JP2018504915A - 尿中の前立腺癌の早期発見のためのｍｉｃｒｏＲＮＡに基づく方法 - Google Patents

尿中の前立腺癌の早期発見のためのｍｉｃｒｏＲＮＡに基づく方法 Download PDF

Info

Publication number
JP2018504915A
JP2018504915A JP2017541256A JP2017541256A JP2018504915A JP 2018504915 A JP2018504915 A JP 2018504915A JP 2017541256 A JP2017541256 A JP 2017541256A JP 2017541256 A JP2017541256 A JP 2017541256A JP 2018504915 A JP2018504915 A JP 2018504915A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
hsa
mir
mirs
expression level
diagnostic
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2017541256A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2018504915A5 (ja
Inventor
アニ トムスン ランフェルト
アニ トムスン ランフェルト
クレスチャン フレトスエ ヤコプ
クレスチャン フレトスエ ヤコプ
カリーナ セアアンスン ダルスゴー
カリーナ セアアンスン ダルスゴー
コングスバク ラース
コングスバク ラース
モウリトスン ピーダ
モウリトスン ピーダ
アアントフト トーベン
アアントフト トーベン
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Exiqon AS
Original Assignee
Exiqon AS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Exiqon AS filed Critical Exiqon AS
Publication of JP2018504915A publication Critical patent/JP2018504915A/ja
Publication of JP2018504915A5 publication Critical patent/JP2018504915A5/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B25/00—ICT specially adapted for hybridisation; ICT specially adapted for gene or protein expression
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B25/00—ICT specially adapted for hybridisation; ICT specially adapted for gene or protein expression
    • G16B25/10—Gene or protein expression profiling; Expression-ratio estimation or normalisation
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B25/00—ICT specially adapted for hybridisation; ICT specially adapted for gene or protein expression
    • G16B25/20—Polymerase chain reaction [PCR]; Primer or probe design; Probe optimisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/118—Prognosis of disease development
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Theoretical Computer Science (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Evolutionary Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本出願は、対象が前立腺癌に罹患するリスクを評価するための新しいin vitro方法に関する。当該方法は、患者からの尿サンプルにおいてhsa-let-7a-5p, hsa-let-7b-5p, hsa-let-7c-5p, hsa-let-7e- 5p, hsa-let-7f-5p, hsa-let-7g-5p, hsa-miR-100-5p, hsa-miR-106a-5p, hsa-miR-10a-5p, hsa-miR-10b-5p, hsa-miR-1238-3p, hsa-miR-125b-5p, hsa-miR-1260a, hsa-miR-130a-3p, hsa-miR-132-3p, hsa-miR-135a-5p, hsa-miR-135b-5p, hsa-miR-136-5p, hsa-miR-140-3p, hsa-miR-141-3p, hsa-miR-142-3p, hsa-miR-146a-5p, hsa-miR-148a-3p, hsa-miR-151a-3p, hsa-miR-151a-5p, hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-191-5p, hsa-miR-1972, hsa-miR-19a-3p, hsa-miR-19b-3p, hsa-miR-200a-3p, hsa-miR-200b-3p, hsa-miR-200b-5p, hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-203a, hsa-miR-204-5p, hsa-miR-205-5p, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-210, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-223-3p, hsa-miR-22-5p, hsa-miR-23a-3p, hsa-miR-23b-3p, hsa-miR-24-3p, hsa-miR-25-3p, hsa-miR-26a-5p, hsa-miR-27b-3p, hsa-miR-29a-3p, hsa-miR-29b-3p, hsa-miR-29c-3p, hsa-miR-30a-3p, hsa-miR-30a-5p, hsa-miR-30b-5p, hsa-miR-30c-5p, hsa-miR-30e-5p, hsa-miR-31-3p, hsa-miR-31-5p, hsa-miR-320a, hsa-miR-320b, hsa-miR-320c, hsa-miR-331-3p, hsa-miR-362-3p, hsa-miR-362-5p, hsa-miR-363-3p, hsa-miR-375, hsa-miR-378a-3p, hsa-miR-425-3p, hsa-miR-425-5p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-490-3p, hsa-miR-660-5p, hsa-miR-93-5p, hsa-miR-99a-5p, and hsa-miR-99b-5pからなるmiRの群から選択される少なくとも2つのmiRの発現レベルを測定することを含む。少なくとも2つの選択されたmiRがhsa-miR-30c-5p, hsa-miR-222-3pおよびhsa-miR-24-3pである方法が好ましい。本出願は、in vitro方法を実施するためのキットの部品にも関連する。

Description

本発明は、前立腺癌における過剰診断の問題を軽減するための方法に関する。尿中のいくつかの特徴的なmicroRNAバイオマーカーのレベルを測定することにより、この方法は、さらなる侵襲的診断手順の利益を受ける前立腺癌患者を事前に選定することができる。
前立腺癌（PC）は、前立腺に由来する悪性腫瘍であり、最も一般的に診断され治療された悪性腫瘍であり、西洋諸国の男性の癌関連死の主要な原因の1つである（1）。約6人に1人の男性が前立腺癌と診断され、多くの高齢男性が最終的にこの病気を発症する。
診断時に、大部分の男性は、予後良好な局所性の前立腺癌（前立腺に限局した癌）を有している。男性の約5％は、身体全体に広がっている進行癌または遠隔癌と診断される。そのような診断を受けた男性にとって、5年相対生存率は29％でしかない。しかし、非転移性PCに対してのみ治癒的治療が可能であるため、PCの早期発見は極めて重要である。
PCは、典型的には前立腺特異抗原（PSA）レベルの上昇に基づいて診断され、続いて針生検の組織病理学的検査が行われる。しかしながら、PC検出のためのPSAの使用は、かなりの偽陽性率が付随する。スクリーニングに4,0ng / mlのPSAカットオフを使用すると、65％の偽陽性率および20％の偽陰性率が存在する（2）。特に、中間範囲領域（2〜10ng / mL）におけるPSAレベルは、予測値が非常に低いグレーゾーン領域を示す。当然ながら、このような割合は、他のバイオマーカー、特に容易に入手可能なバイオフルイドに見出され、入手することが比較的安価なバイオマーカーの探索を促している。現在のところ、出願人の知る限り、この取り組みに成功した例はない。
したがって、PCの早期診断を改善し、不必要な生検に関連する男性の数を減らすことができる方法を開発するための、重大かつ、未だ対処されていないニーズがある。本研究ではそのような方法の一つを提示する。
前立腺癌の潜在的バイオマーカーの新たなクラスは、microRNAs（miRs）である。
MicroRNAは、哺乳動物を含む多様な生物において転写後レベルで遺伝子発現を制御する、内在性の小さな非コード調節RNA（〜22nt）のクラスを含む（3）。microRNAは、RNAポリメラーゼIIによる長い不完全な対になったステムループ一次microRNA転写物（pri-microRNA）として転写され、さらに核RNaseIIIエンドヌクレアーであるDroshaによってヘアピン前駆体microRNA（pre-microRNA）に加工される（4）。Exportin-5-Ran-GTPによる細胞質へのエクスポート後、別のRNaseIIIエンドヌクレアーゼであるDicerは、pre-microRNAを成熟-22nt microRNA二本鎖に切断する（4）。成熟microRNAは、microRNA誘導サイレンシング複合体（miRISC）に組み込まれて、それらの機能を媒介する。microRNAは、この複合体を完全/ほぼ完全な相補的な標的mRNAに導き、翻訳阻害またはmRNA分解をもたらす（5）。
MicroRNAは、遺伝子制御分子の中で最も豊富なクラスの1つであり、miRBase（バージョン21）の最新リリースは2588の成熟ヒトmicroRNA（1881前駆体）を含むhttp://www.mirbase.org/ (6)。全体としてmicroRNAは、すべてのヒトmRNAの3分の2までを調節すると推定されている。その結果、microRNAは、細胞の分化、細胞周期の進行およびアポトーシスなどの細胞内の多数のプロセスに影響を及ぼし、microRNAの制限解除は、癌を含むヒトの病態に関連することが多い（7）。さらに、いくつかのmicroRNAは細胞型特異的および疾患特異的であり、無秩序なmicroRNA発現は癌の発生および進行の両方に関連している（8）。このように、異常なmicroRNA発現は、早期癌診断のための新規なバイオマーカーの有望な潜在源として研究されている（8）。さらに、microRNAは、癌のためのmicroRNAベースの治療法の標的として使用される可能性がある（9）。いくつかのmicroRNAプロファイリング研究でも、PCの発症および/または進行において異常に発現したmicroRNAが報告されている（10）。しかしながら、これまでに発表されたPCのmicroRNAバイオマーカーの研究の大半は、被験体患者数が比較的少なく、また、同定されたmicroRNA候補のバイオマーカーとしてのポテンシャルを確かめるための厳密で独立した臨床での検証が欠けている場合が多い。
重要なことに、我々の知る限りでは、尿などの非侵襲的サンプルで検出されたmicroRNAバイオマーカーに基づく診断方法は出現していない。
そこで、750を超える最も豊富なmicroRNAについてmiRnomeプロファイリングを実施し、異なる疾患段階にわたり、無細胞尿中で検出可能な183個のmicroRNAを選択した（実施例1）。これらの183個のmicroRNAから、根治的前立腺切除術（RP）による前立腺除去の前に尿を採取されたPC患者に対して、良性前立腺肥大患者において著しく異常な制御を受けるmicroRNAを同定した（実施例2）。このデータセットから、非PC験体と比較してPCにおける有意に異なる発現をする少数のmiR群を同定した。さらに、コホート1において2つのmicroRNAのみからなる診断的分類指標を同定し、その診断精度を評価した。この2microRNA分類指標は、独立したコホート2において首尾よく有効性が確認された（実施例3）。堅牢性を調べるために、コホート1および2（実施例4）とはかなり異なる方法で標本をサンプリングし処理した独立コホート（コホート3）にアッセイを適用した。興味深いことに、前記の2microRNA分類指標は、このコホートでも首尾よく有効性が確認された。さらに、ディスカバリーコホートはコントロールの数に制限があるため、コホート1とコホート2を合わせて、合わせたデータに基づいてより強い統計的検定力を有する分類指標を確立することが有益であると思われた。このアプローチは実施例5において遂行され、僅かに異なる20-miR分類指標が同定されたが、驚くべきことに、そのAUCは0.99という高い値であり、特異性は95.5％、感度は93.6％であった。
2つのmiR診断分類指標（比計算を含む）は、試験されたすべての単一miRNAと比較して、向上した正確性を示した。興味深いことに、同定されたすべての分類指標は、全前立腺特異抗原（tPSA）試験と比較して有意に改善された精度を有することを示した。この試験のAUCは、0.59という低い値（11）、またはさらに低い値（12）であることが報告されている。
同定されたmicroRNAバイオマーカーの有効性を確認するために、更に205のPCサンプルのセットを追加し、コホート1およびコホート2からの非癌サンプルを2つのコホート間で均等かつ、無作為に分布させた2つの新しいコホート（それぞれコホート4およびコホート5）で分類指標の確立および検証を繰り返した。また、より厳しいデータフィルタリングパラメータを用いて、アッセイ選択および分類指標確立のための異なる統計的方法が適用された。
この研究から、3〜10個のmicroRNAからなる診断分類指標（以前の研究と有意な重複を有する）を同定し、コホート4において、それらの診断能力を評価した（実施例8）。分類指標は、独立したバリデーションコホート5で首尾よく有効性が確認された（実施例9）。驚くべきことに、この分類指標は、意図した用途のサブポピュレーション、即ち10ng / mL未満のPSAレベルを有する患者で検証した場合に、より優れた結果をを示した（実施例10）。
上述したように、比率に基づく分類指標は、正規化アッセイの必要性を回避し、それによって試験に含まれるアッセイの数を減らす能力があるため、魅力的である。ディスカバリーコホート4において高い診断能力を示した、このような比に基づく各々3つのアッセイからなる2つの分類指標を同定した（実施例11）。2つの比に基づく分類指標は、バリデーションコホート5において首尾よく有効性が確認された（実施例12）。最終的に、これらの比に基づく分類指標は、意図した用途ポピュレーションにおいて検証したところ、より正確であることが証明された。この場合も、3-10miR分類指標および2つの比に基づく分類器指標の両方が、試験されたすべての単一miRNAと比較して、向上した正確性を示した。興味深いことに、識別されたすべての分類指標は、全前立腺特異抗原（tPSA）検査と比較して有意に向上した正確性を有することを示した。実施例4の2 miR分類指標の場合と同様に、根本的に異なるコホート3における2つの3-miR比に基づく分類指標の診断上の堅牢性も試験した。この分析は、3-miR比に基づく分類指標の少なくとも1つがコホート3においてさえも堅牢かつ、有効であることを示している。
Ferlay J, Soerjomataram I, Dikshit R, Eser S, Mathers C, Rebelo M, et al. Cancer incidence and mortality worldwide: Sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012, International journal of cancer Journal international du cancer. 2014. Catalona (1996) The Prostate vol 29, Issue Supplement 7, p 64-69) Carthew RW, Sontheimer EJ. Cell. 2009;136:642-55. Zeng Y, Cullen BR. RNA. 2003;9:112-23. Gregory RI, et al. Cell. 2005;123:631-40. Kozomara A, Griffiths-Jones S.. Nucleic Acids Res. 2014;42:D68-73. Friedman RC, Farh KK, Burge CB, Bartel DP. Genome research. 2009;19:92-105. Di Leva G, Garofalo M, Croce CM. Annual review of pathology. 2014;9:287-314. Bartels CL, Tsongalis GJ. Clin Chem. 2009;55:623-31. Tong AW, et al. Cancer Gene Ther. 2009;16:206-16. Verma et al (2014) The Canadian Journal of Urology 21(3):7312-7321)) Huang et al. (2014) Am J Clin Exp Urol. 2(4): 343-350) Bustin, S.A. (ed.) A-Z of quantitative PCR, IUL Biotechnology Series 5 (2004) 882 pages Andersen CL, Jensen JL, Orntoft TF.. Cancer Res. 2004;64:5245-50. Benjamini Y, Hochberg Y. Journal of the Royal Statistical Society. Series B (Methodological), 1995. Draminski M, Rada-Iglesias, Enroth S, Wadelius C, Koronacki, et al (2008) Bioinformatics (2008) 24 (1): 110-117. Dyrskjot et al.. Nature genetics. 2003;33:90-6. Youden WJ. Index for rating diagnostic tests. Cancer 1950;3:32-5. Goessl (2001) Urology. 2001 Sep;58(3):335-8. Livak and Schmittgen (2001) METHODS 25, 402-408. Tom Mitchell, Machine Learning, McGraw Hill, 1997.
前立腺特異抗原（PSA）法はかなりの偽陰性率を伴い、臨床的に無痛または侵略的な腫瘍を十分に区別しないので、単独でまたは既存のマーカーと組み合わせて使用できる新規の前立腺癌マーカーが必要とされている。本発明は、1組のマーカーと、それらをPC診断のための予備選択患者に適用する方法を提示する。
したがって、第1の態様において、本発明は、対象が前立腺癌に罹患するリスクを評価するためのin vitro方法であって、前記験体からの尿サンプルにおいてhsa-let-7a-5p, hsa-let-7b-5p, hsa-let-7c-5p, hsa-let-7e-5p, hsa-let-7f- 5p, hsa-let-7g-5p, hsa-miR-100-5p, hsa-miR-106a-5p, hsa-miR-10a-5p, hsa-miR-10b-5p, hsa-miR- 1238-3p, hsa-miR-125b-5p, hsa-miR-1260a, hsa-miR-130a-3p, hsa-miR-132-3p, hsa-miR-135a-5p, hsa-miR-135b-5p, hsa-miR-136-5p, hsa-miR-140-3p, hsa-miR-141 -3p, hsa-miR-142-3p, hsa-miR- 146a-5p, hsa-miR-148a-3p, hsa-miR-151 a-3p, hsa-miR-151 a-5p, hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-191 -5p, hsa-miR-1972, hsa-miR-19a-3p, hsa-miR-19b-3p, hsa-miR-200a-3p, hsa-miR-200b- 3p, hsa-miR-200b-5p, hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-203a, hsa-miR-204-5p, hsa-miR-205-5p, hsa-miR- 20a-5p, hsa-miR-210, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-223-3p, hsa-miR-22-5p, hsa-miR-23a-3p, hsa-miR-23b-3p, hsa-miR-24-3p, hsa-miR-25-3p, hsa-miR-26a-5p, hsa-miR-27b-3p, hsa-miR-29a-3p, hsa-miR- 29b-3p, hsa-miR-29c-3p, hsa-miR-30a-3p, hsa-miR-30a-5p, hsa-miR-30b-5p, hsa-miR-30c-5p, hsa- miR-30e-5p, hsa-miR-31 -3p, hsa-miR-31 -5p, hsa-miR-320a, hsa-miR-320b, hsa-miR-320c, hsa-miR- 331 -3p, hsa-miR-362-3p, hsa-miR-362-5p, hsa-miR-363-3p, hsa-miR-375, hsa-miR-378a-3p, hsa- miR-425-3p, hsa-miR-425-5p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-490-3p, hsa-miR-660-5p, hsa-miR-93-5p, hsa-miR-99a-5p,およびhsa-miR-99b-5p,からなるmiRの群から選択される少なくとも2つのmiRの発現レベルを測定することを含み、ここで、健康なドナーと比較して前記の少なくとも2つのmiRの変化した発現レベルは、前記被験体が前立腺癌に罹患している確率が高いことを示す、方法に関する。
本発明の最も好ましい実施形態は、少なくとも2つの選択された25個のmiRがhsa-miR-24-3p、hsa-miR-222-3p、およびhsa-miR-30c-5pであるインビトロ法である。ほぼ等しく好ましい実施形態は、少なくとも2つの選択されたmiRがhsa-miR-24-3p、hsa-miR-222-3pおよびhsa-miR-30a-5pであるインビトロ法である。
本発明の重要な態様は、以前の30の標準前立腺特異抗原（PSA）測定が、その血清PSAレベルが10ng / mL未満であることを示した患者集団にこの方法を適用することである。
診断スコア（S）を計算することを含む生体外診断方法は、本発明の有用な態様である。
さらに、本発明の態様は、験体が前立腺癌に罹患しているリスクをin vitroで評価するためのキットであって、前記験体からの尿サンプルにおいてhsa-let-7a-5p, hsa-let-7b-5p, hsa- let-7c-5p, hsa-let-7e-5p, hsa-let-7f-5p, hsa-let-7g-5p, hsa-miR-100-5p, hsa-miR-106a-5p, hsa-miR- 40 10a-5p, hsa-miR-10b-5p, hsa-miR-1238-3p, hsa-miR-125b-5p, hsa-miR-1260a, hsa-miR-130a-3p, hsa-miR-132-3p, hsa-miR-135a-5p, hsa-miR-135b-5p, hsa-miR-136-5p, hsa-miR-140-3p, hsa-miR- 141 -3p, hsa-miR-142-3p, hsa-miR-146a-5p, hsa-miR-148a-3p, hsa-miR-151 a-3p, hsa-miR-151 a-5p, hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-191 -5p, hsa-miR-1972, hsa-miR-19a-3p, hsa-miR-19b-3p, hsa-miR-200a-3p, hsa-miR-200b-3p, hsa-miR-200b-5p, hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-203a, hsa-miR- 5 204-5p, hsa-miR-205-5p, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-210, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-223-3p, hsa-miR- 22-5p, hsa-miR-23a-3p, hsa-miR-23b-3p, hsa-miR-24-3p, hsa-miR-25-3p, hsa-miR-26a-5p, hsa-miR- 27b-3p, hsa-miR-29a-3p, hsa-miR-29b-3p, hsa-miR-29c-3p, hsa-miR-30a-3p, hsa-miR-30a-5p, hsa-miR-30b-5p, hsa-miR-30c-5p, hsa-miR-30e-5p, hsa-miR-31 -3p, hsa-miR-31 -5p, hsa-miR-320a, hsa- miR-320b, hsa-miR-320c, hsa-miR-331 -3p, hsa-miR-362-3p, hsa-miR-362-5p, hsa-miR-363-3p, hsa- 10 miR-375, hsa-miR-378a-3p, hsa-miR-425-3p, hsa-miR-425-5p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-490-3p, hsa-miR-660-5p, hsa-miR-93-5p, hsa-miR-99a-5p,およびhsa-miR-99b-5pからなるmiRの群から選択される少なくとも2つのmiRの発現レベルを測定することを含み、ここで、健康なドナーと比較して前記の少なくとも2つのmiRの変化した発現レベルは、前記被験体が前立腺癌に罹患している確率が高いことを示す、キットに関する。
定義
表現「microRNA」、「miRNA」および「miR」は、内在性遺伝子由来の約18〜25ヌクレオチド（nt）長の非コードRNAを指すために同義語として使用される。microRNAは、pre-miRと呼ばれるより長い（約75nt）ヘアピン様前駆体からプロセシングされる。microRNAは、miRNPと呼ばれる複合体で集合し、アンチセンス相補性によってその標的を認識する。microRNAがその標的と100％一致する場合、すなわち相補性が完全である場合、標的mRNAは切断され、miRはsiRNAのように作用する。一致が不完全である場合、すなわち相補性が部分的である場合、標的mRNAの翻訳はブロックされる。一般に、mirRの命名は、miRBaseの命名法（バージョン21）に従う（表1参照）。
本明細書で使用する「発現」という用語は、細胞内または無細胞生物流体中のRNA分子の転写および/または蓄積を指す。
用語「Q-PCR」または「q-PCR」は、定量的ポリメラーゼ連鎖反応を指す。Q-PCRは、試験サンプル中の特定のDNA（およびRNA）種の量を定量するための高感度の方法である。PCR技術によるRNAの定量化は、RNAが逆転写されることを必要とするので、定量PCRが特定のRNAを定量するために使用されることを示すために、「qRT-PCR」または「RT-Q-PCR」と呼ばれることが多い。Q-PCRおよびqRT-PCR技術の完全な論文は、（13）に見出すことができる。明細書において、「Q-PCR」、「q-PCR」、「qRT-PCR」、「QRT-PCR」または「RT-Q-PCR」は、特異的RNA種（またはDNA）の量を定量する方法として同義的に使用することが出来る。
本明細書において、用語「miRの発現レベル」、「miR発現レベル」および「miRのレベル」は、サンプル中で検出される「特定のmiRの量」の尺度として、同義的に使用される。「特定のmiRの量」は、絶対的、相対的または正規化された尺度のいずれかで表すことができ、定量的および定性的方法の両方によって得られた値を指す。「特異的miRの量」の特に好ましい尺度の一つは、以下と実施例に記載されるリアルタイムRT-Q-PCR（qRT-PCR）によって得られる交差点（Cp）値であり、「量」はデジタルPCR、または様々な次世代配列決定法によって定量化することができる。特定の状況において、例えば、 miR発現レベルの比を用いて診断スコアを計算する場合、miRの絶対的に決定された発現レベルで十分である。しかしながら、miRの絶対発現レベルに基づいて決定を行う代わりに、miRの正規化された発現レベルに基づいて決定することができる。
発現レベルは、その発現を、構成的またはほぼ構成的に発現される遺伝子の発現と比較することによって、miRの絶対発現レベルを補正することによって正規化される。正規化にしばしば使用される適切な遺伝子には、アクチン遺伝子などのハウスキーピング遺伝子が含まれる。本研究では、正規化にmiRコレクションを使用する。典型的に、3または5のmiRNAのコレクションは平均正規化値を計算することことに使用することができる。好ましい3 miR-ノーマライザーは、hsa-miR-200b-3p、hsa-miR-27b-3p、およびhsa-miR-30b-5pである（実施例8参照）。好ましい5 miR-ノーマライザーは、hsa- miR-20a-5p、hsa-miR-30b-5p、hsa-let-7a-5p、hsa-miR-27b-3p、およびhsa-miR-23b-3pである（実施例5参照）。
「ROC曲線」はレシーバーの動作特性曲線の略である。（ROC）曲線は、診断検査を比較するために広く使用されている。
「健康な個体」、「健康なドナー」および「健康な対照」という表現は、前立腺癌患者と区別するのに対して、前立腺癌の明白な徴候が無い明らかに健康な個体を指すために同義語として使用される。
試料
サンプルは、デンマークのオーフス大学病院泌尿器科（1997〜2005年）または英国シェフィールドの医学部腫瘍学科で集められた。
miR分類指標に関連する用語「堅牢性」は、本明細書では、多少異なるサンプリングおよび定量法が使用されているにもかかわらず、PC患者と非PC患者とを区別することに関して相対的に類似の結果を提供する分類指標を表すのに使用される。
「UniRT」は、Exiqon A/Sによって市販されているQ-PCR方法である。方法およびその性能は、実施例1および7、デンマーク特許出願PA2009 00156、EP2391736、および Mestdagh et al. Nat Methods. 2014 Aug;1 1 (8):809-15に記載されている。
本明細書において「カットオフ値」は、miRsの発現量の存在レベルの計算値がその値を上回った（または下回った）場合に、テストサンプルが結腸癌由来であることを示す閾値である。
本発明の実施形態を以下に説明するが、これらはあくまでも例示目的に過ぎない。
本発明の根底にある技術的問題は、対象が前立腺癌に罹患するリスクを評価するための改善されたin vitro方法の提供である。特に、非侵襲的手順をリレーし、結果としてスクリーニング目的のために有用な方法が、広範なPSA検査を補うことができるとの期待の下、斯かる方法を探索した。
バリデーションコホート（実施例3）のディスカバリーコホート（実施例2参照）および実施例5および8に提示されている代替分析の両方において、患者からの尿サンプル中のmiR群の発現レベルは前立腺癌（PC）の診断分類指標として使用可能であることを、出願人は一貫して確認した。miR群は合計76個のmiRからなる（表1参照）。
驚くべきことに、この76群のmiRから引き出されたわずか20,1,0,9,8,7,6,5,4,3または2つのmiRは、標準的なPSAテストで提供されているものをはるかに超える診断精度でPCを有する患者とBPHを有する患者との間を区別するために用いることが出来ることを発見した（実施例5、2、3、4、6、8、9、10、11、12および13参照）。
一般に、ROC曲線のAUC（Under Under Curve）は、診断テストの診断「力」を示す。
T.G.テープは診断のスコアを提供する。それは、
AUC: 0,90-1 = 優
AUC: 0,80-0,90 = 良
AUC: 0,70-0,80 = 並
AUC: 0,60-0,70 = 可
AUC: 0,50-0,60 = 不可
（参考文献：Tape、Thomas G.： "診断検査の解釈"、http://gim.unmc.edu/dxtests/Default.htm）このスコアによれば、本発明の診断分類指標（またはパネル）は良〜優である。
したがって、本発明の1つの態様は、対象が前立腺癌に罹患するリスクを評価するためのin vitro方法であって、前記験体からの尿サンプルにおいてhsa-let-7a-5p, hsa-let-7b-5p, hsa-let-7c-5p, hsa-let-7e- 5p, hsa-let-7f-5p, hsa-let-7g-5p, hsa-miR-100-5p, hsa-miR-106a-5p, hsa-miR-1 0a-5p, hsa-miR-10b-5p, hsa-miR-1238-3p, hsa-miR-125b-5p, hsa-miR-1260a, hsa-miR-130a-3p, hsa-miR-132-3p, hsa-miR-135a-5p, hsa-miR-135b-5p, hsa-miR-136-5p, hsa-miR-140-3p, hsa-miR-141-3p, hsa-miR-142-3p, hsa-miR-146a-5p, hsa-miR-148a-3p, hsa-miR-151 a-3p, hsa-miR-151 a-5p, hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-191-5p, hsa-miR-1972, hsa-miR-19a-3p, hsa-miR-19b-3p, hsa-miR-200a-3p, hsa-miR-200b-3p, hsa-miR-200b-5p, hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-203a, hsa-miR-204-5p, hsa- miR-205-5p, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-210, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-223-3p, hsa-miR-22-5p, hsa-miR-23a-3p, hsa-miR-23b-3p, hsa-miR-24-3p, hsa-miR-25-3p, hsa-miR-26a-5p, hsa-miR-27b-3p, hsa-miR-29a-3p, hsa-miR-29b-3p, hsa-miR-29c-3p, hsa-miR-30a-3p, hsa-miR-30a-5p, hsa-miR-30b-5p, hsa-miR-30c-5p, hsa-miR-30e-5p, hsa-miR-31-3p, hsa-miR-31-5p, hsa-miR-320a, hsa-miR-320b, hsa-miR-320c, hsa-miR-331-3p, hsa-miR-362-3p, hsa-miR-362-5p, hsa-miR-363-3p, hsa-miR-375, hsa-miR-378a-3p, hsa-miR-425-3p, hsa-miR-425-5p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-490-3p, hsa-miR-660-5p, hsa-miR-93-5p, hsa-miR-99a-5p,およびhsa-miR-99b-5p,からなるmiRの群から選択される少なくとも2つのmiRの発現レベルを測定することを含み、ここで、健康なドナーと比較して前記の少なくとも2つのmiRの変化した発現レベルは、前記被験体が前立腺癌に罹患している確率が高いことを示す、方法である。
バリデーション研究で最も重要な20のmiRNAは特に魅力的である（表20）。したがって、本発明の一実施形態は、対象が前立腺癌に罹患するリスクを評価するためのin vitro方法であって、前記験体からの尿サンプルにおいてhsa-miR-141-3p, hsa-miR-142-3p, hsa-miR-146a-5p, hsa-miR-151a-3p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-191-5p, hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-203a, hsa-miR-204-5p, hsa-miR-205-5p, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-223-3p, hsa-miR-24-3p, hsa-miR-30a-5p, hsa-miR-30c-5p, hsa-miR-31-3p, hsa-miR-31 -5p, hsa-miR-320a, hsa-miR-93-5pおよびhsa-miR-99a-5pからなるmiRの群から選択される少なくとも2つのmiRの発現レベルを測定することを含み、ここで、健康なドナーと比較して前記の少なくとも2つのmiRの変化した発現レベルは、前記被験体が前立腺癌に罹患している確率が高いことを示す、方法である。
76または20のmiRを測定することは、日常診療を目的とした診断検査では非実用的と思われ得る。実施例3の表3では、癌および非PCコントロール間の識別のための最も強力な診断可能性を有するmiRNAが示されている。したがって、本発明のさらなる一実施形態は、PCと非PCとの間の識別のためのin vitro方法であって、hsa-miR-141-3p, hsa-miR-146a-5p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-205-5p, hsa-miR-222- 3p, hsa-miR-24-3p, hsa-miR-30a-5p, hsa-miR-30c-5pおよびhsa-miR-31 -5pからなるmiRの群から選択される少なくとも2つのmiRの発現レベルを測定することを含む、方法である。
同様に、本発明の実施形態としては、6つの最良ランクのmiR、すなわちhsa-miR-146a-5p, hsa-miR- 16-5p, hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-205-5p, hsa-miR-30c-5pおよびhsa-miR-31-5pからなる群から、少なくとも2つのmiRが選択される方法が考慮される。
例えば、コホート１において最も高いAUCを有する4つのmiRSである、hsa-miR-146-5p、hsa-miR-31-5p, hsa-miR-24-3pおよびhsa-miR-30c-5pからなる4miRグループ、hsa-miR-30c-5p, hsa-miR-222-3p、およびhsa-miR-24-3pからなる3miRグループ、およびhsa-miR-30a-5p, hsa-miR-222-3p,およびsa-miR-24-3pからなる3miRグループなどの他のmiRグループも、表3から導き出すことができる。
さらなる分析により、miRグループから導き出された5および4つのmiRもまた、スタンダード全前立腺特異抗原（PSA）試験と同等またはそれ以上の診断力（ROC曲線のAUC）を有する分類指標をもたらすことを示した。
したがって、本明細書では、被験体が前立腺癌に罹患しているリスクを評価するためのin vitroでの方法であって、前記験体からの尿サンプルにおいて、hsa-let-7a-5p, hsa-let-7b-5p, hsa-let-7c-5p, hsa-let-7e-5p, hsa-let-7f-5p, hsa-let-7g-5p, hsa-miR-100-5p, hsa-miR-106a-5p, hsa- miR-10a-5p, hsa-miR-10b-5p, hsa-miR-1238-3p, hsa-miR-125b-5p, hsa-miR-1260a, hsa-miR-130a- 3p, hsa-miR-132-3p, hsa-miR-135a-5p, hsa-miR-135b-5p, hsa-miR-136-5p, hsa-miR-140-3p, hsa- miR-141 -3p, hsa-miR-142-3p, hsa-miR-146a-5p, hsa-miR-148a-3p, hsa-miR-151 a-3p, hsa-miR-151 a- 5p, hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-191-5p, hsa-miR-1972, hsa-miR-19a-3p, hsa-miR-19b-3p, hsa-miR-200a-3p, hsa-miR-200b-3p, hsa-miR-200b-5p, hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-203a, hsa- miR-204-5p, hsa-miR-205-5p, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-210, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-223-3p, hsa-miR-22-5p, hsa-miR-23a-3p, hsa-miR-23b-3p, hsa-miR-24-3p, hsa-miR-25-3p, hsa-miR-26a-5p, hsa-miR-27b-3p, hsa-miR-29a-3p, hsa-miR-29b-3p, hsa-miR-29c-3p, hsa-miR-30a-3p, hsa-miR-30a-5p, hsa-miR-30b-5p, hsa-miR-30c-5p, hsa-miR-30e-5p, hsa-miR-31-3p, hsa-miR-31 -5p, hsa-miR-320a, hsa-miR-320b, hsa-miR-320c, hsa-miR-331-3p, hsa-miR-362-3p, hsa-miR-362-5p, hsa-miR-363-3p, hsa-miR-375, hsa-miR-378a-3p, hsa-miR-425-3p, hsa-miR-425-5p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-490-3p, hsa-miR-660-5p, hsa-miR-93-5p, hsa-miR-99a-5p, およびhsa-miR-99b-5p, からなるmiRの群から選択される少なくとも2,3,4,5,6,7または10以上または20以上のmiRの発現レベルの測定を含む方法を提供する。
本発明のさらなる態様において、前記少なくとも2,3,4,5またはそれ以上、10またはそれ以上または20のmiRは、hsa-miR-10b-5p, hsa-miR-135b-5p, hsa-miR-140-3p, hsa- miR-141 -3p, hsa-miR-142-3p, hsa-miR-146a-5p, hsa-miR-151 a-3p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-191 -5p, hsa-miR-19a-3p, hsa-miR-200b-3p, hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-203a, hsa-miR-204-5p, hsa-miR-205- 5p, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-223-3p, hsa-miR-23a-3p, hsa-miR-23b-3p, hsa-miR- 24-3p, hsa-miR-27b-3p, hsa-miR-30a-3p, hsa-miR-30a-5p, hsa-miR-30b-5p, hsa-miR-30c-5p, hsa- miR-30e-5p, hsa-miR-31 -3p, hsa-miR-31 -5p , hsa-miR-320a., hsa-miR-362-5p, hsa-miR-378a-3p, hsa-miR-93-5pおよびhsa-miR-99a-5pからなるmiRの群から選択され、またはhsa-miR-141-3p, hsa-miR-142-3p, hsa-miR-146a-5p, hsa- miR-151 a-3p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-191-5p, hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-203a, hsa-miR-204-5p, hsa-miR-205-5p, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-223-3p, hsa-miR-24-3p, hsa-miR-30a-5p, hsa-miR-30c- 5p, hsa-miR-31 -3p, hsa-miR-31-5p, hsa-miR-320a, hsa-miR-93-5pおよびhsa-miR-99a-5pからなるmiRの群から選択される。
本発明者等も驚いた知見によれば、最良の分類指標の二つが、僅か3種類の選択されたmiR、即ち、1）hsa-miR-30c-5p, hsa-miR-222-3p, およびhsa-miR-24-3p、2）hsa-miR-30a-5p, hsa-miR-222-3p, およびhsa-miR-24-3pのを含んでいた（実施例11,12および13を参照）。よってこれらの２つの特徴が、本発明の好ましい実施形態となる。
僅か２種類の選択されたmiR、即ちhsa-miR-30c-5pおよびhsa-miR-31-5pを含む分類指標も、有利であると思われる（実施例2,3および4参照）。この分類指標は、非常に高い特異性と感度でPCとコントロールを区別する能力を有することに加えて、非常に頑健であり、具体的なサンプリングの方法やmiRレベルの検出の方法に依存しないように見える。
本明細書において、用語「miRの発現レベル」、「miR発現レベル」および「miRのレベル」は、サンプル中で検出される「特定のmiRの量」の尺度として、相互に同義に使用される。「特定のmiRの量」は、絶対的、相対的または正規化された尺度のいずれかで表すことができ、定量的および定性的方法の両方によって得られた値を指す。しかしながら、miRの絶対発現レベルに基づいて決定を行う代わりに、miRの正規化された発現レベルに基づいて決定することもできる。発現レベルは、その発現を、恒常的またはほぼ恒常的に発現される遺伝子の発現と比較することによって、miRの絶対発現レベルを補正することによって正規化される。正規化にしばしば使用される適切な遺伝子には、アクチン遺伝子などのハウスキーピング遺伝子が含まれる。
したがって、本発明の一実施形態において、発現レベルは正規化された発現レベルである。本研究では、正規化のためにmiRのコレクションを使用する。好ましくは、Normfinderからのトップ3またはトップ5の最も安定なmiRNAを用いて、各サンプルの平均正規化値を算出する。したがって、正規化は、3つのmiR、すなわちhsa-miR-200b-3p, hsa-miR-27b-3p, およびhsa-miR-30b-5p、または５つのmiR、すなわちhsa-miR-20a-5p, hsa-miR-30b-5p, hsa-let-7a-5p, hsa-miR-27b-3p, hsa-miR-23b-3pの平均正規化値を計算することによって行われる。3つのmiR-ノルマライザーが好ましい。
標準的な全前立腺特異抗原（tPSA）検査がスクリーニング目的のために非常に普及している理由の1つは、それが最小限の侵襲的手順（血液検査）に基づいていることである。tPSAは血液検査のみを必要とするが、検査者が血液サンプルを採取できる病院、診療所、または医療従事者へ訪問する必要がある。これと比較して、尿検査は有利と思われる。しかしながら、尿にはわずかな量のmiRしか含まれていない。本発明において、この課題は、1）尿試料から調製されたエキソソーム調製物中の前記miRの発現レベルを測定すること、2）Q-PCRのExiqons感受性法 - UniRT法によるmiRの発現レベルの測定によって克服された（実施例1および7を参照）。したがって、UniRT法はQ-PCRの好ましい方法である。
標準的な尿試料がスクリーニングの視点から好ましいが、前立腺マッサージ後に得られた尿試料が有利であり得る例が提供される（（19）参照）。実施例4は、前立腺マッサージ後に得られた尿試料で実施される。実施例4において、2-miR分類指標（miR-30c、miR-31-5p）は、標準全前立腺特異抗原（tPSA）検査の診断能力をはるかに超える診断力を有することが示されている。2-miR分類指標は、コホート1で設定されたカットオフ値を用い、0.79のROC曲線下面積（CI：0.69 ~ 0.90、p <<0.0001）および72.9％感度、および84.8%の特異性、で驚くほど良好に機能した。
したがって、本発明の一実施形態において、尿試料は、尿を採取する直前に前立腺マッサージを受けた対象からのものである。
診断アッセイを実際に適用する場合、診断値を用いて、診断スコア（S）を計算し、診断スコアに基づいて、カットオフ値を定義し、癌サンプルと非癌サンプルとを区別することが有利である。したがって、本発明の１実施形態は、験体が前立腺癌に罹患しているリスクの評価が前記サンプルにおいて少なくとも２つの前記miRのレベルを検出すること、および少なくとも２つの前記miRの発現レベルのデータを構成する診断スコアを計算することを含む方法である。
miRのレベルは、定量的リアルタイム逆転写酵素媒介性ポリメラーゼ連鎖反応法、RT-QPCR（13）によって簡便に定量することができる。
「特異的miRの量」の1つの特に好ましい尺度は、リアルタイムqRT-PCRによって得られる交差点（Cp）値である。「特定のmiRの量」の別の好ましい尺度は、実施例に記載されるようにリアルタイムqRT-PCRによって同様に得られる「閾値サイクル値（Ct）」値である。「特定のmiRの量」のCpおよびCt尺度は、ほぼ同様の尺度を提供する（（13）を参照）。CpまたはCtを選択するかどうかは主にマシンの選択の問題であり、アッセイは結び付けて実行した。Roche LCソフトウェアを使用するLightCycler（登録商標）480 Real-Time PCR Systemで増幅を実行すると、特定のmiRの量はCpで表されます。増幅が、付属のソフトウェアを用いてApplied Biosystems ABI Prism 7900HT 384ウェル機器で実施される場合、特異的miRの量はCtで表される。以下はCp値を参照するが、Ct値および「定量サイクル」（Cq）値にも適用される。
Cp値は例えば特定のmiRの発現に関連し、その関係は式:
によって表される。式中、Cp（miRx）は、miRxと呼ばれる特定のmiRを特異的に検出するリアルタイムQPCR装置からのCp-読み出しを示す。
実施例2は、そのようなアッセイを詳細に記載する。
従って、Cp値をmiRレベルの定量指数として使用する場合、例えば、
上記式は
と等値となり、同様に
上記式は
と等値となる。
したがって、4-miR分類指標（hsa-miR-31-5p、hsa-miR-146a-5p、hsa-miR-30c-5pおよびhsa-miR-24- 3p）のための有用な推定の診断スコア（S)は線形回帰モデルである。例えば:
（式中、係数X、Y、ZおよびWは、特定の設定に従って回帰分析によって決定される）
である。
同様に、2-miR分類指標に対する推定子-診断スコア（S）は
（式中、係数XおよびYは、回帰分析によって決定される）
である。線形および他のタイプの両方の回帰が考えられる。
したがって、本発明の一実施形態では、診断診断スコア（S）は以下のように計算される:
（式中、「C」は閾値サイクル値（Ct）または交差点値（Cp）であり、XおよびYは、線形または別のタイプの回帰によって決定される係数である）
「機械学習」は、経験を通して自動的に改善するコンピュータアルゴリズムを利用するプロセスを指し、このアルゴリズムを改善するこのプロセスは、しばしば「トレーニング」と呼ばれる。機械学習は、大きなデータセットにおける一般的な規則を発見するために使用することができ、前立腺の癌試料および非癌試料におけるmiR発現を含むデータセットから臨床情報データを抽出するために用いることができる。機械学習の概念の一般的な論文は、（21）に見出すことができ、これらは援用により本明細書に組み込まれる。したがって、本発明の一実施形態では、診断スコア（S）を計算するアルゴリズムは、機械学習を適用することにより達成される。
驚くべきことに、実施例に示されるように、
または
のような比に基づく単純な推定法でさえ、標準全前立腺特異抗原（tPSA）試験の診断力をはるかに超えており、さらにアッセイをさらに単純化することで正規化を不要にするアドバンテージを持つ。
したがって、本発明の好ましい実施形態は、診断スコアSがmiRの発現レベルの比として計算されることを含む方法である。例えばhsa-miR-24-3pおよびhsa-miR-222-3pの発現レベル対hsa-miR-30a-5pの発現レベルの比率、hsa-miR-24-3pおよびhsa-miR-222-3pの発現レベル対hsa-miR-30c-5pの発現レベルの比率、またはhsa-miR-30c-5pの発現レベル対hsa-miR-31-5pの比率等である。
hsa-miR-31-5pとhsa-miR-30c-5pの比で議論したように、ディスカバリーコホートでは89.9％のAUCで驚くほど良好に機能する（実施例5）。実施例11,12および13に示すように、hsa-miR-24-3p, hsa-miR-222-3pを超えるhsa-miR-30a-5p、およびhsa-miR-24-3p, hsa-miR-222-3pを超えるhsa-miR-30c-5pの2種の3つのmiR比に基づく分類指標は妥当性確認において0.9に近いかそれ以上のAUCを示し、さらに良好に機能した。
したがって、本発明のさらなる実施形態では、診断スコア（S）は、
（式中、「C」はhsa-miR-24-3p, hsa-miR-222-3pおよびhsa-miR-30a-5pのそれぞれに対する定量的リアルタイムPCR（qRT-PCR）によって得られた閾値サイクル値（Ct）または交差点値(Cp)である）
として計算される。または：
（式中、「C」はhsa-miR-24-3p, hsa-miR-222-3pおよびhsa-miR-30c-5pのそれぞれに対する定量的リアルタイムPCR（qRT-PCR）によって得られた閾値サイクル値（Ct）または交差点値(Cp)である）
である。
それにもかかわらず、実施例5では、多数の他の驚くほど良好に実施される2のmiR比が言及されている。実施例5の表7を参照。これらの比に基づくバイオマーカーも、本発明の実施形態として考えられる。
本発明の特に興味深い実施形態は、事前の標準的な前立腺特異抗原（PSA）測定の結果、その血清PSAレベルが10ng / mL未満であることによって特徴付けられた患者グループに関連する。
このグループは、そのPSAテストの結果によれば、さらに侵襲的なテストに関しては「グレイゾーン」に分類されてしまうため、おそらく最も興味深いものである。従って、これらの患者は、PSA試験を補うことができる試験から大きな利益を得ると思われる。
驚くべきことに、2つの3-mir分類指標は、10ng / mL未満のPSAレベルを有する患者のサブポピュレーションで検証した場合、さらに良好であった（実施例10）。
特に、hsa-miR-30c-5p, hsa-miR-222-3pおよびhsa-miR-24-3pの分類指標は、バリデーションコホートで実施された場合、AUC = 0.91で注目に値する（実施例13参照）。
したがって、hsa-miR-30c-5p, hsa-miR-222-3pおよびhsa-miR-24-3p分類指標は
（式中、「C」は、miRに特異的な定量的リアルタイムPCR（qRT-PCR）によって得られた閾値サイクル値（Ct）または交差点値（Cp）である）
の診断スコア(S)を有し、本発明の好ましい実施形態である。
さらに、hsa-miR-30c-5p、hsa-miR-222-3p、およびhsa-miR-24-3p分類指標は、卓越した堅牢性を示す。3-miR分類指標の堅牢性を調べるために、検体をコホート5および6とはかなり異なる方法でサンプリングおよび処理した独立コホート（コホート3）にアッセイを適用した（実施例14）。興味深いことに、hsa-miR-30c-5p, hsa-miR-222-3pおよびhsa-miR-24-3p分類指標もまたこのコフォートで首尾よく有効性が確認された（実施例14）。
一態様では、本発明は、前立腺癌治療を必要とする患者を治療する方法であって、患者が前立腺癌に罹患する確率が増加しているかどうかを判定し、この情報に基づいて患者に適切な治療法を選択するために、請求項のいずれか一項に記載の診断検査を行うことを含む方法に関する。
本発明のさらなる態様は、対象が前立腺癌に罹患しているリスクをin vitroで評価するための複数部品のキットであって、前記験体からの尿サンプルにおいてhsa-let-7a-5p, hsa-let-7b-5p, hsa-let-7c-5p, hsa-let-7e-5p, hsa-let-7f-5p, hsa-let-7g-5p, hsa-miR-100-5p, hsa-miR-106a-5p, hsa-miR-10a-5p, hsa-miR-10b-5p, hsa-miR-1238-3p, hsa-miR-125b-5p, hsa-miR-1260a, hsa-miR-130a-3p, hsa-miR-132-3p, hsa-miR-135a-5p, hsa-miR-135b-5p, hsa-miR-136-5p, hsa-miR-140-3p, hsa-miR-141-3p, hsa-miR-142-3p, hsa-miR-146a-5p, hsa-miR-148a-3p, hsa-miR-151a-3p, hsa-miR-151a-5p, hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-191-5p, hsa-miR-1972, hsa-miR-19a-3p, hsa-miR-19b-3p, hsa-miR-200a-3p, hsa-miR-200b-3p, hsa-miR-200b-5p, hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-203a, hsa-miR-204-5p, hsa-miR-205-5p, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-210, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-223-3p, hsa-miR-22-5p, hsa-miR-23a-3p, hsa-miR-23b-3p, hsa-miR-24-3p, hsa-miR-25-3p, hsa-miR-26a-5p, hsa-miR-27b-3p, hsa-miR-29a-3p, hsa-miR-29b-3p, hsa-miR-29c-3p, hsa-miR-30a-3p, hsa-miR-30a-5p, hsa-miR-30b-5p, hsa-miR-30c-5p, hsa-miR-30e-5p, hsa-miR-31-3p, hsa-miR-31-5p, hsa-miR-320a, hsa-miR-320b, hsa-miR-320c, hsa-miR-331-3p, hsa-miR-362-3p, hsa-miR-362-5p, hsa-miR-363-3p, hsa-miR-375, hsa-miR-378a-3p, hsa-miR-425-3p, hsa-miR-425-5p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-490-3p, hsa-miR-660-5p, hsa-miR-93-5p, hsa-miR-99a-5pおよびhsa-miR-99b-5pから成るmiR群から選択される少なくとも2つのmiRの発現レベルを測定するために必要な試薬のアリコートを含むと共に、健康なドナーと比較して少なくとも2つの前記miRの変化した発現レベルは、前記被験体が前立腺癌に罹患している確率が高いことを示す、キットである。
本発明のさらなる実施形態は、少なくとも2つのmiRがhsa-miR-141-3p, hsa-miR-142-3p, hsa-miR-146a-5p, hsa-miR-151a-3p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-191-5p, hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-203a, hsa-miR-204-5p, hsa-miR-205-5p, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-223-3p, hsa-miR-24-3p, hsa-miR-30a-5p, hsa-miR-30c-5p, hsa-miR-31-3p, hsa-miR-31-5p, hsa-miR-320a., hsa-miR-93-5pおよびhsa-miR-99a-5pmiRから成るmiR群から選択され、または、少なくとも2つのmiRが、hsa-miR-141-3p, hsa-miR-146a-5p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-205-5p, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-24-3p, hsa-miR-30a-5p, hsa-miR-30c-5pおよびhsa-miR-31-5pからなるmiR群から選択され、または、少なくとも2つのmiRがhsa-miR-141-3p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-24-3p, hsa-miR-31-3p, hsa-miR-31-5pおよびhsa-miR-331-3pからなるmiR群から選択され、または、少なくとも2つのmiRがhsa-miR-146a-5p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-205-5p, hsa-miR-30c-5pおよびhsa-miR-31-5pからなるmiR群から選択されるキットである。
特に少なくとも2つの選択されたmiRがhsa-miR-30c-5p, hsa-miR-222-3pおよびhsa-miR-24-3pであることが好ましい。
おそらくRNaseに起因して、標準尿サンプルのような生体流体中の豊富な遊離（すなわち、細胞またはパーティクルにない）マイクロRNAは非常に乏しい。しかしながら、マイクロRNAは、種々のタンパク質複合体およびエキソソームまたはマイクロベシクルのような膜状の粒子への包含によって、安定化され、RNase分解から保護されることが示されている。
したがって、本発明の好ましい実施形態において、miRは、尿試料のエキソソーム調製物から抽出される。
したがって、本発明による好ましいキットは、尿サンプルのエキソソーム調製物を得るために必要な試薬を含む。
本発明を以下の非限定的な実施例および図面にさらに例示する。
miR-31-5p対miR-30cの比からなる2miR分類指標のROC曲線。図1Aは、コホート（ディスカバリーコホート）のROC曲線であり、図1Bは、コホート2（バリデーションコホート、実施例3）のROC曲線であり、図1Cは、コホート3（バリデーションコホート、実施例4）のROC曲線である。 実施例5、表5に提示された20のmiRNAのROC曲線は、感度および特異性が曲線の下に示されている。 膀胱癌対コントロール（miR31-5pーmiR30c-5p）に適用されたPC診断のための2mlR分類指標。 UniRTメソッド。 ディスカバリーおよびバリデーションコホート（コホート4および5）における3miRパネル分類指標のROC曲線。 ディスカバリーおよびバリデーションコホート（コホート4および5）における７miRパネル分類指標 (hsa-miR-141-3p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-24-3p, hsa-miR-31-3p, hsa-miR-31-5pおよびhsa-miR-331-3p) のROC曲線。 ディスカバリーコホート、コホート4における3miR_1比に基づく分類指標(hsa-miR-24-3p, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-30a-5p)のROC曲線。 ディスカバリーコホート、コホート4における3miR_2比に基づく分類指標(hsa-miR-24-3p, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-30a-5p)のROC曲線。 バリデーションコホート（コホート5）におけるバイオマーカーシグネチャー比に基づく3miR_1 (hsa-miR-24-3p, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-30a-5p)のROC曲線。 バリデーションコホート（コホート5）における分類指標比に基づく3miR_2(hsa-miR-24-3p, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-30a-5p)のROC曲線。 バリデーションコホート5(< 10ng/mL)のサブセットにおけるバイオマーカーシグネチャーに基づく3miR_1比のROC曲線。 バリデーションコホート5のサブセットにおけるバイオマーカーシグネチャーに基づく3miR_2比のROC曲線。 「デンマーク」コホートの概要。 コホート3における分類指標検証に基づく3miR_2(hsa-miR-24-3p, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-30c-5p)比のROC曲線。
タイトル: 試験的研究-エキソソーム分画した無細胞尿中のマイクロRNAプロファイリング
研究目的
健康な個体および前立腺癌患者（異なる病気のステージにわたり）からの無細胞尿サンプル中に存在する豊富なマイクロRNAを同定すること。
試料
すべてのサンプルは、デンマークオーフス大学病院泌尿器科で収集した（1997〜2005年）。サンプルセットは、前立腺肥大症（BPH)からの12の非悪性サンプル、組織学的に確認された臨床的に局所化されたPC（RP）の治癒を意図した根治的前立腺切除術（RP）の前に33人の患者から採集したサンプル、および去勢抵抗性PC（CRPC）を有する8人の患者の繰り返しから成る。これらのうち３４のサンプルは、コホート1（実施例2）に属する。
方法
サンプル調製
尿試料を沈降させ、4,5mlの上清を5mLのCRYOチューブに移し、使用するまで-80℃で保存した。エキソソーム由来のRNAをmiRCURY（商標） RNA Isolation Kit (カタログ番号300102) - Exosome Isolation in combination with miRCURY（商標） RNA Isolation Kits - Cell & Plant (カタログ番号300110)、両方ともExiqon社より、を使用して製造元の説明書きに従い、尿上清3mlから抽出した。精製したRNAを使用するまで-80℃で保存した。
MicroRNA発現プロファイリング
プロファイリングは、Exiqon社のmiRCURY LNA（商標）Universal RT microRNA PCRプラットフォームを2連（2つの別個の逆転写反応）で行った。すべての定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（qRT-PCR）実験およびデータ品質管理は、Exiqon Services、Vedbaek、Denmarkにより実施した。簡単に、miRCURY LNA（商標）マイクロRNA PCR、ユニバーサルcDNA合成キットII（カタログ番号203301）を使用して、2μlのRNAを10μlの反応で逆転写（RT）した。cDNAを100倍に希釈し、2μlを10μlのPCR反応のための投入量として使用した。相対microRNAレベルを384ウェルPCRプレート中で752の異なるmicroRNAをアッセイできるmicroRNA Ready-to-Use PCR, Human panel I+II, V3,Rを用い解析した。以前にmiRBase（バージョン19）の命名法に関連して「hsa-miR-210」と呼ばれていたものは、miRBAse（バージョン21）の命名法を採用するために「hsa-miR-210-3p」と呼ばれるべきであることを考慮する。同じ問題が「hsa-let-7c」と「hsa-let-7c-5p」およびhsa-miR-203aとhsa-miR-203a-3pにも適応される。本発明のmiRの概要およびそれらの配列を表11に示す。すべての分析について、ExiLENT SYBR（登録商標）Greenマスターミックス（カタログ番号203421）を使用した。逆転写反応からRNA鋳型を除いたネガティブコントロールを行い、平行してプロファイリングした。増幅は、LightCycler（登録商標）480 Real-Time PCR System（Roche）で行った。増幅曲線は、Roche LCソフトウェアを用いて、定量サイクル（Cp）値の決定および融解曲線分析の両方について分析した。
結果
平均Cp値が36未満であり、少なくとも2つの試料で検出された全てのアッセイを、さらなる分析のために含めて考えた。ディスカバリー研究のために183のmicroRNAを選択した（実施例2）。
タイトル: 健常コントロールとPC症例を区別する診断分類指標の同定
目的
前立腺癌患者（PC）および健常コントロールからの尿試料中の診断バイオマーカーポテンシャルを有するmicroRNAを同定すること。
試料
すべての尿サンプルは、デンマークオーフス大学病院泌尿器科で収集した（1997〜2005年）。トレーニングコホート（コホート1）は、BPH患者（コントロール）由来の8つの非悪性サンプル（NM）、組織学的に確認され、臨床的に位置が特定されたされたPCの治癒のために前立腺摘除（RP）を受けた患者由来の122のサンプル、及び、5つの去勢抵抗性前立腺癌（CRPC）のサンプルから構成される。コホートのサンプル構成の概要については、表2を参照。
表2: コホート1および2の患者構成
方法
サンプル調製
尿試料を沈降させ、4,5mlの上清を5mLのCRYOチューブに移し、使用するまで-80℃で保存した。エキソソーム由来のRNAをmiRCURY（商標） RNA Isolation Kit (カタログ番号300102) - Exosome Isolation in combination with miRCURY（商標） RNA Isolation Kits - Cell & Plant (カタログ番号300110)、両方ともExiqon社より、を使用して製造元の説明書きに従い、尿上清3mlから抽出した。精製したRNAを使用するまで-80℃で保存した。
MicroRNA発現プロファイリング
プロファイリングは、Exiqon社のmiRCURY LNA（商標）Universal RT microRNA PCRプラットフォームを2連（2つの別個の逆転写反応）で行った。すべての定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（qRT-PCR）実験およびデータ品質管理は、Exiqon Services、Vedbaek、Denmarkにより実施した。簡単に、miRCURY LNA（商標）マイクロRNA PCR、ユニバーサルcDNA合成キットII（カタログ番号203301）を使用して、2μlのRNAを10μlの反応で逆転写（RT）した。cDNAを100倍に希釈し、2μlを10μlのPCR反応のための投入量として使用した。コホート1について、相対マイクロRNAレベルは183の選択されたmicroRNAアッセイ（実施例1）および4つのspike-inコントロールから成るmicroRNA Ready-Use PCR、Pick-and-Mix microRNA PCRパネル（カスタムメイド、品番20381）を使用し解析した。すべての分析について、ExiLENTSYBR（登録商標）Greenマスターミックス（カタログ番号203421）を用いた。逆転写反応からRNA鋳型を除いたネガティブコントロールを実施し、並行してプロファイリングした。増幅は、LightCycler（登録商標）480 Real-Time PCR System（Roche）で行った。増幅曲線は、Roche LCソフトウェアを用いて、定量サイクル（Cp）値の決定および融解曲線分析の両方について分析した。全てのサンプルにおいて全てのCp値が37を超えるmicroRNAを、さらなる解析から除外した。低品質サンプルを排除するために、検出数が100未満のmiRNAを有する任意のサンプルを除去した。
データのフィルタリングとデータの正規化
増幅効率は、LinRegソフトウェアと同様のアルゴリズムを用いて算出した。すべてのアッセイを明確な融解曲線について検査し、Tmをアッセイの既知の仕様内にあると確認した。さらに、ネガティブコントロールよりも3 Cps低く、データ分析にCp <37を含むアッセイを検出しなければならない。これらの基準を満たさなかったデータは、今後の分析から除外された。 Cpは2次導関数として計算された。低品質サンプルを排除するために、検出数が100未満のmiRNAを有する任意のサンプルを除去した。NormFinderを用いて、最良のノーマライザーは、すべてのサンプルにおいて検出されたアッセイの平均であることが見出された。すべてのデータは、すべてのサンプル（N = 23）（平均-アッセイCp）で検出されたアッセイの平均に対して正規化され、それは多数のアッセイを含むqRT-PCR研究のための最良の標準化であることが示された堅牢な方法である（13）。23のアッセイはhsa-let-7a-5p, hsa-let-7b-5p, hsa-let-7f-5p, hsa-let-7g-5p, hsa-miR-10b-5p, hsa-miR-125b-5p, hsa-miR-1260a, hsa-miR-141-3p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-19b-3p, hsa-miR-200b-3p, hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-204-5p, hsa-miR-23b-3p, hsa-miR-24-3p, hsa-miR-26a-5p, hsa-miR-27b-3p, hsa-miR-30a-5p, hsa-miR-30b-5p, hsa-miR-30c-5p, hsa-miR-99a-5pおよびhsa-miR-99b-5pである。
統計分析
発現解析: すべての分析について、P値<0.05が統計的に有意であると考えられた。Shapiro Wilkテストを使用して、データが正常に配布されたかどうかを評価した。いくつかのmicroRNAは異なったため、ノンパラメトリック統計Wilcoxon signed-rank検定を、異なる群の間のmicroRNA発現のペアワイズ比較のために使用した。miRNA発現の診断ポテンシャルは、受信者操作特性（ROC）曲線分析によって評価した。
結果
発現データ:
いくつかのmicroRNAが、Wilcoxon rank検定に基づいて有意に制御されることが見出され（P <0.01）、トップ20はhsa-miR-135b-5p, hsa-miR-140-3p, hsa-miR-141-3p, hsa-miR-146a-5p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-19a-3p, hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-205-5p, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-23a-3p, hsa-miR-24-3p, hsa-miR-27b-3p, hsa-miR-30a-3p, hsa-miR-30a-5p, hsa-miR-30b-5p, hsa-miR-30c-5p, hsa-miR-30e-5p, hsa-miR-31-5pおよびhsa-miR-362-5pである。
microRNA発現の診断性能および診断用microRNA分類指標の開発
miRNAの診断可能性は、性能の尺度として曲線下面積（AUC）を用いて、受信者操作特性（ROC）によって評価することができる。これに関して、miRNA-31-5pは、ディスカバリーコホートにおいてAUCが0,92である最も高い可能性を示す。
検出差を増やし、標準化の必要性を回避し、アッセイの堅牢性を高めるために、最も有意に上方制御されたmiRNA対、最も強力で有意に下方制御されたmiRNAの比を計算した。miRNA-31-5pとmiR-30cの比がmiRNA-31-5pよりも高いAUC値を示すことを見出した（表3）。
結論
122症例（RP）に対してわずか8コントロール（BPH）でのカテゴリーの不均一な分布にもかかわらず、85,7％の特異性および92,2％の感度を有するROC曲線下面積(AUC=0.92)によって決定されるように、優れた診断精度を有する強力な2 miR分類指標としてのmiR-31-5p対miR-30cの比を同定することができた。
タイトル: 2つのmiR（Cp（miR-31-5p）-Cp（miR-30c））分類指標の診断性能のバリデーション
目的
PC患者からの尿サンプルのmiRNA発現パターンをコントロールと比較して確かめるため、および実施例2で同定された２つのmiR(Cp(miR- 31-5p)- Cp(miR-30c ))分類指標を検証するため。
試料（コホート2）
すべての尿サンプルは泌尿器科で採取され、デンマークオーフス大学病院研究所から入手した（1997〜2005年）。すべての個体について、H＆E染色ホルマリン固定パラフィン包埋組織試料の切片を、訓練された病理学者によって評価した。バリデーションコホート（コホート2）は、47の非悪性サンプル（コントロール：BPH患者）、組織学的に確認され臨床的に位置を突き止められたPCの治癒のための前立腺摘除（RP）を受けた患者由来の98のサンプル、および去勢抵抗性前立腺癌(CRPC)の3つのサンプルから構成される。コホートのサンプル構成の概要については、表2を参照のこと。
方法
サンプル調製
１例として、
MicroRNA発現プロファイリング
プロファイリングは実施例2と全く同じように行った。
データのフィルタリングとデータの正規化
データのフィルタリングおよび正規化は、実施例2と全く同じように行った。すべてのデータを、すべてのサンプル（N = 23）で検出されたアッセイの平均に対して正規化した。それは多数のアッセイを含むqRT-PCR研究のための最良の標準化であることが示された堅牢な方法である（14）。
統計解析
発現解析: すべての分析について、P値<0.05が統計的に有意であると考えられた。Shapiro Wilkテストを使用して、データが正常に分布されたかどうかを評価した。いくつかのmicroRNAは異なったので、ノンパラメトリック統計Wilcoxon signed-rank検定を、異なる群の間のmicroRNA発現のペアワイズ比較のために使用した。Benjamini-Hochberg法（15）を用いて複数の検定のためにP値を補正した。miRNA発現の診断可能性は、受信者操作特性（ROC）によって評価された。
結果
複数の検定（Benjamin Hochberg（BH）法）のために調整されたWilcoxon rank検定に基づいて、いくつかのmicroRNAが有意に調節されることが見出された(P<0,01)、トップ20は: hsa-miR-141-3p, hsa-miR-142-3p, hsa-miR-146a-5p, hsa-miR-151a-3p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-191-5p, hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-203a, hsa-miR-204-5p, hsa-miR-205-5p, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-223-3p, hsa-miR-24-3p, hsa-miR-30a-5p, hsa-miR-30c-5p, hsa-miR-31-3p, hsa-miR-31-5p, hsa-miR-320a, hsa-miR-93-5pおよびhsa-miR-99a-5pである。
これらの上位20の著しく調節されたmiRNAの間には、コホート1と2との間に10個の著しく制御されたmiRNAの重複があった（表3）。
表3に見られるように、癌とコントロールとの間の識別のための最も強力な診断可能性を有するmiRNAは、miR-31-5pおよびmiR-146である。しかしながら、miR-31-5pは試料の96％で検出されたのに対し、miR-146は試料の60％においてのみ検出されたため適切な候補ではない(AUC= 0,85)。
表3: コホート1およびコホート2の両方において有意に制御されたmiRNA、MiRは、Benjamin Hochberg（BH）法による複数の検定のための調整後、バリデーションコホートにおけるWilcoxon rank検定に基づくp値に従ってランク付けされる。「Fold change」は、コントロール（BPH）と症例（RP）との間のmiR発現の相対的差異であり、「-」は、特定のmiRが癌において下方制御されることを示す。「AUC」はROC曲線下面積を示す。「95％CI」は95％信頼区間（CI）を示す。
コホート1において確立されたカットオフを有する2-miR（miR-31-5p/miR30c）分類指標の診断可能性は、コホート2において、ROC分析を用いて0,86 (95% CI: 0,79 to 1,00, p<0,0001)ROC曲線下面積によって定義された高い診断精度で検証され、72.5%の感受性、84.1%の特異性が見出された。
結論
miR-31-5p（正規化済）および2 miRNA（比）分類指標（miR-31-5p / miR-30c）の診断可能性は、コホート1において確立された同様のカットオフ値を用いて独立したバリデーションコホートにおいて首尾よく有効性が確認された。診断用の2 miRNA（miR-31-5p/miR-30c）分類指標の精度は高く（AUC = 0.86）、感受性は72.5％、特異性は84.1％であった。
タイトル: 独立したコホート3における分類指標の堅牢性のテスト
マーカーとして目的
2-miR分類指標の堅牢性、すなわち、かなり異なる方法論に従ってサンプリング、処理されたコホートであってもサンプルを癌症例およびコントロールに正確に分類するための診断ポテンシャルを試験するため。コホート3の試料は、コホート1および2と以下のパラメーターに関して異なる: 1)国籍（イギリス）、2)サンプリング（サンプリング前に前立腺をマッサージした）、3)RNA抽出技術（エキソソームの濃縮を伴わない全細胞フリーの尿からの抽出−異なるキットを使用した）。したがって、2つのmiRNAの実施例1および2に対する重複が有意に上方/下方制御されることは、堅牢性の証拠となる。
試料
尿サンプルは、英国シェフィールドのオンコロジー医科学科によって提供された。バリデーションコホートは34の非悪性コントロールサンプル、限局性前立腺癌患者からの36サンプル、進行したPC患者からの20サンプルから構成される。Ambion、Life TechnologyのmirVana（商標）miRNA分離キット（カタログ番号：AM1560）を使用して、製造元の説明書に従い、細胞フリー尿画分（上清）からRNAを直接抽出した。精製したRNAを使用するまで-80℃で保存した。
方法
プロファイリングは実施例3のように行った。コホート3について、相対microRNAレベルは48の選択されたmicroRNAアッセイと4-spike-inコントロールから成るカスタムメイドmicroRNA Ready-to-Use PCRを用いて解析された。測定された50％未満の48のmiRNAがサンプルセットから除去されたサンプル。コホート1およびコホート3の両方についてNormFinderアルゴリズム（40）を使用し、正規化遺伝子hsa-miR-103a-3pとして最も安定に発現されたmiRNAを両方のセットにおいて選択し、コホート3の標準化を行った。
結果
２つのmiR分類指標(miR31-5p, 30c)はコホート1で確立されたカットオフ値と0,79 (CI: 0,69 to 0,90, p< <0,0001)のROC曲線下面積を用いることで感受性72.9%と特異性84.4%と共にコントロールから分類された。タブ4および図1c参照。
表4: ３つのコホートにおいてmiR-31-5p/miR-30c のためのROC曲線をプロットし、ROC曲線は計算された。95％信頼区間（CI）を表に示す。
結論
コホート３は異なる試料、採集、処理および標準化手順等でコホート１および２とは根本的に異なるのにもかかわらず、miR31の診断ポテンシャルが確認された。コホート1とコホート2で確立されたカットオフ値と同じものを使用して、この独立コホート（コホート3）で2 miR分類指標が首尾よく有効性が確認された。診断分類指標の精度は高く（AUC = 0,79）、感受性は72,9％、特異性は84,8％であった。
タイトル: 診断ポテンシャルを有する改善された分類指標に基づくmiRNAバイオマーカーの発見
目的
単一のmiRNAの発現レベル上で上下変動しない分類指標であるmiRNAのパネルを使用することが有利であり得る。診断ポテンシャルを有するmiRNAの同定検出力を高めるために、コホート1およびコホート2を1つの大きなディスカバリーコホートに併合する。併合されたデータセットは、分類指標を構築するための統計的アプローチに十分な力を有する。
試料（コホート1およびコホート2）
併合されたコホート（実施例1のコホート1および実施例2のコホート2）は48の非悪性サンプル(NM; BPH患者から(コントロール)、組織学的に確認され臨床的に位置を突き止められたPCの治癒のための前立腺摘除を受けている患者からの205サンプル、去勢抵抗性前立腺癌（CRPC）の8サンプルから構成される。
方法
データフィルタリングおよび正規化
ノーマライザの数を減らすために、バックグラウンドでフィルタリングされたデータ（すべてのサンプルで測定値が取得される）がNormfinderアルゴリズムに解析された（14）。Normfinderからの上位5種の最も安定なmiRNA（hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-30b-5p, hsa-let-7a-5p, hsa-miR-27b-3p, hsa-miR-23b-3p）は、各サンプルの平均正規化値を計算するために使用される。個々のサンプルの平均正規化値は、ΔCp値を得るために各個々のサンプルの生データCp値から減算される。2つの正規化手順（トップ5のmiRNAおよび全域平均正規化）は、差次的に発現されるmicroRNAの上位ならびにmicroRNAの全体的なランキングに関して非常に類似した結果をもたらし、その後の検証研究で正規化遺伝子として5 microRNAの妥当性を支持している。5 miR正規化法は、その後のすべての分析に使用される。
分類指標の構築
各miRNA分類指標は、モンテカルロサンプリングによって構築され、2つのグループ間の最も重要なmiRNAのトップ100からランダムに2〜20のmiRNAを抽出した（Benjamini-Hochbergに基づく調整されたWilcoxon test p-value）(17)。これを100万回実施し、ROC AUCまたはlog-rank検定p値をそれぞれ診断および予後分類器のスコアとして用いて、各分類指標の性能を試験した。次いで、分類指標は、分類指標を減らすために、leave-one-outクロスバリデーション（LOOCV）最尤分類器アプローチによって削減された（18）。
分類指標を用いたスコアリング
分類指標に基づく患者スコアは、以下のように計算した: RにおけるpROCパッケージによって決定されたROC曲線から最良の閾値(Youden's J statistic (Youden, 1950)) (17)に基づいて、所定のmiRNAについてカットオフ値（ΔCp値）を選択した。次に、各患者について、所与のmiRNAのΔCp値を調べ、患者ΔCp値がカットオフより大きい場合、ΔCp値がカットオフ未満であれば、miRNAは+1または-1のスコアを与えた。miRNAがアップレギュレートされているかダウンレギュレートされているかに応じて、操作上のサインをそれに応じて変更した。最後に、所定のmiRNAが検出限界内で発現されないことが判明した場合、スコアに0を割り当てた。この手順を各miRNAについて行い、結果を合計して各患者の総合的な分類スコアを得た。
結果
この大きな併合サンプルセットにおいてBenjamin Hochbergによる複数の検査のために調整した後、表5に示すように、BPHとRPの間で有意に脱調節されることが見出されたトップ20のmiRNAは実施例3で検証された20個のmiRNAのうち15個が全てこのセットに含まれている。表6は、実施例5で見出された、BPHとRPとの間の全ての有意に脱調節されたmiRNAを示す。
表5、コントロール（BPH）と症例（RP）の間で有意に調節されたmiRNAを有する上位20個のmiRNA。
「ΔΔCq」は、2-ΔΔCt法によって決定された対照（BPH）および症例（RP）間の遺伝子発現の相対的差の尺度である、(20)参照。
「Fold」は、コントロール（BPH）と症例（RP）との間の遺伝子発現の相対的差異であり、「-」は、miRが癌において下方制御されることを示す。
「Expressed」とは、測定可能な量のmiRを発現するサンプルのパーセンテージを示す。
表６、BPHとRPとの間の有意に脱調節されたmiRNA。MiRは、AUCと発現の積に従ってランク付けされる
実施例5で分析した組合わせセットでは、2miR分類指標（miR-31-5p/miR-30c）はROC曲線分析（0.9（AUC））に基づく診断精度を示した。
単一のmiRNAまたは比に基づくバイオマーカーが良好に機能する一方で、miRNAのパネルを使用することで分類指標の堅牢性を高めることがある。
モンテカルロシミュレーションを使用して、20-miRNA診断分類指標を上記のように構築し、図2に示すようなROC曲線を得た。分析は、95,5％の特異性および93,6％の感受性を有するAUC = 0.99を示した。20のmiRNA分類指標は: hsa-miR-132-3p, hsa-miR-135b-5p, hsa-miR-187-3p, hsa-miR-194-5p, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-24-3p, hsa-miR-363-3p, hsa-miR-495-3p, hsa-miR-548c-5p, hsa-miR-96-5p, hsa-miR-135a-5p, hsa-miR-140-3p, hsa-miR-141-3p, hsa-miR-221-3p, hsa-miR-490-3p, hsa-miR-148a-3p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-20a-3p, hsa-miR-31-5p, hsa-miR-320aから構成される。
比率に基づくバイオマーカー
miRNAの診断ポテンシャルは、性能の尺度として曲線下面積（AUC）を用いて、受信機動作特性（ROC）によって評価することができる。これに関して、miRNA-31-5pはディスカバリーコホートにおいて89.9％のAUCを有する最も高いポテンシャルを示す。
潜在的に、いくつかのmiRNAが診断テストでお互いを補うことができ、それによってどちらかのmiRNAより優れた性能を発揮する。コホート内のmiRNA-31-5pと他のmiRNAとの比を計算することにより、miRNA-31-5pと組み合わせた場合、それら自身より、他の12個のmiRNAがより高いAUCスコアを示すことが発見された（表7参照）。
表7に見られるように、ROC曲線のAUCで判断される最良の実行比は
である。しかしながら、hsa-miR-1238-3pは、サンプルの3％でしか発現せず、その結果、実用的価値はほとんどない。比率が代わりにAUCの産物に従ってランク付けされる場合、発現比:
が最も高いランキング比に基づくバイオマーカーとして示され
等が続く。
表7、miRNA-31-5pと一緒にうまく機能するmiRNAのリスト。「Expressed」とは、そのmiRNAが発現されることが見出されたサンプル数のパーセントの尺度である。
結論
この実施例は、コントロールおよび限局性前立腺癌（RP患者）を有する患者の間の識別のポテンシャルを有するmiRNAを発見するための異なるアプローチを提示した。この分析により、20のmiRNAのリストが明らかとなり、ここで5つのmiRNAが実施例2および3で発見および検証された。診断スコアに最も大きな影響を与えるmiRNAは、miR-320およびmiR-31-5pであり、続いてmiR16-5pであった。
タイトル: 前立腺癌の特異性
目的:
同定されたシグネチャーが前立腺癌に特異的であることを確認するため。
試料
膀胱癌患者からの25サンプルおよび8つの個々の非膀胱癌患者コントロールサンプルからの尿サンプルのセット、実施例１、２および３に用いられた同じプロトコルに従ってサンプリングし処理した。
方法
用いた方法は、実施例1,2および3で使用した方法と同一である。
結果
コントロールと比較して膀胱癌において顕著に異常な発現を有する上位20のランキングマイクロRNAのうち、hsa-miR-16-5p、hsa-miR-320aおよびhsa-miR-10b-5pの3つのマイクロRNAのみがPCで同定されたものと重複している。強力なPC診断2-miR分類指標（miR-31-5p、miR-30c）のROCプロットは、膀胱癌対コントロールの図3に示されており、非常に低い識別値を示す。
タイトル: UniRTメソッド
目的:
この実施例では、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（qRT-PCR）技術を使用して、小さな非コードRNA分子を増幅および定量するためのUniRT法を簡単に説明する。さらなる説明は、EP2391736に見られる。
要約すると、図4を参照、UniRTプロトコルは2ステッププロトコルである。STEP 1では、サンプル中に存在するmiRは、RNA分子の3'-末端にアデニン残基を付加するポリ（A）ポリメラーゼを用いて最初にポリAテイル化される。第2に、ポリ-T-コアヌクレオチド配列、3'-末端VN-縮重モチーフおよび5'-末端テールを有する伸長プライマーは、伸長プライマーのVN-ポリ-T配列とのハイブリダイゼーションによりポリAテイル化されたmiRにアニールされる。続いて、鋳型としてmiRを用いて伸長プライマーを逆転写反応で伸長させる。得られた一次伸長産物は、伸長プライマーと、サンプル中のmiRに相補的な新たに合成されたcDNAとから構成される。
次のステップ2では、miR特異的PCRが行われる。新たに合成されたcDNAの3 '末端にmiR特異的フォワードプライマーをアニーリングし、鋳型としての一次伸長産物を用いてDNA重合反応においてフォワードプライマーを伸長させることにより、上鎖の合成を行う。次に、miR特異的3'-末端配列、ポリ-T-ストレッチおよび5'-末端尾部からなるmiR特異的リバースプライマーを上鎖にハイブリダイズさせ、下鎖はリバースプレイマーの伸長によって合成される。
STEP1およびSTEP2の両方において、LNAは、プライマーのそれぞれの標的への特異的かつ効率的なアニーリングを確実にするために役立つ。
ExiqonのUniRT法（miRCURY LNA（商標）ユニバーサルRT microRNA PCR）は、比類のない感度と特異性をもたらす（Mestdagh et al. Nat Methods. 2014 Aug;11(8):809-15参照）。
タイトル: エキソソーム分画した細胞フリー尿中の改善されたmicroRNA分類指標の発見
研究の目的
良性の状態と癌の状態を区別する診断能力を有するmicroRNAを同定すること。
試料
すべての尿サンプルは、泌尿器科で採取され、デンマークオーフス大学病院研究所から入手した（1997〜2005年）。H＆E染色ホルマリン固定パラフィン包埋組織標本のすべての個体について、訓練された病理学者によって評価した。トレーニングコホート（コホート4-（V））は、22の非悪性試料（NM; BPH患者（コントロール）由来）であり、組織学的に確認された臨床的に突き止められたPCaの治癒のための前立腺摘除を行った患者から200サンプルであった。
コホート組成の概要については、表8および図10を参照。
方法
サンプル調製およびマイクロRNA発現プロファイリングを、実施例1に記載のように実施した。
データのフィルタリングと正規化
全てのサンプルにおいて全てのCq値が37を超えたmicroRNAは、さらなる解析から除外した。低品質サンプルを排除するために、発現されたmiRNAの総数が潜在的最大値の50％を下回るサンプルを除去した。強く発現されたアッセイのみを選択するために、サンプルの80％未満で発現されるmicroRNAアッセイを除去し、35を上回る平均Cq値でのアッセイも同様に除去した。
コホート4の標準化は、NormFinderアルゴリズム(40)によって同定されたトップ3（hsa-miR-200b-3p, hsa-miR-27b-3p, hsa-miR-30b-5p）の最も安定に発現されたアッセイの平均正規化値を計算することによって行った
分類指標の構築-複数のロジック回帰
2つのカテゴリー（良性および癌）が与えられた場合、ロジスティック回帰を使用して、所与の患者が特定のカテゴリーに属する確率をモデル化することが可能である。マルチブルロジスティック回帰モデルを用いることにより、一つ以上の予測因子を含めることができる（microRNAアッセイ測定）。
説明変数の値が与えられたときの特性が存在する確率（p（X））、単一のカテゴリ変数(p (X) = (Y = 1|X = x)の場合において、即ち推定されたCp値を所与された癌を持つ患者は、以下のモデルで表すことができる：
（式中、X=(X1,…,Xp)は説明上の変数のセットであり、この場合は特定のmicroRNAアッセイのΔCq値であり、β0,…,βpは係数である。microRNAアッセイは、LASSO（Least Absolute Shrinkage and Selection Operator）回帰によって選択され、係数は最尤法により推定される。）
microRNAパネルの選択
最適な診断ポテンシャルを有するmicroRNAパネルを同定するための統計的方法としてLasso回帰を用いた。十分なシグナル対ノイズ比を有するmicroRNAから選択するために、正常およびPCa被験体の間のディスカバリーセットにおいて少なくとも1,75倍の変化を示すmiRNAのみを含めた。ロジスティック回帰は完全なデータセットを必要とするため、欠損値を埋めるために複数の帰属法を使用した。補完はRパッケージの「mice」を用いて行った。
次に、Rパッケージglmnetを使用して、どの予測変数を使用するかを判定するため、Lasso回帰を実行した。簡単に説明すると、Lasso回帰は、λが増加すると係数をゼロに縮小するペナルティ（λ）を導入する。予測因子（マイクロRNAアッセイ）がモデルに寄与するほど、β値がゼロになる前にλ値が大きくなければならない(参照、http://www-bcf.usc.edu/~gareth/ISL/ page 219 ラッセル回帰の完全な説明のために)。3つまたは7つの予測因子（microRNA）を用いることが最適であることが示されたcv.glmnetを用いた交差検証においてλおよび異常を増加の結果として、係数は縮小した。
microRNAパネルの診断ポテンシャルは、ロジスティック回帰モデルからのp値を用いたROC分析によって評価した。
結果
上位10位のmicroRNAを表9に示す。LASSO回帰は、3または7個の予測因子（microRNA）を用いることが最適であることを示した。
最高の診断精度を有する単一のmicroRNAアッセイは、AUCが0,92であるhsa-miR-31-5pである。
「PSA≦10」は、先の標準的な前立腺特異抗原（PSA）測定が、個々の患者（または対象）において血清PSAレベルが10ng / mLまたはそれ以下であることを示す。
その後の2つのmicroRNA（ランク2および3）は両方とも、0.95のAUC（カットオフ0.94）を達成する分類指標（hsa-miR-31-5p, hsa-miR-141-3p, hsa-miR-24-3p）に有意な精度を付加した。
最も高い診断精度を有するマイクロRNAパネルは、0.96のROC曲線下面積(AUC)を持つ7 miR分類指標であった: hsa-miR-31-5p, hsa-miR-141-3p, hsa-miR-24-3p, hsa-miR-31-3p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-331-3p。より多くのアッセイを追加しても、識別力はさらに増加しなかった。
結論
良性状態および癌性状態を非常に高精度（AUC> 0.95）で区別するいくつかの新規診断バイオマーカーmicroRNAパネルを同定することができた。
タイトル: 同定されたmicroRNAバイオマーカーパネルの診断性能の検証
目的
実施例8で同定された10個のmiRバイオマーカーパネル（バイオマーカー分類器またはmiRシグネチャとも呼ばれる）の診断能力を検証するため。
試料
サンプルは実施例8に記載したように収集、処理された。バリデーションコホートは22の非悪性サンプル（NM; BPH患者（コントロール）由来）、組織学的に確認され臨床的に位置を突き止められたPC（RP）の治癒のための前立腺摘除受けている患者からの205サンプルから構成される。
方法
microRNA発現プロファイリング、標準化およびデータフィルタリング
実施例8と同様に、microRNA Ready-Use PCRの異なる生産ロットを使用する以外は、Pick-and-Mix microRNA PCRパネル（カスタムメイド;品番号174845）を使用する以外は実施例8と全く同様にした。
結果
コホート4で定義されたパネル（または分類指標）の診断ポテンシャルは、コホート5でROC分析を用いて検証された。結果を表9bに示す（実施例8参照）。
1つのマイクロRNA分類指標（hsa-miR-31-5p）は、バリデーションコホートにおいて0.81の診断精度を示したが、2つのその次のマイクロRNA（hsa-miR-141-3pおよびhsa-miR-24-3 ）は、AUCが0.86に達し、診断精度に無視できない増加を追加した（図5も参照）。ディスカバリーセットにおける良性状態および癌性状態を識別する際に診断精度が最も高いマイクロRNAパネル; 7-miR分類指標は、AUCが0.88であることが確認された（図6）。
結論
コホート4で確立されたカットオフ値を用いて、独立した検証コホートにおいて、診断miR分類指標1〜10（診断miRシグネチャー、または診断バイオマーカーパネル番号1〜10）が首尾よく有効性が確認された。microRNAパネルのいくつかは、診断精度が0.86を超える生検検査の陽性転帰を予測することができた。最も適したmicroRNAバイオマーカーパネルは7-miR分類指標であった。診断検査の場合、診断検査の価格および複雑さのために、少数の検査が好ましい。したがって7miR分類指標とは別に、3miR(hsa-miR-31-5p, hsa-miR-141-3p,およびhsa-miR-24-3p)および４miR(hsa-miR-31-5p, hsa-miR-141-3p, hsa-miR-24-3p,およびhsa-miR-31-3p)分類指標は有望なバイオマーカーの候補である。
タイトル: サブポピュレーションでの使用目的における同定されたmicroRNAバイオマーカーパネルの検証
研究の目的
生検を行うか否かにかかわらず、先のPSA検査結果が「グレーゾーン領域」で10ng / mL未満の患者では、バイオマーカーパネルが、臨床決定を支持するために使用されることが意図されている。この試験の目的は、同定されたバイオマーカーパネルが、10ng / mL未満のPSAレベルを有する患者のサブポピュレーションに適用され得ることができ、さらに高い診断精度で良性および癌性状態を識別することができるかどうかを検証することであった。
試料
コホートはバリデーションコホートのサブセットであった。19の非悪性サンプル（NM; BPH患者から（コントロール））、およびPSAレベルが10 ng/mLより低い、または同等(表8)の組織学的に確認され臨床的に突き止められた治癒のために前立腺摘除を受けた患者からの83サンプルから構成される。
方法
microRNA発現プロファイリング、標準化およびデータフィルタリング
実施例9を参照。
結果
コホート4で定義された分類指標の診断ポテンシャルは、ROC分析を使用して（PSA<10）コホート5のサブポピュレーションで検証された。結果は表9に示す。
1つのmicroRNA分類指標（hsa-miR-31-5p）は、検証コホートでは0.82の診断精度を示したが、一方、3つのmicroRNA（3-miR）分類子は、実施例8のディスカバリー研究に沿って、AUCが0.88に相当する診断精度においてかなりの増加を示した。ディスカバリーコホートにおける正常状態と癌状態の区別において最高の診断精度を示した7-miR microRNAパネルも、AUCが0.89であるバリデーションコホートにおいて最も高い識別力を有することが判明した。ディスカバリーコホートで観察されたように、パネルにさらに多くのマイクロRNAを加えることは、バイオマーカーパネルを改善しなかった。
結論
10ng / mL未満のPSAレベルを有する患者で意図した用途ポピュレーションから構成される独立コホートにおいて、いくつかのmicroRNAパネルの診断バイオマーカーの可能性を検証した。いくつかのmicroRNAパネルは、診断精度が0.88以上の生検検査の良好な結果を予測することができた。
タイトル: 診断のための比率ベースのバイオマーカー
研究目的
比率に基づくmicroRNAバイオマーカーシグネチャーは、正規化の必要性を回避することによって検出差を増加させる重要な利点を有し、それにより診断精度を得るために必要とされるアッセイの数を減少させる。この研究の目的は、良性状態よび癌性状態を識別するための診断ポテンシャルを有する比に基づく分類指標を発見することであった。
試料
実施例8と同様（ディスカバリーコホート）。
方法
microRNA発現プロファイリングおよびデータフィルタリング
実施例8からのデータ-標準化無し。
分類指標構築-比率分類指標
簡単に説明すると、92のプールからのすべての可能なmiRNA対が作成された（n = 4186）。次いで、全試料の少なくとも95％において発現されなかった対を除去し、残りの対（n = 823）の間の比についてAUCを計算した。上位10個のmicroRNA比の対から、可能なすべての3-miR比が作成された。
結果
2-miR比に基づく分類指標を上回る診断力を追加した唯一の3-miR比に基づく分類指標は、感受性と特異性の両方がAUC0.96（感受性および特異性> 0,9、カットオフ2および感度88、特異性95、カットオフ> 6）を有する、hsa-miR-24-3p, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-30a-5p and hsa-miR-24-3p, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-30c-5p（表10参照）（図7）である。
3-miR比分類指標のスコアリングアルゴリズムは、次のように表すことができる:
（式中、X1〜X3は、3つの異なるmiRの発現レベルに関する実験的に決定された値（測定値）のセットである。好ましい場合には、分類指標における特定のmicroRNAアッセイのCq値を発現レベルの尺度として用いる）。
Cq値は対数スケールであるため、スコアは次のように書くこともできる:
（式中、Cq1-Cq3は、3つの異なるmiRについて観察されたCq値である）。
選択された比率ベースの分類指標は、正規化の必要性を回避がない:
（式中、XはmicroRNA測定のCq値であり、Nは（共通選択された）正規化因子である）。
結論
良好な政権結果の予測において有望な診断ポテンシャルを有する2つの比率に基づくmicroRNA分類指標が同定された。
タイトル: 全データセットにおける3miR分類指標のバリデーション
研究の目的
独立した患者コホートにおける2つの同定された3miR比に基づく分類指標のバイオマーカーポテンシャルの検証。
試料
実施例9と同様（すなわちコホート5, 表8）
方法
microRNA発現プロファイリングおよびデータフィルタリング
実施例9からのデータ-正規化無し。
結果
コホート1において確立されたカットオフを有するhsa-miR-24-3p, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-30a-5pおよびhsa-miR-24-3p, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-30c-5pからの2つの3-miR比率に基づく分類指標の診断ポテンシャルはコホート2において、ROC分析を用いて検証された。2つの分類器のROC曲線下面積で定義された診断精度は、それぞれ、0,87（感受性0,89、特異性0,76、カットオフ> 2）および0,89（感受性0,78、特異性0,95 、カットオフ> 6）である（図8）。
診断スコアSが以下式として計算される場合:
1％の偽陰性を受け入れると、診断スコア（S）> 0,5は、患者は生検を受けるべきであることを示唆する。
2％の偽陰性を受け入れると、診断スコア（S）> 0.9は、患者は生検を受けるべきであることを示唆する。
5％の偽陰性を受け入れると、診断スコア（S）> 1.8は、患者は生検を受けるべきであることを示唆する。
同様に診断スコアSが下記の様に計算される場合:
1％の偽陰性を受け入れると、診断スコア（S）> 5は、患者は生検を受けるべきであることを示唆する。
2％の偽陰性を受け入れると、診断スコア（S）> 5.1は、患者は生検を受けるべきであることを示唆する。
5％の偽陰性を受け入れると、診断スコア（S）> 5.8は、患者は生検を受けるべきであることを示唆する。
結論
2つの同定された比率に基づくmicroRNA分類指標の診断能力は、ディスカバリーコホートにおいて確立された同様のカットオフ値を用いて、独立したバリデーションコホートにおいて首尾よく有効性が確認された。診断3 miR分類指標の精度は、AUCが0.87以上で高くなった。
さらに、3miR分類指標について診断スコアSを計算し、患者のさらなる治療を決定するために使用することができると結論付けている。
タイトル: 意図した用途サブポピュレーションにおける比率に基づく分類指標の検証
研究の目的
この研究の目的は、識別された比率に基づく分類指標が10ng / mL以下のPSAレベルを有する患者意図した用途サブポピュレーションに適用できるかどうかを検証することであり、診断精度の高い良性および癌性の被験体を区別する。
試料
コホート5からのデータ。
方法
microRNA発現プロファイリングおよびデータフィルタリング
実施例9からのデータ-正規化無し。
3miR分類指標(hsa-miR-24-3p, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-30a-5p and hsa-miR-30a-5p and hsa-miR-24-3p, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-30c-5p)は（AUC）0.88（感受性0.79、特異性0.88）および0.91（感受性0.88、特異性0.95）それぞれの診断正確性を有するサブポピュレーションにおいて検証された（図9）。
PSA≦10ng / mLの患者の診断スコアSは、以下のように計算される。
1％の偽陰性を受け入れると、診断スコア（S）> 0.7は、患者は生検を受けるべきであることを示唆する。
2％の偽陰性を受け入れると、診断スコア（S）> 1.5は、患者は生検を受けるべきであることを示唆する。
5％の偽陰性を受け入れると、診断スコア（S）> 2は、患者は生検を受けるべきであることを示唆する。
同様に、診断スコアSが以下のように計算される場合:
1％の偽陰性を受け入れると、診断スコア（S）> 5は、患者は生検を受けるべきであることを示唆する。
2％の偽陰性を受け入れると、診断スコア（S）> 5.5は、患者は生検を受けるべきであることを示唆する。
5％の偽陰性を受け入れると、診断スコア（S）> 6は、患者は生検を受けるべきであることを示唆する。
結論
2つの3miR比に基づく分類指標の診断バイオマーカーのポテンシャルは、コホート2の意図した用途サブポピュレーション（PSA≦10ng / mL）において、それぞれ0.88および0.91という高い診断精度で首尾よく有効性が確認された。臨床検体に適用される診断カットオフ値は、0.5から2（ダイナミックレンジ：[-3, +6]最初の3miR分類指標(hsa-miR-24-3p, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-30a-5pおよびhsa-miR-30a-5p)）の間であり、4から6.5（ダイナミックレンジ：[1, 10]2番目の3miR分類指標(hsa-miR-24-3p, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-30c-5p)）の間である。
さらに、3つのmiR分類子について診断スコアSを計算し、患者のさらなる治療を決定するために使用することができると結論付けている。
タイトル: 独立コホート（実施例4のコホート3）における比に基づく分類指標の堅牢性の試験
目的
2つの3-mir比に基づく分類器のロバスト性をテストするため、すなわち、実施例4に記載した根本的に異なる方法論に従ってサンプリングし処理したコホートであっても、サンプルを良性状態および癌性状態に正確に分離するそれらの診断ポテンシャルをテストするため。
試料
実施例4を参照。
方法
実施例4を参照。
結果
3-miR分類指標(hsa-miR-24-3p, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-30c-5p)の一つは0.79（CI：0,68-0,87、p <<0,0001、感受性64％および特異性84％）の正確度（ROC曲線下面積）を有し癌状態から良性状態を分類した、図11参照。他の比率に基づく3miR分類指標（hsa-miR-24-3p, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-30a-5p）の診断ポテンシャルは確認できなかった（0.66のAUC）。
結論
コホート3とディスカバリーコホート（コホート4）の間の根本的な違いに基づいて予想されることはないが; 試料の採取と処理の違いにより、比率に基づく分類指標の1つの診断ポテンシャルが確認された。この分類指標(hsa-miR-24-3p, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-30c-5p)は良性状態と癌状態の区別において0.79の診断正確性（AUC)を有しコホート３において首尾よく有効性が確認された。

Claims (42)

  1. 被験体が前立腺癌に罹患するリスクを評価するためのin vitro方法であって、前記被験体からの尿サンプルにおいて、hsa-let-7a-5p, hsa-let-7b-5p, hsa-let-7c-5p, hsa-let-7e-5p, hsa-let-7f-5p, hsa-let-7g-5p, hsa-miR-100-5p, hsa-miR-106a-5p, hsa-miR-10a-5p, hsa-miR-10b-5p, hsa-miR-1238-3p, hsa-miR-125b-5p, hsa-miR-1260a, hsa-miR-130a-3p, hsa-miR-132-3p, hsa-miR-135a-5p, hsa-miR-135b-5p, hsa-miR-136-5p, hsa-miR-140-3p, hsa-miR-141-3p, hsa-miR-142-3p, hsa-miR-146a-5p, hsa-miR-148a-3p, hsa-miR-151a-3p, hsa-miR-151a-5p, hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-191-5p, hsa-miR-1972, hsa-miR-19a-3p, hsa-miR-19b-3p, hsa-miR-200a-3p, hsa-miR-200b-3p, hsa-miR-200b-5p, hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-203a, hsa-miR-204-5p, hsa-miR-205-5p, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-210, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-223-3p, hsa-miR-22-5p, hsa-miR-23a-3p, hsa-miR-23b-3p, hsa-miR-24-3p, hsa-miR-25-3p, hsa-miR-26a-5p, hsa-miR-27b-3p, hsa-miR-29a-3p, hsa-miR-29b-3p, hsa-miR-29c-3p, hsa-miR-30a-3p, hsa-miR-30a-5p, hsa-miR-30b-5p, hsa-miR-30c-5p, hsa-miR-30e-5p, hsa-miR-31-3p, hsa-miR-31-5p, hsa-miR-320a, hsa-miR-320b, hsa-miR-320c, hsa-miR-331-3p, hsa-miR-362-3p, hsa-miR-362-5p, hsa-miR-363-3p, hsa-miR-375, hsa-miR-378a-3p, hsa-miR-425-3p, hsa-miR-425-5p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-490-3p, hsa-miR-660-5p, hsa-miR-93-5p, hsa-miR-99a-5pおよびhsa-miR-99b-5pからなるmiRの群から選択される少なくとも2つのmiRの発現レベルを測定することを含み、健康なドナーと比較して前記少なくとも2つのmiRの変化した発現レベルが、前記被験体が前立腺癌に罹患している確率が高いことを示す方法。
  2. 前記少なくとも2つのmiRが、hsa-let-7a-5p, hsa-let-7e-5p, hsa-miR-10b-5p, hsa-miR-1238-3p, hsa-miR-130a-3p, hsa-miR-135b-5p, hsa-miR-136-5p, hsa-miR-140-3p, hsa-miR-141-3p, hsa-miR-142-3p, hsa-miR-146a-5p, hsa-miR-151a-3p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-191-5p, hsa-miR-19a-3p, hsa-miR-200b-3p, hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-203a, hsa-miR-204-5p, hsa-miR-205-5p, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-223-3p, hsa-miR-22-5p, hsa-miR-23a-3p, hsa-miR-23b-3p, hsa-miR-24-3p, hsa-miR-27b-3p, hsa-miR-29a-3p, hsa-miR-29c-3p , hsa-miR-30a-3p, hsa-miR-30a-5p, hsa-miR-30b-5p, hsa-miR-30c-5p, hsa-miR-30e-5p, hsa-miR-31-3p, hsa-miR-31-5p, hsa-miR-320a, hsa-miR-362-5p, hsa-miR-378a-3p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-93-5pおよびhsa-miR-99a-5pからなるmiRの群から選択される、請求項1に記載のin vitro方法。
  3. 少なくとも2つのmiRが、hsa-miR-141-3p, hsa-miR-142-3p, hsa-miR-146a-5p, hsa-miR-151a-3p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-191-5p, hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-203a, hsa-miR-204-5p, hsa-miR-205-5p, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-223-3p, hsa-miR-24-3p, hsa-miR-30a-5p, hsa-miR-30c-5p, hsa-miR-31-3p, hsa-miR-31-5p, hsa-miR-320a, hsa-miR-93-5pおよびhsa-miR-99a-5pからなるmiRの群から選択される、請求項1または2に記載の方法。
  4. 少なくとも2つのmiRが、hsa-miR-141-3p, hsa-miR-146a-5p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-205-5p, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-24-3p, hsa-miR-30a-5p, hsa-miR-30c-5pおよびhsa-miR-31-5pからなるmiRの群から選択される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
  5. 少なくとも2つのmiRが、hsa-miR-141-3p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-205-5p, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-24-3p, hsa-miR-31-3p, hsa-miR-31-5p, hsa-miR-331-3p, hsa-miR-375およびhsa-miR-378a-3pからなるmiRの群から選択される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
  6. 少なくとも2つのmiRが、hsa-miR-141-3p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-24-3p, hsa-miR-31-3p, hsa-miR-31-5p, hsa-miR-331-3p, hsa-miR-375およびhsa-miR-378a-3pからなるmiRの群から選択される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
  7. 少なくとも2つのmiRが、hsa-miR-141-3p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-24-3p, hsa-miR-31-3p, hsa-miR-31-5p, hsa-miR-331-3pおよびhsa-miR-375からなるmiRの群から選択される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
  8. 少なくとも2つのmiRが、hsa-miR-141-3p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-24-3p, hsa-miR-31-3p, hsa-miR-31-5pおよびhsa-miR-331-3pからなるmiRの群から選択される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
  9. 少なくとも2つのmiRが、hsa-miR-146a-5p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-205-5p, hsa-miR-30c-5pおよびhsa-miR-31-5pからなるmiRの群から選択される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
  10. 少なくとも2つのmiRが、hsa-miR-141-3p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-24-3p, hsa-miR-31-3pおよびhsa-miR-31-5pからなるmiRの群から選択される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
  11. 少なくとも2つのmiRが、hsa-miR-141-3p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-24-3p, hsa-miR-31-3pおよびhsa-miR-31-5pからなるmiRの群から選択される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
  12. 少なくとも2つのmiRが、hsa-miR-141-3p, hsa-miR-24-3p, hsa-miR-31-3pおよびhsa-miR-31-5pからなるmiRの群から選択される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
  13. 少なくとも2つのmiRが、hsa-miR-141-3p, hsa-miR-24-3pおよびhsa-miR-31-5pからなるmiRの群から選択される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
  14. 少なくとも2つのmiRが3、4、5またはそれ以上のmiRである、前記請求項のいずれかに記載の方法。
  15. 少なくとも2つの選択されたmiRが、hsa-miR-30c-5p, hsa-miR-222-3pおよびhsa-miR-24-3pである、前記請求項のいずれかに記載の方法。
  16. 少なくとも2つの選択されたmiRが、hsa-miR-30a-5p, hsa-miR-222-3pおよびhsa-miR-24-3pである、請求項１−１４のいずれかに記載の方法。
  17. 少なくとも2つの選択されたmiRが、hsa-miR-30c-5pおよびhsa-miR-31-5pである、請求項１−１４のいずれかに記載の方法。
  18. 発現レベルが正規化された発現レベルである、前記請求項のいずれかに記載の方法。
  19. 発現レベルは正規化された発現レベルであり、正規化は、hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-30b-5p, hsa-let-7a-5p, hsa-miR-27b-3pおよびhsa-miR-23b-3pという5つのmiRsの平均正規化値を計算することによって行われる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
  20. 発現レベルは正規化された発現レベルであり、正規化はhsa-miR-200b-3p, hsa-miR-27b-3pおよびhsa-miR-30b-5pという3つのmiRsの平均正規化値を計算することによって行われる、請求項１−１８のいずれかに記載の方法。
  21. 前記miRの発現レベルは、前記尿サンプルから調製されたエキソソーム調製物中で測定される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
  22. 前立腺癌のリスクを評価される被験体は、事前の標準的な前立腺特異抗原（PSA）測定による血清PSAレベルが10ng / mL未満であることによって特徴付けられる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
  23. 尿サンプルは、尿を採取する直前に前立腺マッサージを受けた被験体からのものである、前記請求項のいずれかに記載の方法。
  24. 被験体が前立腺癌に罹患しているリスクの評価は、前記試料中の前記少なくとも2つのmiRのレベルを検出し、前記少なくとも2つのmiRの発現レベルデータを含むデータセットに基づく診断スコア（S）を算出することを含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
  25. 前記miRの発現レベルは、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（Q-PCR）の方法によって決定される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
  26. 診断スコアSは、hsa-miR-30c-5pの発現レベル対hsa-miR-31-5pの発現レベルの比として算出される、請求項２４または２５に記載の方法。
  27. 診断スコアSは、hsa-miR-24-3pおよびhsa-miR-222-3pの発現レベル対hsa-miR-30a-5pの発現レベルの比として算出される、請求項２４または２５に記載の方法。
  28. 診断スコアSは、hsa-miR-24-3pおよびhsa-miR-222-3pの発現レベル対hsa-miR-30c-5pの発現レベルの比として算出される、請求項２４または２５に記載の方法。
  29. 診断スコアSが下記式により計算される:
    （式中、「C」は閾値サイクル値（Ct）または交差点値（Cp）であり、XおよびYは線形回帰によって決定される係数である）
    請求項２６に記載の方法。
  30. 診断スコアSが下記式により計算される:
    （式中、「C」は、hsa-miR-24-3p, hsa-miR-222-3pおよびhsa-miR-30a-5pのそれぞれの定量的リアルタイムPCR（qRT-PCR）によって得られた閾値サイクル値（Ct）または交差点値（Cp）である）
    請求項２７に記載の方法。
  31. 診断スコアSが下記式により計算される:
    （式中、「C」は、hsa-miR-24-3p, hsa-miR-222-3pおよびhsa-miR-30c-5pのそれぞれの定量的リアルタイムPCR（qRT-PCR）によって得られた閾値サイクル値（Ct）または交差点値（Cp）である）
    請求項２８に記載の方法。
  32. 診断スコアSが下記式により計算される:
    （式中、X = (X1,…,Xp)は、各個々のサンプルについての正規化値から各個々のサンプルについての生データCq値を減算することによって得られた特定のmicroRNAアッセイのΔCq値であり、β0,…,βpは最尤法により推定された係数である）
    請求項２４または２５に記載の方法。
  33. ΔCq値は、hsa-miR-200b-3p, hsa-miR-27b-3pおよびhsa-miR-30b-5pのmicroRNAアッセイのCq値の平均のCq値に関して正規化された、hsa-miR-141-3p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-24-3p, hsa-miR-31-3p, hsa-miR-31-5pおよびhsa-miR-331-3pに対する特定のマイクロRNAアッセイの値である、請求項３２に記載の方法。
  34. ΔCq値は、hsa-miR-200b-3p, hsa-miR-27b-3pおよびhsa-miR-30b-5pのmicroRNAアッセイのCq値の平均のCq値に関して正規化された、hsa-miR-141-3p, hsa-miR-24-3pおよびhsa-miR-31-5pに対する特定のマイクロRNAアッセイの値である、請求項３２に記載の方法。
  35. 前立腺癌治療を必要とする患者を治療する方法であって、患者が前立腺癌に罹患する確率が増加しているかどうかを判定するために、上記請求項いずれかに記載の診断テストを実行し、この情報に基づいて患者のための適切な治療法を選択することを含む方法。
  36. 被験体が前立腺癌に罹患するリスクをin vitroで評価するためのキットであって、前記験体からの尿サンプルにおいて、hsa-let-7a-5p, hsa-let-7b-5p, hsa-let-7c-5p, hsa-let-7e-5p, hsa-let-7f-5p, hsa-let-7g-5p, hsa-miR-100-5p, hsa-miR-106a-5p, hsa-miR-10a-5p, hsa-miR-10b-5p, hsa-miR-1238-3p, hsa-miR-125b-5p, hsa-miR-1260a, hsa-miR-130a-3p, hsa-miR-132-3p, hsa-miR-135a-5p, hsa-miR-135b-5p, hsa-miR-136-5p, hsa-miR-140-3p, hsa-miR-141-3p, hsa-miR-142-3p, hsa-miR-146a-5p, hsa-miR-148a-3p, hsa-miR-151a-3p, hsa-miR-151a-5p, hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-191-5p, hsa-miR-1972, hsa-miR-19a-3p, hsa-miR-19b-3p, hsa-miR-200a-3p, hsa-miR-200b-3p, hsa-miR-200b-5p, hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-203a, hsa-miR-204-5p, hsa-miR-205-5p, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-210, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-223-3p, hsa-miR-22-5p, hsa-miR-23a-3p, hsa-miR-23b-3p, hsa-miR-24-3p, hsa-miR-25-3p, hsa-miR-26a-5p, hsa-miR-27b-3p, hsa-miR-29a-3p, hsa-miR-29b-3p, hsa-miR-29c-3p, hsa-miR-30a-3p, hsa-miR-30a-5p, hsa-miR-30b-5p, hsa-miR-30c-5p, hsa-miR-30e-5p, hsa-miR-31-3p, hsa-miR-31-5p, hsa-miR-320a, hsa-miR-320b, hsa-miR-320c, hsa-miR-331-3p, hsa-miR-362-3p, hsa-miR-362-5p, hsa-miR-363-3p, hsa-miR-375, hsa-miR-378a-3p, hsa-miR-425-3p, hsa-miR-425-5p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-490-3p, hsa-miR-660-5p, hsa-miR-93-5p, hsa-miR-99a-5pおよびhsa-miR-99b-5pからなるmiRの群から選択される少なくとも2つのmiRの発現レベルの測定に必要な試薬のアリコートを含み、ここで、健康なドナーと比較して前記少なくとも2つのmiRの変化した発現レベルが、前記被験体が前立腺癌に罹患している確率が高いことを示す、キット。
  37. miR群がhsa-miR-141-3p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-24-3p, hsa-miR-31-3p, hsa-miR-31-5pおよびhsa-miR-331-3pからなる、請求項３６に記載のキット。
  38. 少なくとも２つのmiRがhsa-miR-141-3p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-24-3p, hsa-miR-31-3p, hsa-miR-31-5pおよびhsa-miR-331-3pから選択される、請求項３６または３７に記載のキット。
  39. 少なくとも２つのmiRがhsa-miR-30c-5p, hsa-miR-222-3pおよびhsa-miR-24-3pから選択される、請求項３６に記載のキット。
  40. 少なくとも２つのmiRがhsa-miR-30a-5p, hsa-miR-222-3pおよびhsa-miR-24-3pから選択される、請求項３６に記載のキット。
  41. 1つまたはそれ以上の健常コントロール(s)からのmiRNA発現データの少なくとも1つの参照セットをさらに含む、請求項３６−４０のいずれかに記載のキット。
  42. 尿サンプルのエキソソーム調製物を得るために必要な試薬をさらに含む、請求項３６−４１のいずれかに記載のキット。
JP2017541256A 2015-02-11 2016-02-05 尿中の前立腺癌の早期発見のためのｍｉｃｒｏＲＮＡに基づく方法 Pending JP2018504915A (ja)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DKPA201500079 2015-02-11
DKPA201500079 2015-02-11
DKPA201500825 2015-12-21
DKPA201500825 2015-12-21
PCT/DK2016/050032 WO2016127998A1 (en) 2015-02-11 2016-02-05 A microrna-based method for early detection of prostate cancer in urine samples

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2018504915A true JP2018504915A (ja) 2018-02-22
JP2018504915A5 JP2018504915A5 (ja) 2019-02-28

Family

ID=55435920

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2017541256A Pending JP2018504915A (ja) 2015-02-11 2016-02-05 尿中の前立腺癌の早期発見のためのｍｉｃｒｏＲＮＡに基づく方法

Country Status (6)

Country Link
US (1) US10400288B2 (ja)
EP (1) EP3256602B1 (ja)
JP (1) JP2018504915A (ja)
CA (1) CA2976577A1 (ja)
ES (1) ES2749651T3 (ja)
WO (1) WO2016127998A1 (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019220759A1 (ja) * 2018-05-17 2019-11-21 Ｓｔｅｍｃｅｌｌ株式会社 がんの分析方法、がんの分析システム、プログラムおよびコンピュータ読み取り可能な記録媒体
WO2022209943A1 (ja) * 2021-03-29 2022-10-06 東レ株式会社 生体試料中のマイクロｒｎａの検出方法、中性アミノ酸の塩酸塩の組成物および容器

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2977439A1 (en) 2015-02-27 2016-09-01 Exiqon A/S A microrna-based method for assessing the prognosis of a prostate cancer patient
WO2018049506A1 (en) * 2016-09-14 2018-03-22 Ontario Institute For Cancer Research (Oicr) Mirna prostate cancer marker
CN106834470A (zh) * 2017-02-17 2017-06-13 张灏 miRNA在制备癌症诊断试剂盒中的用途
JP7118046B2 (ja) * 2017-03-02 2022-08-15 第一三共株式会社 オピオイド薬の治療有効性を予測するためのｍｉｃｒｏＲＮＡバイオマーカー
CN107488734B (zh) * 2017-10-10 2019-11-05 广州医科大学附属第二医院 miR-19a-3p在制备前列腺癌骨转移诊断试剂和治疗药物中的应用
CN107663541A (zh) * 2017-10-31 2018-02-06 温州医科大学 一种用于诊断原发性肝癌的特异性生物标志物及其筛选方法与应用
CA3096419A1 (en) * 2018-04-10 2019-10-17 Unity Health Toronto Methods for monitoring and treating prostate cancer
CN108424962B (zh) * 2018-05-25 2021-08-03 中国人民解放军陆军军医大学 系膜增生性肾小球肾炎的miRNA检测标志物及其诊断试剂盒
CN109112109A (zh) * 2018-07-27 2019-01-01 浙江大学 一种骨髓间充质干细胞外泌体的改造方法
EP3699300A1 (en) * 2019-02-22 2020-08-26 Institut d'Investigació Biomèdica de Bellvitge (IDIBELL) Seminal mirnas as non-invasive biomarkers for the diagnosis and/or prognosis of prostate cancer
SG11202109835WA (en) 2019-03-15 2021-10-28 Mir Scientific Llc Methods for predicting prostate cancer and uses thereof
EP3719144A1 (en) * 2019-04-05 2020-10-07 Fundación para la Investigación Biomédica del Hospital Universitario de la Paz (FIBHULP) Mir-151a-3p as an universal endogenous control for exosome cargo normalization
JPWO2021049671A1 (ja) * 2019-09-09 2021-03-18
CN111118165B (zh) * 2020-03-04 2023-04-07 朱伟 一种与前列腺癌辅助诊断相关的血清miRNA标志物及其应用
CN112094910B (zh) * 2020-09-25 2023-03-24 无锡市中医医院 一种用于前列腺癌患病风险评估的miRNA标志物
CN112795657A (zh) * 2021-03-22 2021-05-14 中国农业大学 miRNA在制备诊断或辅助诊断哺乳动物前列腺癌症产品中的应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011080315A1 (en) * 2009-12-30 2011-07-07 Febit Holding Gmbh Mirna fingerprint in the diagnosis of prostate cancer
CN103882118A (zh) * 2014-02-13 2014-06-25 绍兴市人民医院 用于检测前列腺癌的miRNAs
US20140235469A1 (en) * 2009-05-22 2014-08-21 Asuragen, Inc. Mirna biomarkers of prostate disease
US20140309130A1 (en) * 2013-04-15 2014-10-16 Norgen Biotek Corporation Use of MicroRNAs for Screening and Diagnosis of Prostate Cancer and Benign Prostatic Hyperplasia
WO2015190584A1 (ja) * 2014-06-12 2015-12-17 東レ株式会社 前立腺がんの検出キット又はデバイス及び検出方法

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2008298744B8 (en) 2007-09-14 2015-01-15 The Ohio State University Research Foundation MiRNA expression in human peripheral blood microvesicles and uses thereof
US8648017B2 (en) 2009-11-04 2014-02-11 Diamir, Llc Methods of using small RNA from bodily fluids for diagnosis and monitoring of neurodegenerative diseases
CA2795776A1 (en) 2010-04-06 2011-10-13 Caris Life Sciences Luxembourg Holdings, S.A.R.L. Circulating biomarkers for disease
ES2925983T3 (es) 2010-07-27 2022-10-20 Genomic Health Inc Método para usar la expresión génica para determinar el pronóstico del cáncer de próstata
EP2771487A1 (en) 2011-10-27 2014-09-03 Asuragen, INC. Mirnas as diagnostic biomarkers to distinguish benign from malignant thyroid tumors
US9944991B2 (en) 2012-11-02 2018-04-17 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Compositions and methods for diagnosis, prognosis and treatment of hematological malignancies
WO2014085906A1 (en) 2012-12-03 2014-06-12 St. Michael's Hospital Microrna biomarkers for prostate cancer
EP3000895A1 (en) 2014-09-26 2016-03-30 Integragen A method for predicting responsiveness to a treatment with an EGFR inhibitor
US10480033B2 (en) * 2015-01-14 2019-11-19 Ohio State Innovation Foundation MiRNA-based predictive models for diagnosis and prognosis of prostate cancer
CA2977439A1 (en) 2015-02-27 2016-09-01 Exiqon A/S A microrna-based method for assessing the prognosis of a prostate cancer patient

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20140235469A1 (en) * 2009-05-22 2014-08-21 Asuragen, Inc. Mirna biomarkers of prostate disease
WO2011080315A1 (en) * 2009-12-30 2011-07-07 Febit Holding Gmbh Mirna fingerprint in the diagnosis of prostate cancer
US20150337393A1 (en) * 2009-12-30 2015-11-26 Comprehensive Biomarker Center Gmbh miRNA FINGERPRINT IN THE DIAGNOSIS OF PROSTATE CANCER
US20140309130A1 (en) * 2013-04-15 2014-10-16 Norgen Biotek Corporation Use of MicroRNAs for Screening and Diagnosis of Prostate Cancer and Benign Prostatic Hyperplasia
CN103882118A (zh) * 2014-02-13 2014-06-25 绍兴市人民医院 用于检测前列腺癌的miRNAs
WO2015190584A1 (ja) * 2014-06-12 2015-12-17 東レ株式会社 前立腺がんの検出キット又はデバイス及び検出方法

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019220759A1 (ja) * 2018-05-17 2019-11-21 Ｓｔｅｍｃｅｌｌ株式会社 がんの分析方法、がんの分析システム、プログラムおよびコンピュータ読み取り可能な記録媒体
JPWO2019220759A1 (ja) * 2018-05-17 2021-07-15 Ｓｔｅｍｃｅｌｌ株式会社 がんの分析方法、がんの分析システム、プログラムおよびコンピュータ読み取り可能な記録媒体
WO2022209943A1 (ja) * 2021-03-29 2022-10-06 東レ株式会社 生体試料中のマイクロｒｎａの検出方法、中性アミノ酸の塩酸塩の組成物および容器

Also Published As

Publication number Publication date
WO2016127998A1 (en) 2016-08-18
ES2749651T3 (es) 2020-03-23
EP3256602B1 (en) 2019-09-04
CA2976577A1 (en) 2016-08-18
EP3256602A1 (en) 2017-12-20
US20180030542A1 (en) 2018-02-01
US10400288B2 (en) 2019-09-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10400288B2 (en) MicroRNA-based method for early detection of prostate cancer in urine samples
Zhi et al. The use of hsa-miR-21, hsa-miR-181b and hsa-miR-106a as prognostic indicators of astrocytoma
Kang et al. Identification of circulating miRNA biomarkers based on global quantitative real-time PCR profiling
Raponi et al. MicroRNA classifiers for predicting prognosis of squamous cell lung cancer
Torres et al. Selection and validation of endogenous controls for microRNA expression studies in endometrioid endometrial cancer tissues
Wu et al. Next‐generation sequencing of microRNAs for breast cancer detection
Augello et al. MicroRNA profiling of hepatocarcinogenesis identifies C19MC cluster as a novel prognostic biomarker in hepatocellular carcinoma
Babapoor et al. Identification of microRNAs associated with invasive and aggressive phenotype in cutaneous melanoma by next-generation sequencing
Saldanha et al. microRNA-10b is a prognostic biomarker for melanoma
EP2281903B1 (en) METHOD FOR EVALUATION OF CANCER BY USING miRNA CANCER MARKER
WO2009143379A2 (en) Use of extracellular rna to measure disease
JP6769979B2 (ja) マイクロｒｎａに基づく前立腺がん患者の予後評価方法
Izquierdo et al. Prognostic value of microRNA expression pattern in upper tract urothelial carcinoma
US20220267863A1 (en) Compositions and methods for determining the prognosis of bladder urothelial cancer
JP2011501964A (ja) 扁平上皮細胞肺癌の予後予測プロセス
MX2010012542A (es) Metodos para evaluar el cancer colorrectal y composiciones para usar en el.
Khoshnevisan et al. A significant upregulation of miR-886-5p in high grade and invasive bladder tumors
WO2017037057A1 (en) Novel mirna biomarkers and use thereof
US20150344961A1 (en) Sera Based miRNAs as Non-Invasive Biomarkers in Melanoma
Yang et al. Expressions of miRNAs in papillary thyroid carcinoma and their associations with the BRAFV600E mutation and clinicopathological features
US20120252871A1 (en) Diagnosis and treatment of chronic lymphocytic leukemia (cll)
WO2010018585A2 (en) Compositions and methods for prognosis of melanoma
Lye et al. Small RNA sequencing and differential expression of miRNAs in colorectal cancer
WO2018130332A1 (en) Mirna&#39;s for prognosing cutaneous t-cell lymphoma
EP3115465A1 (en) Improved biomarker set for salivary gland tumor diagnosis

Legal Events

Date Code Title Description
A529 Written submission of copy of amendment under article 34 pct

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A529

Effective date: 20170804

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20190115

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20190115

A711 Notification of change in applicant

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711

Effective date: 20190708

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821

Effective date: 20190708

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20200128

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20200428

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20200929