JP6681794B2 - 希釈生体試料成分の分析方法(内部標準法) - Google Patents
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Description
本発明は、血液などの生体試料中の生体成分を分析する方法であって、前記血液などの生体試料を添加する希釈緩衝液と、該希釈緩衝液中に含まれる内部標準物質を分析し、希釈率を算出し、血漿、血清や血球の生体成分の希釈率を算出し、前記血液などの生体試料中の血漿、血清又は生体試料中の生体成分を分析することを特徴とする。
[1−1] 試料血液を入れるための希釈緩衝液を用い、該希釈緩衝液中に含まれる内部標準物質を分析し、血漿又は血清の希釈率を算出し、前記試料血液中の血漿又は血清成分中の生体成分を分析する生体試料成分の分析方法において、前記希釈緩衝液に含まれる内部標準物質が血球内に浸透しない性質を有しており、マルトースを含む2糖類、グルタミン酸、ロイシン、バリン、イソロイシン、4-ハイドロキシンベンゼン、ハイドロキシ酪酸、クレアチン、リンゴ酸、トリンダー試薬、リチウムからなる群から選ばれる物質である内部標準物質を用いた生体試料成分の分析方法。
[1−2] 希釈緩衝液に含まれる内部標準物質がリチウムである、[1−1]の生体試料成分の分析方法。
[1−3] 試料血液を入れるための希釈緩衝液を用い、該希釈緩衝液中に含まれる内部標準物質を分析し、血液の希釈率を算出し、前記試料血液中の血球算定数や血漿の生体成分を分析する生体試料成分の分析方法において、前記希釈緩衝液に含まれる内部標準物質が血球内に浸透する性質を有しており、エタノールアミン、ヘキシルアミン、フェニールエチルアミン、アミールアミン、ヒスタミン、プトレシン、ヒポキサンチン、トリプトファン、プレグレノロン、β-シトステロールからなる群から選ばれる物質である内部標準物質を用いた生体試料成分の分析方法。
[1−4] 試料血液を入れるための希釈緩衝液を用い、該希釈緩衝液中に含まれる内部標準物質を分析し、血液又は血漿又は血清の希釈率を算出し、前記試料血液中の血球算定数や血漿の生体成分又は前記試料血液中の血漿又は血清成分中の生体成分を分析する生体試料成分の分析方法において、前記希釈緩衝液は、血球内に浸透しない性質を有する前記内部標準物質であって、リチウム、マルトースを含む2糖類、グルタミン酸、ロイシン、バリン、イソロイシン、4-ハイドロキシンベンゼン、ハイドロキシ酪酸、クレアチン、リンゴ酸、トリンダー試薬からなる群から選ばれる物質と、血球内に浸透する性質を有する前記内部標準物質であって、エタノールアミン、ヘキシルアミン、フェニールエチルアミン、アミールアミン、ヒスタミン、プトレシン、ヒポキサンチン、トリプトファン、プレグレノロン、β-シトステロールからなる群から選ばれる物質とを含む生体試料成分の分析方法。
[1−5] 前記希釈緩衝液に含まれる内部標準物質が分子量500以下の化学物質で分子内に硫酸イオン(-SO3-)、カルボキシルイオン(-COO-)、チオール基(-SH)、第4級アミン(-NH3+)からなる群から選ばれる置換基を持つ化合物から選ばれる内部標準物質である、[1−1]の生体試料成分の分析方法。
[1−6] 前記希釈緩衝液に含まれる内部標準物質がADOS(N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-3-メトキシアニリン)、ADPS(N-エチル-N-スルホプロピル-3-メトキシアニリン)、ALPS(N-エチル-N-スルホプロピルアニリン)、DAOS(N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-3,5-ジメトキシアニリン)、HDAOS(N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-3,5-ジメトキシアニリン)、MAOS(N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-3,5-ジメチルアニリン)、TOOS(N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-3-メトキシアニリン)、TOPS(N-エチル-N-スルホプロピル-3-メチルアニリン)から成る群から選ばれる化合物であるトリンダー試薬である、[1−1]の生体試料成分の分析方法。
[1−7] 前記希釈緩衝液は、血液が混合されても前記血球の溶血が生じない試薬組成を有している[1−1]〜[1−6]のいずれかの生体試料成分の分析方法。
[1−8] 前記希釈緩衝液が前記血液中の生体試料成分を変性させることなく、安定に維持できるように、エチレンジアミン四酢酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩などのキレート剤、アミカシン硫酸塩、カナマイシン硫酸塩、チアベンダゾール、アジ化ナトリウムなどの抗菌剤や防腐剤、ピリドキサルリン酸、マグネシウム、亜鉛などの補酵素、マンニトール、デキストロース、オリゴ糖などの糖類、ドデシル硫酸ナトリウム、水銀、ヘパリンからなる群から選択される阻害剤を被測定成分に応じて単独若しくは複数組み合わされた組成の添加物を含む[1−1]〜[1−7]のいずれかの生体試料成分の分析方法。
[1−9] 前記内部標準物質の希釈率から血液の血球容積率(ヘマトクリット値)を算出することを特徴とする[1−4]の生体試料成分の分析方法。
血液中のナトリウムやクロールは非常に高い恒常性があり、個体間の変動も小さいことが知られている。そのナトリウムの中央値濃度も142 mmol/Lと生体濃度としては濃いため、緩衝液で希釈しても、高希釈倍数の試料濃度を精度良く測定できる。しかしながら、ナトリウムやクロールを外部標準として用いる場合、ナトリウムやクロールが含まれる緩衝液を希釈用緩衝液として用いることはできなかった。
[2−1] 希釈用緩衝液で微量血液試料を希釈し、血液中の分析対象成分を定量分析する方法において、外部標準物質を用いて血液試料の希釈倍数を算出することを含む、血液試料中の分析対象成分の定量分析方法であって、外部標準物質は血液試料中に恒常的に所定の濃度で含まれる成分であり、前記希釈用緩衝液は外部標準物質の定量に干渉する成分を含んでおらず、希釈用緩衝液で希釈した血液試料中の外部標準物質濃度を測定し、これらの測定値に基づいて血液試料の希釈倍数を算出することを含む、血液試料中の分析対象成分の定量分析方法。
[2−2]希釈用緩衝液で希釈した血液試料中の外部標準物質濃度を測定し、これらの測定値に基づいて血液試料の希釈倍数を算出することを含む、血液試料中の分析対象成分の定量分析方法。
[2−3] 外部標準物質がナトリウム、クロール、アルブミン及び総タンパク質からなる群から選択される、[2−1]又は[2−2]の定量分析方法。
[2−4] 外部標準物質がナトリウム、クロール、及び総タンパク質からなる群から選択される、[2−3]の定量分析方法。
[2−5] 希釈用緩衝液が、緩衝剤成分として、2-アミノ-2-メチル-1-プロパノール、2-エチルアミノエタノール、N-メチル-D-グルカミン、ジエタノールアミン及びトリエタノールアミンからなる群から選択されるアミノアルコール化合物、並びにHEPES (2- [4- (2-Hydoxyethyl)-1-piperazinyl] ethanesulfonic acid)、TES (N-Tris(hydroxymethyl)methyl-2- aminoethanesulfonic acid)、MOPS(3-Morpholinopropanesulfonic acid)及び BES(N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid)からなる群から選択される緩衝剤を含み、pH7.4で緩衝作用を有する緩衝液である、[2−1]〜[2−4]のいずれかの定量分析方法。
[2−6] 希釈用緩衝液が、ナトリウム及びクロールを実質的に含まない、[2−1]〜[2−4]のいずれかの定量分析方法。
[2−7] 微量血液試料の希釈倍数が以下の算出式(I)の算出式により算出され、希釈血漿中の分析対象成分を定量し、算出式(I)で求めた希釈倍数を乗じて、元の血漿中の分析対象成分を定量する、[2−1]〜[2−6]のいずれかの定量分析法:
A
X = --------- (I)
B
A:血漿中外部標準物質濃度の健常者中央値の吸光度、
B:希釈血漿中の外部標準物質の吸光度、
X:血漿希釈倍数
[ここで、希釈血漿とは、血液試料を希釈用緩衝液で希釈し、血球を除去して得られた血漿をいう]。
[2−8] β-ガラクトシダーゼはナトリウムイオン濃度に応じて酵素活性が変化し、その吸光度変化量からナトリウムイオン濃度を定量できることを利用し、希釈用緩衝液を用いて希釈した血液試料中のナトリウムを以下の方法で測定する[2−3]〜[2−7]のいずれかの定量分析方法:
生体試料を希釈用緩衝液で希釈し、さらに精製水で希釈し、
β-ガラクトシダーゼを含む緩衝液である第1試薬を試料量の10〜30倍容積量添加し、30〜45℃で2〜20分加温し、o-Nitrophenyl-β-D-Galactpyranosideを含む基質液である第2試薬を第1試薬量の半量を添加し、主波長410nm、副波長658nmで反応速度の吸光度を測定する。
[2−9] [2−1]〜[2−8]のいずれかの定量分析方法において、微量血液試料の希釈に用いる希釈用緩衝液であって、緩衝剤成分として、2-アミノ-2-メチル-1-プロパノール、2-エチルアミノエタノール、N-メチル-D-グルカミン、ジエタノールアミン及びトリエタノールアミンからなる群から選択されるアミノアルコール化合物、並びにHEPES (2- [4- (2-Hydoxyethyl)-1-piperazinyl] ethanesulfonic acid)、TES (N-Tris(hydroxymethyl)methyl-2- aminoethanesulfonic acid)、MOPS(3-Morpholinopropanesulfonic acid)及び BES(N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid)からなる群から選択される緩衝剤を含み、pH7.4で緩衝作用を有する緩衝液。
[2−10] ナトリウム及びクロールを実質的に含まない、[2−9]の緩衝液。
上記のように、内部標準物質を単独で利用する分析方法、及び外部標準物質を単独で利用する分析方法により、微量の生体試料中の分析対象生体成分を正確に測定できるようになった。
[3−1] 希釈用緩衝液で試料を希釈し、血液中の分析対象成分を定量分析する方法において、内部標準物質及び外部標準物質を用いて血液試料の希釈倍数を算出することを含む、血液試料中の分析対象成分の定量分析方法であって、内部標準物質は希釈用緩衝液に所定濃度添加され、外部標準物質は血液試料中に恒常的に所定の濃度で含まれる成分であり、前記希釈用緩衝液は内部標準物質及び外部標準物質の定量に干渉する成分を含んでおらず、希釈用緩衝液で希釈した血液試料中の内部標準物質濃度と外部標準物質濃度を測定し、これらの測定値に基づいて血液試料の希釈倍数を算出することを含む、血液試料中の分析対象成分の定量分析方法。
[3−2] 前記外部標準物質濃度の測定値を用いて、前記内部標準物質濃度の測定値から求めた血液試料の希釈倍数を補正することにより、前記血液試料中の分析対象成分を定量分析する定量分析方法。
[3−3] 内部標準物質がアルカリ金属類又はアルカリ土類金属類に属する元素、外部標準物質がナトリウム、クロール、アルブミン及び総タンパク質からなる群から選択される、[3−1]又は[3−2]の定量分析方法。
[3−4] 内部標準物質がリチウム、又はグリセロール-3-リン酸であり、外部標準物質がナトリウムである、[3−3]の定量分析方法。
[3−5] 希釈用緩衝液が、緩衝剤成分として、2-アミノ-2-メチル-1-プロパノール、2-エチルアミノエタノール、N-メチル-D-グルカミン、ジエタノールアミン及びトリエタノールアミンからなる群から選択されるアミノアルコール化合物、並びにHEPES (2- [4- (2-Hydoxyethyl)-1-piperazinyl] ethanesulfonic acid)、TES (N-Tris(hydroxymethyl)methyl-2- aminoethanesulfonic acid)、MOPS(3-Morpholinopropanesulfonic acid)及び BES(N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid)からなる群から選択される緩衝剤を含み、pH6.5〜pH8.0の緩衝作用を有する緩衝液である、[3−1]〜[3−4]のいずれかの定量分析方法。
[3−6] 希釈用緩衝液が、ナトリウム及びクロールを実質的に含まない、[3−5]のいずれかの定量分析方法。
[3−7] 微量血液試料の希釈倍数が以下の算出式(1)〜(4)のいずれかの算出式により算出され、希釈血漿中の分析対象成分を定量し、算出式(1)〜(4)のいずれかで求めた希釈倍数を乗じて、元の血漿中の分析対象成分を定量する、[3−1]〜[3−6]のいずれかの定量分析法:
算出式(1)
A + C
X = --------- (1)
B + D
;
算出式(2)
√(A2 + C2)
X = --------------- (2)
√(B2 + D2)
;
算出式(3)
X= a × (B+D) ± b (3)
[ここで、a及びbは係数であり、あらかじめB+Dと希釈倍数のデータを取得し、X= a ×(B+D) ± bで表される標準曲線を作成しておく]
;
並びに
算出式(4)
X=A/B' (4)
[ここで、B'=(A×D)/Cである]、
[上記式において、A、B、C、D、B'及びXは以下のように定義される;
A:内部標準物質を添加した緩衝液中の内部標準物質の吸光度
B:希釈血漿中の内部標準物質の吸光度
C:血漿中外部標準物質濃度の正常中央値の吸光度、
D:希釈血漿中の外部標準物質の吸光度、
B':外部標準物質吸光度から算出した希釈倍数による、希釈血漿中の内部標準物質の吸光度の補正値、及び
X:血漿希釈倍数
[ここで、希釈血漿とは、血液試料を希釈用緩衝液で希釈し、血球を除去して得られた血漿をいう]。
[3−8] β-ガラクトシダーゼはナトリウムイオン濃度に応じて酵素活性が変化し、その吸光度変化量からナトリウムイオン濃度を定量できることを利用し、希釈用緩衝液を用いて希釈した血液試料中の外部標準の一つであるナトリウムを以下の方法で測定する[3−1]〜[3−7]の定量分析方法:
生体試料を希釈用緩衝液で希釈し、さらに精製水で希釈し、β-ガラクトシダーゼを含む緩衝液である第1試薬を試料量の10〜30倍容積量添加し、30〜45℃で2〜20分加温し、o-Nitrophenyl-β-D-Galactpyranosideを含む基質液である第2試薬を第1試薬の半量を添加し、生成するo-Nitrophenolを主波長410nm、副波長658nmで吸光度を測定する。
[3−10] ナトリウム及びクロールを実質的に含まない、[3−9]の緩衝液。
[3−11] 外部標準物質を用いた定量分析方法に用いられる、[3−9]又は[3−10]の緩衝液。
[3−12] 内部標準物質を用いた定量分析方法に用いられる、[3−9]又は[3−10]の緩衝液。
本発明は以下の特徴を有する。すなわち、本発明の1つの特徴によれば、採取した未知濃度の血球を含む生体試料の成分を定量及び酵素活性分析する方法であって、生体試料に全く含まれない若しくはほとんど含まれない成分であって、血球膜を通過しない内部標準物質を用意し、これを緩衝液中に添加する。血液を添加する前の緩衝液中の内部標準物質濃度を分析し、その吸光度と血液添加後の希釈された緩衝液中の内部標準物質の濃度を測定することで、その吸光度の比率から血液中の血漿希釈率を求め、原血漿中の生体成分や酵素活性を求める。この場合、前記緩衝液の浸透圧がほぼ血液浸透圧となるように調製されるのが好ましい。
マルトース測定にあたっては、上記R1及びR2を使用する。
1.7.0μlの混合生体試料と90μlのR1を混合し、37℃で5分間放置する。
2.545/658nm波長で吸光度を測定する。――A1(吸光度)
3.30μlのR2を混合し、37℃で5分間放置する。
4.545/658nm波長で吸光度を測定する。――A2(吸光度)
吸光度は測定値の差として表すことができる。従って、一般に吸光度はΔA=A2-A1として得られる。
エタノールアミン測定にあたって、上記R1及びR2を使用する。
1.11μlの混合生体試料と90μlのR1を混合し、37℃で5分間放置する。
2.596/805nm波長で吸光度を測定する。――A3(吸光度)
3.45μlのR2を混合し、37℃で5分間放置する。
4.546/884nm波長で吸光度を測定する。――A4(吸光度)
吸光度は測定値の差として表すことができる。従って、一般に吸光度はΔA=A4-A3として得られる。
これらは、以下の表4に示すいずれの場合でも利用可能である。
すなわち、
V1=V0/(r1-1)
で算出できる。
すなわち、
V1+V2+V3 =V0/(r2-1)
で算出できる。
V2+V3 =(V1+V2+V3)- V1 = V0 / (r2 - 1) - V0 / (r1 - 1)が算出できる。
V2/(V2+V3)= 0.65より
V2 = 0.65×{V0 / (r2 - 1) - V0 / (r1 - 1)}
V3 = 0.35×V2/0.65
V3 = 0.35×{V0 / (r2 - 1) - V0 / (r1 - 1)}
血漿又は、血清の量(V1)
血漿又は、血清の希釈率(r1)
血漿又は、血清及び血球液体の量(V1+V2)
血液全体の希釈率(r2)
血液量(V1+V2+V3)
血液の希釈率{(V0+V1+V2+V3)/(V1+V2+V3)}
血球量(V2+V3)
血球の希釈率{(V0+V2+V3)/(V2+V3)}
血球液体の量(V2)
血球液体の希釈率{(V0+V2)/V2}
血球固体の量(V3)
血球固体の希釈率{(V0+V3)/V3}
ヘマトクリット値(%){(V2+V3)/(V1+V2+V3)×100(%)}又は1-(血液希釈率-1)/(血漿希釈率-1)
緩衝液の量(V0)
緩衝液の血漿又は、血清に対する希釈率{(V0+V1)/V0}
緩衝液の血漿又は、血清及び血球液体に対する希釈率{(V0+V1+V2)/V0}
緩衝液の血液に対する希釈率{(V0+V1+V2+V3)/V0}
緩衝液の血球液体に対する希釈率{(V0+V2)/V0}
緩衝液の血球固体に対する希釈率{(V0+V3)/V0}
緩衝液の血球に対する希釈率{(V0+V2+V3)/V0}
などが算出可能である。V0、r1、r2、V1、V2、V3を単独又は組み合わせることによって算出できるものは、上記の例に限定されるものではない。
本発明は、血液等の生体試料を緩衝液で希釈した後に生体試料中の定量すべき分析対象成分を定量する方法であって、生体試料成分である外部標準物質を用いて生体試料の希釈倍数を求め、該希釈倍数から生体試料中の分析対象成分を定量することを特徴とする。
外部標準物質を用いる方法を外部標準法と呼び、例えば、ナトリウムを外部標準物質として用いる方法をナトリウム(Na)外部標準法と呼ぶ。
生体成分に含まれる恒常成分である外部標準物質を用いて希釈倍数を求める。
本発明の生体試料の希釈倍数を求める方法は以下のようにして行う態様が望ましい。
算出方法1
A
X = --------- (I)
B
A:血漿中外部標準物質濃度の正常中央値の吸光度、
B:希釈血漿中の外部標準物質の吸光度、
X:血漿希釈倍数
外部標準物質としてナトリウムを用いる場合、ナトリウムの吸光度を求めればよい。血漿中ナトリウム濃度の正常中央値の吸光度としては、ナトリウム142 mmol/Lの吸光度を用いればよい。
本発明は、血液等の生体試料を緩衝液で希釈した後に生体試料中の定量すべき分析対象成分を定量する方法であって、内部標準物質及び外部標準物質を用いて生体試料の希釈倍数を求め、該希釈倍数から生体試料中の分析対象成分を定量することを特徴とする。
また、特開2003-161729号公報に記載のグリセロール-3-リン酸を用いることもできる。
本発明の生体試料の希釈倍数を求める方法は以下のようにして行う態様が望ましい。
A:内部標準物質を添加した緩衝液中の内部標準物質の吸光度
B:希釈血漿中の内部標準物質の吸光度
C:血漿中外部標準物質濃度の正常中央値の吸光度
D:希釈血漿中の外部標準物質の吸光度
X:血漿希釈倍数
ここで、希釈血漿とは、血液試料を希釈用緩衝液で希釈し、血球を除去して得られた血漿をいう。内部標準物質としてリチウムを用い、外部標準物質としてナトリウムを用いる場合、リチウムの濃度は、例えば、キレート比色法等でリチウム濃度を測定した場合に得られる吸光度で表すことができる。また、ナトリウムの濃度は、酵素的測定法等で測定した場合の吸光度で表すことができる。血漿中ナトリウム濃度の正常中央値は健常者の中央値であり、血漿中ナトリウム濃度の正常中央値の吸光度としては、ナトリウム142 mmol/Lの吸光度を用いればよい。該値は、既知の値である。以下の算出方法2及び3においても同様である。
A + C
X = -------- (1)
B + D
√(A2 + C2)
X = -------------- (2)
√(B2 + D2)
希釈血漿中の分析対象成分である生化学成分の測定濃度や酵素活性を定量し、該定量値に算出式(1)又は算出式(2)で求めた希釈倍数を乗じて、元の血漿中の分析対象成分を定量することができる。
B:希釈血漿中の内部標準物質の吸光度
D:希釈血漿中の外部標準物質の吸光度
X:血漿希釈倍数
血漿の希釈倍数は下の算出式(3)で求めることができる。
X= a × (B+D) ± b (3)
(a及びbは係数)
算出方法2においては、あらかじめB+Dと希釈倍数のデータを取得し、X = a × (B+D) ± bで表される回帰直線を作成しておく。
希釈血漿中の分析対象成分である生化学成分の測定濃度や酵素活性を定量し、該定量値に算出式(3)で求めた希釈倍数を乗じて、元の血漿中の分析対象成分を定量することができる。
A:内部標準物質を添加した緩衝液中の内部標準物質の吸光度
B:希釈血漿中の内部標準物質の吸光度
C:血漿中外部標準物質濃度の正常中央値の吸光度、
D:希釈血漿中の外部標準物質の吸光度
B':外部標準物質の吸光度から算出した希釈倍数による、希釈血漿中の内部標準物質の吸光度の補正値
X:血漿希釈倍数
内部標準物質(例えば、リチウム)と外部標準物質(例えば、ナトリウム)の希釈倍数Xは同じと仮定すると、下記の式が得られる。
X = A/B = C/D
外部標準物質(例えば、ナトリウム)の希釈倍数により内部標準物質(例えば、リチウム)の吸光度変化量補正値B'を下の式で求める。
(B')=(A×D)/C
内部標準物質(例えば、リチウム)の吸光度変化量補正値B'でAを除することで外部標準物質(例えば、ナトリウム)補正による内部標準物質(例えば、リチウム)希釈倍数を求める。
X=A/B' (4)
希釈血漿中の分析対象成分である生化学成分の測定濃度や酵素活性を定量し、該定量値に算出式(4)で求めた希釈倍数を乗じて、元の血漿中の分析対象成分を定量することができる。
1.内部標準を利用する分析法(内部標準法)
[実施例1−1]
マルトースを内部標準物質として希釈緩衝液に添加した血液希釈緩衝液にEDTA-2Na添加した全血試料を60μLと血液希釈緩衝液を200 μL加え、50例の静脈血液試料について検討した。希釈なしの全血を遠心して得られた血漿の測定値と希釈した血漿の測定値に内部標準で希釈倍数を乗じて求めた希釈血漿測定値について相関を調べた結果、図1に示すように酵素活性(トランスアミナーゼ;ALT,γ-グルタミルトランスフェラーゼ;GGT)、脂質検査(中性脂肪;TG、LDL-コレステロール、グルコース、ヘモグロビンA1c)の検査で良好な相関性が得られた。
血球及び血漿に分布する内部標準であるエタノールアミンを血液希釈緩衝液に添加した希釈緩衝液にEDTA-2Na添加した全血試料を60μLと血液希釈緩衝液を200μL加え、50例の静脈血液試料について検討した。
静脈採血のEDTA-2Na添加全血とこの全血を血液希釈緩衝液で希釈した希釈全血をそれぞれ試料として白血球(WBC)、赤血球(RBC)、ヘモグロビン濃度(Hgb)、ヘマトクリット値(Hct)、血小板数(Plt)を算定した相関図を図5に示す。これによれば血小板数を除き、良好な相関性が認められる。
マルトース内部標準から求めた血漿希釈率とエタノールアミンから求めた全血希釈率を用いて計算式から求めた血液中の血球体積を示すヘマトクリット値と全血を血球計数機で求めた値との相関を調べた。その結果を図6に示す。良好な相関性で実用性がある。
[実施例2−1] 微量血液試料を用いた定量分析
(1)外部標準物質(ナトリウム)の測定及び希釈倍数の算出
微量血液試料65μLを緩衝液280μLに添加して混合し、フィルターで血球を濾過して、希釈血漿を試料として生化学自動分析装置で外部標準物質及び生体成分の各濃度を測定した。
血液試料の希釈用緩衝液としては、2-アミノ-2-メチル-1-プロパノールとHEPES(2-[4-(2-Hydoxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid)を組合わせて混合したpH7.4の緩衝液を用いた。
用いた緩衝液の組成を表5に示す。
希釈血漿の微量ナトリウム測定はβ-ガラクトシダーゼがナトリウムで活性化することを利用し、緩衝液で希釈された試料のナトリウム濃度とガラクトシダーゼ活性が比例関係にあることを利用した酵素的測定法を開発した。
表6にナトリウム測定試薬の組成を示す。
希釈緩衝液280μLに全血65μLを添加すると全血中の血漿(約30μL)は約10希釈される。この希釈血漿を精製水で4.5倍希釈後の3μLにβ-ガラクトシダーゼ緩衝液(第1試薬)を52μL加えて、37℃で5分加温し、基質液o-Nitrophenyl-β-D-Galactpyranoside(第2試薬)を26μL加えて、1分間の吸光度速度変化を、日本電子(株)JCA-BM 6050型生化学自動分析装置を用いて、主波長410nm、副波長658nmで吸光度を測定することにより求めた。図1にナトリウム濃度と吸光度変化量を示した検量線を示す。24mmol/Lまで原点を通る直線性が得られナトリウムの定量性が認められた。
以下の試薬を用いた
1)第一試薬:pH6.0, 0.1 mol/L MES・NaOH緩衝液に膵由来アミラーゼ2 U/ml及び10 mmol/L EDTAを含む溶液
2)第二試薬:5 mmol/L 2-クロロ-4-ニトロフェニルマルトース溶液
クロール測定法は以下のとおりであった。
試料5μLに第一試薬150μL加え、37℃で5分間加温して後、第二試薬を50μL加えた後、1分後から2分間の405nmにおける吸光度変化を求めた。
図8にクロール濃度と吸光度変化量を示した検量線を示す。
表7には血漿測定値と外部標準物質(ナトリウム)の希釈倍率から求めた希釈血漿測定値との相関統計値を示した。測定は、日本電子(株)JCA-BM 6050型自動分析装置を用いて行った。142mmol/Lのナトリウム測定吸光度(A)と希釈血漿のナトリウム吸光度(B)を下記の式(I)により求めた希釈倍数(X:8倍希釈)を利用して求めた希釈血漿の生化学検査データ(希釈血漿測定値)と血漿データ(血漿測定値)の相関を示す。各検査項目の血漿測定は常法で行った。また、希釈血漿の測定は常法より試料の容量を増やして最適化した条件で測定を行った。表7に示すように生化学検査13項目の相関性は良好であり、微量の血液から元の血漿中の生化学検査データを得ることが可能である。
A
X = --------- (I)
B
[実施例3−1] 微量血液試料を用いた定量分析
(1)内部標準物質(リチウム、グリセロール-3-リン酸)及び外部標準物質(ナトリウム)の測定及び希釈倍数の算出
微量血液試料65μLを内部標準物質添加緩衝液280μLに添加して混合し、フィルターで血球を濾過して、希釈血漿を試料として生化学自動分析装置で内部標準物質と外部標準物質及び生体成分の各濃度を測定した。
血液試料の希釈用緩衝液としては、2-アミノ-2-メチル-1-プロパノールとHEPES(2-[4-(2-Hydoxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid)を組合わせて混合したpH7.4の緩衝液を用いた。
用いた内部標準物質を添加した緩衝液の組成を表8に示す。
緩衝液に内部標準物質として添加したリチウムの測定は、キレート比色法(ハロゲン化ポルフィリンキレート法:perfluoro-5,10,15,20-tetraphenyl-21H,23H -porphyrin)により行った。
希釈血漿の微量ナトリウム測定はβ-ガラクトシダーゼがナトリウムで活性化することを利用し、緩衝液で希釈された試料のナトリウム濃度とガラクトシダーゼ活性が比例関係にあることを利用した酵素的測定法を開発した。
表9にナトリウム測定試薬の組成を示す。
希釈緩衝液280μLに全血65μLを添加すると全血中の血漿(約30μL)は約10希釈される。この希釈血漿を精製水で4.5倍希釈後の3μLにβ-ガラクトシダーゼ緩衝液(第1試薬)を52μL加えて、37℃で5分加温し、基質液o-Nitrophenyl-β-D-Galactpyranoside(第2試薬)を26μL加えて、1分間の吸光度速度変化を、日本電子(株)JCA-BM 6050型生化学自動分析装置を用いて、主波長410nm、副波長658nmで吸光度を測定することにより求めた。図7にナトリウム濃度と吸光度変化量を示した検量線を示す。24mmol/Lまで原点を通る直線性が得られナトリウムの定量性が認められた。
希釈緩衝液280μLに全血65μLを添加すると全血中の血漿(約30μL)は約10希釈される。日本電子(株)JCA-BM 6050型生化学自動分析装置を用いて、この希釈血漿を精製水で4.5倍希釈後の5μLにキレート試薬(第1試薬)を55μL加えて、37℃で10分加温し、主波長545nm、副波長596nmで吸光度を測定することにより求めた。
グリセロール-3-リン酸測定法は表11に示した試薬組成を用いた。
日本電子(株)JCA-BM 6050型自動分析装置を用いて測定した血漿と希釈血漿の生化学検査項目の測定値の相関図を図10−1〜10−6に示す。希釈用緩衝液中の内部標準物質(リチウム)の測定吸光度(A)と血漿添加後の内部標準物質の測定吸光度(B)及び142mmol/Lのナトリウム測定吸光度(C)と希釈血漿のナトリウム吸光度(D)を下記の算出式(1)により求めたハイブリッドで希釈倍数(X:8倍希釈)を利用して求めた希釈血漿の生化学検査データ(希釈血漿測定値)をy軸、血漿データ(血漿測定値)をx軸に表示した。各検査項目の血漿測定は常法で行った。また、希釈血漿の測定は常法より試料の容量を増やして最適化した条件で測定を行った。図10−1〜10−6に示すように生化学検査13項目の相関性は良好であり、微量の血液から元の血漿中の生化学検査データを得ることが可能である。
A + C
X = -------- (1)
B + D
表12には内部標準物質(リチウム)及び外部標準物質(ナトリウム)を併用するハイブリッド法での血漿測定値と希釈血漿測定値との相関統計値を示した。
日本電子(株)JCA-BM 6050型自動分析装置を用いて測定した血漿と希釈血漿の生化学検査項目の測定値の相関を表13に示す。希釈用緩衝液中の内部標準物質(グリセロール-3-リン酸)の測定吸光度(A)と血漿添加後の内部標準物質の測定吸光度(B)及び142mmol/Lのナトリウム測定吸光度(C)と希釈血漿のナトリウム吸光度(D)を実施例3−1の算出式(1)により求めたハイブリッドで希釈倍数(X:8倍希釈)を利用して求めた希釈血漿の生化学検査データ(希釈血漿測定値)をy軸、血漿データ(血漿測定値)をx軸に表示した。各検査項目の血漿測定は常法で行った。また、希釈血漿の測定は常法より試料の容量を増やして最適化した条件で測定を行った。表13に示すように生化学検査13項目の相関性は良好であり、微量の血液から元の血漿中の生化学検査データを得ることが可能である。
表13には内部標準物質(グリセロール-3-リン酸)及び外部標準物質(ナトリウム)を併用するハイブリッド法での血漿測定値と希釈血漿測定値との相関統計値を示した。
(1)外部標準物質として血漿ナトリウムを用いる場合の希釈倍数に与える影響
健常者の血漿ナトリウム濃度は個体内及び個体間の生理的変動は非常に小さく、その基準範囲(正常範囲)は135〜145 mmol/Lである。この健常者の中央値である142mmol/Lという値を利用して、血液試料を希釈用緩衝液で希釈し血球を除去して得た希釈血漿中のナトリウム濃度を高感度な酵素法で測定すると0〜30 mmol/Lまで精度良く測定ができる。また、基準範囲上下限の135mmol/Lと145 mmol/Lの試料を142 mmol/Lを基準として希釈倍数を補正しても±2%の誤差範囲内で測定ができる。
血液を希釈する緩衝液にリチウムを内部標準物質として添加した場合、血液中の血漿量に応じてリチウム濃度が希釈されて、血漿希釈倍数を求める方法は8〜10倍程度までは血漿添加量が多いため、添加前と添加後の濃度差が大きく希釈倍数の再現性は変動係数2%以下である。しかし、12〜16倍では血漿の添加量が減少するため希釈倍数は変動係数4〜5%に上昇する。
従って、ハイブリッド法を用いた補正により、精度の高い測定値を得ることができる。
ハイブリット法は内部標準法の単独の再現性に比べ良好な再現性を示した。
2:血漿(血清)
3:血球
4:緩衝液
5:内部標準物
6:血液希釈溶液
Claims (7)
- 試料血液を入れるための希釈緩衝液を用い、該希釈緩衝液中に含まれる内部標準物質を分析し、血漿又は血清の希釈率を算出し、前記試料血液中の血漿又は血清成分中の生体成分を分析する生体試料成分の分析方法において、前記希釈緩衝液に含まれる内部標準物質が血球内に浸透しない性質を有している、リチウム、ルビジウム、セシウム及びフランシウムからなる群から選択されるアルカリ金属に属する元素、又はストロンチウム、バリウム及びラジウムからなる群から選択されるアルカリ土類金属に属する元素である生体試料成分の分析方法。
- 希釈緩衝液に含まれる内部標準物質がリチウムである、請求項1に記載の生体試料成分の分析方法。
- 試料血液を入れるための希釈緩衝液を用い、該希釈緩衝液中に含まれる内部標準物質を分析し、血液又は血漿又は血清の希釈率を算出し、前記試料血液中の血球算定数や血漿の生体成分又は前記試料血液中の血漿又は血清成分中の生体成分を分析する生体試料成分の分析方法において、
前記希釈緩衝液は、
血球内に浸透しない性質を有する前記内部標準物質である、リチウム、ルビジウム、セシウム及びフランシウムからなる群から選択されるアルカリ金属に属する元素、又はストロンチウム、バリウム及びラジウムからなる群から選択されるアルカリ土類金属に属する元素と、
血球内に浸透する性質を有する前記内部標準物質であって、エタノールアミン、ヘキシルアミン、フェニールエチルアミン、アミールアミン、ヒスタミン、プトレシン、ヒポキサンチン、トリプトファン、プレグレノロン、β-シトステロールからなる群から選ばれる物質とを含む生体試料成分の分析方法。 - 前記希釈緩衝液に含まれる血球内に浸透しない性質を有する内部標準物質がリチウムである、請求項3に記載の生体試料成分の分析方法。
- 前記希釈緩衝液は、血液が混合されても前記血球の溶血が生じない試薬組成を有している請求項1〜4のいずれか1項に記載の生体試料成分の分析方法。
- 前記希釈緩衝液が前記血液中の生体試料成分を変性させることなく、安定に維持できるように、エチレンジアミン四酢酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩などのキレート剤、アミカシン硫酸塩、カナマイシン硫酸塩、チアベンダゾール、アジ化ナトリウムなどの抗菌剤や防腐剤、ピリドキサルリン酸、マグネシウム、亜鉛などの補酵素、マンニトール、デキストロース、オリゴ糖などの糖類、ドデシル硫酸ナトリウム、水銀、ヘパリンからなる群から選択される阻害剤を被測定成分に応じて単独若しくは複数組み合わされた組成の添加物を含む請求項1〜5のいずれか1項に記載の生体試料成分の分析方法。
- 前記内部標準物質の希釈率から血液の血球容積率(ヘマトクリット値)を算出することを特徴とする請求項3に記載の生体試料成分の分析方法。
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