はhsa-miR-200b-3p, hsa-miR-27b-3pおよびhsa-miR-30b-5pという3つのmiRsの平均正規化値を計算することによって行われる、請求項1−18のいずれかに記載の方法。
- 前記miRの発現レベルは、前記尿サンプルから調製されたエキソソーム調製物中で測定される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前立腺癌のリスクを評価される被験体は、事前の標準的な前立腺特異抗原(PSA)測定による血清PSAレベルが10ng / mL未満であることによって特徴付けられる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 尿サンプルは、尿を採取する直前に前立腺マッサージを受けた被験体からのものである、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 被験体が前立腺癌に罹患しているリスクの評価は、前記試料中の前記少なくとも2つのmiRのレベルを検出し、前記少なくとも2つのmiRの発現レベルデータを含むデータセットに基づく診断スコア(S)を算出することを含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記miRの発現レベルは、定量的ポリメラーゼ連鎖反応(Q-PCR)の方法によって決定される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 診断スコアSは、hsa-miR-30c-5pの発現レベル対hsa-miR-31-5pの発現レベルの比として算出される、請求項24または25に記載の方法。
- 診断スコアSは、hsa-miR-24-3pおよびhsa-miR-222-3pの発現レベル対hsa-miR-30a-5pの発現レベルの比として算出される、請求項24または25に記載の方法。
- 診断スコアSは、hsa-miR-24-3pおよびhsa-miR-222-3pの発現レベル対hsa-miR-30c-5pの発現レベルの比として算出される、請求項24または25に記載の方法。
- 診断スコアSが下記式により計算される:
請求項26に記載の方法。 - 診断スコアSが下記式により計算される:
請求項27に記載の方法。 - 診断スコアSが下記式により計算される:
請求項28に記載の方法。 - 診断スコアSが下記式により計算される:
請求項24または25に記載の方法。 - ΔCq値は、hsa-miR-200b-3p, hsa-miR-27b-3pおよびhsa-miR-30b-5pのmicroRNAアッセイのCq値の平均のCq値に関して正規化された、hsa-miR-141-3p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-24-3p, hsa-miR-31-3p, hsa-miR-31-5pおよびhsa-miR-331-3pに対する特定のマイクロRNAアッセイの値である、請求項32に記載の方法。
- ΔCq値は、hsa-miR-200b-3p, hsa-miR-27b-3pおよびhsa-miR-30b-5pのmicroRNAアッセイのCq値の平均のCq値に関して正規化された、hsa-miR-141-3p, hsa-miR-24-3pおよびhsa-miR-31-5pに対する特定のマイクロRNAアッセイの値である、請求項32に記載の方法。
- 前立腺癌治療を必要とする患者を治療する方法であって、患者が前立腺癌に罹患する確率が増加しているかどうかを判定するために、上記請求項いずれかに記載の診断テストを実行し、この情報に基づいて患者のための適切な治療法を選択することを含む方法。
- 被験体が前立腺癌に罹患するリスクをin vitroで評価するためのキットであって、前記験体からの尿サンプルにおいて、hsa-let-7a-5p, hsa-let-7b-5p, hsa-let-7c-5p, hsa-let-7e-5p, hsa-let-7f-5p, hsa-let-7g-5p, hsa-miR-100-5p, hsa-miR-106a-5p, hsa-miR-10a-5p, hsa-miR-10b-5p, hsa-miR-1238-3p, hsa-miR-125b-5p, hsa-miR-1260a, hsa-miR-130a-3p, hsa-miR-132-3p, hsa-miR-135a-5p, hsa-miR-135b-5p, hsa-miR-136-5p, hsa-miR-140-3p, hsa-miR-141-3p, hsa-miR-142-3p, hsa-miR-146a-5p, hsa-miR-148a-3p, hsa-miR-151a-3p, hsa-miR-151a-5p, hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-191-5p, hsa-miR-1972, hsa-miR-19a-3p, hsa-miR-19b-3p, hsa-miR-200a-3p, hsa-miR-200b-3p, hsa-miR-200b-5p, hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-203a, hsa-miR-204-5p, hsa-miR-205-5p, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-210, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-223-3p, hsa-miR-22-5p, hsa-miR-23a-3p, hsa-miR-23b-3p, hsa-miR-24-3p, hsa-miR-25-3p, hsa-miR-26a-5p, hsa-miR-27b-3p, hsa-miR-29a-3p, hsa-miR-29b-3p, hsa-miR-29c-3p, hsa-miR-30a-3p, hsa-miR-30a-5p, hsa-miR-30b-5p, hsa-miR-30c-5p, hsa-miR-30e-5p, hsa-miR-31-3p, hsa-miR-31-5p, hsa-miR-320a, hsa-miR-320b, hsa-miR-320c, hsa-miR-331-3p, hsa-miR-362-3p, hsa-miR-362-5p, hsa-miR-363-3p, hsa-miR-375, hsa-miR-378a-3p, hsa-miR-425-3p, hsa-miR-425-5p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-490-3p, hsa-miR-660-5p, hsa-miR-93-5p, hsa-miR-99a-5pおよびhsa-miR-99b-5pからなるmiRの群から選択される少なくとも2つのmiRの発現レベルの測定に必要な試薬のアリコートを含み、ここで、健康なドナーと比較して前記少なくとも2つのmiRの変化した発現レベルが、前記被験体が前立腺癌に罹患している確率が高いことを示す、キット。
- miR群がhsa-miR-141-3p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-24-3p, hsa-miR-31-3p, hsa-miR-31-5pおよびhsa-miR-331-3pからなる、請求項36に記載のキット。
- 少なくとも2つのmiRがhsa-miR-141-3p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-24-3p, hsa-miR-31-3p, hsa-miR-31-5pおよびhsa-miR-331-3pから選択される、請求項36または37に記載のキット。
- 少なくとも2つのmiRがhsa-miR-30c-5p, hsa-miR-222-3pおよびhsa-miR-24-3pから選択される、請求項36に記載のキット。
- 少なくとも2つのmiRがhsa-miR-30a-5p, hsa-miR-222-3pおよびhsa-miR-24-3pから選択される、請求項36に記載のキット。
- 1つまたはそれ以上の健常コントロール(s)からのmiRNA発現データの少なくとも1つの参照セットをさらに含む、請求項36−40のいずれかに記載のキット。
- 尿サンプルのエキソソーム調製物を得るために必要な試薬をさらに含む、請求項36−41のいずれかに記載のキット。
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