CN1178701C - 检测异常上皮细胞脱落的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种检测温血动物的成熟上皮细胞的异常细胞脱落速率的方法，所述成熟上皮细胞例如是胃或结肠腺的上皮细胞。在上皮细胞上施用包含例如花青染料的标记组合物，然后随时间观察该部位。异常细胞脱落速率说明有疾病存在，如癌症。

Description

检测异常上皮细胞脱落的方法

发明领域

本发明涉及活体检测异常上皮细胞脱落速率的方法，其可用作诊断方法。

相关技术的描述

已知上皮细胞动力学(称为细胞增殖、迁移、分化、衰老和丧失的现象)的变化与不同的疾病状态有关，包括炎症和癌症(上皮细胞的恶性癌)。因此，建立测定细胞动力学的精确方法对于医学和相关领域是非常重要的。在使用氚化的胸苷(3H-胸苷)的自体放射照相法之前，细胞动力学通常是使用各种方法学来测定，包括检测细胞有丝分裂、测量胃肠腺体的尺寸(例如通过显微计数或测量)、以及在体外细胞培养基中进行简单的细胞计数。

分析细胞动力学的常规方法使用与增殖细胞中的DNA合成有关的标记物。增殖细胞可用3H-胸苷或者胸苷类似物-溴代脱氧尿苷(BrdU)来标记，它们在DNA合成期间能够快速地插入在细胞DNA中。但是，该方法仅测量DNA合成的速率，而不是直接测量细胞在体内的生长、迁移或脱落。

因为使用与DNA合成有关的标记物的方法易于实施，它们已通常作为评估疑有异常动力学的上皮细胞的首选方法。这些方法的使用受制于以下因素：必须用增殖细胞培养3-H胸苷和BrdU固定长度的时间。另外，用3H-胸苷和BrdU标记不能在人体内进行。必须从患者身上提取人上皮细胞样品，然后在包含3H-胸苷或BrdU的培养基中进行组织培养。

测定某些酶的水平，如增殖细胞核抗原(PCNA)和胸苷激酶，也被用于测定细胞动力学。虽然这些方法不需要组织培养，但它们也不能用作评估细胞动力学(包括细胞迁移或脱落)的体内方法。

花青染料已用于多种生物应用中。二氧羰花青染料已用于进行白细胞分化计数。Gunter Valet，Max Plank Ges Wissensch；Patent Accession No.84-102307/17，通过选择性染色和测量体积及荧光同时定量测定白细胞(Simultaneous Quantitative Determination of Blood Cells by SelectiveStaining and Measuring volume and Fluorescence)。用于这些研究中的染料是短链羰花青染料(低于10个碳原子)，而且对膜电势的变化产生反应。短链羰花青染料进入细胞线粒体中，而且是细胞毒性的。当洗涤细胞时，无论细胞的膜电势是否发生变化，这些染料都容易从细胞中泄漏出来。三羰花青染料(Fox，I.J.等人，Proc.May Clinic，32：478-484，1957)和Evans蓝染料(Schad，H.等人，Pfluegers Arch.Eur.J.Physiol.，370(2)：139-144，1977)已用于通过稀释法在活体中评估心输出。Dow(Dow，P.，Physiol.Rev.，36：77-102，1956)描述了此等方法，其包括：在肺的静脉侧注射已知量的血管内指示剂，然后测量指示剂随时间的动脉浓度，以测定注射点和取样点之间的体积。但是这些染料不用于染色细胞。

第4,762,701号美国专利公开了用于追踪花青标记之细胞并通过测量给药于宿主之花青染料标记的细胞的消失速率来测定细胞寿命的体内方法，该文献的全部内容在此并入。

第4,783,401号美国专利公开了用花青染料标记存活细胞的方法，其目的之一是测量所培养之细胞的生长速率。该文献的全部内容在此并入。

第4,859,584号美国专利公开了测定体外和体内生长之花青标记的细胞的生长速率的方法，该文献的全部内容在此并入。

在本发明之前，尚没有人通过体内检查成熟表面上皮细胞的脱落速率来研究细胞的动力学。因此，已公开的文献包括非常少的有关例如胃肠道或其它粘膜表面上的健康或异常成熟上皮细胞的脱落速率。洗涤胃衬固定长的时间，然后通过测量洗涤溶液中的细胞DNA来测定细胞损失，由此可评估胃中的细胞脱落。该方法已被证明是不精确的，这是因为其程序复杂且难以标准化，洗涤期间获得的细胞不足以进行DNA分析，而且在洗涤期间不小心有可能得到非确定目标位置处的细胞。

发明简述

因此，本发明的目的是提供一种体内检测异常上皮细胞脱落速率的方法。

本发明的再一个目的是提供一种体内诊断以成熟上皮细胞中异常细胞脱落速率为特征的疾病状态的方法，其包括体内测定温血动物的目标位置处的表面上皮细胞的脱落速率是正常还是异常。

本发明的又一个目的是提供一种诊断癌症的改进方法，所述癌症例如是胃癌和结肠癌、以及其它以异常上皮细胞脱落速率为特征的疾病。

为实现上述及其它目的，本发明提供一种体内检测温血动物之成熟上皮细胞如粘膜表面的上皮细胞中异常细胞脱落速率的方法，其包括以下步骤：标记目标位置处的成熟表面上皮细胞，然后监测该位置是否存在标记物。在该方法的优选实施方案中，已标记的细胞存留在粘膜表面上，其中胃肠道的粘膜表面提供特别优选的目标。

本发明还提供一种诊断以温血动物的成熟上皮细胞中异常细胞脱落速率为特征的疾病状态的方法，其包括：标记成熟的上皮细胞，测定标记细胞的脱落速率，然后对比标记细胞的脱落速率和处于相似位置处的健康上皮细胞的已知脱落速率。

附图简述

图1是胃粘膜的部分示意图。

图2是结肠粘膜的部分示意图。

优选实施方案的描述

以下将详细描述本发明的优选实施方案。本发明提供体内检测温血动物的成熟上皮细胞的异常细胞脱落速率的改进方法，所述温血动物包括人。目标位置如粘膜表面处的成熟表面上皮细胞用标记组合物进行标记。适合于体内标记上皮细胞的标记组合物是已知的，其包括花青染料，其它化学染料如乙酸结晶紫、Hoechsdye H33342、曙红和Floxyn，以及抗体基标记物(即、可检测并共价键连接在抗体上的部分，如荧光分子、放射性同位素、不透X射线的化合物)。在此优选包含花青染料部分的标记组合物。花青染料部分可在标记组合物中起到可检测的单独物质的作用。另外，其它可检测的物质如其它化学染料或者不透X射线的化合物(X射线显影剂)也可存在于标记组合物中。该其它可检测的物质可化学偶联在花青染料部分上，或者也可简单地存在于与花青染料或其它标记化合物的混合物中。

根据本发明靶向标记的细胞群优选主要(如果不是完全的话)由成熟上皮细胞组成。成熟上皮细胞是那些有丝分裂已经完成而且已失去增殖能力的细胞。因此，在目标位置处丢失可检测的标记物是由于已标记的细胞从上皮脱落，这不同于标记细胞之间的细胞分裂导致的标记物稀释。

标记细胞从目标位置处脱落的速率，以在预定长的时间内丢失的可检测标记物表示，可用多种方法来测定。目前优选由医生直接目视检测目标位置，但也可使用测定是否存在标记物的其它方法(例如，使用X射线或者结合使用X射线显影剂标记物的其它放射性成象法)。

在此所用术语“异常细胞脱落速率”是指较正常细胞脱落速率更高或更低的脱落速率。本发明的独特之处在于，成熟表面上皮细胞的脱落速率可直接在体内评估，以评价细胞动力学并有助于确定疾病状态的存在。

没有细胞更新就不能维持组织功能和形态学的完整性。人胃粘膜和结肠粘膜是连续进行快速细胞丢失(通过管腔内表皮脱落和细胞死亡)和更新的组织的例子。在进行恒定细胞更新以维持特定数量的细胞的器官中，细胞产生和细胞丢失在健康的组织中几乎是以相同的速率进行。在胃粘膜中，具有固定寿命的胃粘膜上皮细胞在位于胃窝底部和腺体的连续上部分处的增殖区域中产生。这些细胞向上迁移至上皮的表面，以补充粘膜细胞，而且在该过程中分化和成熟，向下替代胃腺细胞。因为胃上皮细胞具有advanced junction complexes，所以在迁移过程中细胞的顺序不发生改变。其结果是，老的上皮细胞首先脱落在管腔中。该根据细胞年龄而顺序脱落在管腔中的现象称为“管线系统(pipe line system)”。在结肠的上皮中，增殖区域位于腺管的下三分之二部分中。这些细胞也表现有顺序脱落的“管线系统”，但是与胃上皮细胞不同，其仅向上迁移。这些过程在健康和异常上皮组织中通常都具有细胞增加和细胞丢失的特征，在此统称为“细胞脱落”。

现已发现，当标记例如内脏器官的粘膜表面上的成熟上皮细胞时，可通过观察标记细胞从粘膜表面上的脱落速率来评估细胞动力学。观察到的脱落速率可与(1)该器官的其它位置处的成熟上皮细胞的脱落速率和/或(2)所评估的具体类型和位置处的细胞的标准脱落速率进行比较。因此，与当前测量细胞动力学的方法相反，本发明是测量已分化的成熟上皮细胞的脱落速率，而不是测量增殖细胞的生长速率。评估这些成熟表面上皮细胞的脱落速率可向医生提供用于诊断和/或监控上皮细胞群之健康状态的重要信息。具体而言，这些信息有助于诊断和监控高增殖及低增殖病变以及以异常细胞动力学为特征的疾病状态，包括胃癌和大肠癌。

根据本发明，为检测表面上皮细胞的异常脱落速率，用可检测的物质标记细胞，该物质优选为花青染料。标记后，可在预选的时间处观察标记部位处的标记物浓度变化，并由此检测细胞脱落。本发明的方法不限于任何具体的目标器官或任何具体的标记组合物，且通常适用于对身体的任何上皮化表面(上皮)所进行的细胞脱落速率研究。此等表面包括胃、胆管、结肠、尿道、血管、包括鼻腔的呼吸道、角膜、食管、胰管、小肠、包括阴道和卵巢的生殖器官、以及前列腺。胃的上皮衬里(胃粘膜)和大肠的上皮衬里(结肠粘膜)是特别易于形成癌的部位，而且占世界死亡人口的大部分。因此，以下将针对这两个目标位置来详细地阐明本发明。

在实施本发明时，细胞标记物的选择应使得在其结合于目标上皮表面时易于检测其存在。标记物应连接在上皮上，但不会不利地改变上皮细胞的本质。标记物还应保持连接足够长的时间，而且在进行诊断的时间中不会降解。

用于本发明方法中的优选标记组合物包含下式的花青染料：

其中：

Y是氧、硫、亚甲基或者烷基取代的亚甲基；

m是0-3；及

n是3-22。

在此所用的“烷基取代的亚甲基”是指单或二取代的亚甲基，取代基为甲基、乙基或者丙基。上述结构的化合物也可用以下简单通式表示(Sims，P.J.等人，Biochem.，13：3315(1974))：

DiYC_n(2m+1)

因此，例如其中Y是硫并具有三个桥接环的碳原子和两个14碳脂族链的化合物称为DiSC₁₄(3)。类似地，DiIC₁₄(5)表示其中Y是异丙基并具有五个桥接环的碳和两个14碳脂族链的化合物。

具有一个或更多个取代的上式化合物也包括在以上称为花青染料的化合物中，其条件是此等经取代的化合物可溶解在至少是标记所需的细胞标记介质中，而且具有足够高的膜分配系数以保持与细胞的缔合。此等化合物还必须在标记所需的浓度时不对细胞的存活性产生任何负面影响。除碘盐外，也可使用药物学上可接受形式的花青染料，包括其它药物学上可接受的盐。

更优选的是，用包含下式之花青染料的组合物进行标记：

或

式I的染料(“PKH2”，碘化1-二十二烷基-1′-丙基氧羰花青)和式II的染料(“PKH26”，碘化1-二十二烷基-1′-十四烷基-3，3，3′，3′-四甲基吲哚羰花青)都可从Sigma BioSciences购得，并由Phanos Technologies，Inc.制造。PKH2和PKH26在体内都特异性和选择性地染色细胞膜，而且不对细胞的性质产生负面影响。这两种染料可通过荧光容易地鉴别。这些化合物也可作为具有亲脂亲和性的结合剂，其它诊断化合物或者其它治疗化合物可连接于其上。

除这些优点外，PKH2和PKH26是非抗原性的、非细胞毒性的，具有长的半衰期，而且具有稳定和持续染色细胞的能力。该染料仅需要施用在表面上皮细胞上几分钟，就可实现足够的染色。

其它花青染料可从各种来源购得，或者也可使用已知的合成方法从已有的起始物制得。参见Hamer，F.M.，花青染料及相关化合物(TheCynine Dyes and Related Compounds)，Interscience Publishers(1964)。当用于人体内时，将有效量的染料溶解于蔗糖水溶液中，由此可制备PKH2或者PKH26的溶液。PKH2和PKH26都可从Phanos Technologies，Inc.售卖的染料试剂盒中得到，它们提供500μl的染料原料液和60ml的稀释剂。因此，在使用其中一种染料试剂盒制备染料溶液时，染料对稀释剂的浓度为1∶120。

PKH2和PKH26在用于本发明的组合物中的浓度水平类似于这些染料在体外染色细胞时已知的浓度水平。待使用的精确浓度是可变的，而且容易最佳化。待使用的染料组合物的体积取决于该组合物中花青染料的浓度以及目标位置的大小而变化。施用体积例如可在1-100ml之间变化，而且在许多情况下可使用约10ml的染料组合物。精确的施用体积是可变的，而且容易最佳化。

标记组合物包含在介质(稀释剂)中的花青染料，该介质在施用时是安全的，而且提供可重复的细胞标记。通常使用渗透压调节剂，使花青染料至少在需要标记的时间内形成稳定的溶液。可接受的渗透压调节剂包括糖，包括单糖如葡萄糖、果糖、山梨糖、木糖、核糖，以及二糖如蔗糖；糖醇，包括甘露糖醇、甘油、肌醇、木糖醇、和核糖醇；氨基酸，包括甘氨酸和精氨酸；以及某些Good′s缓冲剂，如N-三(羟甲基)-甲基-3-氨基丙磺酸。可在标记介质中添加少量的缓冲剂，以调节氢离子浓度(pH)。还可使用其它常规试剂，如抗生素和防腐剂。

在准备受试者以实施本发明的方法时，可使用进行内窥镜检查所需的常规制剂。在进行本发明的方法前应遵循常规的准备程序，例如节食。为增加花青染料如PKH2和PKH26与上皮粘膜的粘结力，可使用粘液去除法，该法利用蛋白酶(链酶蛋白酶，由Kaken Seiyaku制造)。此等粘液去除法描述于K.Ida等人的“Endoscopic Diagnosis of GastricCancer with Dye Scattering”(Amer.J.Gastroenterology，第63卷，第4号，316-320页，1975年4月)。该文献的内容在此完全并入。简而言之，在检查前20分钟给药抗惊厥药，然后口服给药约80ml经十倍稀释的二甲基聚硅氧烷(Gasoon)溶液，该溶液混有1g的碳酸氢钠和20000p.u.的蛋白酶(链酶蛋白酶)。

可使用各种途径向目标位置处的表面上皮细胞给药标记组合物。可使用缓释口服剂型来给药标记组合物。优选的是，在内窥镜的观察下直接将溶液形式的组合物施用(喷涂)在上皮粘膜的表面上，或者以饮剂的形式将溶液给药于受试者。虽然期望直接将溶液喷涂在表面上皮上可增加与粘膜的粘结力，但口服给药溶液也是优选的，这是因为可减轻受试者的负担。

根据本发明的一个实施方案，将标记组合物施用在上皮化表面的具体区域中。通过内窥镜检查，医生可容易地确定该局部区域是否为异常的，并由此确立是否为本发明之脱落速率评估方法的好的候选者。医生也可将标记组合物施用在邻近的正常位置处，以在这两个位置之间进行比较。

仅在细胞的局部区域而不是在整个粘膜表面的大部分上施用标记组合物的优点是节省染料并降低给药和诊断时间。在优选的方法中，当然也可施用标记组合物以覆盖内脏目标器官之整个粘膜表面的大部分。例如在将花青染料施用在整个胃衬里的大部分上时，可通过检查染色上皮细胞位置处的荧光强度来观察成熟内皮细胞的正常脱落速率。

在根据本发明标记胃上皮细胞时，与其它器官的上皮细胞不同，给药标记组合物至观察时的时间长度平均来说取决于以下事实：胃表面粘膜细胞的寿命约为2天。因此，在评估胃上皮细胞的脱落速率(其中癌症使正常的脱落速率减慢)时，给药2天后至少进行一次检查。相反地，为测定是否存在使胃粘膜细胞过度增殖的疾病，在给药后的头2天内至少进行一次检查。在此期间，受试者可维持其正常的生活及饮食方式，但应避免可加速胃及其它上皮细胞脱落速率的物质如阿斯匹林和酒精。

如在动物和人实验中所观察到的，结肠中整个腺体的寿命周期估计约为4-7天。通常情况下，应在给药染料溶液后4-7天再进行结肠癌的诊断。

在实施本发明时，可直接肉眼观察经标记的表面上皮细胞。根据本发明的优选方法，直接肉眼观察在给药部位是否存在经标记的成熟上皮细胞，由此可将此等细胞的脱落速率评估为正常或异常。目标部位处观察到的荧光强度随标记细胞的脱落而降低。如果超过标记部位处正常上皮细胞脱落的时间仍存在标记物，则表明过度增殖。同样，在正常上皮细胞脱落前标记物消失，则表明增殖过低。有利的是，仅在标记步骤后的预选时间处定性测定是否存在标记物。虽然可以对标记物进行定量，但这对于实施本发明的诊断步骤并不是必须的。

根据本发明的优选方法，将标记细胞的部位暴露于激发光，然后观察和/或测量荧光强度，由此可检测花青染料标记物。例如，PKH2和PKH26都具有固定的吸收波长和荧光波长。在观察最大荧光时，PKH2需要约490-504nm的激发光，而PKH26需要约551-567nm的激发光。使用例如合适的滤波器和光检测器，通过内窥镜即可观察荧光。

在实施本发明时，可使用普通的纤维镜。具体而言，可选择性地将上皮粘膜暴露于特定波长的光，其中使用带有滤波器的纤维镜，而且所述滤波器设定为只能传输总光谱中所希望的部分。优选的是，对于PKH2滤波器从光源(如卤灯)传输波长约为490-504nm的光，而对于PKH26则传输波长约为551-567nm的光。使从标记细胞中发射的光从合适的窄带滤波器中通过，并任选地从图象增强器中通过，到达产生相应于被检测光强度的信号的光学检测器，由此即可检测荧光。观察目标部位时还可使用其它装置，如装有高分辨CCD检测器的内窥镜。

洗涤胃腔，测量洗涤溶液中的DNA，然后测量胃液中脱落细胞的数量，由此已可得到有关成熟上皮细胞从胃肠道粘膜脱落之速率的已有公开数据。根据该数据，每分钟约有500000个细胞从胃粘膜上脱落下来。已认识到，在萎缩性胃炎时该细胞丢失增加。

虽然有关脱落速率的数据是有限的，但肿瘤的细胞动力学却是已知的。通常情况下，当在某一器官中发生癌变，而且该器官中健康细胞周转的动力学在健康组织中变慢时，癌细胞的细胞动力学增加。相反地，如果健康器官的上皮细胞动力学高并发生癌变时，细胞动力学则降低。例如，健康肝细胞几乎不经历细胞分裂。在肝癌细胞中细胞动力学则增加。在胃肠道粘膜的健康细胞中，细胞动力学在正常情况下是极快的。当有癌症时，细胞动力学急剧下降。

在健康人的胃肠道粘膜中，S期(DNA合成期)的长度约在10-11小时之间。已知的是，人的胃粘膜循环时间(T)为约24-48小时，肠组织转化的循环时间为约37小时，结肠粘膜的循环时间为约40小时，而直肠粘膜的循环时间为约24-48小时。相比较而言，人的胃癌循环时间为约2.5-13天，而结肠癌的循环时间为约4.2-7.0天。因此，可明确地看出，在癌症时细胞增殖明显降低。另外，在人的癌症中，虽然肿瘤细胞增加一倍的时间(D)(即、细胞个数加倍所需要的时间)通常在约30-120天之间，但对于胃肠道癌症是极缓慢的；早期胃癌为约555-3076天，晚期胃癌为约105-305天，而结肠癌为约636天。

健康和癌细胞之间的细胞循环时间(T)差异约为10倍。该生长速率的差异也反映在正常及癌变粘膜上皮细胞所表现的上皮脱落速率上。胃表面粘膜细胞的正常寿命周期为约1-2天。结肠粘膜上皮细胞的正常寿命周期为约4-7天。如果癌细胞的脱落速率等于该正常的循环周期，则表明癌细胞的脱落速率比其T更快，基本上意味着癌细胞从身体中消失了。因此，可认为癌细胞的脱落速率必须慢于正常细胞的脱落速率十倍(癌细胞和正常细胞的T差异)，以使癌细胞存留在身体中。所以明显的是，在正常和癌变粘膜的脱落速率之间存在着明显的差异。本发明的独特方法利用了该脱落速率的不同。

在实施本发明时，观察所用的具体仪器的精度(即、区分正常细胞和癌症)是非常重要的。两种最经常使用的内窥镜是纤维镜和电子内窥镜。虽然各制造商的纤维镜和电子内窥镜的分辨率差别较大，但是纤维镜的分辨率通常为600μm，而电子内窥镜的分辨率通常为约100μm。作为本发明的目标物，直径为5-10mm损伤内的上皮细胞的脱落速率对于正常或异常者是可以分辨的。因此，应选择合适的仪器。

因为正常胃表面粘膜细胞的脱落速率为约2天，花青染色在该时间前显著消失说明有脱落速率较正常者更快的病症存在。如果花青染色在2天后仍可明显观察到，则表明有脱落速率减缓的病症(如胃癌)存在。

萎缩性胃炎通常随年龄老化而在胃粘膜中发生。因为已知在萎缩性胃炎时细胞周转增加，所以认为脱落速率也增加。

胃溃疡时的细胞周转通常高于正常胃组织的。没有有关脱落速率的数据，但为补偿粘膜的损失，进行正常的生长。因此，可认为细胞丢失没有被延迟。还可认为，在该病症和胃癌之间存在明显的差异，后者中细胞周转降低。

以下将通过实施例进一步说明本发明，这些实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的限制。

实施例1

为调查是否可以通过检查标记上皮细胞的脱落速率来分析细胞动力学，用PKH2和PKH26染色鼠胃粘膜中的上皮细胞。本研究的目的是在增殖细胞中相对于已知调查DNA合成的方法在成熟上皮细胞的迁移和脱落速率的基础上评估细胞动力学。在2周龄(160-200g)雄性Wistar鼠上进行以下实验。

为降低在胃中的残留，给大鼠喂以7％蔗糖、0.5％氯化钠溶液2天。为标记胃粘膜的重生性(generative)细胞区域，以6小时的间隔腹膜内给药50mg/kg(每只动物约10mg)的BrdU(5-溴-2-脱氧尿苷(sigma Chemical Co.))4次。在第4次给药BrdU后立即通过口腔插管向大鼠给药3ml的链酶蛋白酶溶液(链酶蛋白酶20000单位和1g碳酸氢钠在80ml水中)，以除去附着在胃粘膜上的表面粘液。在口服给药链酶蛋白酶溶液后30分钟时，通过口腔插管以相同的方式向胃中给药3ml的PKH2或者PKH26。在最终给药BrdU后的1、8、16、24、32、40、48、60和72小时杀死大鼠，并切除胃，然后立即在液氮中冷冻。

用恒冷切片机切割经冷冻的组织，制备4个分别为5μm厚的样品。

用第一个冷冻样品证明PKH2或PKH26的存在。使用氰基丙烯酸树脂(Bond Aron Alpha，由Toa Gousei Kagaku Co.制造)立即固定该样品，制成未经染色的样品。将其余3个冷冻样品固定在10％经缓冲的福尔马林中3分钟。一个样品用苏木紫-曙红染色。其余2个样品通过酶-抗体法用如下所述的抗-BrdU单克隆抗体染色。

用0.1M PBS(磷酸盐缓冲盐水，Experimental Bio Medical ResearchInc.)冲洗样品，然后在2N盐酸中于37℃下温育30分钟，以断裂DNA。在0.1M PBS中冲洗样品3次。为阻断内源性过氧化酶，在室温下用0.3％过氧化氢溶液处理样品10分钟，并在0.1M PBS中洗涤3次。接着，为阻断非特异性反应，在双倍稀释的Block-ACE(Snow Brand ProductsCo.，Ltd.)中温育10分钟，然后在0.1M PBS中洗涤3次。之后，一个样品用原抗体(抗-BrdU，鼠单克隆，Becton Dickinson)在室温下温育1小时，所述原抗体用包含1％BSA的0.1M PBS稀释50倍。作为负对照，其余样品在室温下用正常鼠血清温育1小时，所述鼠血清在包含1％BSA的0.1M PBS中稀释10000倍。然后样品用0.1M PBS冲洗3次，并在室温下用生物素化的鼠IgG温育30分钟。用0.1M PBS冲洗3次后，样品与ABC试剂(Vector)在室温下反应30分钟，并再用0.1M PBS冲洗3次，然后在DAB溶液(Dojindo)中温育1分钟。在流水中洗涤后，样品用Mayer苏木紫染色剂(Merck)进行核染色1分钟，然后再用流水洗涤10分钟。用乙醇使样品脱水，在甲苯中清洁，然后嵌入HSR。

对垂直于粘膜表面切除的各部分进行以下研究。图1显示了一部分切除的胃粘膜的各种区域。重生性细胞区域(G)定义为在第4次给药BrdU后1小时在增殖性区域中从最上层BrdU染色的细胞至最下层BrdU染色的细胞之间的距离。在最上层BrdU染色的细胞至粘膜表面的区域称为表面粘膜细胞区域(S)。此时在重生性细胞区域中BrdU阳性细胞与细胞总数的比例称为增殖区域标记指数。测量上皮细胞从BrdU阳性细胞迁移至粘膜表面所需要的时间。BrdU阳性细胞到达粘膜表面所用的时间称为表面粘膜细胞更新时间。如图1所示，距离(A)是相当于从粘膜表面至PKH2染色的最下层细胞的距离，而距离(B)相当于从粘膜表面至PKH26染色的最下层细胞的距离。

用荧光显微镜检查在未染色样品中存在PKH2和PKH26。PKH2使用用于FITC的滤波器检查，而PKH6使用用于若丹明(rhodamine)的滤波器检查。测量被PKH2和PKH26染色的粘膜表面的距离。染色细胞的丢失称为周转。使用目镜测微计测量各样品的组织学测量距离。

第4次给药50mg/kg BrdU后，在6小时间隔中的第1小时作为对照样品。BrdU阳性细胞主要局限在腺体的上部。在重生性细胞区域中的细胞中，98.2％是BrdU阳性细胞。因此，重生性细胞区域中的大多数细胞已吸收了BrdU。

连续检查BrdU阳性细胞的迁移，由此可观察表面粘膜细胞的迁移。在给药后1小时取得的第一个样品中，在约110μ处可看见最上层的BrdU阳性细胞(即、在重生性细胞区域上可看见110μ的表面细胞区域)。因此，可以清楚地得出，BrdU阳性细胞随时间向上迁移，而且在给药后60小时的时候，可在粘膜表面处看见BrdU阳性细胞。所以，可测定大鼠的表面粘膜细胞的寿命周期为约60小时。

已有报道称，人表面粘膜细胞的寿命周期约为72小时。由涉及BrdU标记细胞到达粘膜表面所需要的时间的本研究得到的数据非常接近文献报道的数值。

从粘膜表面计算，染料PKH2可染色在深度约为75μ处的表面粘膜细胞。PKH2染色的深度随时间流逝而变得越来越浅，并在40小时后消失。PKH26染色较PKH2更浅，从粘膜表面计算可染色最多至约45μ。在此情况下，经染色的细胞深度也随时间流逝而变得越来越浅，并在24小时后消失。如在约110μ处以BrdU所测定的，表面粘膜细胞脱落所需要的时间为60小时，从粘膜表面计算约75μ时以PKH2染色时为40小时，在约45μ时以PKH26染色时为24小时。据信，脱落速率的不同是由于各标记物的染色深度不同。该研究的结果是，可明显得出PKH2和PKH26可作为分析表面粘膜细胞脱落的标记物。

实施例2

为调查是否可以通过检查标记上皮细胞的脱落速率来分析细胞动力学，用PKH2和PKH26染色鼠结肠粘膜中的上皮细胞。在2周龄(160-200g)雄性Wistar鼠上进行以下实验。

为降低在结肠中的残留，给大鼠喂以7％蔗糖、0.5％氯化钠溶液2天。为标记结肠粘膜的重生细胞区域，以6小时的间隔腹膜内给药50mg/kg(每只动物约10mg)的BrdU4次。在第4次给药BrdU后立即通过肛门向大鼠给药3ml的链酶蛋白酶溶液(链酶蛋白酶20000单位和1g碳酸氢钠在80ml水中)，以除去附着在结肠粘膜上的表面粘液。在口服给药链酶蛋白酶溶液后30分钟时，也通过肛门向结肠中给药3ml的PKH2或者PKH26。在最终给药BrdU后的1、8、16、24、32、40、48、60和72小时杀死大鼠，并切除结肠，然后立即在液氮中冷冻。

用恒冷切片机切割经冷冻的组织，制备4个分别为5μm厚的样品。

用第一个冷冻样品证明PKH2或PKH26的存在。使用氰基丙烯酸树脂(Bond Aron Alpha，由Toa Gousei Kagaku Co.制造)立即固定该样品，制成未经染色的样品。将其余3个冷冻样品固定在10％经缓冲的福尔马林中3分钟。一个样品用苏木紫-曙红染色。其余2个样品通过酶-抗体法用如下所述的抗-BrdU单克隆抗体染色。

用0.1M PBS(磷酸盐缓冲盐水，Experimental Bio Medical ResearchInc.)冲洗样品，然后在2N盐酸中于37℃下温育30分钟，以断裂DNA。在0.1M PBS中冲洗样品3次。为阻断内源性过氧化酶，在室温下用0.3％过氧化氢溶液处理样品10分钟，并在0.1M PBS中洗涤3次。接着，为阻断非特异性反应，在双倍稀释的Block-ACE(Snow Brand ProductsCo.，Ltd.)中温育10分钟，然后在0.1M PBS中洗涤3次。之后，一个样品用原抗体(抗-BrdU，鼠单克隆，Becton Dickinson)在室温下温育1小时，所述原抗体用包含1％BSA的0.1M PBS稀释50倍。作为负对照，其余样品在室温下用正常鼠血清温育1小时，所述鼠血清在包含1％BSA的0.1M PBS中稀释10000倍。然后样品用0.1M PBS冲洗3次，并在室温下用生物素化的鼠IgG温育30分钟。用0.1M PBS冲洗3次后，样品与ABC试剂(Vector)在室温下反应30分钟，并再用0.1M PBS冲洗3次，然后在DAB溶液(Dojindo)中温育1分钟。在流水中洗涤后，样品用Mayer苏木紫染色剂(Merck)进行核染色1分钟，然后再用流水洗涤10分钟。用乙醇使样品脱水，在甲苯中清洁，然后嵌入HSR。

对垂直于粘膜表面切除的各部分进行以下研究。图2显示了一部分切除的结肠粘膜的各种区域。重生性细胞区域(G)定义为在第4次给药BrdU后1小时在增殖性区域中从最上层BrdU染色的细胞至最下层BrdU染色的细胞之间的腺体距离。在最上层BrdU染色的细胞至粘膜表面的区域称为表面粘膜细胞区域(S)。此时在重生性细胞区域中BrdU阳性细胞与细胞总数的比例称为增殖区域标记指数。测量上皮细胞从BrdU阳性细胞迁移至粘膜表面所需要的时间。BrdU阳性细胞到达粘膜表面所用的时间称为表面粘膜细胞更新时间。如图2所示，距离(A)是相当于从粘膜表面至PKH2染色的最下层细胞的距离，而距离(B)相当于从粘膜表面至PKH26染色的最下层细胞的距离。

用荧光显微镜检查在未染色样品中存在PKH2和PKH26。PKH2使用用于FITC的滤波器检查，而PKH6使用用于若丹明的滤波器检查。测量被PKH2和PKH26染色的粘膜表面的距离。染色细胞的丢失称为周转。使用目镜测微计测量各样品的组织学测量距离。

第4次给药50mg/kg BrdU(约10mg/动物)后，在6小时间隔中的第1小时作为对照时间。BrdU阳性细胞主要局限在腺体的底部7/10中。上3/10是表面细胞区域，测量深度约为60μ在重生性细胞区域中的细胞中，98.2％是BrdU阳性细胞。因此，重生性细胞区域中的大多数细胞已吸收了BrdU。

连续检查BrdU阳性细胞的迁移，由此可观察表面粘膜细胞的迁移。在给药后1小时的时候，在约60μ处可看见最高的BrdU阳性细胞(即、在重生性细胞区域上可看见60μ的表面细胞区域)。可以清楚地得出，BrdU阳性细胞随时间向上迁移，而且在给药后32小时的时候，可在粘膜表面处看见BrdU阳性细胞。所以，可测定大鼠的表面粘膜细胞的寿命周期为约32小时。因为鼠BrdU阳性结肠表面粘膜细胞的寿命为约32小时，而该部分细胞占腺体的上3/10，所以估计整个腺体的寿命为约107小时或者4.5天。

已有报道称，人表面粘膜细胞的寿命周期约为4-7天。由涉及BrdU标记细胞到达粘膜表面所需要的时间的本研究得到的数据非常接近文献报道的数值。

从粘膜表面计算，染料PKH2可染色在深度约为40μ处的表面粘膜细胞。PKH2染色的深度随时间流逝而变得越来越浅，并在16小时后消失。PKH26染色较PKH2更深，从粘膜表面计算可染色最多至约50μ。该标记物的深度也随时间流逝而变得越来越浅，并在32小时后消失。如在约60μ处以BrdU所测定的，表面粘膜细胞脱落所需要的时间为32小时，在约40μ处以PKH2染色时为16小时，而在约50μ处以PKH26染色时为32小时。据信，脱落速率的不同是由于各标记物的染色深度不同。

实施例3

进行体外检查，以确定是否可通过鉴别人结肠癌细胞和胃癌细胞与正常的人结肠细胞和胃细胞的脱落速率不同，来从正常粘膜中区分出癌损伤。所得结果表明人结肠癌和胃癌可通过测定脱落速率来诊断。

借助于内窥镜通过直接观察将包含PKH2和PKH26的细胞标记组合物喷涂在目标部位上，然后切除疾病损伤及该损伤周围的正常组织。用荧光显微镜观察经冷冻的样品，以鉴别PKH2或PKH26的存在，并测定脱落速率。为制备用于本方法的胃，首先使用包含链酶蛋白酶20000单位和1g碳酸氢钠在80ml水中的溶液消除胃粘液。清除后，进行正常的结肠镜检查，其中借助于内窥镜通过直接观察将PKH2和PKH26溶液喷涂在损伤部位和周围区域上。

在结肠中，进行结肠镜检查，并制备在正常的结肠镜检查后切除的患病区域，其中使用约137g聚乙二醇及2-4升的水。患者禁用食物、药物、其它有可能影响细胞动力学的药剂如甾体药物、阿斯匹林、以及酒精，4天后进行首次检查，然后再进行以下的检查。

因为所研究的病例涉及早期癌症，所以进行内窥镜切除(活组织检查)，以切除损伤部位。经切除的部分立即保存在液氮中。用恒冷切片机将组织切成5μm的样品，由此形成两个样品。在制备冷冻样品后，立即固定其中的一个样品，并形成未经染色的样品，以鉴别是否存在PKH2或者PKH26。第二个样品固定在10％经缓冲的福尔马林中3分钟，然后用苏木紫-曙红染色。在苏木紫-曙红染色的样品上进行损伤诊断。使用荧光显微镜和用于FITC的滤波器来鉴别PKH2的存在，并用荧光显微镜和用于若丹明的滤波器鉴别PKH26的存在。

患者1

患者1为60岁的男人，在幽门窦患有早期胃癌(隆肿型，IIa型)，直径为20mm。使用链酶蛋白酶20000单位和1g碳酸氢钠在80ml水中的溶液进行胃粘液清除后，进行正常的内窥镜检查。使用内窥镜肉眼证实损伤存在后，立即喷涂10ml的PKH2溶液，以染色损伤。在内窥镜检查后4天时，使用剥除活体组织检查法切除IIa型早期胃癌。使用上述方法冷冻组织样品，并用显微镜进行检查。从H-E染色组织的图象来看，区别明显的腺癌区域所处的粘膜周围是正常的粘膜。用荧光显微镜并使用FITC滤波器观察癌症区域后，发现癌变组织的表面被PKH2染色的深度为30μ。

相反地，虽然在周围正常细胞中鉴别出肠组织变形和幽门腺，但未检测出PKH2荧光。因此，被PKH2染色的正常粘膜上皮细胞已由于脱落而丢失，而被PKH2染色的癌细胞却没有。

患者2

患者2是一位63岁的男性，患有直肠癌(隆肿I型直肠癌)，直径为10mm。用聚乙二醇清楚粪便后，进行结肠镜检查。使用内窥镜肉眼证实损伤存在后，立即喷涂10ml的PKH26溶液，以染色损伤及周围区域。在结肠镜检查后4天时，在内窥镜直接观察下切除损伤。使用与上述患者1相同的方法制备切除组织。H-E染色的组织显示出区别明显的腺癌局限在粘膜上，荧光显微镜检查发现癌变组织的表面被PKH26染色至60μ的深度。还发现在周围粘膜中被PKH26染色的上皮细胞已脱落。因此，被PKH26染色的正常粘膜已脱落，而被PKH26染色的癌粘膜仍存在。所以，可以明显地看出，在癌粘膜和正常结肠粘膜的脱落速率之间存在差异。

在结肠粘膜中，增殖细胞的区域包括腺体的下三分之二。当在体外进行测量时，S阶段的持续时间为9-20小时，而总循环时间在24-48小时之间。根据体外实验的数据，S阶段的大肠中的细胞数量(或者标记指数L.I.)在12-25％之间变化。从这些数值计算出，该组织的替换时间为4-8天。体内研究通常提供较短的S阶段持续时间(7.2-11.2小时)和较低的标记指数数值(1.5-17％)。因此，总细胞时间的估计值可提供比体内得到的更大的数值(体外为77.2-129.9小时，体内为24-48小时)。

上述描述和附图仅是用于说明实现本发明目的、特征和优点的优选实施方案，而不意味着本发明的范围就囿于此。在本发明的精髓和范围内还可进行各种改进。

Claims (7)

1、花青染料在制备用于体内检测温血动物之成熟表面上皮细胞的异常细胞脱落速率或者评估温血动物的粘膜表面上成熟表面上皮细胞之脱落速率的标记组合物中的应用。

2、如权利要求1所述的应用，其中，所述花青染料为下式者：

其中：

Y是氧、硫、亚甲基或烷基取代的亚甲基；

m是0-3；及

n可相同或不同并是3-22。

3、如权利要求1或2所述的应用，其中，所述花青染料是下式者：

或

4、如权利要求1所述的应用，其中，所述标记组合物是口服剂型。

5、如权利要求1所述的应用，其中，所述标记组合物是直肠给药的剂型。

6、如权利要求1所述的应用，其中，所述粘膜表面是胃的粘膜表面。

7、如权利要求1所述的应用，其中，所述粘膜表面是结肠的粘膜表面。

Images