WO2022209943A1

WO2022209943A1 - 生体試料中のマイクロｒｎａの検出方法、中性アミノ酸の塩酸塩の組成物および容器

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Publication number: WO2022209943A1
Application number: PCT/JP2022/012206
Authority: WO
Inventors: 古志洋一郎; 若尾摂
Original assignee: 東レ株式会社
Priority date: 2021-03-29
Filing date: 2022-03-17
Publication date: 2022-10-06
Also published as: EP4317454A1

Abstract

マイクロＲＮＡを含む生体試料を採取後、保存の工程を経ると、検出量が低下する。また、結晶である中性アミノ酸の塩酸塩は、水に溶解させるためには比較的時間を要する。中性アミノ酸の塩酸塩は、酸性物質であり、皮膚刺激性および粘膜刺激性を有することから、取扱いにおいては安全面で注意を要する。本発明は、生体試料に酸を混合する工程、所定時間保存する工程、生体試料中のマイクロＲＮＡを回収する工程、検出する工程を含むことを特徴とする、生体試料中のマイクロＲＮＡの検出方法である。また、本発明は、中性アミノ酸の塩酸塩、水およびアルコールからなる、均質な半固体状の組成物を提供する。

Description

生体試料中のマイクロＲＮＡの検出方法、中性アミノ酸の塩酸塩の組成物および容器

　本発明は、生体試料中のマイクロＲＮＡの検出方法に関する。また、本発明は、中性アミノ酸の塩酸塩を含む組成物に関する。

　近年の遺伝子解析技術の発展により、生体試料中のマイクロＲＮＡを検出し、疾患の診断や治療等に役立てようとする試みがなされている。血液等の生体試料中から疾患に関連するマイクロＲＮＡを検出することにより、疾患をより早期に発見できる可能性がある。

　一方、これまでも様々な研究が行われてきた一般的なＲＮＡと比べて、血液等の生体試料に含まれるマイクロＲＮＡは他のＲＮＡと比べて極微量であり、かつ生体試料に含まれるＲＮＡ分解酵素よって容易に分解される。特に癌の診断においてマーカーとするマイクロＲＮＡは、血清や体液中において細胞外に存在するため、一般的な細胞内のＲＮＡと比較すると特にＲＮＡ分解酵素の影響を受けやすい。

　このため、マイクロＲＮＡの検出に使用する生体試料は、通常、生体試料を取得後すぐに検出に使用する。または、生体試料を取得後、冷凍等の方法でマイクロＲＮＡの分解を抑えた状態で保存した上で検出に使用する必要がある。このように、マイクロＲＮＡの検出においては、他のＲＮＡの場合と比べて生体試料の取り扱いに一層の注意を要する。

　産業現場においては生体試料を取得する臨床現場とマイクロＲＮＡの検出を行う検査機関とが離れている場合が多く、生体試料を臨床現場から検査機関まで輸送する数時間から数日間という長期間、生体試料を保存する必要がある。

　マイクロＲＮＡの検出に使用する生体試料は、一般的に、－７０℃以下の超低温で冷凍保存される。しかしながら、生体試料を超低温に保つための冷凍設備および輸送資材は高額であり、マイクロＲＮＡの検出に使用する生体試料を冷凍以外の方法で長期間保存する方法が求められている。

　生体試料中のＲＮＡの分解を抑制する方法としては、冷凍以外に、生体試料にグアニジウム塩を加えてＲＮＡ分解酵素を変性させる方法や、合成小分子阻害剤を混合する方法が知られている。しかし、より効果的で簡便な方法として、ＲＮＡ分解酵素の活性が低下するｐＨ領域に、生体試料のｐＨを調節し、ＲＮＡの分解を抑制する方法が知られている。

　特許文献１には、生体試料のｐＨをＲＮＡ分解酵素の活性が低下する４．０以下に調節することで、ＲＮＡの分解を抑制した後に、ＲＮＡ分解酵素を不活化させ、その後、生体試料のｐＨを６．０より大きく調節し、ＲＮＡを利用する方法が記載されている。

　グリシン塩酸塩を含む中性アミノ酸の塩酸塩は、主に生化学分野において使用される化合物である。特に、抗体と抗原の結合を可逆的に解離させる性質を有することから、例えば、抗体のアフィニティ精製における抗体の溶出や、多重免疫染色における１次抗体の洗浄、赤血球に結合した自己抗体の検査などにおいて使用される。

　また、生化学以外の分野においても使用されており、水に難溶性の物質を可溶化させる性質を有することから、例えば、難溶性の多糖の可溶化にも使用される（非特許文献１）。

特開平８－５０８６３７号公報

Ｊｏｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｐｏｌｙｍｅｒ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　１２３，　３７７２－３７８０　（２０１１）．

　マイクロＲＮＡを用いた疾患の診断や治療を行うためには、ごく微量であり分解されやすいマイクロＲＮＡを、検出量を落とすことなく検出する手法が求められている。本発明はこのようなニーズに応えるものであり、マイクロＲＮＡを含む生体試料から、長時間保存する工程を経た後でも、マイクロＲＮＡの検出量を落とすことなく検出する方法を提供するものである。

　また、グリシン塩酸塩は常温で結晶性の固体である。上記の用途に使用する場合、水溶液の状態で使用されることが多い。グリシン塩酸塩の水溶液は、グリシン塩酸塩の固体（結晶）を水（蒸留水等）に溶解して調製されるが、完全に溶解させるためには、比較的時間を要することから十分な攪拌が必要であった。また、グリシン塩酸塩は酸性物質であり、皮膚刺激性および粘膜刺激性を有することから、固体状態（粉状）での飛散や水溶液状態での飛び跳ねを防ぐ等の必要があるなど、特に移動等の際の取り扱いにおいて安全面で注意を要した。本発明は、上記マイクロＲＮＡの検出方法において簡便かつ安全に使用できる組成物を提供するものである。

　本発明者らは、冷凍以外の方法で長期間保存した生体試料から、保存前と同等のマイクロＲＮＡの検出が可能かを検証するため、まずは冷凍せずに長期間保存した生体試料中のマイクロＲＮＡの検出量を保存前後で比較した。

　疾患の診断や治療を目的とした場合、特定のマイクロＲＮＡの定量値または、それら定量値の組み合わせによって算出した値によって、診断や治療に供することが行われている。この際、例えば、各マイクロＲＮＡの検出量が７０％未満まで減少すると、疾患の判断や治療に著しい支障が生じるが、９０％未満に減少しても支障が生じることがある。ここで、定量するマイクロＲＮＡの組み合わせは、対象の疾患や治療によって異なるため、すべてのマイクロＲＮＡについて蛍光強度が減少しない条件を見出すことは現実的ではない。このため、各々のマイクロＲＮＡについて検出量の変化を測定する代わりに、マイクロアレイにて検出されるすべてのマイクロＲＮＡの蛍光強度の和によって、マイクロアレイに配置されているすべてのマイクロＲＮＡの検出量の変化を推定する方法が知られている。本発明者らは、マイクロアレイ上の全マイクロＲＮＡの蛍光強度の和をマイクロＲＮＡの検出量として用い、生体試料の保存前に対して７０％の検出量を、疾患の判断や治療に供することができる閾値として設定して検討を行った。

　後述する比較例４のとおり、血清を調節した後に２３℃で４８時間保存し、その後、マイクロＲＮＡの検出を行った結果、マイクロＲＮＡの検出量が保存前（比較例５）の２８．９％に減少した。つまり、冷凍せずに長期間保存した生体試料中は、ＲＮＡ分解酵素による分解の結果、保存前と比較してマイクロＲＮＡの検出量が大幅に減少することが判明した。

　本発明者らは、上記課題を克服するために鋭意検討した結果、生体試料に酸を混合した後に、所定時間保存し、その後にマイクロＲＮＡを回収することで、保存前と同等または同等以上のマイクロＲＮＡを検出できることを見出した。

　また、発明者らは、前述のグリシン塩酸塩における溶解速度と安全性の課題を解決するため、より溶解性の高い中性アミノ酸の塩酸塩の組成物を見いだすために鋭意検討を行った結果、中性アミノ酸の塩酸塩、水およびアルコールからなる、均質な半固体状の組成物を見いだし、この組成物が、従来の中性アミノ酸の塩酸塩の固体（結晶）と比べて水溶性が改善された組成物であることを見出した。

　すなわち、本発明は、以下の（１）～（１８）を提供する。
（１）生体試料中のマイクロＲＮＡを検出する方法であって、
（Ａ）生体試料に酸を混合し、生体試料混合液を得る工程、
（Ｂ）工程（Ａ）により得られた生体試料混合液を保存する工程、
（Ｄ）工程（Ｂ）により得られた生体試料混合液からマイクロＲＮＡを回収する工程、
（Ｅ）工程（Ｄ）により回収したマイクロＲＮＡを検出する工程、
を含む、検出方法。
（２）　工程（Ａ）において、得られる生体試料混合液のｐＨが２．０～４．０である、（１）に記載の検出方法。
（３）　工程（Ｄ）の前に、工程（Ｂ）により得られた生体試料混合液に塩基を混合し、ｐＨ６．０～９．０に調節する工程（Ｃ）を含む、（１）または（２）に記載の検出方法。
（４）　工程（Ｃ）において、調節するｐＨが７．５～９．０である、（３）に記載の検出方法。
（５）　前記生体試料が血液、血清または血漿である、（１）～（４）のいずれかに記載の検出方法。に記載の検出方法。
（６）　工程（Ａ）において、用いられる酸が、グリシン塩酸塩、アラニン塩酸塩、クエン酸、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸またはシュウ酸である、（１）～（５）のいずれかに記載の検出方法。
（７）　工程（Ａ）において、用いられる酸が、中性アミノ酸の塩酸塩、水、アルコールからなる均質な組成物であって、２３℃において半固体状の組成物である、（１）～（５）のいずれかに記載の検出方法。
（８）　工程（Ｂ）において、生体試料混合液を保存する時間が９６時間以内である、（１）～（７）のいずれかに記載の検出方法。
（９）　工程（Ｂ）において、生体試料混合液を保存する温度が１～３０℃である、（１）～（８）のいずれかに記載の検出方法。
（１０）　工程（Ｃ）において、用いられる塩基がトリスヒドロキシメチルアミノメタン、Ｎ－［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン、トリエタノールアミン、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）グリシン、Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－Ｎ’－２－エタンスルホン酸または２－ヒドロキシ－３－［トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］－１－プロパンスルホン酸である、（３）または（４）に記載の検出方法。
（１１）　工程（Ｅ）において、マイクロＲＮＡを検出する方法がマイクロアレイ法である、（１）～（１０）のいずれかに記載の検出方法。
（１２）　前記マイクロＲＮＡが疾患マーカーとして用いるマイクロＲＮＡである、（１）～（１１）のいずれかに記載の検出方法。
（１３）　前記疾患が癌または認知症である、（１２）に記載の検出方法。
（１４）　（１）に記載の検出方法の工程（Ａ）で酸として使用する、中性アミノ酸の塩酸塩、水、アルコールからなる均質な組成物であって、２３℃において半固体状である、組成物。
（１５）　前記組成物中の中性アミノ酸の塩酸塩の重量比が６５ｗｔ％以上、７０ｗｔ％以下、アルコールの重量比が２ｗｔ％以上、６ｗｔ％以下である、（１４）に記載の組成物。
（１６）　前記中性アミノ酸の塩酸塩がグリシン塩酸塩またはアラニン塩酸塩である、（１４）または（１５）に記載の組成物。
（１７）　前記アルコールがメタノールまたはエタノールである、（１４）～（１６）のいずれかに記載の組成物。
（１８）　（１４）～（１７）のいずれかに記載の組成物が封入された、生体試料を保存する容器。

　本発明によれば、マイクロＲＮＡを含む生体試料を、採取後、例えば冷凍条件でなく、長時間保存した後であっても、検出量を低下させることなくマイクロＲＮＡを検出することができる。

　また、本発明の組成物は、中性アミノ酸の塩酸塩の固体と比較して、水に速やかに溶解させることができる。また、均質な半固体状の組成物であるため、中性アミノ酸の塩酸塩の固体や水溶液で課題であった、固体状態（粉状）での飛散や水溶液の飛び跳ねによる安全面の懸念がなく、特に移動等の際の取り扱いが容易である。

　本発明は、生体試料中のマイクロＲＮＡ検出方法であって、次の工程を含む。
（Ａ）生体試料に酸を混合し、生体試料混合液を得る工程、
（Ｂ）当該工程（Ａ）により得られた生体試料混合液を所定時間保存する工程、
（Ｄ）当該工程（Ｂ）により得られた生体試料混合液からマイクロＲＮＡを回収する工程、
（Ｅ）当該工程（Ｄ）により回収したマイクロＲＮＡを検出する工程。
以下、上記工程ごとに、本発明を説明する。

　本発明の工程（Ａ）は、酸を混合し、生体試料混合液を得る工程である。好ましくは生体試料のｐＨを２．０～４．０に、さらに好ましくは２．５～４．０に調節することで、生体試料中のＲＮＡ分解酵素の活性が低下し、生体試料中のマイクロＲＮＡの分解が抑制される。生体試料のｐＨを２．０以上に調節すると、マイクロＲＮＡのリン酸ジエステル結合が酸加水分解により切断されることを防げるため好ましい。また生体試料のｐＨを４．０以下に調節すると、生体試料に含まれるＲＮＡ分解酵素の酵素活性を十分に低下させることができるため、好ましい。

　本発明で使用される生体試料は、マイクロＲＮＡを含む生体から得られる試料をいう。具体的には、例えば、血清、血漿、全血、骨髄液、リンパ液、唾液、胆汁、膵液、腹水、体液、分泌物等が挙げられる。その他生体から得られた組織や培養細胞等の培養物であってもよい。

　また、生体試料は、生物から採取されたものであれば特に限定されるものではないが、ヒト由来のものであることが好ましい。本発明で使用される生体試料としては、特にヒト由来の、血液、血清または血漿が好ましく、ヒト由来の血清または血漿がより好ましい。

　生体試料を収集するための方法は、当技術分野において周知である。例えば、熟練した医療専門家などの採血者によって、採血針を使用して血液が吸引取得され、その後遠心分離により血清や血漿が取得され得る。

　生体試料に混合する酸は、当該工程において、生体試料と混合することが可能な酸である。本発明で使用される酸としては、例えば、グリシン塩酸塩、アラニン塩酸塩、クエン酸、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、シュウ酸等が挙げられる。特に、グリシン塩酸塩またはクエン酸が好ましい。また、中性アミノ酸の塩酸塩、水、アルコールからなる均質な組成物であって、２３℃において半固体状の組成物も好ましい。

　生体試料と酸を混合する方法は、特に限定されるものではない。例えば、予め酸を入れておいた容器に、生体試料を投入し、マイクロピペット等を用いて、ピペッティング混合してもよい。または、例えば、予め酸を入れておいた密閉可能な容器に、生体試料を投入し、密閉した後、該容器をボルテックス等の振とう機にかけることにより混合してもよく、または、該容器を上下に転倒させることにより混合してもよい。特に、該容器を上下に転倒させることによる混合方法は、例えば、定期検診等の場合で用いられる健診車等の特殊な装置のない環境においても迅速に混合することができる。

　本発明の工程（Ｂ）は、生体試料混合液を所定時間保存する工程である。当該工程における所定時間とは、酸の混合による生体試料内のマイクロＲＮＡの分解抑制効果を奏し得る時間であり、工程（Ｄ）に至るまでの時間を考慮し適宜決定することができる。

　例えば、工程（Ａ）の後、一時作業を中断し、工程（Ａ）で得られた生体試料混合液を保存し、その後マイクロＲＮＡの回収および検出操作を行う場合、この保存された時間を当該工程の所定時間とすることができる。また、例えば、工程（Ａ）において得られた生体試料混合液を一時保存した後、輸送する場合には、この保存時間と輸送時間との合計時間を当該工程における所定時間とすることができる。

　より具体的には、例えば、定期健診等の場合のように、採血者が生体試料を取得する場所と、マイクロＲＮＡの回収および検出操作を行う場所とが離れており、生体試料混合液が密閉可能な容器に入れられたまま取得する場所で保存され、その後に輸送される場合には、この保存時間と輸送時間を当該工程の所定時間とすることができる。

　具体的には、所定時間は、本発明の効果が得られる時間として、１時間以上が好ましく、特に、実際に運用された場合、採血者が生体試料を取得する場所とマイクロＲＮＡの回収および検出操作を行う場所とが離れている場合を考慮すると、２４時間以上がより好ましく、４８時間以上がさらに好ましい。

　一方で、本発明の効果が得られる時間は、温度や生体試料の種類により変動し得るが、所定時間としてはおおむね９６時間以内が好ましい。

　工程Ｂにおける生体試料混合液の保存は、通常、生体試料の採取や輸送等が行われる温度条件、例えば冷凍条件を必要とせずに行うことができる。具体的には１～３０℃、好ましくは１５～２５℃である。特に、工程（Ｅ）のマイクロＲＮＡの検出において、例えばマイクロアレイ法において７０％以上のマイクロＲＮＡの検出量が得られる保存条件が好ましい。さらに好ましくは、９０％以上のマイクロＲＮＡの検出量が得られる保存条件が良い。

　本工程において、工程（Ｄ）の前に、工程（Ｃ）として、生体試料混合液に塩基を混合しｐＨを調節する工程を加えると好ましい。工程（Ｃ）にて調節するｐＨは、保存前と比較して同等のマイクロＲＮＡを検出できる６．０～９．０であるとよい。好ましいｐＨは、保存前と比較して同等以上のマイクロＲＮＡの検出することができる７．５～９．０であり、さらに好ましくは、７．５～８．５である。生体試料混合液のｐＨを６．０未満または９．０より大きく調節した場合、マイクロＲＮＡの検出量が保存前と比較して低下するおそれがある。

　工程（Ｃ）で混合する塩基は、生体試料混合液と混合することでｐＨを６．０～９．０にすることが可能な塩基である。例えば、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）、Ｎ－［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン（トリシン）、トリエタノールアミン、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）グリシン（ビシン）、４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２－ヒドロキシ－３－［トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］－１－プロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）等が挙げられる。本発明で使用される塩基としては、特に、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンが好ましい。

　生体試料混合液と塩基を混合する方法は、特に限定されるものではない。例えば、予め生体試料混合液を入れておいた容器に、塩基を投入し、マイクロピペット等を用いて、ピペッティング混合してもよい。または、例えば、予め生体試料混合液を入れておいた密閉可能な容器に、塩基を投入し密閉した後、該容器をボルテックス等の振とう機にかけることにより混合してもよく、または、該容器を上下に転倒させることにより混合してもよい。

　本発明の工程（Ｄ）は、マイクロＲＮＡを抽出し回収する工程である。用いる回収方法は、核酸回収に関する技術分野において周知の方法が適用できる。例えば、フェノール・クロロホルム抽出法やカラムクロマトグラフィー法、エタノール沈殿法、磁気ビーズ吸着法等が挙げられる。

　本発明の工程（Ｅ）は、回収したマイクロＲＮＡを検出する工程である。用いる検出方法は、核酸検出に関する技術分野において周知の方法が適用できる。例えば、マイクロアレイ法、ＰＣＲ法、ノーザンブロッティング法、シーケンス解析法等が挙げられる。本発明で用いる方法としては、特に、マイクロアレイ法が好ましい。

　本発明のマイクロＲＮＡの例として、疾患マーカーとして用いるマイクロＲＮＡが挙げられる。本発明は、疾患マーカーとなるマイクロＲＮＡの検体中における発現量の検出値を提供することで、疾患を診断するための情報を提供することができる。本発明の疾患マーカーの例として、癌または認知症のマーカーが挙げられる。

　また、本発明は、中性アミノ酸の塩酸塩と水およびアルコールからなる組成物に関する。

　本発明の組成物は、中性アミノ酸の塩酸塩の固体（結晶）や、中性アミノ酸の塩酸塩の水溶液、中性アミノ酸の塩酸塩の固体が分散した懸濁液とは異なり、２３℃で均質な半固体状であることを特徴とする。

　本発明の工程（Ａ）において用いる酸として、中性アミノ酸の塩酸塩、水、アルコールからなる均質な組成物であって、２３℃において半固体状の組成物は、生体試料混合液に速やかに溶解し、飛散しにくいという利点があるため好ましい
　半固体状とは、力を加えられることによって容易に変形し、力を取り除いた後も変形後の形状を保つ状態を指す。中性アミノ酸の塩酸塩（結晶）は固体であり、力による変形が容易でないため、本定義には当たらない。また、中性アミノ酸の塩酸塩の懸濁液は、変形後の形状を保たないため、本定義には当たらない。

　組成物が半固体状であるかの判断は、力を加えて変形させた後に、変形後の形状を保つかで判断できる。具体的には、組成物を両辺が０．５ｃｍ、高さが１．０ｃｍの立方体状に変形させた後、２３℃にて、１０分間高さが０．８ｃｍ以上を保持できた場合に半固体状であると判断する。

　本発明の組成物は、中性アミノ酸の塩酸塩の固体と比較して、常温で、攪拌等の操作を必要とせず、水に速やかに溶解することを特徴とする。

　組成物が水に速やかに溶解するかの評価は、組成物を水に添加して溶解する様子を観察することにより行うことができる。組成物を封入した容器に組成物の１０倍の重量の蒸留水を添加し、一定時間静置した後に、水中に固体の残留が見られなければ、速やかに溶解したと判断し、水中に固体の残留が見られる場合は、溶解しなかったと判断する。具体的には、０．１ｇの組成物を封入した２ｍＬのＰＰチューブに、蒸留水１ｍＬを添加し、２３℃で１分間静置した後に、水溶液中に固体の残留が見られなければ、速やかに溶解したと判断し、水溶液中に固体の残留が見られる場合は、溶解しなかったと判断する。

　グリシン塩酸塩の固体（結晶）を上記方法で評価した場合、水溶液中に固体の残留が見られたため、溶解しなかったと判断された（比較例１１を参照）。

　本発明の組成物は、中性アミノ酸の塩酸塩、水、アルコールを含み、２３℃において半固体状の組成物である。

　本発明の組成物は、重量比が６５ｗｔ％以上、７０ｗｔ％以下の中性アミノ酸の塩酸塩、重量比が２ｗｔ％以上、６ｗｔ％以下のアルコール、および水を含むことが好ましい。組成物中の中性アミノ酸の塩酸塩およびアルコールの重量比は、組成物を水で希釈した後に、ガスクロマトグラフィーにより分析することで算出することができる。組成物中の水の重量比は、水分気化装置を用いて、加熱により組成物中の水分を気化させたのち、気化した水分量をカールフィッシャー水分計により測定することにより、算出することができる。

　本発明の組成物に用いる中性アミノ酸の塩酸塩は、分子内に含まれる酸性カルボキシ基と塩基性アミノ基が同数であるアミノ酸の塩酸塩を含む。例えば、タンパク質を構成するアミノ酸としては、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン等の塩酸塩が挙げられるが、これらに限定されない。コストおよび入手性の観点から、グリシン塩酸塩またはアラニン塩酸塩が好ましい。

　本発明の組成物に用いるアルコールは、例えば炭素数１～８のアルコールが好ましい。また、本発明のアルコールは、１価アルコール～３価アルコールが好ましい。具体的には、メタノール、エタノール、ｎ－プロパノール、イソプロパノール、ｎ－ブタノール、ｉ－ブタノール、ｔ－ブタノール、３－メチル－１－ブタノール、１－ペンタノール、２－ペンタノール、ｎ－ヘキサノール、シクロヘキサノール、１－ヘプタノール、１－オクタノール、２－オクタノール、２－メトキシエタノール、アリルアルコール、フルフリルアルコール、フェノール等の１価アルコール、エチレングリコール、プロピレングリコール、ブチレングリコール、グリセリン等の多価アルコール等が挙げられるが、コストおよび入手性の観点から、メタノールまたはエタノールが好ましい。

　なお、グリシン塩酸塩および水のみからなる組成物（水溶液）の場合、グリシン塩酸塩の重量比が５０ｗｔ％を超える組成物は、２３℃において、グリシン塩酸塩が水に溶解せず、グリシン塩酸塩の固体が水中に分散した懸濁液となる。また、アラニン塩酸塩および水のみからなる組成物（水溶液）の場合も同様に、アラニン塩酸塩の重量比が５０ｗｔ％を超える組成物は、２３℃において、アラニン塩酸塩が水に溶解せず、アラニン塩酸塩の固体が水中に分散した懸濁液となる。本発明の組成物は、中性アミノ酸の塩酸塩と水に加えて、アルコールを含むものであり、その結果、懸濁液ではなく、均質な半固体状の組成物として得られる。

　本発明の組成物は、水に溶解させることで、所望の濃度の中性アミノ酸の塩酸塩の水溶液を簡便に調製することができる。また、水系の溶媒にも溶解させることができる。水系の溶媒としては、例えば、緩衝液や培地、液状の生体試料などが挙げられる。液状の生体試料としては、例えば、血液、血清、血漿、尿、唾液または涙液などが挙げられる。

　本発明の組成物を溶媒に溶解させる方法は、溶媒に組成物を添加する方法と、組成物を予め封入した容器に溶媒を添加する方法が挙げられる。組成物を予め封入する容器は、特に限定されないが、プラスチックチューブ、ガラスチューブなどが挙げられる。

　このように本発明の組成物をあらかじめ封入した容器は、生体試料を保存する容器とすることができる。このような容器は、開封しても組成物が飛散しにくく、生体試料を添加すると酸性化による安定化が迅速に行えるという利点を持つ。

　溶媒に溶解させる本発明の組成物の量は、目的とする濃度により適宜調節すればよいが、溶媒１００ｍＬに対して、組成物が０．０１ｇ～１０．０ｇが好ましく、０．１ｇ～１．０ｇがより好ましい。

　本発明の組成物の溶液は、酸性を示すことから、本発明の組成物は、従来の中性アミノ酸の塩酸塩と同様に、ｐＨ調節剤として使用することができる。

　本発明の組成物は、例えばグリシン塩酸塩、水およびメタノールまたはエタノールからなる組成物の場合、
工程（１）：グリシン塩酸塩、水およびメタノールまたはエタノールを所定の重量比で混合し、グリシン塩酸塩の懸濁液を得る工程；
工程（２）：（１）で得られた懸濁液を加熱し、グリシン塩酸塩を溶解させる工程；
工程（３）：（２）で得られたグリシン塩酸塩の溶液を冷却し、組成物を得る工程；
により調製することができる。ここで、工程（１）で混合するグリシン塩酸塩の重量比は６５ｗｔ％以上、７０ｗｔ％以下、エタノールまたはメタノールの重量比は２ｗｔ％以上、６ｗｔ％以下、とする。

　上記の方法で調製する場合、工程（１）では、グリシン塩酸塩が溶解せずグリシン塩酸塩の固体が水中に分散した懸濁液の状態となるが、工程（２）で加熱することにより、グリシン塩酸塩を溶解させることで均質な溶液となり、工程（３）で冷却することで、目的とする均質な半固体状の組成物を得る。

　工程（１）で、グリシン塩酸塩、水およびエタノールまたはメタノールを混合する方法は、特に限定されない。例えば、ボルテックスミキサーを用いて２３℃で１分間混合する方法、が挙げられる。

　工程（２）で、懸濁液を加熱する温度は、成分中で沸点の最も低い物質の沸点以下で、かつグリシン塩酸塩を溶解可能な温度であればよい。例えば、エタノール（沸点７８．４℃）を用いる場合は７５℃で、メタノール（沸点６４．７℃）を用いる場合は６０℃で加熱すればよい。加熱する方法は、特に限定されないが、ウォーターバスやブロックインキュベーターを用いればよい。また、加熱時間は、５分以上、３０分以下が好ましい。加熱中は水およびエタノールまたはメタノールの蒸発を防ぐため、密封した状態で加熱することが好ましい。

　工程（２）で、グリシン塩酸塩が溶解したかの判断は目視観察により行うことができる。加熱後に、水溶液中に固体の残留がみられない場合は溶解したと、水溶液中に固体の残留が見られる場合は溶解しなかったと判断する。

　工程（３）で、冷却する方法は、汎用される冷却機器を用いてもよいが、加熱後の水溶液を、加熱した容器のまま、または、別の容器に移して、静置して放冷してもよい。放冷する時間は、１０分間以上、６０分以下が好ましい。放冷後の温度は、２０～２５℃が好ましい。

　グリシン塩酸塩と同様の工程で、アラニン塩酸塩についても、本発明の組成物とすることができる。

　グリシン塩酸塩、アラニン塩酸塩以外の中性アミノ酸の塩酸塩についても、同様の工程で、本発明の組成物とすることができる。

　実施例１　　グリシン塩酸塩を混合後に保存した血清からのマイクロＲＮＡの検出１
　（Ａ）生体試料に酸を混合する工程
　健康被験者Ｘより採血し、血清を調製した。調製直後の血清３００μＬに対して、１Ｍグリシン塩酸塩水溶液（富士フイルム和光純薬工業株式会社）９０μＬを混合した。ハンディ型ｐＨメーター（株式会社堀場製作所）を用いて血清のｐＨを測定した結果、酸の混合により、ｐＨが７．５から２．８に低下したことを確認した。

　（Ｂ）生体試料混合液を所定時間保存する工程
　工程（Ａ）で酸を混合した血清を２３℃下で４８時間静置保存した。

　（Ｃ）生体試料混合液に塩基を混合する工程
　工程（Ｂ）で保存した血清に、４Ｍトリスヒドロキシメチルアミノメタン水溶液（ナカライテスク株式会社）２７μＬを混合した。ハンディ型ｐＨメーターを用いて、塩基の混合によりｐＨが２．８から７．５に上昇したことを確認した。

　（Ｄ）生体試料混合液からマイクロＲＮＡを回収する工程
　工程（Ｃ）で塩基を混合した血清から、３Ｄ－Ｇｅｎｅ（登録商標）ＲＮＡ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｒｅａｇｅｎｔ　ｆｒｏｍ　ｌｉｑｕｉｄ　ｓａｍｐｌｅ　ｋｉｔ（東レ株式会社）のＲＮＡ抽出用試薬を用いて、同社の定めるプロトコールに従ってマイクロＲＮＡを回収した。

　（Ｅ）マイクロＲＮＡを検出する工程
　工程（Ｄ）で血清中から回収したマイクロＲＮＡを３Ｄ－Ｇｅｎｅ（登録商標）ｍｉＲＮＡ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　ｋｉｔ（東レ株式会社）を用いて同社が定めるプロトコールに基づいて蛍光標識した。ＤＮＡマイクロアレイチップとして、２，５６５種のマイクロＲＮＡと相補的な配列を有するプローブを搭載した３Ｄ－Ｇｅｎｅ（登録商標）　Ｈｕｍａｎ　ｍｉＲＮＡ　Ｏｌｉｇｏ　ｃｈｉｐ（東レ株式会社）を用い、同社が定めるプロトコールに基づいてハイブリダイゼーションを行った。ＤＮＡマイクロアレイチップを３Ｄ－Ｇｅｎｅ（登録商標）スキャナー（東レ株式会社）を用いてスキャンし、画像を取得した。３Ｄ－Ｇｅｎｅ（登録商標）Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ（東レ株式会社）を用いて蛍光強度を数値化し、検出限界を超えて検出されたマイクロＲＮＡの蛍光強度の合計値を算出し、マイクロＲＮＡの検出量とした。表１にマイクロＲＮＡの検出量を示す。

　実施例２～５　　グリシン塩酸塩を混合後に保存した血清からのマイクロＲＮＡの検出２
　塩基混合時に、
実施例２では４Ｍトリスヒドロキシメチルアミノメタン水溶液３０μＬを混合することでｐＨを７．７に、
実施例３では４Ｍトリスヒドロキシメチルアミノメタン水溶液３６μＬを混合することでｐＨを８．０に、
実施例４では４Ｍトリスヒドロキシメチルアミノメタン水溶液６０μＬを混合することでｐＨを８．５に、
実施例５では４Ｍトリスヒドロキシメチルアミノメタン水溶液１２０μＬを混合することでｐＨを９．０に、
それぞれ調節したこと以外は、実施例１と同様の方法で実施した。表１に実施例２～５のそれぞれのマイクロＲＮＡの検出量を示す。

　実施例６、７　　グリシン塩酸塩を混合後に保存した血清からのマイクロＲＮＡの検出３
　塩基混合時に、
実施例６では４Ｍトリスヒドロキシメチルアミノメタン水溶液２１μＬを混合することでｐＨを６．０に、
実施例７では４Ｍトリスヒドロキシメチルアミノメタン水溶液２２．５μＬを混合することでｐＨを７．０に、
それぞれ調節したこと以外は、実施例１と同様の方法で実施した。表１に実施例６，７のそれぞれのマイクロＲＮＡの検出量を示す。

　実施例８　　グリシン塩酸塩を混合後に保存した血清からの、塩基を混合せずに行ったマイクロＲＮＡの検出
　実施例８では、塩基を混合しなかったこと以外は、実施例１と同様の方法で実施した。表１に実施例８のマイクロＲＮＡの検出量を示す。

　比較例１　　酸を混合せずに保存した血清から、塩基を混合せずに行ったマイクロＲＮＡの検出
　比較例１では、酸および塩基を混合しなかったこと以外は、実施例１と同様の方法で実施した。表１および表２に比較例１のマイクロＲＮＡの検出量を示す。

　比較例２　　調製直後の血清からのマイクロＲＮＡの検出１
　健康被験者Ｘより採取した血清３００μＬから、実施例１工程（Ａ）～（Ｃ）を行うことなく、実施例１工程（Ｄ）と同様の方法でマイクロＲＮＡを回収し、回収したマイクロＲＮＡ検出を、実施例１工程（Ｅ）と同様に行った。表１および表２にマイクロＲＮＡの検出量を示す。

　血清に酸を混合しｐＨ２．８に調節した後に、２３℃下で４８時間保存し、その後、塩基を混合しｐＨ７．５～８．５に調節した場合（実施例１～４）は、調製直後の血清を用いた場合（比較例２）と比較して、同等以上（１００％以上）のマイクロＲＮＡが検出された。塩基を混合し、ｐＨ９．０に調節した場合（実施例５）でも、調整直後の血清を用いた場合（比較例２）と比較して、９０％以上のマイクロＲＮＡが検出された。また、塩基を混合しｐＨ６．０および７．０に調節した場合（実施例６，７）でも、調製直後の血清を用いた場合（比較例２）と比較して、同等（７０％以上）のマイクロＲＮＡが検出された。さらに、塩基を混合しなかった場合（実施例８）でも、調製直後の血清を用いた場合（比較例２）と比較して、同等（７０％以上）のマイクロＲＮＡが検出された。

　一方、血清に酸を混合することなく、２３℃下で４８時間保存した場合（比較例１）は、調製直後の血清を用いた場合（比較例２）と比較して、マイクロＲＮＡの検出量が３０％未満に低下した。これは、酸を混合しなかったことから、保存中にマイクロＲＮＡが分解された結果と考えられる。

　以上の結果より、酸を混合した後に血清を保存することが、マイクロＲＮＡの検出に重要であり、特に保存後に塩基を混合してｐＨを７．５～９．０に調節することが、マイクロＲＮＡの検出に重要であることが明らかになった。

　実施例９　　グリシン塩酸塩を混合後に保存した血清からのマイクロＲＮＡの検出４
　酸混合時に、１Ｍグリシン塩酸塩水溶液４５μＬを混合することでｐＨを４．０に、調節したこと、塩基混合時に４Ｍトリスヒドロキシメチルアミノメタン水溶液１０μＬを混合し、ｐＨ７．７に調節したこと以外は、実施例１と同様の方法で実施した。表２にマイクロＲＮＡの検出量を示す。

　比較例３　　酸を混合せずに保存した血清からのマイクロＲＮＡの検出
　比較例３では、酸を混合しなかったこと、塩基混合時に４Ｍトリスヒドロキシメチルアミノメタン水溶液０．７５μＬを混合することでｐＨを７．７に調節したこと以外は、実施例１と同様の方法で実施した。表２にマイクロＲＮＡの検出量を示す。

　血清に酸を混合しｐＨ４．０に調節した後に、２３℃下で４８時間保存し、その後、塩基を混合しｐＨ７．７に調節した場合（実施例９）は、調製直後の血清を用いた場合（比較例２）と比較して、同等以上（９０％以上）のマイクロＲＮＡが検出された。

　一方、血清に酸を混合することなく、２３℃下で４８時間保存した後に、塩基を混合しｐＨ７．７に調節した場合（比較例３）および塩基を混合しなかった場合（比較例１）は、調製直後の血清を用いた場合（比較例２）と比較して、マイクロＲＮＡの検出量が３０％未満に低下した。これは、酸を混合しなかったことから、保存中にマイクロＲＮＡが分解された結果と考えられる。

　以上の結果より、保存前に血清に酸を混合し、ｐＨ４．０以下に調節することが、マイクロＲＮＡの検出に重要であることが明らかとなった。

　実施例１０～１２　　グリシン塩酸塩を混合後に保存した血清からのマイクロＲＮＡの検出５
　生体試料混合液の保存時間を、
実施例１０では２時間と、
実施例１１では６時間と、
実施例１２では９６時間と、
したことと、実施例１０～１２において、塩基混合時に、４Ｍトリスヒドロキシメチルアミノメタン水溶液３０μＬを混合することでｐＨを７．７に調節したこと以外は、実施例１と同様の方法で実施した。表３に実施例１０～１２のそれぞれのマイクロＲＮＡの検出量を示す。

　血清に酸を混合しｐＨ２．８に調節した後に、２３℃下で２，６および９６時間保存し、その後、塩基を混合しｐＨ７．７に調節した場合（実施例１０～１２）、調製直後の血清を用いた場合（比較例２）と比較して、同等以上（１００％以上）のマイクロＲＮＡが検出された。

　以上より、本手法を用いることで、２３℃下で少なくとも２～９６時間保存した血清からマイクロＲＮＡ検出できることが明らかとなった。

　実施例１３　　クエン酸を混合後に保存した血清からのマイクロＲＮＡの検出１
　健康被験者Ｙより採取した血清を用いたこと、酸混合時に、１Ｍクエン酸水溶液（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｏ．ＬＬＣ．）９０μＬを混合することでｐＨを３．１に調節したこと、塩基混合時に、４Ｍトリスヒドロキシメチルアミノメタン水溶液９０μＬを混合することでｐＨ７．８に調節したこと以外は、実施例１と同様の方法で実施した。表４にマイクロＲＮＡの検出量を示す。

　実施例１４、１５　　クエン酸を混合後に保存した血清からのマイクロＲＮＡの検出２
　塩基混合時に、
実施例１４では、４Ｍトリスヒドロキシメチルアミノメタン水溶液６３μＬを混合し、ｐＨ６．０に調節したこと、
実施例１５では、４Ｍトリスヒドロキシメチルアミノメタン水溶液６７．５μＬを混合し、ｐＨ７．０に調節したこと、
以外は、実施例１３と同様の方法で実施した。表４にマイクロＲＮＡの検出量を示す。

　実施例１６　　クエン酸を混合後に保存した血清からの、塩基を混合せずに行ったマイクロＲＮＡの検出
　塩基を混合しなかったこと以外は、実施例１３と同様の方法で実施した。表４にマイクロＲＮＡの検出量を示す。

　比較例４　　調製直後の血清からのマイクロＲＮＡの検出２
　健康被験者Ｙより採取した血清３００μＬから、実施例１工程（Ａ）～（Ｃ）を行うことなく、実施例１工程（Ｄ）と同様の方法でマイクロＲＮＡを回収し、回収したマイクロＲＮＡ検出を、実施例１工程（Ｅ）と同様に行った。表４にマイクロＲＮＡの検出量を示す。

　血清にクエン酸を混合した後に、２３℃下で４８時間保存し、その後、塩基を混合しｐＨ７．８に調節した場合（実施例１３）は、調製直後の血清を用いた場合（比較例４）と比較して、同等以上（１００％以上）のマイクロＲＮＡが検出された。また、保存後に、塩基を混合しｐＨ６．０または７．０に調節した場合（実施例１４、１５）および塩基を混合しなかった場合（実施例１６）でも、調製直後の血清を用いた場合（比較例４）と比較して、同等（７０％以上）のマイクロＲＮＡが検出された。

　以上の結果より、血清に混合する酸は、種類によらず、グリシン塩酸塩でも、クエン酸でも効果が得られることが明らかとなった。

　実施例１７　　グリシン塩酸塩を混合後に保存した血清からのマイクロＲＮＡの検出６
　健康被験者Ｚより採取した血清を用いたこと、酸混合時に、１Ｍグリシン塩酸塩水溶液１８０μＬを混合することでｐＨを２．０に、調節したこと、塩基混合時に４Ｍトリスヒドロキシメチルアミノメタン水溶液６０μＬを混合し、ｐＨ７．７に調節したこと以外は、実施例１と同様の方法で実施した。表５にマイクロＲＮＡの検出量を示す。

　比較例５　　調製直後の血清からのマイクロＲＮＡの検出３
　健康被験者Ｚより採取した血清３００μＬから、実施例１工程（Ａ）および工程（Ｂ）を行うことなく、実施例１工程（Ｄ）と同様の方法でマイクロＲＮＡを回収し、回収したマイクロＲＮＡ検出を、実施例１工程（Ｅ）と同様に行った。表５および表６にマイクロＲＮＡの検出量を示す。

　血清に酸を混合しｐＨ２．０に調節した後に、２３℃下で４８時間保存し、その後、塩基を混合しｐＨ７．７に調節した場合（実施例１７）は、調製直後の血清を用いた場合（比較例５）と比較して、同等以上（１００％以上）のマイクロＲＮＡが検出された。

　以上の結果より、保存前に血清に酸を混合し、少なくともｐＨ２．０～４．０に調節することが、マイクロＲＮＡの検出に重要であることが明らかとなった。
実施例１８　グリシン塩酸塩を混合後に保存した血清からのマイクロＲＮＡの検出７
　健康被験者Ｚより採取した血清を用いたこと、酸混合時に、後述の実施例１９に記載の組成物２を混合することでｐＨを２．８に調節したこと、塩基混合時に４Ｍトリスヒドロキシメチルアミノメタン水溶液３０μＬを混合し、ｐＨ７．７に調節したこと以外は、実施例１と同様の方法で実施した。表６にマイクロＲＮＡの検出量を示す。

　血清に中性アミノ酸の塩酸塩、水、アルコールからなる均質な２３℃において半固体状の組成物２を混合しｐＨ２．８に調節した後に、２３℃下で４８時間保存し、その後、塩基を混合しｐＨ７．７に調節した場合（実施例１８）は、調製直後の血清を用いた場合（比較例４）と比較して、同等以上（１００％以上）のマイクロＲＮＡが検出された。

　以上の結果より、保存前に血清に混合する酸は、中性アミノ酸の塩酸塩、水、アルコールからなる均質な組成物であって２３℃において半固体状である組成物であっても効果が得られることが明らかとなった。

　実施例１９
　グリシン塩酸塩、水およびエタノールからなる組成物（組成物１～６）
　（１）組成物の調製
　２ｍＬのＰＰチューブに、総量が１．０ｇとなるように、グリシン塩酸塩（富士フィルム和光純薬工業株式会社）６５０ｍｇ（６５．０ｗｔ％）、エタノール（富士フィルム和光純薬工業株式会社）２０ｍｇ（２．０ｗｔ％）および蒸留水３３０ｍｇ（３３．０ｗｔ％）を添加し、ボルテックスミキサーを用いて２３℃で１分間混合し懸濁液を得た。懸濁液の入ったチューブを、ブロックインキュベーターを用いて７５℃で１０分間加熱した。加熱後にグリシン塩酸塩の溶解状態を目視観察で評価した結果、水溶液中に固体の残留が見られず、グリシン塩酸塩が溶解したことを確認した。チューブをブロックインキュベーターから取り出し後、２３℃で３０分間静置し、組成物１を得た。

　上記と同様の操作で、総量が１．０ｇとなるように、表７に記載された重量比のグリシン塩酸塩、エタノールおよび蒸留水を用いて、組成物２～６を調製した。

　組成物２～６の調製工程において、加熱後にグリシン塩酸塩が溶解したことを目視観察で確認した。

　（２）形状の評価
　（１）で得られた組成物１を、プラスチックシャーレ上で、スパーテルを用いて、両辺が０．５ｃｍ、高さ１．０ｃｍの立方状に変形し、変形後に２３℃にて１０分間静置後に高さを測定した結果、高さが０．８ｃｍ以上であり、変形後の形状を保っていたことから、組成物１は半固体状と判断した。

　上記と同様の方法で組成物２～６の状態を評価した結果、いずれの組成物も、変形後の形状を保っていたことから、組成物１は半固体状と判断した。

　（３）溶解性の評価
　（１）で得られた組成物１の溶解性を評価した。０．１ｇの組成物１が入った２ｍＬのＰＰチューブに蒸留水１ｍＬを添加し、２３℃で１分間静置後に溶解状態を目視観察で評価した結果、水溶液中に固体の残留が見られなかったことから、速やかに溶解したと判断した。

　上記と同様の方法で組成物２～６の溶解性を評価した結果、水溶液中に固体の残留が見られなかったことから、速やかに溶解したと判断した。

　比較例６
　グリシン塩酸塩、水およびエタノールからなる組成物（組成物７～２０）
　（１）組成物の調製
　実施例１９（１）と同様の操作で、表７に記載された重量比のグリシン塩酸塩、エタノールおよび蒸留水を用いて、組成物７～２０を調製した。

　組成物７～１５の調製工程において、加熱後にグリシン塩酸塩が溶解したことを目視観察で確認した。一方、組成物１６～２０の調製工程において、加熱後も水溶液中に固体の残留が見られことから、グリシン塩酸塩の一部が溶解しなかったと判断し、以降の評価を実施しなかった。

　（２）形状の評価
　実施例１９（２）と同様の方法で、（１）で得られた組成物７～１５の状態を評価した結果、いずれもの組成物も、変形後の形状を保たず、目視観察でも溶液中に固体が分散した様子が確認されたことから、半固体状ではなく、懸濁液と判断した。

　（３）溶解性の評価
　実施例１９（３）と同様の方法で、（１）で得られた組成物７～１５の溶解性を評価した結果、水溶液中に固体の析出が見られたことから、溶解しなかったと判断した。

　実施例１９および比較例６で得られた結果を表７に示す。

　実施例１９の組成物１～６は、半固体状で、蒸留水に速やかに溶解した。一方、比較例１１の組成物７～１５は、析出したグリシン塩酸塩の固体が水溶液中に分散した懸濁液の状態であり、さらに蒸留水を加えても速やかに溶解しなかった。また、比較例６の組成物１６～２０は、加熱してもグリシン塩酸塩が溶解しなかった。

　以上の結果から、組成物中のグリシン塩酸塩の重量比が６５ｗｔ％以上、７０ｗｔ％以下であり、エタノールの重量比が２ｗｔ％以上、６ｗｔ％以下の場合に、半固体状で、水に速やかに溶解する目的の組成物が得られることが明らかとなった。

　実施例２０
　グリシン塩酸塩、水およびメタノールからなる組成物（組成物２１～２６）
　（１）組成物の調製
　実施例１９（１）において、エタノールをメタノール（富士フイルム和光純薬）に、加熱温度を７５℃から６０℃にそれぞれ変更し、表８に記載された重量のグリシン塩酸塩、メタノールおよび蒸留水を用いて、組成物２１～２６を調製した。

　組成物２１～２６の調製工程において、加熱後にグリシン塩酸塩が溶解したことを目視観察で確認した。

　（２）形状の評価
　実施例１９（２）と同様の方法で、（１）で得られた組成物２１～２６の状態を評価した結果、いずれの組成物も、変形後の形状を保っていたことから、半固体状と判断した。

　（３）溶解性の評価
　実施例１９（３）と同様の方法で、（１）で得られた組成物２１～２６の溶解性を評価した結果、水溶液中に固体の析出が見られなかったことから、溶解したと判断した。

　比較例７
　グリシン塩酸塩、水およびメタノールからなる組成物（組成物２７～４０）
　（１）組成物の調製
　実施例２０（１）と同様の操作で、表８に記載された重量のグリシン塩酸塩、メタノールおよび蒸留水を用いて、組成物２７～４０を調製した。

　組成物２７～３５の調製工程において、加熱後にグリシン塩酸塩が溶解したことを目視観察で確認した。一方、組成物３６～４０の調製工程において、加熱後も水溶液中に固体の残留が見られことから、グリシン塩酸塩が溶解しなかったと判断し、以降の操作を実施しなかった。

　（２）形状の評価
　実施例１９（２）と同様の方法で、（１）で得られた組成物２７～３５の状態を評価した結果、いずれもの組成物も、変形後の形状を保たず、目視観察でも溶液中に固体が分散した様子が確認されたことから、半固体状ではなく、懸濁液と判断した。

　（３）溶解性の評価
　実施例１９（３）と同様の方法で、（１）で得られた組成物２７～３５の溶解性を評価した結果、水溶液中に固体の析出が見られたことから、溶解しなかったと判断した。

　実施例２０および比較例７で得られた結果を表８に示す。

　実施例２０の組成物２１～２６は、半固体状で、蒸留水に速やかに溶解した。一方、比較例７の組成物２７～３５は、析出したグリシン塩酸塩の固体が水溶液中に分散した懸濁液の状態であり、さらに蒸留水を加えても速やかに溶解しなかった。また、比較例７の組成物３６～４０は、加熱してもグリシン塩酸塩が溶解しなかった。

　以上の結果から、エタノールの場合と同様に、メタノールの場合も組成物中のグリシン塩酸塩の重量比が６５ｗｔ％以上、７０ｗｔ％以下であり、メタノールの重量比が２ｗｔ％以上、６ｗｔ％以下の場合に、半固体状で、水に速やかに溶解する目的の組成物が得られることが明らかとなった。

　比較例８
　グリシン塩酸塩、水およびアセトンからなる組成物（組成物４１～５２）の調製と評価
　（１）組成物の調製
　実施例１９（１）において、エタノールをアセトン（富士フイルム和光純薬）に、加熱温度を７５℃から６０℃にそれぞれ変更し、表９に記載された重量のグリシン塩酸塩、アセトンおよび蒸留水を用いて、組成物４１～５２を調製した。

　組成物４１～４９の調製工程において、加熱後にグリシン塩酸塩が溶解したことを目視観察で確認した。一方、組成物５０～５２の調製工程においては、加熱後も水溶液中に固体の残留が見られことから、グリシン塩酸塩が溶解しなかったと判断し、以降の操作を実施しなかった。

　（２）形状の評価
　実施例１９（２）と同様の方法で、（１）で得られた組成物４１～４９の状態を評価した結果、いずれもの組成物も、変形後の形状を保たず、目視観察でも溶液中に固体が分散した様子が確認されたことから、半固体状ではなく、懸濁液と判断した。

　（３）溶解性の評価
　実施例１９（３）と同様の方法で、（１）で得られた組成物４１～４９の溶解性を評価した結果、水溶液中に固体の析出が見られたことから、溶解しなかったと判断した。

　比較例８で得られた結果を表９に示す。

　エタノールまたはメタノールの代わりにアセトンを使用した場合、得られた組成物はグリシン塩酸塩の固体が水溶液中に分散した懸濁液の形態であり、本発明の目的とする組成物は得られなかった。

　比較例９
　グリシン塩酸塩、水およびアセトニトリルからなる組成物（組成物５３～６４）
　（１）組成物の調製
　実施例１９（１）において、エタノールをアセトニトリル（富士フイルム和光純薬）に変更し、表１０に記載された重量のグリシン塩酸塩、アセトニトリルおよび蒸留水を用いて、組成物５３～６４を調製した。

　組成物５３～６１の調製過程において、加熱後にグリシン塩酸塩が溶解したことを目視観察で確認した。一方、組成物６２～６４の調製過程において、加熱後も水溶液中に固体の残留が見られことから、グリシン塩酸塩が溶解しなかったと判断し、以降の操作を実施しなかった。

　（２）形状の評価
　実施例１９（２）と同様の方法で、（１）で得られた組成物５３～６１の状態を評価した結果、いずれもの組成物も、変形後の形状を保たず、目視観察でも溶液中に固体が分散した様子が確認されたことから、半固体状ではなく、懸濁液と判断した。

　（３）溶解性の評価
　実施例１９（３）と同様の方法で、（１）で得られた組成物５３～６１の溶解性を評価した結果、水溶液中に固体の析出が見られたことから、溶解しなかったと判断した。

　比較例９で得られた結果を表１０に示す。

　アセトニトリルを使用した場合、得られた組成物はグリシン塩酸塩の固体が水溶液中に分散した懸濁液の形態であり、本発明の目的とする組成物は得られなかった。

　比較例１０
　グリシン塩酸塩および水からなる組成物（組成物６５～６８）
　（１）組成物の調製
　実施例１９（１）において、エタノールを使用しない方法に変更し、表１１に記載された重量比のグリシン塩酸塩および蒸留水を用いて、組成物６５～６８を調製した。

　組成物６５～６７の調製過程において、加熱後にグリシン塩酸塩が溶解したことを目視観察で確認した。一方、組成物６８の調製過程において、加熱後も水溶液中に固体の残留が見られことから、グリシン塩酸塩が溶解しなかったと判断し、以降の操作を実施しなかった。

　（２）形状の評価
　実施例１９（２）と同様の方法で、（１）で得られた組成物６５～６７の状態を評価した結果、いずれもの組成物も、変形後の形状を保たず、目視観察でも溶液中に固体が分散した様子が確認されたことから、半固体状ではなく、懸濁液と判断した。

　（３）溶解性の評価
　実施例１９（３）と同様の方法で、（１）で得られた組成物６５～６７の溶解性を評価した結果、水溶液中に固体の析出が見られたことから、溶解しなかったと判断した。

　比較例１０で得られた結果を表１１に示す。

　グリシン塩酸塩および水のみでは、得られた組成物はグリシン塩酸塩の固体が水溶液中に分散した懸濁液の形態であり、本発明の目的とする組成物は得られなかった。

　以上、比較例８～１０で得られた結果より、本発明の目的とする、半固体状で、水に速やかに溶解する組成物は、グリシン塩酸塩および水に加えて、エタノールまたはメタノールが必要であることが明らかとなった。

　比較例１１
　グリシン塩酸塩の固体の溶解性の評価
　０．１ｇのグリシン塩酸塩が入った２ｍＬのＰＰチューブに蒸留水１ｍＬを添加し、２３℃で１分間静置後に溶解状態を目視観察で評価した結果、水溶液中に固体の残留が見られたことから、溶解しなかったと判断した。

　実施例２１
　グリシン塩酸塩、水およびエタノールからなる組成物（組成物１～６）を用いた血清のｐＨ調節
　実施例１９（１）で調製した、０．１ｇの組成物１を封入した２ｍＬＰＰチューブに、ヒト健常者より採血し、調整した血清１ｍＬを添加し、２３℃で１分間静置後に、溶解状態を目視観察で評価した結果、血清中固体はみられず、各組成物が速やかに溶解したと判断した。チューブ内の血清の上層より０．１ｍＬを回収し、ハンディ型ｐＨメーター（株式会社堀場製作所）を用いてｐＨを測定した結果、ｐＨは２．７であり、添加前の血清のｐＨ（７．７）と比較して大きく低下した。

　上記と同様の方法で、０．１ｇの組成物２～６を封入したチューブに、血清１ｍＬを添加し溶解状態を目視で評価した結果、血清中に固体はみられず、組成物２～６が速やかに溶解したと判断した。静置後のｐＨ測定した結果、組成物２および３を封入したチューブではｐＨは２．７、組成物４～６を封入したチューブではｐＨは２．６であり、添加前の血清のｐＨ７．７）と比較して大きく低下した。

　比較例１２
　グリシン塩酸塩の固体を用いた血清のｐＨ調節
　実施例２１と同様の方法で、６５ｍｇのグリシン塩酸塩の固体（結晶）を封入した２ｍＬＰＰチューブに、血清１ｍＬを添加し溶解状態を目視で評価した結果、血清中に固体がみられ、グリシン塩酸塩の固体は速やかに溶解しなかったと判断した。静置後、血清のｐＨを測定した結果、ｐＨは４．５であり、組成物１～６を添加した実施例２１の場合と比較して、その低下幅は小さかった。

　実施例２１および比較例１２の結果を表１２に示す。

　グリシン塩酸塩、水およびエタノールからなる組成物（組成物１～６）は血清に速やかに溶解し、血清のｐＨを低下させた。一方、グリシン塩酸塩の固体は、静置のみでは、血清に速やかに溶解せず、血清のｐＨを十分に低下させることができなかった。

　以上より、本発明の組成物がｐＨを調節剤としても使用できることが明らかとなった。
実施例２２
　アラニン塩酸塩、水およびエタノールからなる組成物（組成物６９、７０）
　実施例１９（１）において、グリシン塩酸塩をアラニン塩酸塩（シグマ社）に変更し、表１３に記載された重量のアラニン塩酸塩、エタノールおよび蒸留水を用いて、組成物６９および７０を調製した。

　組成物６９および７０の調製工程において、加熱後にアラニン塩酸塩が溶解したことを目視観察で確認した。

　（２）形状の評価
　実施例１９（２）と同様の方法で、（１）で得られた組成物６９および７０の状態を評価した結果、いずれの組成物も、変形後の形状を保っていたことから、半固体状と判断した。

　（３）溶解性の評価
　実施例１９（３）と同様の方法で、（１）で得られた組成物６９および７０の溶解性を評価した結果、水溶液中に固体の析出が見られなかったことから、溶解したと判断した。

　比較例１３
　アラニン塩酸塩、水およびエタノールからなる組成物（組成物７１～８０）
　（１）組成物の調製
　実施例２０（１）と同様の操作で、表１３に記載された重量のアラニン塩酸塩、エタノールおよび蒸留水を用いて、組成物７１～８０を調製した。

　組成物７１～７７の調製工程において、加熱後にアラニン塩酸塩が溶解したことを目視観察で確認した。一方、組成物７８～８０の調製工程において、加熱後も水溶液中に固体の残留が見られことから、アラニン塩酸塩が溶解しなかったと判断し、以降の操作を実施しなかった。

　（２）形状の評価
　実施例１９（２）と同様の方法で、（１）で得られた組成物７１～７７の状態を評価した結果、いずれもの組成物も、変形後の形状を保たず、目視観察でも溶液中に固体が分散した様子が確認されたことから、半固体状ではなく、懸濁液と判断した。

　（３）溶解性の評価
　実施例１９（３）と同様の方法で、（１）で得られた組成物７１～７７の溶解性を評価した結果、水溶液中に固体の析出が見られたことから、溶解しなかったと判断した。

　実施例２２および比較例１３で得られた結果を表１３に示す。

　アラニン塩酸塩を用いた実施例２２の組成物６９および７０は、半固体状で、蒸留水に速やかに溶解した。一方、比較例１３の組成物７１～７７は、析出したアラニン塩酸塩の固体が水溶液中に分散した懸濁液の状態であり、さらに蒸留水を加えても速やかに溶解しなかった。また、比較例１３の組成物７８～８０は、加熱してもアラニン塩酸塩が溶解しなかった。

　以上の結果から、グリシン塩酸塩の場合と同様に、アラニン塩酸塩の場合も組成物中のアラニン塩酸塩の重量比が６５ｗｔ％以上、７０ｗｔ％以下であり、エタノールの重量比が５ｗｔ％の場合に、半固体状で、水に速やかに溶解する目的の組成物が得られることが明らかとなった。

　比較例１４
　グルタミン酸塩酸塩、水およびエタノールからなる組成物（組成物８１～９２）
　（１）組成物の調製
　実施例１９（１）において、グリシン塩酸塩をグルタミン酸塩酸塩（富士フイルム和光純薬）に変更し、表１４に記載された重量のグルタミン酸塩酸塩、エタノールおよび蒸留水を用いて、組成物８１～９２を調製した。

　組成物８１～８６の調製過程において、加熱後にグルタミン酸塩酸塩が溶解したことを目視観察で確認した。一方、組成物８７～９２の調製過程において、加熱後も水溶液中に固体の残留が見られことから、グルタミン酸塩酸塩が溶解しなかったと判断し、以降の操作を実施しなかった。

　（２）形状の評価
　実施例１９（２）と同様の方法で、（１）で得られた組成物８１～８６の状態を評価した結果、いずれもの組成物も、変形後の形状を保たず、目視観察でも溶液中に固体が観察されなかったことから、半固体状ではなく、グルタミン酸塩酸塩が完全に溶解した溶液と判断した。グルタミン酸塩酸塩が溶解していることから、実施例１９の（３）に示すような溶解性の評価は実施しなかった。

　比較例１４で得られた結果を表１４に示す。

　グルタミン酸塩酸塩を使用した場合、得られた組成物はグルタミン酸塩酸塩が完全に溶解した溶液の形態であり、本発明の目的とする組成物は得られなかった。

　比較例１５
　リジン・１塩酸塩、水およびエタノールからなる組成物（組成物９３～１０４）
　（１）組成物の調製
　実施例１９（１）において、グリシン塩酸塩をリジン・１塩酸塩（富士フイルム和光純薬）に変更し、表１５に記載された重量のリジン・１塩酸塩、エタノールおよび蒸留水を用いて、組成物９３～１０４を調製した。

　組成物９３～９８の調製過程において、加熱後にリジン・１塩酸塩が溶解したことを目視観察で確認した。一方、組成物９９～１０４の調製過程において、加熱後も水溶液中に固体の残留が見られことから、リジン・１塩酸塩が溶解しなかったと判断し、以降の操作を実施しなかった。

　（２）形状の評価
　実施例１９（２）と同様の方法で、（１）で得られた組成物９３～９８の状態を評価した結果、いずれもの組成物も、変形後の形状を保たず、目視観察でも溶液中に固体が観察されなかったことから、半固体状ではなく、リジン・１塩酸塩が完全に溶解した溶液と判断した。リジン・１塩酸塩が溶解していることから、実施例１９の（３）に示すような溶解性の評価は実施しなかった。

　比較例１５で得られた結果を表１５に示す。

　リジン・１塩酸塩を使用した場合、得られた組成物はリジン・１塩酸塩が完全に溶解したに溶液の形態であり、本発明の目的とする組成物は得られなかった。

　比較例１６
　リジン・２塩酸塩、水およびエタノールからなる組成物（組成物１０５～１１６）
　（１）組成物の調製
　実施例１９（１）において、グリシン塩酸塩をリジン・２塩酸塩（富士フイルム和光純薬）に変更し、表１６に記載された重量のリジン・２塩酸塩、エタノールおよび蒸留水を用いて、組成物１０５～１１６を調製した。

　組成物１０５～１１３の調製過程において、加熱後にリジン・２塩酸塩が溶解したことを目視観察で確認した。一方、組成物１１４～１１６の調製過程において、加熱後も水溶液中に固体の残留が見られことから、リジン・２塩酸塩が溶解しなかったと判断し、以降の操作を実施しなかった。

　（２）形状の評価
　実施例１９（２）と同様の方法で、（１）で得られた組成物１０５～１１３の状態を評価した結果、いずれもの組成物も、変形後の形状を保たず、目視観察でも溶液中に固体が観察されなかったことから、半固体状ではなく、リジン・２塩酸塩が完全に溶解した溶液と判断した。リジン・２塩酸塩が溶解していることから、実施例１９の（３）に示すような溶解性の評価は実施しなかった。

　比較例１６で得られた結果を表１６に示す。

　リジン・２塩酸塩を使用した場合、得られた組成物はリジン・２塩酸塩が溶完全に溶解したに溶液の形態であり、本発明の目的とする組成物は得られなかった。

Claims

生体試料中のマイクロＲＮＡを検出する方法であって、
（Ａ）生体試料に酸を混合し、生体試料混合液を得る工程、
（Ｂ）工程（Ａ）により得られた生体試料混合液を保存する工程、
（Ｄ）工程（Ｂ）により得られた生体試料混合液からマイクロＲＮＡを回収する工程、
（Ｅ）工程（Ｄ）により回収したマイクロＲＮＡを検出する工程、
を含む、検出方法。
　工程（Ａ）において、得られる生体試料混合液のｐＨが２．０～４．０である、請求項１に記載の検出方法。
　工程（Ｄ）の前に、工程（Ｂ）により得られた生体試料混合液に塩基を混合し、ｐＨ６．０～９．０に調節する工程（Ｃ）を含む、請求項１または２に記載の検出方法。
　工程（Ｃ）において、調節するｐＨが７．５～９．０である、請求項３に記載の検出方法。
　前記生体試料が血液、血清または血漿である、請求項１～４のいずれかに記載の検出方法。に記載の検出方法。
　工程（Ａ）において、用いられる酸が、グリシン塩酸塩、アラニン塩酸塩、クエン酸、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸またはシュウ酸である、請求項１～５のいずれかに記載の検出方法。
　工程（Ａ）において、用いられる酸が、中性アミノ酸の塩酸塩、水、アルコールからなる均質な組成物であって、２３℃において半固体状の組成物である、請求項１～５のいずれかに記載の検出方法。
　工程（Ｂ）において、生体試料混合液を保存する時間が９６時間以内である、請求項１～７のいずれかに記載の検出方法。
　工程（Ｂ）において、生体試料混合液を保存する温度が１～３０℃である、請求項１～８のいずれかに記載の検出方法。
　工程（Ｃ）において、用いられる塩基がトリスヒドロキシメチルアミノメタン、Ｎ－［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン、トリエタノールアミン、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）グリシン、Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－Ｎ’－２－エタンスルホン酸または２－ヒドロキシ－３－［トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］－１－プロパンスルホン酸である、請求項３または４に記載の検出方法。
　工程（Ｅ）において、マイクロＲＮＡを検出する方法がマイクロアレイ法である、請求項１～１０のいずれかに記載の検出方法。
　前記マイクロＲＮＡが疾患マーカーとして用いるマイクロＲＮＡである、請求項１～１１のいずれかに記載の検出方法。
　前記疾患が癌または認知症である、請求項１２に記載の検出方法。
　請求項１に記載の検出方法の工程（Ａ）で酸として使用する、中性アミノ酸の塩酸塩、水、アルコールからなる均質な組成物であって、２３℃において半固体状である、組成物。
　前記組成物中の中性アミノ酸の塩酸塩の重量比が６５ｗｔ％以上、７０ｗｔ％以下であり、アルコールの重量比が２ｗｔ％以上、６ｗｔ％以下である、請求項１４に記載の組成物。
　前記中性アミノ酸の塩酸塩がグリシン塩酸塩またはアラニン塩酸塩である、請求項１４または１５に記載の組成物。
　前記アルコールがメタノールまたはエタノールである、請求項１４～１６のいずれかに記載の組成物。
　請求項１４～１７のいずれかに記載の組成物が封入された、生体試料を保存する容器。