JPWO2006054519A1 - リポ蛋白中成分の分別定量用標準品 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明における測定すべき成分を含有する検体としては、各種リポ蛋白を少なくとも複数含有する検体であれば特に制限されず、例えば全血、血漿、血清、関節液、髄液、唾液、羊水、尿、汗、膵液、滑液などが挙げられるが、全血、血漿、血清が好ましい。
本発明におけるリポ蛋白としては、例えば高密度リポ蛋白(以下、HDLと記す)、低密度リポ蛋白(以下、LDLと記す)、超低密度リポ蛋白(以下、VLDLと記す)、カイロミクロン(以下、CMと記す)及びレムナントリポ蛋白などが挙げられる。
本発明におけるリポ蛋白中の測定すべき成分としては、例えばHDL中のコレステロール(HDLコレステロール)、HDL中の中性脂肪、LDL中のコレステロール(LDLコレステロール)、LDL中の中性脂肪、VLDL中のコレステロール、VLDL中の中性脂肪、CM中のコレステロール、CM中の中性脂肪、レムナントリポ蛋白中のコレステロール、レムナントリポ蛋白中の中性脂肪などが挙げられる。
本発明において用いられる血清又は血漿としては、血液から血球成分等を除いて得られる通常の意味の血清又は血漿を意味する。血液としては、ヒト等の動物由来の血液が用いられる。
本発明におけるスルホ基を有する緩衝剤としては、血清又は血漿中のリポ蛋白質が沈澱しないpHを与える緩衝剤が好ましく、pHとしては、例えばpH6〜9が好ましい。スルホ基を含有する緩衝剤としては、例えばN−(2−ヒドロキシエチル)−N’−(2−スルホエチル)ピペラジン(HEPES)、ピペラジン−N,N’−ビス(2−エタンスルホン酸)(PIPES)、N−(2−アセトアミド)−2−アミノエタンスルホン酸(ACES)、3−モルホリノ−2−ヒドロキシプロパンスルホン酸(MOPSO)、N,N−ビス(2−ヒドロキシエチル)−2−アミノエタンスルホン酸(BES)、3−モルホリノプロパンスルホン酸(MOPS)、N−[トリス(ヒドロキシメチル)メチル]−2−アミノエタンスルホン酸(TES)、3−[N,N−ビス(2−ヒドロキシエチル)アミノ]−2−ヒドロキシプロパンスルホン酸(DIPSO)、N−[トリス(ヒドロキシメチル)メチル]−2−ヒドロキシ−3−アミノプロパンスルホン酸(TAPSO)、ピペラジン−N,N’−ビス(2−ヒドロキシプロパンスルホン酸)(POPSO)、3−[4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジニル]−2−ヒドロキシプロパンスルホン酸(HEPPSO)、3−[4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジニル]プロパンスルホン酸[(H)EPPS]、N−トリス(ヒドロキシメチル)メチル−3−アミノプロパンスルホン酸(TAPS)、N−シクロヘキシル−2−アミノエタンスルホン酸(CHES)、N−シクロヘキシル−3−アミノ−2−ヒドロキシプロパンスルホン酸(CAPSO)及びN−シクロヘキシル−3−アミノプロパンスルホン酸(CAPS)などを挙げることができ、中でも、N−(2−ヒドロキシエチル)−N’−(2−スルホエチル)ピペラジン(HEPES)が特に好ましい。
さらに、スルホ基を有する緩衝剤に加えて、乳酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、コハク酸緩衝剤、フタル酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、トリエタノールアミン緩衝剤、ジエタノールアミン緩衝剤、リジン緩衝剤、バルビツール緩衝剤、イミダゾール緩衝剤、リンゴ酸緩衝剤、シュウ酸緩衝剤、グリシン緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、炭酸緩衝剤、グリシン緩衝剤、グッド緩衝剤などが挙げられる。グッド緩衝剤としては、例えばMES(2−モルホリノエタンスルホン酸)緩衝剤、Bis−Tris[ビス(2−ヒドロキシエチル)イミノトリス(ヒドロキシメチル)メタン]緩衝剤、Tris[トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン]緩衝剤、ADA[N−(2−アセトアミド)イミノ二酢酸]緩衝剤等を併用することができる。
本発明の標準品は、必要に応じて、水性媒体、金属イオン、塩類、界面活性剤、防腐剤、糖化合物などの添加物を含有してもよい。水性媒体としては、例えば脱イオン水、蒸留水などが挙げられる。金属イオンとしては、例えばマグネシウムイオン、カルシウムイオン、マンガンイオン、亜鉛イオンなどが挙げられる。塩類としては、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウムなどが挙げられる。界面活性剤としては、例えば非イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、両性界面活性剤などが挙げられる。防腐剤としては、例えばアジ化ナトリウム、ストレプトマイシン、ゲンタマイシンなどの抗生物質、バイオエース、プロクリン300(商標)、プロキセル(Proxel)GXL(商標)などが挙げられる。
リポ蛋白中の測定すべき成分の分別測定用試薬は、HDL、LDL、VLDL、CM、レムナントリポ蛋白などの特定のリポタンパク質を遠心分離等の手段により分画することなく、複数種のリポ蛋白が同一の反応液に共存した状態で特定のリポ蛋白中の成分を分別測定する試薬、所謂ホモジニアス測定試薬で有れば特に制限はなく、HDL中のコレステロール測定試薬、HDL中の中性脂肪測定試薬、LDL中のコレステロール測定試薬、LDL中の中性脂肪測定試薬、VLDL中のコレステロール測定試薬、VLDL中の中性脂肪測定試薬、CM中のコレステロール測定試薬、CM中の中性脂肪測定試薬、レムナントリポ蛋白中のコレステロール測定試薬、レムナントリポ蛋白中の中性脂肪測定試薬などが挙げられる。かかるリポ蛋白中の測定すべき成分の分別測定試薬としては、例えば自家調製した試薬のみならず、市販の測定用試薬も使用することができる。市販の測定用試薬としては、例えばHDLコレステロール測定試薬であるデタミナー HDL(協和メデックス社製)、デタミナーL HDL(協和メデックス社製)、コレステストN HDL(第一化学薬品社製)や、LDLコレステロール測定試薬であるデタミナーL LDL(協和メデックス社製)などが挙げられる。
本発明の標準品の製造方法は、スルホ基を有する緩衝剤と血清又は血漿とを混合し、得られた混合液を凍結乾燥した後、凍結乾燥物中の測定すべき成分の含量を、既知量の測定すべき成分を用いて値付けする方法であれば特に制限されず、血清又は血漿とスルホ基を有する緩衝剤とを混合する際、スルホ基を有する緩衝剤は水溶液(緩衝液)の状態で混合することができ、かかる水溶液のpHは、混合した後に血清又は血漿中のタンパク質が沈澱しないpHが選択され、pH6〜9が好ましい。
凍結乾燥状態の標準品の値付けとは、製造された標準品中に含まれるリポ蛋白中の測定すべき成分の含量を、既知量の当該測定すべき成分を用いて決定することを意味する。得られた凍結乾燥状態の標準品中の測定成分の値付けは、例えば健常人の複数の血清又は血漿を別途米国厚生省疾病管理・予防センター(CDC)勧告法等のホモジニアス法によらない標準法にて既知量の測定すべき成分を用いて測定し、自動分析装置等を用いて当該複数の血清又は血漿と標準品を同時に測定したとき、血清又は血漿での測定値がCDC勧告法等の標準法で得られる測定値と一致するように標準品中の測定すべき成分の含量を決定することにより行うことができる。
(リポ蛋白を含有する検体中の測定すべき成分の分別定量用キット)
本発明のリポ蛋白を含有する検体中の測定すべき成分の分別定量用キットとしては、本発明の標準品と上記リポ蛋白中の測定すべき成分の分別測定用試薬とを含有するものであれば特に制限されず、本発明のキットを用いると、リポ蛋白を含む検体中の測定すべき成分の分別測定を簡便に行うことができる。
本発明のリポ蛋白を含む検体中の測定すべき成分の分別測定方法としては、(1)リポ蛋白中の測定すべき成分の分別測定用試薬を用いて、検体中の測定すべき成分を測定する工程、(2)本発明の測定すべき成分量の値付けがなされた標準品と上記分別測定用試薬を用いて検量線を作成する工程、及び(3)上記(1)の工程で得られた測定値と(2)の工程で作成した検量線とから、検体中の測定すべき成分濃度を算出する工程を有する定量方法であれば特に制限されるものではなく、上記(1)の工程における測定すべき成分の分別測定工程では、HDL、LDL、VLDL、CM、レムナントリポ蛋白などの特定のリポタンパク質を遠心分離等の手段により分画することなく、複数種のリポ蛋白が同一の反応液に共存した状態で特定のリポ蛋白中の成分を分別測定する方法、所謂ホモジニアス測定方法が用いられ、かかるホモジニアス測定方法として、具体的にHDL中のコレステロール測定方法、HDL中の中性脂肪測定方法、LDL中のコレステロール測定方法、LDL中の中性脂肪測定方法、VLDL中のコレステロール測定方法、VLDL中の中性脂肪測定方法、CM中のコレステロール測定方法、CM中の中性脂肪測定方法、レムナントリポ蛋白中のコレステロール測定方法、レムナントリポ蛋白中の中性脂肪測定方法などが挙げられる。このように、ホモジニアス法による検体中のリポ蛋白の測定すべき成分の測定方法とは、検体中のリポ蛋白を物理的に分離することなくリポ蛋白が複数種共存下で、特定のリポ蛋白中の成分を測定する方法を意味する。
新鮮人血清8mLに10%アジ化ナトリウム溶液を0.1mL添加し、これに1mol/LのHEPES溶液を2mL添加撹拌したものを調製した。この溶液をバイヤルビンに1mLずつ分注し、−40℃にて凍結し、13.3〜133.3Paで20時間乾燥凍結乾燥し、標準品を製造した。第1表及び第2表中、該標準品をHEPES0.2mol/Lと記載する。これは、血清100mLに、緩衝剤を25mmol添加したものに相当する。また、HEPES溶液の代わりにPBSを用いたものを対照とした。
実施例1で調製した凍結乾燥品をそれぞれ0.5mLの精製水で溶解し、サンプル中のHDLコレステロールの濃度を市販ホモジニアスHDL測定試薬であるデタミナー HDL[協和メデックス社製;凍結乾燥試薬製品(試薬DHと記す)]及びデタミナーL HDL[協和メデックス社製;液状試薬製品(試薬LHと記す)]を用いて自動分析機(日立7170)にて測定した。測定結果を表1に示す。
実施例1にて得られた凍結乾燥品の安定性を調べる目的で各凍結乾燥品を40℃の加温状態で1週間保存した。実施例2で用いた2つのHDLコレステロール測定用試薬製品、並びに、コレステストN HDL[第一化学薬品社製;液状試薬製品(試薬NHと記す)]及びLDLコレステロール測定用試薬デタミナーL LDL[協和メデックス社製;液状試薬製品(試薬LLと記す)]を用いて自動分析機で測定し、保存前後の測定値を比較した。結果を第2表に示す。第2表中の数値は、保存前後の測定値の比率、即ち保存後の標準品(対照品)中のコレステロール測定値/保存前の標準品(対照品)中のコレステロール測定値)を示す。
Claims (12)
- リポ蛋白中の測定すべき成分を分別定量するために使用する、スルホ基を有する緩衝剤を添加した血清又は血漿を凍結乾燥してなる標準品であって、標準品中の測定すべき成分の含量が、既知量の測定すべき成分を用いて値付けされていることを特徴とする凍結乾燥状態の標準品。
- スルホ基を有する緩衝剤が、N−(2−ヒドロキシエチル)−N’−(2−スルホエチル)ピペラジン、ピペラジン−N,N’−ビス(2−エタンスルホン酸)、N−(2−アセトアミド)−2−アミノエタンスルホン酸、3−モルホリノ−2−ヒドロキシプロパンスルホン酸、N,N−ビス(2−ヒドロキシエチル)−2−アミノエタンスルホン酸、3−モルホリノプロパンスルホン酸、N−[トリス(ヒドロキシメチル)メチル]−2−アミノエタンスルホン酸、3−[N,N−ビス(2−ヒドロキシエチル)アミノ]−2−ヒドロキシプロパンスルホン酸、N−[トリス(ヒドロキシメチル)メチル]−2−ヒドロキシ−3−アミノプロパンスルホン酸、ピペラジン−N,N’−ビス(2−ヒドロキシプロパンスルホン酸)、3−[4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジニル]−2−ヒドロキシプロパンスルホン酸、3−[4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジニル]プロパンスルホン酸、N−トリス(ヒドロキシメチル)メチル−3−アミノプロパンスルホン酸、N−シクロヘキシル−2−アミノエタンスルホン酸、N−シクロヘキシル−3−アミノ−2−ヒドロキシプロパンスルホン酸及びN−シクロヘキシル−3−アミノプロパンスルホン酸から選ばれる1種又は2種以上の緩衝剤である請求項1記載の標準品。
- スルホ基を有する緩衝剤が、N−(2−ヒドロキシエチル)−N’−(2−スルホエチル)ピペラジンである請求項2記載の標準品。
- リポ蛋白中の測定すべき成分が、コレステロール又は中性脂肪である請求項1〜3のいずれかに記載の標準品。
- リポ蛋白が、高密度リポ蛋白、低密度リポ蛋白、超低密度リポ蛋白、カイロミクロン及びレムナントリポ蛋白からなる群より選ばれるリポ蛋白である請求項1〜4のいずれかに記載の標準品。
- 血清又は血漿とスルホ基を有する緩衝剤とを混合し、得られた混合液を凍結乾燥した後、凍結乾燥物中の測定すべき成分の含量を、既知量の測定すべき成分を用いて値付けすることを特徴とするリポ蛋白中の測定すべき成分を分別定量するために使用する凍結乾燥状態の標準品の製造方法。
- スルホ基を有する緩衝剤が、N−(2−ヒドロキシエチル)−N’−(2−スルホエチル)ピペラジン、ピペラジン−N,N’−ビス(2−エタンスルホン酸)、N−(2−アセトアミド)−2−アミノエタンスルホン酸、3−モルホリノ−2−ヒドロキシプロパンスルホン酸、N,N−ビス(2−ヒドロキシエチル)−2−アミノエタンスルホン酸、3−モルホリノプロパンスルホン酸、N−[トリス(ヒドロキシメチル)メチル]−2−アミノエタンスルホン酸、3−[N,N−ビス(2−ヒドロキシエチル)アミノ]−2−ヒドロキシプロパンスルホン酸、N−[トリス(ヒドロキシメチル)メチル]−2−ヒドロキシ−3−アミノプロパンスルホン酸、ピペラジン−N,N’−ビス(2−ヒドロキシプロパンスルホン酸)、3−[4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジニル]−2−ヒドロキシプロパンスルホン酸、3−[4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジニル]プロパンスルホン酸、N−トリス(ヒドロキシメチル)メチル−3−アミノプロパンスルホン酸、N−シクロヘキシル−2−アミノエタンスルホン酸、N−シクロヘキシル−3−アミノ−2−ヒドロキシプロパンスルホン酸及びN−シクロヘキシル−3−アミノプロパンスルホン酸から選ばれる1種又は2種以上の緩衝剤である請求項6記載の製造方法。
- スルホ基を有する緩衝剤が、N−(2−ヒドロキシエチル)−N’−(2−スルホエチル)ピペラジンである請求項7記載の製造方法。
- リポ蛋白中の測定すべき成分が、コレステロール又は中性脂肪である請求項6〜8のいずれかに記載の製造方法。
- リポ蛋白が、高密度リポ蛋白、低密度リポ蛋白、超低密度リポ蛋白、カイロミクロン及びレムナントリポ蛋白からなる群より選ばれるリポ蛋白である請求項6〜9のいずれかに記載の製造方法。
- リポ蛋白中の測定すべき成分の分別測定用試薬及び請求項1〜5のいずれかに記載の標準品を含有することを特徴とするリポ蛋白を含有する検体中の測定すべき成分の分別定量用キット。
- (1)リポ蛋白中の測定すべき成分の分別測定用試薬を用いて、リポ蛋白を含有する検体中の前記成分を測定する工程、(2)請求項1〜5のいずれかに記載の標準品と前記分別測定用試薬を用いて検量線を作成する工程、及び(3)前記(1)の工程で得られた測定値と(2)の工程で作成した検量線とから、検体中の前記成分濃度を算出する工程を有することを特徴とするリポ蛋白を含む検体中の測定すべき成分の分別定量方法。
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