CN111088363B - 基于双链dna肽连接酶的jak1基因特定突变检测试剂盒及方法 - Google Patents

基于双链dna肽连接酶的jak1基因特定突变检测试剂盒及方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种基于双链DNA肽连接酶的JAK1基因g.[227149insA]突变检测试剂盒及方法，是在指数扩增前就直接先对目标基因突变片段进行捕获富集，然后再对目标基因突变片段进行特异性扩增和检测的。JAK1基因g.[227149insA]检测试剂盒主要包括：dDPlaseII连接酶，dDPlaseII连接酶缓冲液，RNase H酶，磁载多肽Ps，RNA引物Pr，DNA引物Pn，DNA片段Pd和DNA引物Pm，其中dDPlaseII连接酶其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；检测方法主要包括前扩增、RNase H酶消化、dDPlaseII酶连接和磁珠分离、特异性扩增这4部分。本发明提供的检测试剂盒和检测方法，具有特异性强和准确高效、简便经济的特点，可以有效检测出样本中含量低至1%的JAK1基因g.[227149insA]突变，可以应用于中年女性结直肠癌患者肝转移的预测和诊治中。

Description

基于双链DNA肽连接酶的JAK1基因特定突变检测试剂盒及 方法
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种基于双链DNA肽连接酶的JAK1基因g.[227149insA]突变检测试剂盒及其检测方法。
背景技术
基因是生物体的遗传物质，由其表达的蛋白质承担着生物体内的各项生命机能。基因发生变异或突变将导致生物体出现不同的生物特性或疾病状态。基因突变是基因在其分子结构上发生的核苷酸组成或排列顺序的改变，主要包括点突变、移码突变、缺失突变和插入突变这四种。基因突变和肿瘤的发生发展密切相关。目前，肿瘤已成为全世界范围内发病率和致死率最高的疾病。根据国家癌症中心2019年发布的数据显示，我国2015年新发癌症病例约392.9万例（平均每天超过1万人被确诊为癌症），死亡人数约233.8万例；近10多年来，我国癌症发病率每年保持约3.9％的增幅，死亡率每年保持约2.5％的增幅，给国人的生命健康造成了重大的威胁和沉重的负担。
在癌症诊治过程中常采用的血清肿瘤标志物和CT等检测手段具有局限性，首先其敏感性和特异性均不高，其次发现有异常时往往已是中晚期，最关键的是无法准确反映出癌灶的分子特征。癌症是一种基因疾病，其发生发展过程中涉及了各种基因突变，它是一个多基因突变累积的过程。因此解析癌症样本中存在的基因突变尤其是驱动基因等关键基因的特定突变，才能从分子本质上体现癌症的真实状况，这对于探究癌症的发生发展机制和预测癌症的发展变化，对于癌症的筛查和诊断，对于癌症的用药和治疗等方面都具有重要的意义。然而在癌症样本中，癌灶部分往往只占检材中的一部分，并且发生特定基因突变的癌细胞也只是癌灶中的一部分（癌灶的异质性），即癌症检测样本中常常存在着大量的野生型基因，尤其是在早癌样本中突变基因只占微小的比例，因此要从中准确有效地检测出特定的基因突变将具有很大的挑战性。
目前有多种分子技术可用于癌症基因突变的检测，如PCR-Sanger测序法、实时荧光定量PCR、扩增阻滞突变系统PCR（ARMS-PCR）、数字PCR、变性高效液相色谱法（D-HPLC）以及二代测序（NGS）等方法。其中多数是基于PCR的方法，然而常规PCR扩增时无法区分野生型基因和突变基因，必需进行特定的设计或解析。如常规应用的PCR-Sanger测序法，就是扩增出特定基因片段，然后进行Sanger测序，利用测序峰图来分析特定基因位点的突变情况；再如商品化的ARMS技术，就是设计针对特定基因突变的扩增引物和检测探针，来实现特定基因突变的特异扩增和检测的；再如非常热门的二代测序技术，就是首先无区分地扩增特定基因片段，再利用二代测序超高通量的并行测序能力测出所有扩增基因片段，最后解析其中的突变。
本发明借助于申请人前期研究获取的双链DNA肽连接酶dDPlaseII（详见申请人之前提交的发明专利申请：一种双链DNA肽连接酶dDPlaseII及使用方法，申请号：2020100773289），提出了一种特定基因突变的检测新方法，与现有方法不同的是本发明方法是在指数扩增前，先利用dDPlaseII酶连接和磁珠吸附直接对目标基因突变片段进行捕获富集，然后再对目标基因突变片段进行特异性扩增和检测的。这是一种全新的特定基因突变检测方法，具有特异性强和准确高效、简便经济的特点。基于此，本发明将其应用于JAK1基因g.[227149insA]突变的检测，提供了具体的检测试剂盒及其检测方法。
发明内容
本发明提供了基于特定双链DNA肽连接酶dDPlaseII的JAK1基因g.[227149insA]突变的检测试剂盒及其对应的检测方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下：
本发明的目的之一在于提供一种基于特定双链DNA肽连接酶dDPlaseII的JAK1基因g.[227149insA]突变的检测试剂盒，其主要组分包括：（1）dDPlaseII连接酶，dDPlaseII连接酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，对应的基因编码序列如SEQ ID NO：2所示；（2）dDPlaseII连接酶缓冲液，由pH为7.8的450mM Tris-Hcl、100mM Mg2+、80mM NaCl、20mM ATP和8mM Triton X-100组成，每1μl反应体系中添加0.1μl的连接酶缓冲液；（3）RNase H酶，采用美国Thermo Fisher公司产品，包括其配套的缓冲液；（4）磁载多肽Ps，其中多肽Ps的氨基酸序列为N’-EAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGMANCEHL-C’，其N端氨基酸E需要进行生物素修饰；（5）RNA引物Pr，其序列为5’-AGUUUGUGGAAGGGGGUCCU-3’；（6）DNA引物Pn，其序列为5’-CTGAACAGCTGACCCATGGT-3’；（7）DNA片段Pd，其序列为5’-AGGACCCCCTTCCACAAACT-3’；（8）DNA引物Pm，其序列为5’-CTGGATCATCTTCATGCAC-3’。
其中，试剂盒组分（4）即磁载多肽Ps的主要制备步骤为：1）取0.1ml磁珠按照链霉亲和素磁珠产品说明书中方法进行磁珠的准备，用15ml的离心管装载，采用磁珠产品中自带的缓冲液，最终得到10ml工作液状态下的磁珠液；2）往1）中的磁珠液中加入10mmol/l的多肽Ps溶液0.1ml，采用垂直旋转混匀仪室温下保持充分混匀10min；3）借助磁力架并用缓冲液洗涤已包被多肽的磁珠3次，去除未结合物质，之后加入适量超纯水进行重悬，则可得到磁载多肽Ps悬液。除了本发明试剂盒各组分外，JAK1基因g.[227149insA]突变的检测还需要一些常规通用组分，如Taq DNA聚合酶、PCR buffer、dNTP mix等，可以自行采备。
本发明的目的之二在于提供一种基于特定双链DNA肽连接酶dDPlaseII的JAK1基因g.[227149insA]突变的检测方法，即采用上述试剂盒进行JAK1基因g.[227149insA]突变检测的检测方法，其主要包括如下步骤：
（1）前扩增
以提取的待测样本基因组DNA为模板，采用RNA引物Pr和DNA引物Pn对JAK1基因目标片段进行前扩增富集，所得到的产物为前扩增产物，具体扩增体系为：1μl的10×PCRBuffer（Mg2+plus），1μl的dNTP mix（each10mM），1μl的引物Pr(1μmol/l)，1μl的引物Pn(1μmol/l)，0.1μl的Taq DNA聚合酶(5U/μl)，1μl的DNA模板（>50ng/μl），最后再用灭菌无RNA酶超纯水补足至总体积为10μl；具体扩增条件为：95℃预变性3min；94℃变性15s，50℃退火20s，72℃延伸30s，循环10次；72℃终延伸1min。
（2）RNase H酶消化
采用RNase H酶消化前扩增产物中的RNA单链区，使其暴露出突变区域即dDPlaseII酶识别区，具体做法为：前扩增结束后，往前扩增产物体系中加入1μl 的DNA片段Pd（10μmol/l），25℃下保温10min，之后再加入1μl的RNase H（5U/μl），按照说明书方法配制15μl的总消化反应体系，并在37℃下消化5min，最终得到消化产物。
（3）dDPlaseII酶连接和磁珠分离
利用dDPlaseII酶催化突变基因片段和多肽Ps的共价连接，再通过磁珠将连接产物分离出来，具体做法是首先配制dDPlaseII酶连接反应体系：15μl 的RNase H酶消化产物，1μl的1ng/μL的磁载多肽Ps，5μl的连接酶缓冲液（由pH为7.8的450mM Tris-Hcl、100mMMg2+、80mM NaCl、20mM ATP和8mM Triton X-100组成），0.1μg的dDPlaseII连接酶，最终用灭菌超纯水补足至总体积为50μl；反应条件为：将连接体系置于40℃下保温5min。连接反应结束后，将连接反应产物全部吸出，转移到1.5ml灭菌塑料离心管中，并加入250μl灭菌超纯水，后将离心管置于磁力架上3min以让磁珠吸附在离心管壁上，小心吸出并废弃其中的液体，将离心管从磁力架上移开并再加入250μl灭菌超纯水重悬，后再将离心管置于磁力架上3min以让磁珠重新吸附在离心管壁上，再次小心吸出并废弃其中的液体，最后再将离心管从磁力架上移开并再加入10μl灭菌超纯水重悬磁珠，即得到磁载多肽Ps和突变基因片段的连接产物，转入灭菌PCR管中待用。
（4）突变基因片段特异性扩增
以（3）中经磁珠分离的连接产物为模板，采用Pm和Pn引物对JAK1基因的g.[227149insA]突变片段进行特异性扩增，扩增体系为：5μl的10×PCR Buffer（Mg2+plus），4μl的dNTP mix（each10mM），1μl的引物Pm(10μmol/l)，1μl的引物Pn(10μmol/l)，0.25μl的TaqDNA聚合酶(5U/μl)，10μl分离得到的连接产物，最后再用灭菌超纯水补足至总体积为50μl；扩增条件为：95℃预变性3min；94℃变性15s，52℃退火20s，72℃延伸30s，循环30次；72℃终延伸5min。扩增结束后，将扩增产物送基因公司进行Sanger测序分析，分析测序结果获取突变情况。
其中上述检测方法中用到的dDPlaseII连接酶，dDPlaseII连接酶缓冲液，RNase H酶，磁载多肽Ps，RNA引物Pr，DNA引物Pn，DNA片段Pd，DNA引物Pm均为本发明提供的JAK1基因g.[227149insA]突变检测试剂盒中组分。其余常规通用组分如Taq DNA聚合酶、PCRbuffer、dNTP mix等自备。
附图说明
图1是基于双链DNA肽连接酶dDPlaseII的JAK1基因g.[227149insA]突变检测原理示意图。
图2是常规PCR-Sanger测序法（图A）和本发明方法（图B）在JAK1基因g.[227149insA]突变处的Sanger测序图谱，圆圈处为突变位点。图中的检测对象为JAK1基因g.[227149insA]突变含量为24.7%的样本。g.[227149insA]突变代表其中一条链的第227149位点插入了A核苷酸，在图中加粗表示；下划线部分为连接酶识别位点。
具体实施方式
参照申请人之前提交的发明专利申请（一种双链DNA肽连接酶dDPlaseII及使用方法，申请号：2020100773289），本发明申请人前期研究获取到了一种可用于催化特定双链DNA和特定多肽共价连接的双链DNA肽连接酶dDPlaseII，并探究了其酶学特性。dDPlaseII酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，对应的基因编码序列如SEQ ID NO：2所示。dDPlaseII酶可以识别5’末端起始为5’-CTGGATCAT-3’双链序列且该5’末端脱氧核糖核苷酸C为磷酸化状态的特定DNA双链和C末端起始为N’-MANCEHL-C’这7肽的特定多肽链，并催化DNA双链5’末端磷酸化的胞嘧啶脱氧核糖核苷酸C和多肽链C末端的亮氨酸L之间发生脱水缩合反应形成O=P-C=O构造磷碳键，使得双链DNA和多肽以共价键相互连接在一起。其中N’-MANCEHL-C’这7肽具体为N’-甲硫氨酸-丙氨酸-天冬酰胺-半胱氨酸-谷氨酸-组氨酸-亮氨酸-C’。
申请人前期在探究结直肠癌转移相关基因时发现了系列新的基因突变，其中在约65%的中年女性结直肠癌肝转移患者样本中发现普遍存在JAK1基因的g.[227149insA]新突变。JAK1基因的g.[227149insA]突变是指JAK1野生型基因（参考NCBI登录号为NG_023402.2的序列）第227149位点发生了插入突变，该位点插入了A=T核苷酸对。g.[227149insA]突变后JAK1基因该突变处序列变成5’-CTGGATCAT-3’（其互补链序列为5’-ATGATCCAG-3’），能够被dDPlaseII酶所识别，在此基础上申请人构建了JAK1基因g.[227149insA]突变的检测试剂盒和对应的检测方法，其检测原理详见图1。假设样本中含有大量的野生型JAK1基因和微量的含g.[227149insA]突变的JAK1突变基因，g.[227149insA]突变用星号标识。图1中JAK1基因黑色标识区域为dDPlaseII酶的识别区，突变基因该区域序列（5’-CTGGATCAT-3’）恰可以被dDPlaseII酶所识别；而由于dDPlaseII酶对识别区的严谨性，野生型基因该区域序列（5’-CTGGATCT-3’）是无法被dDPlaseII酶所识别的。
图1所示的JAK1突变基因检测过程主要包括前扩增、RNase H酶消化、dDPlaseII酶连接和磁珠分离、特异性扩增这4部分。（1）首先以样本中的基因组DNA提取物为模板，采用紧邻dDPlaseII酶识别区（即黑色区域）的上游引物Pr和下游引物Pn进行约10个循环左右的前扩增，旨在先对JAK1基因目标区域进行一定量的富集，得到的是前扩增产物。其中上游引物Pr采用的是RNA引物，用虚线标识，箭头所指为其扩增方向，由于Taq DNA聚合酶无法以RNA为模板合成DNA，因此前扩增产物的Pr引物端为RNA单链区（Pr引物所致），用虚线标识。（2）接着加入与前扩增产物的RNA单链区（即Pr引物）互补的DNA片段Pd，Pd和前扩增产物共孵育后再加入RNase H酶（可消化DNA-RNA杂交链中的RNA）进行处理，则前扩增产物的RNA区域将被RNase酶消化掉，得到的是消化产物，此时的消化产物一端暴露出了dDPlaseII酶识别区（即黑色区域）。（3）再加入dDPlaseII酶和另外一种底物即多肽Ps，则突变基因片段可以被dDPlaseII酶所识别，并将其和多肽Ps进行共价连接得到连接产物，而野生型基因片段则没有被识别和连接。由于多肽Ps借助其N末端E氨基酸上修饰的生物素被连接在包被有链霉亲和素的磁珠上，因此突变基因片段和多肽Ps的连接产物此时就借助多肽Ps连接到了磁珠上，于是利用磁力架就可以有效地分离出突变基因片段了。（4）最后以捕获的突变基因片段为模板，采用靶向突变基因片段的引物对（Pm和Pn）进行常规PCR就可以实现对突变基因片段的特异和高效扩增了，再利用Sanger测序等技术解析特异性扩增产物中的突变。
因此，本发明提供了一种基于特定双链DNA肽连接酶dDPlaseII的JAK1基因g.[227149insA]突变的检测试剂盒，其主要组分包括：（1）dDPlaseII连接酶，dDPlaseII连接酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，对应的基因编码序列如SEQ ID NO：2所示；（2）dDPlaseII连接酶缓冲液，由pH为7.8的450mM Tris-Hcl、100mM Mg2+、80mM NaCl、20mM ATP和8mM Triton X-100组成，每1μl反应体系中添加0.1μl的连接酶缓冲液；（3）RNase H酶，采用美国Thermo Fisher公司产品，包括其配套的缓冲液；（4）磁载多肽Ps，其中多肽Ps的氨基酸序列为N’-EAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGMANCEHL-C’，其N端氨基酸E需要进行生物素修饰；（5）RNA引物Pr，其序列为5’-AGUUUGUGGAAGGGGGUCCU-3’；（6）DNA引物Pn，其序列为5’-CTGAACAGCTGACCCATGGT-3’；（7）DNA片段Pd，其序列为5’-AGGACCCCCTTCCACAAACT-3’；（8）DNA引物Pm，其序列为5’-CTGGATCATCTTCATGCAC-3’。
其中，试剂盒组分（4）即磁载多肽Ps的主要制备步骤为：1）取0.1ml磁珠按照链霉亲和素磁珠产品说明书中方法进行磁珠的准备，用15ml的离心管装载，采用磁珠产品中自带的缓冲液，最终得到10ml工作液状态下的磁珠液；2）往1）中的磁珠液中加入10mmol/l的多肽Ps溶液0.1ml，采用垂直旋转混匀仪室温下保持充分混匀10min；3）借助磁力架并用缓冲液洗涤已包被多肽的磁珠3次，去除未结合物质，之后加入适量超纯水进行重悬，则可得到磁载多肽Ps悬液。除了本发明试剂盒各组分外，JAK1基因g.[227149insA]突变的检测还需要一些常规通用组分，如Taq DNA聚合酶、PCR buffer、dNTP mix等，可以自行采备。
此外，本发明提供了一种基于特定双链DNA肽连接酶dDPlaseII的JAK1基因g.[227149insA]突变的检测方法，即采用上述试剂盒进行JAK1基因g.[227149insA]突变检测的检测方法，其主要包括如下步骤：
（1）前扩增
以提取的待测样本基因组DNA为模板，采用RNA引物Pr和DNA引物Pn对JAK1基因目标片段进行前扩增富集，所得到的产物为前扩增产物，具体扩增体系为：1μl的10×PCRBuffer（Mg2+plus），1μl的dNTP mix（each10mM），1μl的引物Pr(1μmol/l)，1μl的引物Pn(1μmol/l)，0.1μl的Taq DNA聚合酶(5U/μl)，1μl的DNA模板（>50ng/μl），最后再用灭菌无RNA酶超纯水补足至总体积为10μl；具体扩增条件为：95℃预变性3min；94℃变性15s，50℃退火20s，72℃延伸30s，循环10次；72℃终延伸1min。
（2）RNase H酶消化
采用RNase H酶消化前扩增产物中的RNA单链区，使其暴露出突变区域即dDPlaseII酶识别区，具体做法为：前扩增结束后，往前扩增产物体系中加入1μl 的DNA片段Pd（10μmol/l），25℃下保温10min，之后再加入1μl的RNase H（5U/μl），按照说明书方法配制15μl的总消化反应体系，并在37℃下消化5min，最终得到消化产物。
（3）dDPlaseII酶连接和磁珠分离
利用dDPlaseII酶催化突变基因片段和多肽Ps的共价连接，再通过磁珠将连接产物分离出来，具体做法是首先配制dDPlaseII酶连接反应体系：15μl 的RNase H酶消化产物，1μl的1ng/μL的磁载多肽Ps，5μl的连接酶缓冲液（由pH为7.8的450mM Tris-Hcl、100mMMg2+、80mM NaCl、20mM ATP和8mM Triton X-100组成），0.1μg的dDPlaseII连接酶，最终用灭菌超纯水补足至总体积为50μl；反应条件为：将连接体系置于40℃下保温5min。连接反应结束后，将连接反应产物全部吸出，转移到1.5ml灭菌塑料离心管中，并加入250μl灭菌超纯水，后将离心管置于磁力架上3min以让磁珠吸附在离心管壁上，小心吸出并废弃其中的液体，将离心管从磁力架上移开并再加入250μl灭菌超纯水重悬，后再将离心管置于磁力架上3min以让磁珠重新吸附在离心管壁上，再次小心吸出并废弃其中的液体，最后再将离心管从磁力架上移开并再加入10μl灭菌超纯水重悬磁珠，即得到磁载多肽Ps和突变基因片段的连接产物，转入灭菌PCR管中待用。
（4）突变基因片段特异性扩增
以（3）中经磁珠分离的连接产物为模板，采用Pm和Pn引物对JAK1基因的g.[227149insA]突变片段进行特异性扩增，扩增体系为：5μl的10×PCR Buffer（Mg2+plus），4μl的dNTP mix（each10mM），1μl的引物Pm(10μmol/l)，1μl的引物Pn(10μmol/l)，0.25μl的TaqDNA聚合酶(5U/μl)，10μl分离得到的连接产物，最后再用灭菌超纯水补足至总体积为50μl；扩增条件为：95℃预变性3min；94℃变性15s，52℃退火20s，72℃延伸30s，循环30次；72℃终延伸5min。扩增结束后，将扩增产物送基因公司进行Sanger测序分析，分析测序结果获取突变情况。
其中上述检测方法中用到的dDPlaseII连接酶，dDPlaseII连接酶缓冲液，RNase H酶，磁载多肽Ps，RNA引物Pr，DNA引物Pn，DNA片段Pd，DNA引物Pm均为本发明提供的JAK1基因g.[227149insA]突变检测试剂盒中组分。其余常规通用组分如Taq DNA聚合酶、PCRbuffer、dNTP mix等自备。
以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。
实施例1体系和方法构建
收集福建省内经临床病理确诊且行切除术的结直肠癌患者，并且这些患者曾经因临床诊治需要有在第三方基因公司进行过包含JAK1基因在内的癌症基因或全外显子组或全基因组测序（二代测序法）。在这些结直肠癌患者充分知情同意和满足临床诊治的情况下取其术后石蜡包埋组织样本，并收集其基因检测报告和数据。符合条件的结直肠癌患者共26例，二代基因测序测得的患者JAK1基因突变情况（已知）如表4所示。本实施例将采用上述基于特定双链DNA肽连接酶dDPlaseII的JAK1基因g.[227149insA]突变检测试剂盒和检测方法，对这26例结直肠癌患者样本进行JAK1基因g.[227149insA]突变的检测，具体如下。
（1）前扩增
采用德国Qiagen公司的石蜡包埋组织基因组提取试剂盒（QIAamp DNA FFPETissue Kit）按照说明书方法提取患者石蜡组织切片样本基因组DNA。设计并合成相关引物，按照表1中的PCR体系（10μl）和条件进行JAK1基因g.[227149insA]突变所在片段的前扩增，旨在对目的基因片段进行一定量的富集。其中委托公司合成的上游引物Pr紧邻dDPlaseII酶识别区（即图1中JAK1基因黑色区域），其为RNA引物（序列为5’-AGUUUGUGGAAGGGGGUCCU-3’），而非常规的DNA引物，因此表1所示PCR体系中的各组分和耗材尽量采用RNase-free级别。下游引物Pn为DNA引物，其序列为5’-CTGAACAGCTGACCCATGGT-3’。由于前扩增只有10个循环，因此引物Pr和Pn均只取1μmol/L浓度加1μl，Taq DNA聚合酶取5U/μl加0.1μl，终延伸进行1min即可。前扩增片段理论长度为476bp。表1中的PCR体系亦可采用PCR mix预混液按照说明书方法配制。
表1 前扩增体系和条件
Figure 614126DEST_PATH_IMAGE001
（2）RNase H酶消化
前扩增结束后，往前扩增产物体系中加入与Pr引物（即前扩增产物的RNA区域，由于Taq聚合酶无法以RNA为模板合成DNA，因此其RNA区域为单链区）互补的DNA片段Pd（其序列为5’-AGGACCCCCTTCCACAAACT-3’，10μmol/l的Pd加入1μl，尽量采用RNase-free灭菌水配制），25℃下保温10min以形成RNA-DNA杂交双链（即Pr和Pd杂交双链）；后再加入1μl的RNaseH酶（美国Thermo Fisher公司产品，5U/μl），按照说明书方法配制15μl的总消化反应体系（所缺体积用灭菌超纯水补足），在37℃下消化5min。由于前扩增产物量不多且所加的RNaseH酶充足，兼之RNA较短又是很容易被酶解的，因此消化反应的条件和时间要求并不需要特别严格，就足以对前扩增产物中的单链RNA区域进行充分消化了（图1中JAK1基因虚线标识部分），则获得的消化产物将在5’端暴露出dDPlaseII酶的识别位点，即图1中JAK1基因黑色标识部分。由于RNase H酶消化针对的是3’5’-磷酸二酯键，因此酶解产物为5’磷酸和3’羟基末端核苷酸链，即最终目标DNA双链片段的5’末端核苷酸C将会带有游离的磷酸基团。
（3）dDPlaseII酶连接和磁珠分离
RNase H酶解后，按照表2所示体系和条件进行dDPlaseII酶连接反应。申请人前期研究表明dDPlaseII酶可以识别5’末端起始为5’-CTGGATCAT-3’双链序列且该5’末端脱氧核糖核苷酸C为磷酸化状态的特定DNA双链和C末端起始为N’-MANCEHL-C’这7肽的特定多肽链，并催化DNA双链5’末端磷酸化的胞嘧啶脱氧核糖核苷酸C和多肽链C末端的亮氨酸L之间发生脱水缩合反应形成O=P-C=O构造磷碳键，使得双链DNA和多肽以共价键相互连接在一起。在表2体系中，RNase H酶消化产物中的JAK1基因突变片段和添加的多肽Ps即为dDPlaseII连接酶的底物。此时JAK1突变基因片段的5’端含有5’-CTGGATCAT-3’双链DNA序列，且经RNase H酶消化后此序列位于5’末端且同时5’末端的脱氧核糖核苷酸C含有游离磷酸基团，因此可以被dDPlaseII连接酶所识别（详见图1）。所添加的底物Ps为多肽，其氨基酸序列为N’-EAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGMANCEHL-C’，简记为N’-E(AG)12MANCEHL-C’,其中C端的9氨基酸链N’-MANCEHL-C’是dDPlaseII酶的识别区，而N末端E氨基酸即谷氨酸用生物素进行修饰，紧接着是AG（即丙氨酸和甘氨酸）的多聚体氨基酸链，有12组共24个氨基酸，用(AG)12表示。多肽Ps其N端的这25个氨基酸（即N’-E(AG)12）主要是用于和链霉亲和素磁珠连接的，即其是做为linker的，这样突变基因扩增片段基于dDPlaseII酶而和多肽Ps的共价连接产物就可以借助多肽Ps的N端上连接的磁珠得以从体系中分离出来了（参见图1）。
表2 dDPlaseII酶连接反应体系和条件
Figure 9335DEST_PATH_IMAGE002
委托生物公司合成多肽Ps，其N末端氨基酸E需要进行生物素修饰，要求纯度不低于95%。合成多肽Ps后需要先借助生物素和亲和素体系将其制备成磁载多肽，生物素与链霉亲和素的结合是目前自然界中已知的最强的非共价相互作用。采用美国Thermo Fisher公司的链霉亲和素磁珠M-280（DynabeadsTM M-280 Streptavidin，Invitrogen），按照说明书方法依靠生物素（Biotin，多肽Ps的N末端氨基酸E上的修饰基团）和链霉亲和素（包被在M-280磁珠表面）之间强的亲和作用力，制备包被多肽Ps的磁珠。磁载多肽Ps制备的主要步骤为：1）取0.1ml磁珠按照链霉亲和素磁珠M-280产品说明书中方法进行M-280磁珠的准备，用15ml的离心管装载，缓冲液采用的是磁珠产品中自带的B&W Buffer，最终得到10ml工作液状态下的磁珠液；2）往1）中的磁珠液中加入10mmol/L的多肽Ps溶液0.1ml，采用垂直旋转混匀仪室温下保持充分混匀10min；3）借助磁力架并用B&W Buffer洗涤已包被多肽的磁珠3次，去除未结合物质，之后加入适量超纯水进行重悬，则可得到磁载多肽Ps悬液。对于表2中使用的磁载多肽Ps，1ng/μl指的是多肽Ps的浓度，不计其上的磁珠。参照申请人之前提交的发明专利申请（一种双链DNA肽连接酶dDPlaseII及使用方法，申请号：2020100773289）制备dDPlaseII酶。
如表2中条件将dDPlaseII连接酶反应体系置于40℃下保温5min。将连接反应产物（50μl）吸出，转移到1.5ml灭菌塑料离心管中，并加入250μl灭菌超纯水，后将离心管置于磁力架上3min以让磁珠吸附在离心管壁上，小心吸出并废弃其中的液体，将离心管从磁力架上移开并再加入250μl灭菌超纯水重悬，后再将离心管置于磁力架上3min以让磁珠重新吸附在离心管壁上，再次小心吸出并废弃其中的液体，最后再将离心管从磁力架上移开并再加入10μl灭菌超纯水重悬磁珠，即得到磁载多肽Ps和突变基因片段的连接产物，转入灭菌PCR管中待用。
（4）突变基因片段特异性扩增
以（3）中经磁珠分离的连接产物为模板，采用Pm（其序列为：5’-CTGGATCATCTTCATGCAC-3’）和Pn引物对按照表3中的体系（50μl）和条件对JAK1基因的g.[227149insA]突变片段进行特异性扩增。将扩增产物送基因公司进行Sanger测序分析，分析测序结果获取突变情况。表3中的PCR体系亦可采用PCR mix预混液按照说明书方法配制。
表3 突变基因特异扩增体系和条件
Figure 512123DEST_PATH_IMAGE003
26例结直肠癌患者癌灶样本的JAK1基因g.[227149insA]突变检测结果如表4所示。除了患者自身事先做的二代基因测序和本发明检测方法有JAK1基因突变结果外，同时在本实施例中采用常规的PCR-Sanger测序法分析其JAK1基因g.[227149insA]突变情况以做对比，具体是参照表3中的扩增体系和条件，不同的是采用对应于Pr的DNA引物（即5’-AGTTTGTGGAAGGGGGTCCT-3’）和（1）中提取的癌灶样本基因组DNA为模板。
表4 26例结直肠癌患者的JAK1基因突变情况
Figure 334585DEST_PATH_IMAGE004
注：-表示未检测或未检出。
表4中的二代测序结果显示有11例结直肠癌患者其JAK1基因没有发生突变，本发明方法和常规PCR-Sanger测序法在这11例患者样本中也均没有检测出JAK1基因的g.[227149insA]突变，这同二代测序结果是一致的。在另外8例患者样本中，二代测序和本发明方法均检测出了JAK1基因的g.[227149insA]突变，而常规PCR-Sanger测序法只在其中的4例中检出此突变。进一步分析二代测序数据发现，这8例检出JAK1基因g.[227149insA]突变的患者样本中也都含有野生型JAK1基因片段，其中常规PCR-Sanger测序法检出突变的这4例其g.[227149insA]突变基因含量（参照二代测序得到的JAK1基因目标片段的Reads数目计算，具体为该区域g.[227149insA]突变片段Reads数/该区域总Reads数）均超过20%；而8例中常规PCR-Sanger测序法未能检出突变的另外4例，其突变基因含量均低于20%（参照二代测序数据，这4例的突变基因含量分别是13.2%、2.3%、1.10%和0.48%）。
以常规PCR-Sanger测序法检出突变的4例样本中的其中1例为例（突变基因含量为24.7%），常规PCR-Sanger测序法和本发明方法在JAK1基因g.[227149insA]突变处的Sanger测序图谱如图2所示。图2中常规PCR-Sanger测序法的Sanger测序峰图（图A）显示，从g.[227149insA]突变发生处向右起同时存在两条测序模板序列，可知在突变处有一个移码突变即g.[227149insA]，表明同时存在JAK1野生型基因片段和g.[227149insA]突变片段，且野生型基因片段含量远大于突变基因含量，若非人工查看且测序效果很好（基本没有背景），则很可能就认为体系中不存在JAK1基因的g.[227149insA]突变了。然而图2中本发明方法的Sanger测序峰图（图B）显示，体系中有且仅有突变基因片段，野生型基因片段完全被剔除掉了。由此表明本发明方法是十分准确和有效的。
常规PCR-Sanger测序法是基因分析的金标准，技术成熟、应用广泛且具有经济简便等优点。表4和图2结果显示，常规PCR-Sanger测序法无法检出低丰度的特定基因突变片段，这和文献中的报道是一致的。然而本发明方法对于低至0.10%的突变基因片段也可以实现准确和有效的检测，这主要得益于本发明方法在进行突变基因扩增之前，基于dDPlaseII酶连接和磁珠将突变基因片段捕获分离出来，从而只针对突变基因片段进行扩增，而避免了大量野生型基因的干扰。
此外，表4中采用本发明方法检出JAK1基因g.[227149insA]突变的8例患者中有6例为中年（年龄在40-60岁之间）女性结直肠癌肝转移患者，因此该突变的检测对于女性结直肠癌肝转移具有重要的临床意义，对于其肝转移机制研究、以及预测和诊治工作有很大的价值。表4中二代测序还测出了JAK1基因除g.[227149insA]突变以外的其它突变（有7例），而本发明方法和常规PCR-Sanger测序法均只检测JAK1基因的一部分，并未检测或检出其它突变，因此这7例JAK1基因的其它突变未明。
实施例2样本验证
进一步的收集20例临床病理确诊的中年女性结直肠癌患者（40-60岁，平均年龄为53.5岁），且确诊时未见转移，取得患者充分知情同意和满足临床诊治的情况下在其检查过程中额外抽取外周静脉血5ml，采用德国Qiagen公司的细胞外游离DNA提取试剂盒（QIAampCirculating Nucleic Acid kit）提取血液中的cell-freeDNA即cfDNA。以提取的血液cfDNA为模板，参照实施例1采用本发明方法和常规PCR-Sanger测序法进行JAK1基因的g.[227149insA]突变检测，结果如表5所示。采用本发明方法检出JAK1基因g.[227149insA]突变的患者有9例，而常规PCR-Sanger测序只检出了其中的2例。随访这20例患者，本发明方法检出突变的9例患者当中有7例在半年内发生了肝转移，而未检出突变的11例患者当中在半年内发生了肝转移的只有1例，可见JAK1基因的g.[227149insA]突变对中年女性结直肠癌患者肝转移具有良好的提示意义，有望做为肝转移的分子标志物。然而常规PCR-Sanger测序法由于未对突变进行特异性捕获和扩增检测，因此在大量野生型基因背景下往往无法对一开始为低丰度的突变基因片段实现有效准确的检测。
表5 20例患者JAK1基因g.[227149insA]突变情况及意义
Figure 601618DEST_PATH_IMAGE005
综上可知，本发明提供的JAK1基因g.[227149insA]突变检测试剂盒和对应的检测方法，具有特异性强和准确高效、简便经济的特点，可以有效检测出样本中含量低至1%的JAK1基因g.[227149insA]突变。
序列表
<110> 福建晨欣科生物科技有限公司
<120> 基于双链DNA肽连接酶的JAK1基因特定突变检测试剂盒及方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 454
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Arg Thr Arg His Ser Arg Thr Leu Leu Leu Glu His Leu Ala Thr
1 5 10 15
Glu Arg Arg Arg Leu Ala Pro Trp Asn Ile Gly Ser Ala Ser Thr Arg
20 25 30
His Leu Leu Leu Asp Lys Ser Pro Ser Arg Asn Pro Phe Gln Ser Ile
35 40 45
Cys Tyr Trp Gly Gln Glu Leu Val Thr Gly Gly Asn Leu Thr Leu Ser
50 55 60
Asn Gly Gln Leu Arg Ser Gln Arg Tyr Trp His Thr Leu Ser Ser Thr
65 70 75 80
Pro Ile Leu Arg Ile Cys Met Arg Ser Cys Phe Ser Leu Arg Ser Pro
85 90 95
Lys Leu Gln Leu Arg Pro Ile Pro Val Leu Cys Phe Phe Met Gly Pro
100 105 110
Ser Arg Ser Leu Arg Phe Ala Ser Gln Gly Thr Val Asp Ile Val His
115 120 125
Ser Val Glu Arg Ser Glu Ser Gln Ser Arg Thr Tyr Val Phe Leu Glu
130 135 140
Leu Trp Ala Phe Gly Phe Tyr Thr Ala Phe Gly Phe Ser Met Leu Leu
145 150 155 160
Val Ser Thr Leu Glu Ala His Leu Ile Thr Val Lys Gly Asp Gly Leu
165 170 175
Ile Arg Trp Asp Val Ala Arg Ser Phe Arg Ser Gly His Glu Asp Gly
180 185 190
Ala Cys Leu Thr Arg Asp Pro Cys Gly Pro Gln Phe Ala Ser Asp Asp
195 200 205
Tyr Glu Pro Arg Ser Cys Leu Pro Gln Met Leu Ser Ala Arg Gly Gly
210 215 220
Pro Val Phe Thr Asp Leu Tyr Met Cys His Trp Ala Gln Leu Arg Ile
225 230 235 240
Gln Ala Gly Leu Ala Asn Gln Val Leu Ser Val Cys Leu Ile Cys Lys
245 250 255
Ala Tyr Met Ile Ser Glu Phe Leu Ser Ile Pro Asn His Ser Tyr Tyr
260 265 270
Leu Arg Ala Pro Cys Glu Gln Gly Lys Met Leu Ile Asp Ala Arg His
275 280 285
Leu Trp Leu Arg Val Glu Arg Leu Asn Ser Ile Ile Ala Gly Leu Ala
290 295 300
Ser Leu Arg Lys Arg Gly Asn Thr Arg Thr Ser Leu Asn Ser Ile Leu
305 310 315 320
Leu Phe Ser Lys Asp Gln Gln Tyr Lys Met Arg Arg Ala Ala Leu Ser
325 330 335
Ile Leu Leu Tyr Trp Gly Tyr Phe Thr Val Arg Ala Ser Cys Asp Asn
340 345 350
Leu Val Ala Thr Leu Arg Lys Asp Pro Arg Glu Tyr Asp Ser Ala Thr
355 360 365
Gly Pro Ser Lys Leu Cys Gln Pro Lys Ala His Pro Cys His Pro Met
370 375 380
Gln Met Tyr Leu Arg Asp Trp Ala Gly Lys Leu Arg Ala Thr Lys Arg
385 390 395 400
Pro Asp Arg Gly Ala Gln Gln Glu His Ala Val Asn Pro Ala Gly Tyr
405 410 415
His Gln Met Gln Ser Ala Arg Leu Val Ala Pro Leu Thr Pro Ser Ala
420 425 430
Gln Leu Thr Glu Arg Ser His Thr Asp Cys Thr Gly Lys Val Gly Leu
435 440 445
Asp Leu Arg Arg Gln Met
450
<210> 2
<211> 1365
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgcggacgc gccacagcag aactctgcta ctcgagcatc ttgccacaga aagacgacgt 60
ttagctccgt ggaacatagg gtccgcttca acaagacact tgcttctaga caagagtccc 120
tctagaaatc ccttccagtc tatatgttac tggggccaag aattggtcac cggcgggaat 180
cttacattga gtaacgggca gctccgatca cagagatatt ggcacacctt gagttcgacg 240
cccatcctcc gaatctgtat gagatcctgc ttctccttac gttctccgaa actacagttg 300
cgtccgatac cagttttatg tttcttcatg ggaccgagca gaagtttacg cttcgcaagc 360
caagggacgg tggatatagt tcatagtgtt gaacgttccg agagtcagtc ccgcacctac 420
gtgtttttgg aactgtgggc cttcgggttt tacacagcct ttggtttcag catgctatta 480
gtctccacct tggaggcaca cctaatcacg gtaaagggtg atggcctaat acgttgggat 540
gtagcgcgct ccttccggtc aggtcacgag gatggagcgt gtcttacacg cgatccgtgc 600
ggtccgcagt ttgcgtctga cgactacgag ccgcgttctt gcctacccca gatgctatcg 660
gcgagagggg gtcccgtttt taccgatctt tatatgtgtc attgggctca attgcggatt 720
caggcggggc tagcaaacca agtgttgagt gtttgtctta tttgtaaggc atatatgatc 780
tcagagtttt tgtccatacc taaccattcc tattacttgc gcgcgccatg tgaacaaggt 840
aaaatgttga tagatgcgag gcacctttgg ctacgggtag agcggctgaa ttctatcatt 900
gcaggtctgg catcacttcg taagcgaggt aatactcgca ccagcttgaa ctcaatcctt 960
ttatttagta aggatcaaca gtataaaatg cggcgcgccg cactgagtat actactatat 1020
tggggctatt tcacagtccg cgcatcctgc gataatcttg tggccactct acggaaagac 1080
ccccgggaat acgattcggc gactgggccg tcgaaacttt gtcagcccaa agctcatccc 1140
tgtcatccga tgcaaatgta cctgagggac tgggcaggca aattaagagc aacgaagcgg 1200
ccagacaggg gcgcccaaca agaacatgcg gtgaaccccg ccggctacca tcaaatgcag 1260
agtgcaaggt tggttgcgcc tttaaccccg tccgcccagc ttactgagcg cagccacaca 1320
gattgtacag gaaaggttgg gcttgacctt cgacgtcaga tgtag 1365

Claims (1)

1.一种JAK1基因g.[227149insA]突变的检测试剂盒，其特征在于试剂盒包括：（1）dDPlaseII连接酶，dDPlaseII连接酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，对应的基因编码序列如SEQ ID NO：2所示；（2）dDPlaseII连接酶缓冲液，pH为7.8，由450mM Tris-Hcl、100mMMg2+、80mM NaCl、20mM ATP和8mM Triton X-100组成，每1μl反应体系中添加0.1μl的连接酶缓冲液；（3）RNase H酶及其配套的缓冲液，采用美国Thermo Fisher公司产品；（4）磁载多肽Ps，即包被多肽Ps的链霉亲和素磁珠，其中多肽Ps的氨基酸序列为N’-EAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGMANCEHL-C’，其N端氨基酸E已经经过生物素修饰；（5）RNA引物Pr，其序列为5’-AGUUUGUGGAAGGGGGUCCU-3’；（6）DNA引物Pn，其序列为5’-CTGAACAGCTGACCCATGGT-3’；（7）DNA片段Pd，其序列为5’-AGGACCCCCTTCCACAAACT-3’；和（8）DNA引物Pm，其序列为5’-CTGGATCATCTTCATGCAC-3’；所述JAK1基因g.[227149insA]突变是以NCBI登录号为NG_023402.2的JAK1野生型基因作为参考序列的。
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