JP2009065900A - 標的ｒｎａの解析方法及び保存方法 - Google Patents

Abstract

【課題】夾雑物が非常に多く、かつ、大量の核酸が存在する糞便試料中の標的ＲＮＡを解析する場合において、糞便試料からＲＮＡを回収した後、得られたＲＮＡの定量操作等を要することなく、標的ＲＮＡを解析し得る方法の提供。
【解決手段】糞便試料中に存在する標的ＲＮＡを解析する方法であって、（ａ）糞便試料から核酸を抽出し、ＲＮＡ溶液を得る工程と、（ｂ）前記ＲＮＡ溶液が含有する核酸量よりも少量である一定量の核酸と可逆的に結合可能な固形支持体を、前記ＲＮＡ溶液に供給する工程と、（ｃ）前記工程（ｂ）において供給された固形支持体と、前記ＲＮＡ溶液が含有するＲＮＡの一部とで複合体を形成させる工程と、（ｄ）前記複合体を形成していない核酸を、前記複合体から分離除去する工程と、（ｅ）前記工程（ｄ）の後、前記複合体を形成している標的ＲＮＡを検出又は定量する工程と、を有することを特徴とする標的ＲＮＡの解析方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、糞便試料中に存在する標的ＲＮＡの解析方法及び保存方法に関する。

食生活の欧米化に伴い、欧米と同様に日本においても、大腸がんの発症率が増加し、がん死亡率の上位を占めるようになってきており、より高精度でかつ簡便な大腸がんの診断方法が望まれている。近年、非侵襲的で簡便な検査方法として、糞便を用いた検査方法が注目されており、特に、糞便から核酸マーカーを検出する方法の研究・開発が盛んに行われている

例えば、ＤＮＡの突然変異によるがんの解析は、糞便中にがん細胞が存在しているか否かを、正常細胞には存在しない変異型ＤＮＡが、糞便試料中に存在しているか否かにより解析されるものであり、糞便試料から得られた一定量の核酸中に、僅かでも変異型ＤＮＡの存在が確認された場合には、大腸がんを発症している可能性があると診断される。このような変異型ＤＮＡの検査法として、例えば、ＡＰＣ遺伝子、ｐ５３遺伝子、Ｋ−ｒａｓ遺伝子等の変異の有無を調べる方法や、マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ、ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ）、ＬＯＨ（ｌｏｓｓ ｏｆ ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓｉｔｙ）、ｌｏｎｇＤＮＡ等を調べる方法がある。

血液等と異なり、糞便は、その半分は細菌から成り立っているといわれるほど大量の細菌を含有しているため、糞便試料から抽出された核酸は、通常、大量の細菌由来核酸に対して、微量のヒト由来核酸が含まれているものである。このため、糞便試料からの核酸回収工程が、核酸マーカーによるがん診断の結果に大きく影響する。

一般に、生物試料からＤＮＡを回収する方法としては、フェノール／クロロホルム法や、生物試料溶解物をチオシアン酸グアニジンや塩酸グアニジン等のカオトロピック塩の存在下で処理することにより抽出した核酸を、シリカコーティングされた固相担体に吸着させ、非特異的に吸着した物質を洗浄液にて洗浄した後、溶出液で固相担体から核酸を溶出する核酸の回収方法が開示されている（例えば、特許文献１参照。）。

より変異型ＤＮＡの検出感度及び精度を改善し得る方法として、例えば、（１）（ａ）約８．０〜約９．０のｐＨで約１０ｍＭ〜約２００ｍＭの濃度のキレート剤、約１ｍＭ〜約２０ｍＭの濃度の塩、及び少なくとも約５００ｍＭの濃度のバッファーを含む糞便溶解バッファー中で糞便試料から粒形物を除いて非粒子画分を生成させ、そして（ｂ）該非粒子画分から核酸を分離することを含む糞便試料から哺乳動物の核酸を分離する方法が開示されている（例えば、特許文献２参照。）。このような糞便溶解バッファーを用いることにより、糞便試料中の細菌は溶解せず、哺乳細胞のみを溶解し得るため、糞便中に大量に存在する細菌ＤＮＡの影響を低減し、より高精度に大腸がんを検出することができる。また、（２）糞便試料を溶解させるために用いられる溶媒と糞便試料との比率や、溶媒の組成等の条件を適当にすることにより、糞便試料からＤＮＡを安定的に回収する方法が開示されている（例えば、特許文献３参照。）。その他、生物試料から定量的にＤＮＡを回収する方法として、例えば、（３）生物試料に適当なバッファーとカオトロピック塩を添加して抽出した核酸溶液に、解析に必要充分な一定量のＤＮＡを可逆的に結合し得るシリカ含有固形支持体を添加することにより、該シリカ含有固形支持体に結合し得る一定量のＤＮＡのみを単離して回収する方法が開示されている（例えば、特許文献４参照。）

また、近年、糞便中のＲＮＡをマーカーとして大腸がんを診断する方法が開示されている。ＲＮＡをマーカーとするがんの検出方法においては、生物試料中に含まれている標的ＲＮＡ量の多寡により、がんの発症の有無が判断される場合が多い。このため、生物試料から回収するＲＮＡ量に対して、一般的に、ＤＮＡによる変異検査よりも高い定量性が求められる。このようなＲＮＡをマーカーとするがんの検出方法として、例えば、（４）糞便試料をＲＮＡ分解酵素阻害剤の存在下で均質化して得られた懸濁物からＲＮＡを抽出した後、ｃｏｘ−２ ｍＲＮＡの有無をｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲで半定量的に検出することにより、がんの検出を行う方法が開示されている（例えば、特許文献５参照。）。該方法は、ＲＮＡを定量的に検出するため、ＤＮＡの解析に比べて感度や特異度で非常によい結果を示している。

一般に、生物試料からＲＮＡを回収する方法としては、上記（４）の方法においても行われているように、生物試料溶解物から、タンパク質等の夾雑物の分離をせず、酸性条件下でフェノールとカオトロピック塩を用いて、全ＲＮＡを回収する方法が、スタンダードな方法として広く利用されている（例えば、特許文献６参照。）。その他、生物試料から抽出された核酸からＲＮＡを回収する方法として、例えば、（５）核酸を含む生物試料溶解物中の、塩及びアルコール基を含む物質の濃度を調整することにより、全核酸を同時に無機支持体に吸収させ、分別溶出により二本鎖核酸及び単鎖核酸に分離するか、二本鎖核酸又は単鎖核酸を無機支持体に選択的に吸収させることにより、二本鎖核酸と単鎖核酸を別個に回収し得る方法が開示されている（例えば、特許文献７参照。）。その他、特に糞便試料からＲＮＡを回収する方法として、例えば、（６）糞便試料からタンパク質等の夾雑物を除去した後、フェノールとカオトロピック塩を用いてＲＮＡを抽出し、抽出されたＲＮＡをさらにシリカ含有固形支持体に吸着させることにより回収する方法が開示されている（例えば、非特許文献１参照。）。
特許第２６８０４６２号公報 特許第３６３３９３２号公報 特表２００２−５３９７６５号公報 特表２００３−５０７０４９号公報 国際公開第２００４／０８３８５６号パンフレット 特許第２６７９９２９号公報 特許第３２５６２３８号公報 Alexander et al.、１９９８年、Digestive Diseases and Sciences、 第４３巻、ｐ２６５２〜２６５８

上記（４）〜（６）の方法を用いた場合には、通常、一回の回収操作によって１００〜２００μｇ以上の核酸が回収される。一方で、標的ＲＮＡの検出はＲＴ−ＰＣＲ等の核酸増幅法を用いて行われる場合が多く、わずか１〜２μｇ程度のＲＮＡが回収できれば充分である場合が多い。特に、検出に供されるＲＮＡには、各検出方法に適した濃度範囲があるため、過剰量のＲＮＡを用いて検出操作を行った場合には、検出限界を超え、検出不能となる場合がある。このため、上記（４）〜（６）の方法でＲＮＡを回収した場合には、標的ＲＮＡの解析を行う前に、予め回収されたＲＮＡを定量した後、一定の濃度にＲＮＡ溶液を調整する必要がある。

しかしながら、このような濃度測定や濃度調整の工程を経て調製されたＲＮＡを用いることにより、標的ＲＮＡの検出感度や精度が低下し易く、信頼性が損なわれ易いという問題がある。ＲＮＡはＤＮＡと異なり分解され易いという特徴があり、精製や定量の操作が煩雑になるほど分解の影響を受け易いためである。ＲＮＡは、定量等の操作において特に分解され易く、このため、回収されるＲＮＡ量にバラツキが生じ易く、安定した検出結果が得られ難い。

一方、上記（３）の方法により、ある一定量のＤＮＡのみを定量的に回収することができるため、定量操作等を要することなく、ＰＣＲ等のフラグメント解析等を続けて行うことができる。しかしながら、ＲＮＡを回収する試料が血液等の比較的夾雑物が少ない生物試料である場合には、上記（３）の方法によっても所望の量の核酸を回収することが可能であるが、糞便由来のタンパク質等の多種多様な夾雑物を大量に含む糞便試料である場合には、生物試料にカオトロピック塩を含有するバッファーを添加しただけでは、夾雑物により核酸の抽出や回収の効率が安定しないという問題がある。また、糞便試料は、大量の細菌を含むため、血液試料等と比べてＲＮＡが分解され易いという問題もある。このため、上記（３）の方法のように、カオトロピック塩を含有するバッファーによる試料中の細胞の溶解と、シリカ含有固形支持体による吸着によって回収されたＲＮＡ量は、非常にバラツキが大きくなり、ＲＮＡの発現量解析等のより高い定量性が要求される検出方法に用いられ得る程、厳密に一定量のＲＮＡを回収することは困難であった。

本発明は、夾雑物が非常に多く、かつ、大量の核酸が存在する糞便試料中の標的ＲＮＡを解析する場合において、糞便試料からＲＮＡを回収した後、得られたＲＮＡの定量操作等を要することなく、標的ＲＮＡを解析し得る方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、糞便試料中から、必要最小限量のＲＮＡを正確に回収することにより、回収されたＲＮＡの定量操作を要することなく、標的ＲＮＡを解析し得ること、及び、有機溶媒を含む溶液で処理することにより糞便試料からタンパク質等の夾雑物を除去した後、核酸結合能力が糞便試料中の総ＲＮＡ量よりもはるかに少量である固形支持体に吸着させてＲＮＡを回収することにより、糞便試料中から、必要最小限量のＲＮＡを正確に回収し得ることを見出し、本発明を完成させた。

すなわち、本発明は、糞便試料中に存在する標的ＲＮＡを解析する方法であって、（ａ）糞便試料から核酸を抽出し、ＲＮＡ溶液を得る工程と、（ｂ）前記ＲＮＡ溶液が含有する核酸量よりも少量である一定量の核酸と可逆的に結合可能な固形支持体を、前記ＲＮＡ溶液に供給する工程と、（ｃ）前記工程（ｂ）において供給された固形支持体と、前記ＲＮＡ溶液が含有するＲＮＡの一部とで複合体を形成させる工程と、（ｄ）前記複合体を形成していない核酸を、前記複合体から分離除去する工程と、（ｅ）前記工程（ｄ）の後、前記複合体を形成している標的ＲＮＡを検出又は定量する工程と、を有することを特徴とする標的ＲＮＡの解析方法を提供するものである。
また、本発明は、前記工程（ｅ）が、（ｅ１）前記工程（ｄ）後、前記複合体から、溶出用バッファーを供給することにより、前記複合体を形成しているＲＮＡの一部を溶出して遊離させる工程と、（ｅ２）前記工程（ｅ１）により得られた遊離ＲＮＡを用いて核酸増幅を行う工程と、を有することを特徴とする標的ＲＮＡの解析方法を提供するものである。
また、本発明は、前記工程（ｅ１）が、前記溶出用バッファーの組成、ｐＨ、又は温度を調節し、前記固形支持体の核酸結合能力を調整することにより、前記複合体から、前記複合体を形成しているＲＮＡの一部を溶出して遊離させる工程であること、を特徴とする標的ＲＮＡの解析方法を提供するものである。
また、本発明は、前記工程（ｅ）が、（ｅ１’）前記工程（ｄ）後、前記複合体から、溶出用バッファーを供給することにより、前記複合体を形成しているＲＮＡを溶出して遊離させる工程と、（ｅ２’）前記工程（ｅ１’）により得られた遊離ＲＮＡを用いて核酸増幅を行う工程と、を有することを特徴とする標的ＲＮＡの解析方法を提供するものである。
また、本発明は、前記工程（ｅ）が、（ｅ１”）前記工程（ｄ）後、前記複合体を形成しているＲＮＡを用いて核酸増幅を行う工程と、を有することを特徴とする標的ＲＮＡの解析方法を提供するものである。
また、本発明は、前記工程（ａ）において、フェノール又はフェノール／クロロホルムを用いて核酸を抽出することを特徴とする標的ＲＮＡの解析方法を提供するものである。
また、本発明は、前記工程（ａ）において、さらにカオトロピック塩を用いて核酸を抽出することを特徴とする標的ＲＮＡの解析方法を提供するものである。
また、本発明は、前記固形支持体が、シリカ質オキシド被覆磁性粒子であることを特徴とする標的ＲＮＡの解析方法を提供するものである。
また、本発明は、前記工程（ａ）において、０．１〜１ｇの糞便試料から核酸を抽出することを特徴とする標的ＲＮＡの解析方法を提供するものである。
また、本発明は、前記工程（ａ）において得られたＲＮＡ溶液が含有する核酸量が、２００μｇ以上であることを特徴とする標的ＲＮＡの解析方法を提供するものである。
また、本発明は、前記工程（ａ）において得られたＲＮＡ溶液が含有する核酸量が、１０μｇ以上であることを特徴とする標的ＲＮＡの解析方法を提供するものである。
また、本発明は、前記工程（ｂ）において供給された前記固形支持体の核酸結合能力が、２μｇ以下であることを特徴とする標的ＲＮＡの解析方法を提供するものである。
また、本発明は、前記工程（ｂ）において供給された前記固形支持体の核酸結合能力が、１μｇ以下であることを特徴とする標的ＲＮＡの解析方法を提供するものである。
また、本発明は、前記核酸増幅が、増幅された核酸量を経時的に計測する方法を用いて行われることを特徴とする標的ＲＮＡの解析方法を提供するものである。
また、本発明は、前記核酸増幅が、逆転写反応により得られたｃＤＮＡを鋳型として、リアルタイムＰＣＲを行うことを特徴とする標的ＲＮＡの解析方法を提供するものである。
また、本発明は、前記糞便試料が、凍結乾燥処理済み糞便試料であることを特徴とする標的ＲＮＡの解析方法を提供するものである。
また、本発明は、糞便試料中に存在する標的ＲＮＡを保存する方法であって、（ａ）糞便試料から核酸を抽出し、ＲＮＡ溶液を得る工程と、（ｂ）前記ＲＮＡ溶液が含有する核酸量よりも少量である一定量の核酸と可逆的に結合可能な固形支持体を、前記ＲＮＡ溶液に供給する工程と、（ｃ）前記工程（ｂ）において供給された固形支持体と、前記ＲＮＡ溶液が含有するＲＮＡの一部とで複合体を形成させる工程と、（ｄ）前記複合体を形成していない核酸を、前記複合体から分離除去する工程と、（ｆ）前記工程（ｄ）の後、前記複合体を乾燥させた後保存する工程と、を有することを特徴とする標的ＲＮＡの保存方法を提供するものである。
また、本発明は、前記記載の標的ＲＮＡの保存方法を用いて保存した標的ＲＮＡを解析することを特徴とする標的ＲＮＡの解析方法を提供するものである。

本発明の標的ＲＮＡの解析方法により、夾雑物が非常に多く、かつ、大量の核酸が存在する糞便試料中の標的ＲＮＡを、高感度かつ高精度に検出又は定量することができる。糞便試料から、必要最小限量のＲＮＡを正確に回収することができるため、回収されたＲＮＡを、定量操作を要することなく、標的ＲＮＡの解析に供することができるためである。このため、本発明の標的ＲＮＡの解析方法を用いることにより、ＲＮＡの発現量解析のように高い定量性を要求される解析を行う場合にも、安定した信頼性の高い結果を得ることができる。また、濃度測定・濃度調整工程を省略し得るため、従来法と比べて、操作が簡便となり、経済的にも好ましい。
さらに、本発明の標的ＲＮＡの保存方法により、一定量の核酸を安定して保存することができるため、保存後解析前に濃度測定・濃度調整工程を省略することができ、再検査等における省力化が期待できる。つまり、本発明の標的ＲＮＡの保存方法により、核酸の抽出・定量・保存を、一連の操作によって高精度に行うことが可能となる。

本発明における標的ＲＮＡとは、検出又は定量等の解析対象であるＲＮＡであり、ＰＣＲ等の通常核酸の解析に用いられる手法によって解析可能な程度に明らかになっている塩基配列を有するＲＮＡであれば、特に限定されるものではない。例えば、動物や微生物由来のｍＲＮＡ等がある。

本発明の標的ＲＮＡの解析方法の対象となる糞便試料は、採取直後のものであってもよく、採取後一定期間保存されたものであってもよい。また、採取されたままのものであってもよく、前処理がなされたものであってもよい。該前処理は、糞便試料等の生物試料に対して通常行われている処理であれば、特に限定されるものではない。該前処理として、例えば、乾燥処理、凍結処理、凍結乾燥処理等がある。糞便試料中の標的ＲＮＡを損なうおそれが小さいため、凍結処理や凍結乾燥処理がなされた糞便試料であることが好ましい。また、取り扱いが簡便であるため、特に凍結乾燥処理がなされた糞便試料であることが好ましい。凍結処理や凍結乾燥処理における凍結方法は、生物試料を凍結し得る方法であれば、特に限定されることはないが、液体窒素を用いる方法であることが好ましい。速やかに凍結することができるため、糞便処理中の標的ＲＮＡに対する影響を抑えることができるためである。

本発明の標的ＲＮＡの解析方法の対象となる糞便試料は、動物由来の糞便試料であれば、特に限定されるものではないが、哺乳類由来の糞便試料であることが好ましく、ヒト由来の糞便試料であることがより好ましい。

本発明の標的ＲＮＡの解析方法は、糞便試料中に存在する標的ＲＮＡを解析する方法であって、（ａ）糞便試料から核酸を抽出し、ＲＮＡ溶液を得る工程と、（ｂ）前記ＲＮＡ溶液が含有する核酸量よりも少量である一定量の核酸と可逆的に結合可能な固形支持体を、前記ＲＮＡ溶液に供給する工程と、（ｃ）前記工程（ｂ）において供給された固形支持体と、前記ＲＮＡ溶液が含有するＲＮＡの一部とで複合体を形成させる工程と、（ｄ）前記複合体を形成していない核酸を、前記複合体から分離除去する工程と、（ｅ）前記工程（ｄ）の後、前記複合体を形成している標的ＲＮＡを検出又は定量する工程と、を有することを特徴とする。以下、工程ごとに説明する。

まず、工程（ａ）として、糞便試料から核酸を抽出し、ＲＮＡ溶液を得る。ここで、核酸を抽出するとは、糞便試料に溶解用バッファーを添加して溶解させ、得られた糞便試料溶解液からタンパク質等の夾雑物を除去することを意味する。このように、ＲＮＡを回収する前に試料中から夾雑物を除去することにより、ＲＮＡの分解や、抽出及び回収効率の低下等の夾雑物による影響を顕著に低減することができるため、糞便試料中の標的ＲＮＡを、高感度かつ高精度に検出又は定量することができる。

糞便試料に添加する溶解用溶液は、糞便試料中の細胞や微生物等を溶解させ、核酸を溶出し得るＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅの溶液であれば、特に限定されるものではなく、生物試料を溶解するために通常使用される溶液を用いることができる。該溶解用溶液として、例えば、ＤＥＰＣ（Ｄｉｅｔｙｌ Ｐｙｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅ）処理等の公知のＲＮａｓｅ分解処理を施した精製水、トリスバッファー、シュウ酸ナトリウムバッファー、リン酸バッファー、ＭＯＰＳ（ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｐｒｏｐａｎｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）バッファー、酢酸塩バッファー等がある。

該溶解用溶液は、細胞や微生物等の溶解を促進させるために、カオトロピック塩を含有させた溶液であることが好ましい。該カオトロピック塩として、例えば、塩酸グアニジン、グアニジンイソチオシアネート、ヨウ化ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、及びトリクロロ酢酸ナトリウム等がある。カオトロピック塩の種類や濃度は、糞便試料の溶解促進効果が得られる濃度であれば、特に限定されるものではなく、糞便試料の前処理方法や濃度等を考慮して、適宜決定することができる。

また、該溶解用溶液は、ＣＨＡＰＳ（３-[３-コラミドプロピルジメチルアンモニオ]-１-プロパンスルホネート）や、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００等の界面活性剤や、プロテアーゼ等のＲＮＡ以外の物質に対する分解酵素等を含有していてもよい。界面活性剤や分解酵素等を含有させることにより、糞便試料の溶解が促進され、核酸の抽出効率を向上させることができるためである。該溶解用溶液に含有させる界面活性剤や分解酵素の種類や濃度等は、カオトロピック塩と同様に、糞便試料の前処理方法や濃度等を考慮して、適宜決定することができる。

糞便試料の溶解は、生体試料の溶解に通常行われる手法を用いることができる。例えば、溶解用溶液を添加して混合攪拌してもよく、市販のホモジナイザーを用いてホモジナイズしてもよく、超音波処理をしてもよい。

得られた糞便試料溶解液からタンパク質等の夾雑物を除去し、核酸を抽出する方法は、通常、生体成分からタンパク質等を変性除去する場合に用いられる任意の方法で行うことができる。例えば、糞便試料溶解液に有機溶媒を添加して混合することにより、糞便試料中に含有されていた脂質等の有機溶媒に可溶な成分は有機溶媒に移行し、変性したタンパク質は糞便試料溶解液に不溶となるため、糞便試料溶解液からタンパク質等を除去することができる。該有機溶媒として、例えば、フェノール、フェノール／クロロホルム等がある。糞便試料溶解液に添加するフェノールは、中性であってもよく、酸性であってもよい。ＤＮＡよりもＲＮＡを選択的に水層の糞便試料溶解液に抽出することができるため、酸性のフェノール又はフェノール／クロロホルムであることが好ましい。

糞便試料に対して、溶解用溶液を添加して溶解させた後、有機溶媒を添加してもよく、溶解用溶液と有機溶媒を同時に添加してもよい。核酸の抽出効率がより高くなり、かつ安定した結果を得られるため、溶解用溶液を添加して溶解させ後に有機溶媒を添加することが好ましい。また、フェノールとカオトロピック塩を用いて、ＲＮＡ溶液を得るために、例えば、ＴＲＩＺＯＬ (トリゾール、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製)、Ｉｓｏｇｅｎｅ（アイソジェン、和光純薬社製）等の市販のキットを用いることもできる。

工程（ａ）において、核酸の抽出に用いる糞便試料の量は、特に限定されるものではないが、操作性が良好であり、かつ解析に必要十分な量である１０μｇ以上のＲＮＡを得ることができるため、０．１〜１ｇの糞便試料から核酸を抽出することが好ましい。２００μｇ以上のＲＮＡを含有するＲＮＡ溶液を得ることができるため、０．５〜１ｇの糞便試料から核酸を抽出することがより好ましい。

このようにして得られたＲＮＡ溶液は、ＲＮＡとＤＮＡの両方を含む溶液であってもよく、ＲＮＡのみを含む溶液であってもよい。ＲＮＡとＤＮＡの両方を含む場合に、得られたＲＮＡ溶液にＤＮａｓｅを添加する等により、ＤＮＡを分解してもよい。

次に、工程（ｂ）として、工程（ａ）により得られたＲＮＡ溶液に、該ＲＮＡ溶液が含有する核酸量よりも少量である一定量の核酸と可逆的に結合可能な固形支持体を供給する。ここで、「ＲＮＡ溶液が含有する核酸量よりも少量である一定量の核酸と可逆的に結合可能な固形支持体」とは、該固形支持体の核酸結合能力が、予め判明しているある一定の量であり、かつ、該ＲＮＡ溶液が含有する核酸量よりも少量であることを意味する。このように、固形支持体の核酸結合能力を、ＲＮＡ溶液が含有する核酸量よりも少量とすることにより、固形支持体と核酸の結合を飽和させ、常にほぼ一定量の核酸を固形支持体と結合させることができる。

固形支持体の核酸結合能力（結合できる最大核酸量）は、ＲＮＡ溶液中の核酸量よりも少量であれば、特に限定されるものではないが、固形支持体が結合できる最大核酸量に対して、ＲＮＡ溶液中の核酸量が過剰量であることが好ましい。例えば、固形支持体の核酸結合能力はＲＮＡ溶液中の核酸量の２分の１以下であることが好ましく、５分の１以下であることがより好ましく、１０分の１以下であることがさらに好ましく、１００分の１以下であることが特に好ましい。具体的には、該固形支持体の核酸結合能力は、２μｇ以下であることが好ましく、１μｇ以下であることがより好ましい。通常、１〜２μｇ程度のＲＮＡを回収することができれば、以降の標的ＲＮＡの解析には必要充分であること、及び、０．１〜１ｇの糞便試料から得られるＲＮＡ溶液中の核酸量よりも充分に微量であるため、糞便試料ごとにＲＮＡ溶液の核酸量に差がある場合であっても、各糞便試料から安定して一定量の核酸を回収することができる。

固形支持体は、核酸と可逆的に結合し得るものであれば、特に限定されるものではなく、核酸の回収や精製に通常使用されている任意の固形支持体を用いることができる。該固形支持体として、例えば、シリカゲル、シリカ質オキシド、ガラス、珪藻土等のシリカ含有粒子（ビーズ）や、ナイロン、ポリカーボネート、ポリアクリレート、ニトロセルロース等の多孔質膜等がある。また、固形支持体は、これらの核酸と可逆的に結合し得る化合物をコーティングした粒子や膜であってもよい。いずれの素材の固形支持体を用いるかは、所望の核酸結合能力等を考慮して、適宜決定することができる。

固形支持体が粒子である場合には、磁性粒子であることが好ましい。後述する工程（ｄ）において、磁石等を用いて磁場をかけることにより、遠心分離することなく、簡便に固形支持体からＲＮＡ溶液を分離除去し得るためである。磁性粒子は、例えば、核酸と可逆的に結合し得る粒子に、フェリコロイドや鉄粉等の磁性体を含有させることにより、形成することができる。特に、磁性体を含有させた粒子の表面に、核酸と可逆的に結合し得る化合物をコーティングした粒子であることが好ましい。このような磁性粒子として、例えば、磁性粒子にシリカ質オキシドをコーティングしたシリカ質オキシド被覆磁性粒子等がある。

固形支持体の形状は特に限定されるものではなく、粒子状であってもよく、膜状であってもよく、繊維状であってもよいが、重量又は容量あたりの表面積を一定に規定されたものであることが好ましい。通常、核酸結合能力は固形支持体の表面積に依存しており、固形支持体の核酸結合能力が、固形支持体の重量又は容量あたりで一定値に規定されている場合には、ＲＮＡ溶液への添加量を調整することにより、簡便に固形支持体の核酸結合能力を調整することができるためである。固形支持体が多孔質である場合には、完全に均一化されている多孔質であってもよく、ランダムに均一化されている多孔質であってもよい。なお、該固形支持体の核酸結合能力は、予め測定等により、明らかにしておく必要がある。例えば、固形支持体が粒子である場合には、粒子の一定重量あたりの核酸結合能力を予め測定しておくことが好ましく、多孔質膜である場合には、膜の一定面積あたりの核酸結合能力を予め測定しておくことが好ましい。その他、市販の核酸結合能力が判明している固形支持体を用いてもよい。

固形支持体が粒子である場合には、該粒子をＲＮＡ溶液に添加し、混合することにより、ＲＮＡ溶液に固形支持体を供給することができる。固形支持体が膜である場合には、ＲＮＡ溶液を該膜に透過させることや、該膜をＲＮＡ溶液に浸漬させることにより、ＲＮＡ溶液に固形支持体を供給することができる。

ＲＮＡ溶液に添加する固形支持体の核酸結合能力は、用いる固形支持体の種類によっては、塩濃度等のバッファーの組成、ｐＨ、温度等により変動させ得る。このため、ＲＮＡ溶液に添加する固形支持体に、所望の量の核酸を結合させるために、ＲＮＡ溶液のバッファーの組成等を調整することもできる。その他、上記（５）の方法のように、バッファー中の組成を調整して、ＤＮＡよりもＲＮＡと選択的に結合するようにしてもよい。例えば、固形支持体としてシリカ質オキシド等のシリカ含有固形支持体を用いる場合には、ＲＮＡ溶液のバッファーとして、３０％以上のエタノールを含有する１〜５Ｍグアニジン塩溶液を用いることができる。

工程（ｃ）において、工程（ｂ）において供給された固形支持体と、前記ＲＮＡ溶液が含有するＲＮＡの一部とで複合体を形成させる。ＲＮＡ溶液中の核酸量に比べて、固形支持体の核酸結合能力が充分に低いため、糞便試料ごとにＲＮＡ溶液の核酸量に差がある場合であっても、固形支持体の核酸結合能力いっぱいまで安定して核酸と結合することができる。例えば、糞便試料Ａから得られたＲＮＡ溶液中のＲＮＡ量が１００μｇであり、糞便試料Ｂから得られたＲＮＡ溶液中のＲＮＡ量が２００μｇである場合に、核酸結合能力が１μｇである固形支持体をそれぞれ添加することにより、いずれのＲＮＡ溶液からも、ほぼ１μｇの核酸と複合体を形成することができる。

さらに、工程（ｄ）として、固形支持体と複合体を形成していない核酸を、該複合体から分離除去する。これにより、ＲＮＡ溶液中の核酸から、固形支持体と複合体を形成している一定量の核酸のみを分離して回収することができる。具体的には、固形支持体からＲＮＡ溶液を分離除去することにより、該複合体から固形支持体と複合体を形成していない核酸を除去することができる。例えば、固形支持体が粒子である場合には、遠心分離等により固形支持体のみを沈殿させ、上清のＲＮＡ溶液を除去することができる。

工程（ｂ）〜（ｄ）は、ＲＮＡ溶液に供給される固形支持体の核酸結合能力を調整する以外は、従来公知の方法を用いることができ、例えば、ＲＮＡＰｒｅｐ トータルＲＮＡ抽出キット（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ（ＱＩＡＧＥＮ社製）、ＲＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）等の市販のキットを用いることができる。

その他、工程（ｄ）の後、工程（ｅ）の前に、適当な洗浄バッファーを用いて、固形支持体と核酸の複合体を洗浄してもよい。該複合体を洗浄することにより、固形支持体と複合体を形成していない核酸を充分に除去することができる。該洗浄バッファーは、固形支持体と核酸の結合を損なわないバッファーであれば、特に限定されるものではない。該洗浄バッファーとして、例えば、工程（ｃ）において複合体を形成する時点のＲＮＡ溶液と同様の組成のバッファーを用いることができる。

その後、工程（ｅ）として、前記複合体を形成している標的ＲＮＡを検出又は定量することにより、標的ＲＮＡを解析することができる。このように、ＲＮＡ溶液に供給される固形支持体の核酸結合能力を一定とすることにより、最終的に糞便試料から回収される核酸量を常に一定にすることができるため、回収された核酸を、濃度測定・濃度調整工程を経ることなく、その後の解析操作に供することができる。また、常に一定量の核酸を回収して解析することができるため、従来行われていたフェノール／クロロホルム抽出法とエタノール沈殿法の組み合わせにより回収された核酸を用いた解析に比べて、試料や解析操作ごとのバラツキを顕著に低減することができる。

標的ＲＮＡの検出又は定量は、ＲＮＡを検出・定量する場合に通常行われている任意の方法で行うことができるが、該複合体を形成しているＲＮＡを用いて核酸増幅を行う工程を有する方法であることが好ましい。１〜２μｇという微量の核酸量であっても高精度かつ高感度に標的ＲＮＡを検出等し得るためである。このような方法として、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ法やＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法等がある。また、このような核酸増幅法は、等温反応条件によるものであってもよく、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ等を用いた非等温反応条件によるものであってもよい。

標的核酸の検出等には、ＰＣＲが汎用されているが、本発明の標的核酸はＲＮＡであるため、ＲＴ−ＰＣＲを行うことが好ましい。具体的には、まず、逆転写反応を行うことにより、工程（ｄ）により得られた複合体を形成している標的ＲＮＡに相補的なＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を得た後、該ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行う。逆転写酵素（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）、ＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオチド、反応バッファー等のＲＴ−ＰＣＲに用いられる試薬は、特に限定されるものではなく、通常ＲＴ−ＰＣＲを行う場合に用いられるものを、通常用いられる量で用いることができる。例えば、逆転写酵素としては、ＲＡＶ（Ｒｏｕｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ）やＡＭＶ（Ａｖｉａｎ ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）等のレトロウィルス由来の逆転写酵素や、ＭＭＬＶ（Ｍｏｌｏｎｅｙ ｍｕｒｉｎｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ）等のマウスのレトロウィルス由来の逆転写酵素等を用いることができ、ＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｔａｑポリメラーゼ等を用いることができる。また、ＲＴ−ＰＣＲの反応条件等は、標的ＲＮＡを検出するためのプライマーや、用いる酵素の種類等を考慮して、適宜決定することができる（例えば、関谷剛男等編、「ＰＣＲ法最前線」、１９９７年、共立出版、第１８７〜１９６ページ参照。）。

ＮＡＳＢＡ法を用いて標的ＲＮＡを検出等する場合には、逆転写反応を要することなく、直接標的ＲＮＡを検出することができる。ＮＡＳＢＡは、常法に基づき行うことができる。また、ＲＮＡポリメラーゼ、ヌクレオチド、反応バッファー等のＮＡＳＢＡに用いられる試薬は、特に限定されるものではなく、通常ＮＡＳＢＡを行う場合に用いられるものを、通常用いられる量で用いることができる。

また、増幅された核酸量を経時的に測定するリアルタイムＲＴ−ＲＣＲやリアルタイムＮＡＳＢＡを行うことにより、標的ＲＮＡを定量することが可能である。その他、通常のＲＴ−ＲＣＲやＮＡＳＢＡを行う場合であっても、エンドポイントにおける核酸増幅の有無から、半定量的に標的ＲＮＡを検出し、その含有量を推定することが可能である。

増幅された核酸は、通常核酸の定量や検出に用いられるいずれの方法を用いて検出又は定量してもよい。例えば、ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法等のＦＲＥＴプローブを用いた方法や、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ等のインターカレーターを用いた方法のように、標的核酸を蛍光物質で標識して検出する方法であってもよい。また、最終的に得られたＰＣＲ産物を、アガロースゲル等を用いた電気泳動法により分離した後に半定量的に検出する方法であってもよい。増幅された核酸を、継時的に高感度に検出することができるため、蛍光物質を用いて標識する方法であることが好ましい。

該複合体を形成しているＲＮＡを用いて核酸増幅を行う場合に、核酸と固相支持体との複合体に、直接核酸増幅のためのバッファー等の試薬を供給して核酸増幅反応を行っても良く、該複合体に溶出用バッファーを供給することにより、該複合体を形成しているＲＮＡを溶出して遊離させ、該遊離ＲＮＡを用いて核酸増幅反応を行っても良い。
例えば、複合体から核酸を溶出させることなく、複合体のまま速やかに核酸増幅反応に用いることにより、操作が簡便となることに加え、溶出操作における核酸の損失を防止し得る。なお、ＲＴ−ＰＣＲにおける逆転写反応やＮＡＳＢＡ法では、鋳型となるＲＮＡが粒子等の固相支持体に結合した状態であっても、支障なく反応を行うことができる。一方で、複合体から溶出した遊離ＲＮＡを用いることにより、核酸増幅反応に対する固体支持体の影響を抑えることができる。なお、溶出用バッファーは、固相支持体に結合させた核酸を、分解等により核酸を損なうことなく、固相支持体から溶出し得るバッファーであれば、特に限定されるものではなく、固相支持体に結合させた核酸を溶出する場合に、通常使用されているバッファーを用いることができる。例えば、固形支持体として、シリカ質オキシドを用いた場合には、溶出用バッファーとして、グアニジン塩溶液等を用いることができる。

固形支持体の核酸結合能力は、塩濃度等のバッファーの組成や、ｐＨ、温度等に依存して変動する（例えば、特表２００２−５２８０９３号公報参照。）。このため、溶出用バッファーの組成等を調整することにより、固形支持体に結合している核酸の全量ではなく、一部のみを溶出することができる。すなわち、規定量の核酸を結合させた後に、全ての核酸を溶出させるのではなく、溶出液の組成を調整することによって、次に行う反応に対して必要最低限量の核酸のみを得るように溶出させることができる。固形支持体に結合している核酸のうち、一定の割合の核酸量を溶出する操作を段階的に複数回行うことにより、一定量の核酸ずつ分注していくこともできる。例えば、固形支持体として、シリカ質オキシドを用いた場合には、溶出用バッファーとして、一般的に、グアニジン塩溶液が用いられる。ここで、シリカ含有化合物は、溶出用バッファーとして一定量のグアニジン塩溶液を用いた場合には、図１に示すように、エタノール濃度に依存してＤＮＡやＲＮＡに対する結合能力が変動する。例えば、１．７５Ｍグアニジンチオシアネートに添加するエタノールの濃度を変化させると、核酸がＲＮＡの場合、１５％〜３０％の間はほぼリニアに結合量が増加する。つまり、この場合、エタノール濃度が１％上昇すると、結合量が５％上昇することになる。この性質を利用して、適当な組成の溶出用バッファーを用いる等により、段階的に溶出することによって、全量を一度に遊離した後に必要量ずつ分取する操作を要することなく、一定量のＲＮＡを所望の割合で分注することができる。その他、溶出用バッファー中の塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム等の塩濃度を調整することによっても、固形支持体の核酸結合能力を調整することができる。例えば、塩化ナトリウムの場合、通常は、１００ｍＭ〜５Ｍの濃度範囲において核酸結合能力が向上し、それよりも低濃度において核酸結合能力が低下する。

例えば、固形支持体として２μｇの核酸結合能力を有するシリカ質オキシド粒子を、ＲＮＡ溶液のバッファーとして３０％エタノール１．７５Ｍグアニジンチオシアネート溶液を用いて、糞便試料中から核酸を固形支持体に結合させて複合体を形成した場合に、溶出用バッファーとして、まず２０％エタノール１．７５Ｍグアニジンチオシアネート溶液を用いることにより、固形支持体に結合しているＲＮＡ量の５０％である１μｇを溶出させ、得られた遊離ＲＮＡ含有溶液を別の容器に分取した後、１０％エタノールグアニジン塩溶液を用いることにより、固形支持体に結合している残りのＲＮＡ１μｇをほぼ全量溶出させることができる。このように、溶出用バッファーの組成を適宜調節することにより、全量を一度に遊離した後に必要量ずつ分取する操作を要することなく、一定量のＲＮＡを所望の割合で分注することができる。

また、本発明の標的ＲＮＡの保存方法は、本発明の標的ＲＮＡの解析方法と同様に工程（ａ）〜（ｄ）を行った後、工程（ｆ）として、前記複合体を乾燥させた後保存することを特徴とする。ＲＮＡ回収後直ちに解析が行うことができない場合や、解析結果が非合理的であった場合等に再解析を行う場合のために、回収したＲＮＡはその全部又は一部が保存されることが一般的に行われている。本発明の標的ＲＮＡの保存方法においては、前述した工程（ａ）〜（ｄ）により、ＲＮＡ溶液に供給される固形支持体の核酸結合能力を一定とすることにより、糞便試料中から、必要最小限量の核酸を、該固形支持体との複合体として正確に回収し得る。このため、このようにして得られた複合体を乾燥させた後保存することにより、核酸回収後速やかに定量化された保存核酸検体を得ることができる。また、乾燥状態で保存するため、酵素による分解等により保存中に標的ＲＮＡを損失するおそれを顕著に低減することができる。つまり、予め規定されている一定量の核酸を安定して保存し得るため、本発明の標的ＲＮＡの保存方法により保存された標的ＲＮＡは、保存後解析前に、濃度測定・濃度調整工程を経ることなく、その後の解析操作に供することができる。

該複合体の乾燥方法は、複合体中の標的ＲＮＡを損なうことなく乾燥させることができる方法であれば、特に限定されるものではない。例えば、該複合体を、エタノール等の揮発性が高くかつＲＮＡの溶解性が低い溶媒で洗浄した後、該溶媒を除去することにより、該複合体を乾燥させることができる。その他、凍結乾燥法により乾燥させてもよい。特に、該複合体を５０％以上のエタノールで洗浄することにより乾燥させることが好ましく、１００％エタノールで洗浄することにより乾燥させることがより好ましい。エタノール濃度が高いほど、該複合体を乾燥しやすくなるためである。乾燥した複合体は、常温で保存してもよく、４℃程度において冷蔵保存してもよく、冷凍保存してもよい。

本発明の標的ＲＮＡの保存方法により保存された標的ＲＮＡと固形支持体との複合体は、一定量の溶媒に溶出することにより、解析に供することができる。該溶媒は、ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅの溶液であれば特に限定されるものではなく、通常ＲＮＡの溶出に用いられているものを用いることができる。該溶媒として、例えば、ＲＮａｓｅ分解処理済みの純水、ＴＥバッファー等がある。また、標的ＲＮＡの解析は、前述の工程（ｅ）において記載した手法と同様に行うことができる。

次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［実施例１］
健常人の便にｃｏｘ−２を発現している培養細胞であるＭＫＮ４５細胞を混合した糞便試料から核酸を回収し、ｃｏｘ−２のｍＲＮＡを検出した。がん患者の糞便からｃｏｘ−２などの遺伝子のｍＲＮＡの発現量を見ることによって大腸がんの診断が行われている。なお、ＭＫＮ４５細胞は常法により培養した。
まず、健常人由来の糞便試料を、１５ｍＬチューブに０．８ｇずつ分取し、ＭＫＮ４５細胞をそれぞれ０、１×１０^２、１×１０^３、１×１０^４、１×１０^５、１×１０^６ｃｅｌｌｓずつ混合したものを各３セットずつ調製した。また、健常人由来の糞便試料を、１５ｍＬチューブに１．６ｇずつ分取し、ＭＫＮ４５細胞をそれぞれ０、１×１０^２、１×１０^３、１×１０^４、１×１０^５、１×１０^６ｃｅｌｌｓずつ混合したものも各３本ずつ調製した。これらの糞便試料を、液体窒素を用いて凍結させ、−８０℃で保存した。
その後、各試料を、４ｍＬのグアニジン塩とフェノールを含む抽出液を用いてホモジナイザーでホモジナイズし、クロロホルムで全ＲＮＡを抽出し、２ｍＬのＲＮＡ溶液を得た。
各３セットのうち１セットのＲＮＡ量を測定した。測定結果を表１に示す。この結果、ＲＮＡ溶液に含まれる核酸量は、いずれも２００μｇ以上であった。

残りの２セット計２４本のＲＮＡ溶液に対し、以下の操作を続けた。
まず、ＲＮＡＰｒｅｐ ｋｉｔ（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ社製）のシリカコート磁性粒子を含むＬｙｓｉｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎをｖｏｒｔｅｘで攪拌し、そこから５ｍＬとり、１５００ｒｐｍで１０分間遠心することにより、シリカコート磁性粒子を含まない上清を得た。該上清１４４０μＬに、ｖｏｒｔｅｘで攪拌した磁性粒子を含む１６０μＬのＬｙｓｉｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを混合し、通常の１／１０の濃度になる磁性粒子を含む固形支持体溶液（核酸結合能力が約３μｇ）を作成した。
得られた固形支持体溶液を用いて、ＲＮＡＰｒｅｐ ｋｉｔに添付のプロトコールに従い、ＲＮＡ溶液から核酸を回収した。
具体的には、１００μＬの各ＲＮＡ溶液（出発糞便量の１／２０量）に、１．５ｍＬの該固形支持体溶液を供給し、攪拌して３分間インキュベートした後、さらに攪拌した。なお、２ｍＬの各ＲＮＡ溶液のうち、１００μＬ中に含有されているＲＮＡ量は、該固形支持体溶液の核酸結合能力に対して過剰量であると予想される。攪拌後、全量を２．０ｍＬチューブに移し、磁性スタンドであるＳＰＩＲＩｓｔａｎｄ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）に立て、５分間静置した。
チューブ中にそのまま、磁性粒子である固形支持体を残し、上清のみを吸引除去した。１．５ｍＬの７０％エタノールを固形支持体に添加し、１分間のインキュベート後、エタノールを吸引除去した。さらに、ＤＮａｓｅI溶液を３００μＬ添加し、１５分間インキュベートした。１．４ｍＬのＢｉｎｄ ｓｏｌｕｔｉｏｎを添加し、撹拌後、ＳＰＩＲＩｓｔａｎｄに立て、１０分間静置し後、溶液を完全に吸引除去した。Ｗａｓｈ ｓｏｌｕｔｉｏｎを１．５ｍＬ添加し、撹拌後、ＳＰＩＲＩｓｔａｎｄ上で５分間静置し、上清を吸引除去した。１ｍＬの７０％エタノールを添加し、１分間インキュベートし、エタノールを吸引除去する工程を４度繰り返し、最後に、室温で風乾させた。３０μＬのＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒを添加し、撹拌後、５分間室温でインキュベートすることにより、固形支持体に結合させたＲＮＡを溶出した。その後再びチューブをＳＩＲＩＳＴＡＮＤ上に置き、５分間静置し、遊離ＲＮＡが含有されている上清を得た。
このようにして得られた各遊離ＲＮＡのうち、１セットのＲＮＡ量をそれぞれ測定した。測定結果を表２に示す。この結果、いずれも３μｇ程度のＲＮＡが回収されていた。つまり、これらの結果から、ＲＮＡ溶液が含有する核酸量よりも少量である一定量の核酸と可逆的に結合可能な固形支持体を用いて核酸を回収することにより、一定量の核酸を簡便に回収し得ることが明らかである。また、得られた３μｇのＲＮＡのうち１／３量である１０μＬ以下のｃｏｘ−２の解析に用いた。つまり、再現性を確認するために必要充分な１〜２回の反応分のみ残り、必要以上に核酸溶液のストックができなかった。

残る１セット１２本を、ＲＴ−ＰＣＲにかけて、ｃｏｘ−２のｍＲＮＡを検出した。
まず、各チューブに、リバースクリプトII（登録商標、和光純薬社製）を用いて、反応液量を２０μＬとして逆転写反応によりｃＤＮＡを合成した。このようにして得られたｃＤＮＡの一部を鋳型にｃｏｘ−２のＴａｑＭａｎ ａｓｓａｙ（アプライドバイオシステムズ社製）を行い、ｃｏｘ−２を増幅して検出した。具体的には、３０サイクルでの増幅シグナルの立ち上がりの有無を判定した。判定結果を表３に示す。なお、表３中、「ｃｏｘ−２」は、ｃｏｘ−２の検出の有無を示したものであり、各３０サイクル時点において、増幅シグナルの立ち上がりが観測されたものを陽性、観測されなかったものを陰性とした。

この結果、出発糞便量が０．８ｇと１．６ｇのいずれの場合であっても、糞便試料に最初に添加した細胞数が０．８ｇあたり１ｘ１０^３以上であった場合に、陽性となり、ｃｏｘ−２を検出することができた。この結果から、糞便試料中の標的ＲＮＡを、簡便かつ定量的に解析することが可能であることが明らかである。

［比較例１］
上記（３）の方法により、ＭＫＮ４５細胞を混合した糞便試料から核酸を回収し、ｃｏｘ−２のｍＲＮＡを検出した。すなわち、糞便中のＲＮＡの抽出を、有機溶媒を使わず直接、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ ＲＮＡＰｒｅｐ ｋｉｔで抽出した。なお、実施例１との比較が行えるように、出発糞便量を、０．８ｇの１／２０量である４０ｍｇとし、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ ＲＮＡＰｒｅｐ ｋｉｔのプロトコールを改変して行った。
実施例１と同様に調製することにより、通常の１／１０の濃度になる磁性粒子を含む固形支持体溶液（核酸結合能力が約３μｇ）を作成した。
１００μＬのＲＮＡ溶液に代えて４０ｍｇのＭＫＮ４５細胞含有糞便試料を用いることにより、実施例１と同様にしてＲＮＡを回収した。回収されたＲＮＡ量の測定結果を表４に記載する。上記（３）の方法のように、タンパク質等を除去せずにＲＮＡを回収する場合には、実施例１と同様の固形支持体溶液を用いた場合であっても、糞便試料からＲＮＡを定量的に回収することは非常に困難であることが明らかである。

［実施例２］
健常人由来の糞便試料を、３本の１５ｍＬチューブに０．５ｇずつ分取した後、液体窒素を用いて凍結させ、−８０℃で保存した。
その後、各試料を、３ｍＬの３．５Ｍグアニジウムチオシアネートと４０％フェノールを含む抽出液を用いてホモジナイザーでホモジナイズし、クロロホルムで全ＲＮＡを抽出し、３本の１００μＬのＲＮＡ溶液を得た。
得られた１００μＬのＲＮＡ溶液に、４５０μＬの７０％エタノールを添加した後、さらにそれぞれｐＨの異なる３５０μＬの溶解用バッファー（４Ｍ イソチオシアン酸グアニジニウム、２５ｍＭクエン酸ナトリウム）を添加して混合した。該溶解用バッファーは、塩酸又は水酸化ナトリウム溶液によって、ｐＨ３、７、１１にそれぞれ調整した。
ｐＨを調整した各ＲＮＡ溶液に、固形支持体である２５ｍｇのシリカ粒子（シグマ社製）を添加し、１０分間室温にてＶｏｒｔｅｘで攪拌した後、１２，０００×ｇ、５秒間遠心分離することによりシリカ粒子を沈殿させ、上清を除去した。続いて洗浄バッファーＲＰＥ（キアゲン社製）を用いてシリカ粒子を２回洗浄した。その後、沈殿を１００μＬのＴＥ バッファーに再度懸濁し、Ｖｏｒｔｅｘで攪拌後、１２，０００×ｇ、５秒間遠心分離することによりシリカ粒子を沈殿させ、遊離ＲＮＡが含有されている上清を回収した。
このようにして得られた上清中のＲＮＡ量をそれぞれ測定した。測定結果を表４に示す。この結果、ｐＨを変更することによって核酸結合量を調整することができることが確認された。

［実施例３］
溶出用バッファーのエタノール濃度を調整することにより、溶出する遊離ＲＮＡ量を調整した。具体的には、図１に基づき、シリカ粒子に結合している全ＲＮＡのうち２５％を溶出させ得るエタノール濃度を有するバッファーＡと、シリカ粒子に結合している全ＲＮＡのうち５０％を溶出させ得るエタノール濃度を有するバッファーＢを調整し、これらのバッファーを用いてＲＮＡの溶出を試みた。
まず、健常人由来の糞便試料を、６本の１５ｍＬチューブに０．５ｇずつ分取した後、液体窒素を用いて凍結させ、−８０℃で保存した。
その後、各試料を、３ｍＬの３．５Ｍグアニジウムチオシアネートと４０％フェノールを含む抽出液を用いてホモジナイザーでホモジナイズし、クロロホルムで全ＲＮＡを抽出し、６本の１００μＬのＲＮＡ溶液を得た。
得られた１００μＬのＲＮＡ溶液に、固形支持体である２５ｍｇのシリカ粒子（シグマ社製）を添加し、１０分間室温にてＶｏｒｔｅｘで攪拌した後、１２，０００×ｇ、５秒間遠心分離することによりシリカ粒子を沈殿させ、上清を除去した。その後、沈殿を１００μＬのバッファーＡ（１．７５Ｍ グアニジウムチオシアネート、１２．５ｍＭ クエン酸ナトリウム、０．５％ β-メルカプトエタノール、２３％ エタノール、ｐＨ７．５）に再度懸濁し、Ｖｏｒｔｅｘで十分に攪拌後、１２，０００×ｇ、５秒間遠心分離し、上清Ａを回収した。さらに、その後、沈殿を１００μＬのバッファーＢ（１．７５Ｍ グアニジウムチオシアネート、１２．５ｍＭ クエン酸ナトリウム、０．５％ β-メルカプトエタノール、１８％ エタノール、ｐＨ７．５）に再度懸濁し、Ｖｏｒｔｅｘで十分に攪拌後、１２，０００×ｇ、５秒間遠心分離し、上清Ｂを回収した。
このようにして得られた各試料における上清Ａ及び上清Ｂの吸光度を測定し、含有されているＲＮＡ量を求めた。測定結果を表５に示す。この結果、上清Ａ中のＲＮＡ量は、１．０１〜１．１２μｇであり、各６試料において、ほぼ一定量であった。一方、上清Ｂ中のＲＮＡ量は、１．０１〜１．０７μｇであり、上清Ａと同様に各６試料において、ほぼ一定量であった。すなわち、これらの結果から、溶出用バッファー中のエタノール濃度を適宜調整することにより、一定量ずつ分注し得ることが明らかである。

［実施例４］
実施例１と同様に、健常人由来の糞便試料を、１５ｍＬチューブに０．８ｇずつ分取し、ＭＫＮ４５細胞をそれぞれ０又は１×１０^３ｃｅｌｌｓずつ混合したものを各２セットずつ調製した後、液体窒素を用いて凍結させ、−８０℃で保存した。その後、各試料を、４ｍＬのグアニジン塩とフェノールを含む抽出液を用いてホモジナイザーでホモジナイズし、クロロホルムで全ＲＮＡを抽出し、２ｍＬのＲＮＡ溶液を得た。
得られた２種類４本のＲＮＡ溶液のうち、ＭＫＮ４５細胞の添加量が同じ糞便試料由来のＲＮＡ溶液同士を、一度混合して均一の試料とし、再度２ｍＬずつ２本に分注した。この結果、ＭＫＮ４５細胞を添加しなかった糞便試料由来の２ｍＬのＲＮＡ溶液と、ＭＫＮ４５細胞を１×１０^３ｃｅｌｌｓ添加した糞便試料由来の２ｍＬのＲＮＡ溶液と、からなるセットが２セット（セットＡとＢ）得られた。
これら２セットの各ＲＮＡ溶液に対して、実施例１と同様に、該固形支持体溶液（核酸結合能力が約３μｇ）に核酸を結合させた後、ＤＮａｓｅI溶液を添加してＤＮＡ分解処理をし、核酸を結合させた固形支持体をＷａｓｈ ｓｏｌｕｔｉｏｎで洗浄後、７０％エタノールを添加して吸引除去する工程を４度繰り返した。
その後、セットＡに対してのみ、実施例１と同様に、該固形支持体を室温で風乾させた後、３０μＬのＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒを添加して、該固形支持体からＲＮＡを遊離させ、遊離ＲＮＡが含有されている上清を得た。該上清は、その後、−８０℃で保存した。
一方、セットＢに対しては、核酸を結合させた固形支持体をさらに１ｍＬのアセトンで洗浄し、５６℃にて乾燥させた後、４℃で２週間保存した。２週間経過後、保存後の固形支持体に、実施例１と同様に、３０μＬのＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒを添加して、該固形支持体からＲＮＡを遊離させ、遊離ＲＮＡが含有されている上清を得た。
全セットの上清が揃った時点で、各上清中のＲＮＡ量をそれぞれ測定した。測定結果を表６に示す。この結果、セットＡとセットＢで、ほぼ同量のＲＮＡが得られていること確認された。すなわち、これらの結果から、本発明の標的ＲＮＡの保存方法により、一定量のＲＮＡを安定して保存し得ることが明らかである。

［実施例５］
実施例４と同様にして、ＭＫＮ４５細胞を添加しなかった糞便試料由来の２ｍＬのＲＮＡ溶液と、ＭＫＮ４５細胞を１×１０^３ｃｅｌｌｓ添加した糞便試料由来の２ｍＬのＲＮＡ溶液と、からなるセットを２セット（セットＡとＢ）得た。
これら２セットの各ＲＮＡ溶液に対して、実施例１と同様に、該固形支持体溶液（核酸結合能力が約３μｇ）に核酸を結合させた後、ＤＮａｓｅI溶液を添加してＤＮＡ分解処理をし、核酸を結合させた固形支持体をＷａｓｈ ｓｏｌｕｔｉｏｎで洗浄後、７０％エタノールを添加して吸引除去する工程を４度繰り返した後、さらに１ｍＬのアセトンで洗浄し、５６℃にて乾燥させた。
その後、セットＡに対してのみ、それぞれの乾燥済み固形支持体を、試料ごとに２００μＬのＰＣＲチューブに入れ、最終容量が１００μＬとなるようにＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ III Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ ｑＲＴ−ＰＣＲキット(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製)の全試薬を適宜添加した。その後、Ｖｏｒｔｅｘを行い、１０分間静置することにより固形支持体からＲＮＡを遊離させ、標的ＲＮＡを溶出した。続いて遠心分離を行い、固形支持体を沈殿させ、遊離ＲＮＡを含有する上清を得た。該上清５０μＬを新しい２００μＬのＰＣＲチューブに移し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ III Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ ｑＲＴ−ＰＣＲキットの手順に従って温度サイクルによる反応を行い、ｃｏｘ−２を増幅して検出した。具体的には、実施例１と同様に、３０サイクルでの増幅シグナルの立ち上がりの有無を判定した。
一方、セットＢは、乾燥後１週間保存した後、セットＡと同様にしてｃｏｘ−２を増幅して検出した。
表７は、各セットの判定結果を示したものである。なお、表７中、「ｃｏｘ−２」は、ｃｏｘ−２の検出の有無を示したものであり、各３０サイクル時点において、増幅シグナルの立ち上がりが観測されたものを陽性、観測されなかったものを陰性とした。この結果、乾燥後速やかに検出に用いたセットＡと乾燥後１週間保存した後に検出に用いたセットＢのいずれにおいても、最初にＭＫＮ４５細胞を添加した糞便試料由来の試料では陽性となり、添加しなかった糞便試料由来の試料では陰性となった。これらの結果から、本発明の標的ＲＮＡの保存方法により保存されたＲＮＡを用いて、標的ＲＮＡを定量的に解析し得ることが明らかである。

［実施例６］
実施例１と同様に、健常人由来の糞便試料を、１５ｍＬチューブに０．８ｇずつ分取し、ＭＫＮ４５細胞をそれぞれ０、１×１０^２、０．５×１０^３、１×１０^３ｃｅｌｌｓずつ混合したものを各５セットずつ調製した後、液体窒素を用いて凍結させ、−８０℃で保存した。その後、各試料を、４ｍＬのグアニジン塩とフェノールを含む抽出液を用いてホモジナイザーでホモジナイズし、クロロホルムで全ＲＮＡを抽出し、２ｍＬのＲＮＡ溶液を得た。
得られた４種類２０本のＲＮＡ溶液のうち、ＭＫＮ４５細胞の添加量が同じ糞便試料由来のＲＮＡ溶液同士を、一度混合して均一の試料とし、再度２ｍＬずつ５本に分注した。この結果、ＭＫＮ４５細胞を添加しなかった糞便試料由来の２ｍＬのＲＮＡ溶液と、１×１０^２ｃｅｌｌｓ添加した糞便試料由来の２ｍＬのＲＮＡ溶液と、０．５×１０^３ｃｅｌｌｓ添加した糞便試料由来の２ｍＬのＲＮＡ溶液と、１×１０^３ｃｅｌｌｓ添加した糞便試料由来の２ｍＬのＲＮＡ溶液と、からなるセットが５セット（セットＡ〜Ｅ）得られた。
これら５セットの各ＲＮＡ溶液に対して、実施例１と同様に、該固形支持体溶液（核酸結合能力が約３μｇ）に核酸を結合させた後、ＤＮａｓｅI溶液を添加してＤＮＡ分解処理をし、核酸を結合させた固形支持体をＷａｓｈ ｓｏｌｕｔｉｏｎで洗浄後、７０％エタノールを添加して吸引除去する工程を４度繰り返した後、さらに１ｍＬのアセトンで洗浄し、５６℃にて乾燥させ、乾燥済み固形支持体を得た。その後、セットＣ、Ｄ、Ｅは４℃で１週間保存した。

セットＡとＢの全８つの乾燥済み固形支持体のそれぞれを、試料ごとに２００μＬのＰＣＲチューブに入れ、最終容量が１００μＬとなるようにＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ III Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ ｑＲＴ−ＰＣＲキット(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製)の全試薬を適宜添加した。その後、Ｖｏｒｔｅｘを行い、１０分間静置した後、固形支持体からＲＮＡを遊離させ、標的ＲＮＡを溶出した。続いて遠心分離を行い、固形支持体を沈殿させ、遊離ＲＮＡを含有する上清を得た。該上清５０μＬを新しい２００μＬのＰＣＲチューブに移し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ III Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ ｑＲＴ−ＰＣＲキットの手順に従って温度サイクルによる反応を行い、ｃｏｘ−２を増幅して検出した。具体的には、実施例１と同様に、３０サイクルでの増幅シグナルの立ち上がりの有無を判定した。
その結果、セットＡとＢのいずれにおいても、ＭＫＮ４５細胞を０又は１×１０^２ｃｅｌｌｓずつ混合した糞便試料由来の乾燥済み固形支持体を用いた場合にはｃｏｘ−２陰性であり、１×１０^３ｃｅｌｌｓ添加した糞便試料由来の乾燥済み固形支持体を用いた場合にはｃｏｘ−２陽性であった。これに対して、ＭＫＮ４５細胞を０．５×１０^３ｃｅｌｌｓ添加した糞便試料由来の乾燥済み固形支持体を用いた場合には、セットＡにおいて陰性であり、セットＢにおいて陽性であり、判定がバラついた。

０．５×１０^３ｃｅｌｌｓ添加した糞便試料由来のサンプルにおける判定のバラつきが、操作の過程で何らかのエラーが生じたせいであるのか、それともｃｏｘ−２の濃度が検出限界値付近であるために、必然的にバラついた結果であるのかを判断するために、保存しておいたセットＣ、Ｄ、Ｅのうち、０．５×１０^３ｃｅｌｌｓ添加した糞便試料由来の乾燥済み固形支持体についてのみ、再度検出を行った。
まず、４℃で１週間保存したセットＣ、Ｄ、Ｅの０．５×１０^３ｃｅｌｌｓ添加した糞便試料由来の乾燥済み固形支持体のそれぞれを、試料ごとに２００μＬのＰＣＲチューブに入れ、セットＡとＢの試料と同様にＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ III Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ ｑＲＴ−ＰＣＲキットを用いて標的ＲＮＡを溶出した後、ｃｏｘ−２を増幅して検出した。
その結果、セットＣとＥにおいて陽性であったが、セットＤにおいて陰性であり、やはり判定がバラついた。３つの試料のうち２本が陽性であったことから、該試料は陽性であると判断した。
もともとセットＡ〜Ｅの試料はすべて均一の試料である。にもかかわらず、２度とも結果がバラついていることから、判定のバラツキは、操作上の問題ではなく、ｃｏｘ−２の濃度が検出限界値付近であるために生じたものであり、判定結果は適切であると考えられた。

このように、最初の判定結果に疑義が生じた場合であっても、本発明の標的ＲＮＡの保存方法を用いることにより、一定量の核酸を安定して保存することができるため、保存後解析前に濃度測定・濃度調整工程を要することなく、速やかに再検査を行うことができる。なお、このように定量的に核酸を回収したにもかかわらず、結果がバラついた場合に、３つの試料を同時に検査することによって誤判定を防ぐことができる。このため、３つ以上の試料を用いて検査を行うことが好ましいが、２つの試料であってもよい。２つの場合には、２つの結果が一致した場合にのみその結果を採用し、結果が異なった場合には再検査を行うことが好ましい。

本発明の標的ＲＮＡの解析方法を用いることにより、回収した核酸の濃度測定・濃度調整工程無しに、解析に必要最低限量の核酸をより高精度に安定して回収することができるため、がん検出等のための糞便中のＲＮＡの定量的な解析を、簡便な操作と低コストで行うことが可能となり、臨床検査の分野において利用が可能である。

１．７５Ｍグアニジンチオシアネート中の各エタノール濃度における、シリカ含有化合物のＤＮＡ及びＲＮＡに対する結合能力を示した図である。

Claims (18)

1. 糞便試料中に存在する標的ＲＮＡを解析する方法であって、
   （ａ） 糞便試料から核酸を抽出し、ＲＮＡ溶液を得る工程と、
   （ｂ） 前記ＲＮＡ溶液が含有する核酸量よりも少量である一定量の核酸と可逆的に結合可能な固形支持体を、前記ＲＮＡ溶液に供給する工程と、
   （ｃ） 前記工程（ｂ）において供給された固形支持体と、前記ＲＮＡ溶液が含有するＲＮＡの一部とで複合体を形成させる工程と、
   （ｄ） 前記複合体を形成していない核酸を、前記複合体から分離除去する工程と、
   （ｅ） 前記工程（ｄ）の後、前記複合体を形成している標的ＲＮＡを検出又は定量する工程と、
   を有することを特徴とする標的ＲＮＡの解析方法。
2. 前記工程（ｅ）が、
   （ｅ１） 前記工程（ｄ）後、前記複合体から、溶出用バッファーを供給することにより、前記複合体を形成しているＲＮＡの一部を溶出して遊離させる工程と、
   （ｅ２） 前記工程（ｅ１）により得られた遊離ＲＮＡを用いて核酸増幅を行う工程と、
   を有することを特徴とする請求項１記載の標的ＲＮＡの解析方法。
3. 前記工程（ｅ１）が、前記溶出用バッファーの組成、ｐＨ、又は温度を調節し、前記固形支持体の核酸結合能力を調整することにより、前記複合体から、前記複合体を形成しているＲＮＡの一部を溶出して遊離させる工程であること、を特徴とする請求項２記載の標的ＲＮＡの解析方法。
4. 前記工程（ｅ）が、
   （ｅ１’） 前記工程（ｄ）後、前記複合体から、溶出用バッファーを供給することにより、前記複合体を形成しているＲＮＡを溶出して遊離させる工程と、
   （ｅ２’） 前記工程（ｅ１’）により得られた遊離ＲＮＡを用いて核酸増幅を行う工程と、
   を有することを特徴とする請求項１記載の標的ＲＮＡの解析方法。
5. 前記工程（ｅ）が、
   （ｅ１”） 前記工程（ｄ）後、前記複合体を形成しているＲＮＡを用いて核酸増幅を行う工程と、
   を有することを特徴とする請求項１記載の標的ＲＮＡの解析方法。
6. 前記工程（ａ）において、フェノール又はフェノール／クロロホルムを用いて核酸を抽出することを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載の標的ＲＮＡの解析方法。
7. 前記工程（ａ）において、さらにカオトロピック塩を用いて核酸を抽出することを特徴とする請求項６記載の標的ＲＮＡの解析方法。
8. 前記固形支持体が、シリカ質オキシド被覆磁性粒子であることを特徴とする請求項１〜７のいずれか記載の標的ＲＮＡの解析方法。
9. 前記工程（ａ）において、０．１〜１ｇの糞便試料から核酸を抽出することを特徴とする請求項１〜８のいずれか記載の標的ＲＮＡの解析方法。
10. 前記工程（ａ）において得られたＲＮＡ溶液が含有する核酸量が、２００μｇ以上であることを特徴とする請求項１〜９のいずれか記載の標的ＲＮＡの解析方法。
11. 前記工程（ａ）において得られたＲＮＡ溶液が含有する核酸量が、１０μｇ以上であることを特徴とする請求項１〜９のいずれか記載の標的ＲＮＡの解析方法。
12. 前記工程（ｂ）において供給された前記固形支持体の核酸結合能力が、２μｇ以下であることを特徴とする請求項１〜１１のいずれか記載の標的ＲＮＡの解析方法。
13. 前記工程（ｂ）において供給された前記固形支持体の核酸結合能力が、１μｇ以下であることを特徴とする請求項１〜１１のいずれか記載の標的ＲＮＡの解析方法。
14. 前記核酸増幅が、増幅された核酸量を経時的に計測する方法を用いて行われることを特徴とする請求項２〜１１のいずれか記載の標的ＲＮＡの解析方法。
15. 前記核酸増幅が、逆転写反応により得られたｃＤＮＡを鋳型として、リアルタイムＰＣＲを行うことを特徴とする請求項１４記載の標的ＲＮＡの解析方法。
16. 前記糞便試料が、凍結乾燥処理済み糞便試料であることを特徴とする請求項１〜１５のいずれか記載の標的ＲＮＡの解析方法。
17. 糞便試料中に存在する標的ＲＮＡを保存する方法であって、
    （ａ） 糞便試料から核酸を抽出し、ＲＮＡ溶液を得る工程と、
    （ｂ） 前記ＲＮＡ溶液が含有する核酸量よりも少量である一定量の核酸と可逆的に結合可能な固形支持体を、前記ＲＮＡ溶液に供給する工程と、
    （ｃ） 前記工程（ｂ）において供給された固形支持体と、前記ＲＮＡ溶液が含有するＲＮＡの一部とで複合体を形成させる工程と、
    （ｄ） 前記複合体を形成していない核酸を、前記複合体から分離除去する工程と、
    （ｆ） 前記工程（ｄ）の後、前記複合体を乾燥させた後保存する工程と、
    を有することを特徴とする標的ＲＮＡの保存方法。
18. 請求項１７記載の標的ＲＮＡの保存方法を用いて保存した標的ＲＮＡを解析することを特徴とする標的ＲＮＡの解析方法。

Images