JP2004525697A - 腫瘍組織の光力学的診断用のデバイス及び方法 - Google Patents

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Abstract

遠位端部と近位端部とをもつ外科用テレスコープ型デバイスと、前記外科用テレスコープ型デバイスの近位端部に結合したカメラと、前記外科用テレスコープ型デバイスの近位端部と前記カメラとの間に挿入されたホログラフィックノッチフィルターとを含む装置。このカメラは電荷結合素子カメラ（CCDカメラ）であるのが好ましい。本装置は、焦点レンズまたは、ロングパスフィルター若しくは熱線フィルターなどの別のタイプのフィルターも含むことができる。この外科用テレスコープ型デバイスは、非白色光で材料を照射し、次いで放出された蛍光、燐光またはルミネセンスを検出することによって使用することができる。

Description

【０００１】
本発明は、生物学的に標的化した分子を、光源（たとえばレーザー）からの光で励起させるためのデバイス及び方法に関する。特定の態様では、蛍光コバラミン類（本明細書中、CobalaFluorと称することもある）を、本開示のデバイス及び装置で使用することができる。この蛍光コバラミン類は、コバラミンに共有結合した蛍光、燐光、ルミネセンスまたは光発生化合物を含む。これらの蛍光コバラミン類は、診断及び予後診断マーカーとして使用して、（a）癌細胞を含むリンパ節を同定することを含む、健常細胞と組織から癌細胞と組織を区別し、（b）コバラミンベースの治療用バイオコンジュゲート（bioconjugate）を使用する化学療法に対して個体が積極的な反応を示すかどうかを検出することができる。
【０００２】
発明の背景
本明細書中で引用した文献及び他の資料は、以下のテキスト中に著者及び年代順に参照し、付記文献目録に著者をアルファベット順に列記する。
【０００３】
急速に分裂している細胞には、DNA複製前に1個の炭素の代謝をサポートするために酵素メチオニンシンターゼ（合成酵素）の補因子としてコバラミンが必要である（Hogenkampら、1999年）。急性骨髄球性白血病では、B12結合タンパク質トランスコバラミン及びハプトコリン（haptocorrin）の濃度上昇により、血液の不飽和B12結合能が3〜26倍に上昇する（Schneiderら、1987年；Rachimelwitzら、1971年）。充実性腫瘍の患者は、トランスコバラミンとハプトコリンの循環レベルの顕著な増加を示すこともある（Carmelら、1975年）。不飽和血清コバラミン結合能の上昇は、急速に分裂している細胞によりコバラミンの取り込みが多くなっていることと対応する。ガンマ放出性放射線核種、たとえば111Inが八配座子（octadentate）キレート化合物のジエチレントリアミンペンタ酢酸（DTPA）を介してコバラミンに結合しているならば、腫瘍は、診断用画像化目的に関して十分なコバラミンをまさに封鎖している（Hogenkamp及びCollins、1997年）。このことは、繊維肉腫を移植したマウス（Hogenkamp及びCollins、1997年）並びに、肺癌のヒト（Collinsら、1999年）、そして前立腺、肺及び脳腫瘍（Collinsら、2000年）において、立証されている。
【０００４】
黒色腫及び乳癌手術の際のセンチネルリンパ節コンセプトでは、染料または放射線核種を腫瘍周辺の組織に注射して、腫瘍から流出する最初のリンパ節を同定する（Mortonら、1992年；McGreevy，1998年）。この節は、センチネルリンパ節（sentinel lymph node）と呼ばれ、原発腫瘍の域を超える転移度を決定するための診断試験用に取り出される。患者の約12％で転移性疾患を検出できないので、この手順は論議を巻き起こしている（McMasterら，1999年）。注射する染料または放射線核種は、癌細胞に対して特異的ではなく、外科医に腫瘍部分から流出する原発リンパ節を同定させるに過ぎない。癌細胞に特異的な蛍光マーカーを使用することによって、高比率の偽陰性を劇的に改善すべきである。
【０００５】
かくして、優れた結果をもたらす、癌組織または細胞の診断及び予後診断に使用し得る試薬及び装置に対する需要がある。
発明の概要
蛍光、燐光またはルミネセンスを放つ化合物または組織を受容者（host）内で、検出、操作及び／または除去するのに使用し得る検出及び画像化装置について記載する。第一の態様では、本装置は、遠位端部と近位端部とをもつ外科用テレスコープ型デバイス；前記外科用テレスコープ型デバイスの近位端部に結合したカメラ；前記外科用テレスコープ型デバイスの近位端部と前記カメラとの間に挿入されたホログラフィックノッチフィルターとを含む。態様によっては、このカメラは電荷結合素子カメラ（CCDカメラ）である。本装置は、焦点レンズまたは、ロングパスフィルター若しくは熱線フィルターなどの別のタイプのフィルターも含むことができる。
【０００６】
もう一つの態様では、本装置は、蛍光、燐光またはルミネセンスを放つ物質を照射する光発生源；遠位端部と近位端部とをもつ外科用テレスコープ型デバイス；前記外科用テレスコープ型デバイスの近位端部に近接して配置された第一の端部をもつ焦点レンズ；前記焦点レンズの第二の端部に結合したカメラ；及び前記外科用テレスコープ型デバイスの近位端部と前記カメラとの間に挿入された少なくとも一つの部材であって、前記光発生源によって伝達された少なくとも一部の波長を除去する前記部材を含む。この部材は、フィルター、プリズム、グレーティング、鏡または同様の波長選択デバイスであってもよい。
【０００７】
さらに開示された態様において、本装置は、拡大レンズを含むハウジング；前記拡大レンズと受容者との間に挿入されたホログラフィックノッチフィルター；及び、蛍光、燐光またはルミネセンスを放つ物質を照射するための光発生源を含む。
【０００８】
この外科用テレスコープ型デバイスは、物質に非白色光を照射し、次いで放出された蛍光、燐光またはルミネセンスを検出することによって使用することができる。
一態様では、コバラミンに共有結合した蛍光、燐光、ルミネセンスまたは光発生化合物から構成される蛍光コバラミン類を、上記装置と組み合わせて使用することができる。これらの蛍光コバラミン類は、診断用及び予後診断マーカーとして使用して、（a）癌細胞を含むリンパ節を同定することを含む、健常細胞と組織から癌細胞と組織を区別でき、そして（b）コバラミンベースの治療用バイオコンジュゲートを使用する化学療法に対して個体が積極的な反応を示すかどうかを検出することができる。この蛍光コバラミン類は、（1）癌細胞による迅速な輸送及び貯蔵（最大取り込みは4〜6時間で起きる）、（2）非常に低濃度で視覚的に検出し得る明るいフルオロフォア、及び（3）非毒性成分という特徴を示す。
【０００９】
一つの側面では、蛍光、燐光、ルミネセンスまたは光発生化合物がコバラミン（ビタミンB12）に共有結合している蛍光コバラミン類を提供する。この蛍光、燐光または光発生化合物は、コバラミンのコバルト原子、コリン環、またはリボース部分に共有結合することができる。蛍光、燐光、ルミネセンスまたは光発生化合物がコリン環またはリボース部分に共有結合するのが好ましい。任意の蛍光、燐光、ルミネセンスまたは光発生化合物をこの蛍光コバラミン類の製造に使用することができるとはいえ、可視光または赤外線で励起可能な蛍光、燐光、ルミネセンスまたは光発生化合物を使用するのが好ましい。好ましい蛍光化合物の例としては、フルオレセイン、フルオレセイン-5EX、メトキシクマリン、ナフトフルオレセイン、BODIPY 493/503、BODIPY FL、BODIPY R6G、BODIPY 530/550、BODIPY TMR、BODIPY 564/570、BODIPY 576/589、BODIPY 581/591、BODIPY TR、Cascade Blue、Dansyl、ジアルキルアミノクマリン、4',5'-ジクロロ-2',7'-ジメトキシフルオレセイン、2',7'-ジクロロフルオレセイン、エオシン、エオシンF3S、エリトロシン、ヒドロキシクマリン、リサミンローダミンB、メトキシクマリン（methosycoumarin）、ナフトフルオレセイン（maphthofluorescein）、NBD、Oregon Green 488、Oregon Green 500、Oregon Green 514、PyMPO、ピレン、ローダミン6G、ローダミングリーン、ローダミンレッド、ロドール（rhodol）グリーン、2',4',5',7'-テトラブロモスルホンフルオレセイン、テトラメチルローダミン（TMR）、Texas Red、X-ローダミン、Cy2染料、Cy3染料、Cy5染料、Cy5.5染料、Cy7染料、IC Greenまたは量子ドット構造（quantum dot structure）が挙げられるが、これらに限定されない。可視光または赤外線で励起したときに、好ましい蛍光コバラミン類は、コバラミンから蛍光または燐光化合物を分離する必要なく蛍光を発生する。この光は、適当なフィルターを使用するレーザーまたは光ファイバー光源によって供給してもよい。赤色光は組織によく浸透するので好ましい。
【００１０】
第二の態様では、この蛍光コバラミン類は、新生物細胞、形成異常細胞、または過形成細胞などの異常細胞の同定に使用する。特にこの蛍光コバラミン類は、健常細胞と癌細胞を区別するのに使用する。一態様において、蛍光コバラミンは、手術前に患者に投与する。原発腫瘍であろうと転移部位であろうと、癌細胞での蛍光、燐光、ルミネセンスまたは放出光の存在は、除去すべき組織を画定するために外科医によって使用される。第二の態様では、蛍光コバラミンは、腫瘍の位置から流出するリンパ節によって取り込まれるのに好適な状態で、患者に投与する。蛍光、燐光、ルミネセンスまたは放出光が存在すると、手術の間に除去すべきこれらのリンパ節を確認できる。この後者の態様において、腹腔鏡、内視鏡及び顕微鏡法を使用して、癌細胞を含むリンパ節と同定することができる。これらの方法を使用すると、陽性のリンパ節の同定及び回収（retrieval）が容易である。
【００１１】
第三の側面では、この蛍光コバラミン類を使用して、個体がコバラミン-ベースの治療用バイオコンジュゲートを使用する化学療法に対して積極的な反応を示すかどうかを検出することができる。この側面において、蛍光コバラミンを使用して、定量的及び定性的の両面において、特定の型の癌細胞がコバラミンを輸送し貯蔵する能力を評価する。大量のコバラミンを輸送し貯蔵する種々のタイプの癌は、コバラミン-ベースの治療用バイオコンジュゲートを使用する治療の良い候補である。腫瘍細胞のコバラミンの結合、取り込み、輸送及び貯蔵の定量化は、目視検査（たとえば、組織スライド）下で蛍光により、エピ蛍光（epifluorescence）顕微鏡法、蛍光腹腔鏡法、蛍光内視鏡法またはフローサイトメトリーによって実施することができる。
【００１２】
第四の側面では、この蛍光コバラミン類を使用して、血液、血漿、血清、脳脊髄液または尿中のコバラミンレベルを測定したり、あるいは血液、血漿、血清または脳脊髄液中の未結合のコバラミン結合能量を測定する。
【００１３】
第五の側面では、腹腔鏡または内視鏡視覚化を利用して、リンパ節において、いずれかの蛍光分子（癌-ターゲット化、または非ターゲット化）を検出することができる。
【００１４】
幾つかの態様の詳細な説明
本明細書で開示の外科用テレスコープ型デバイスを使用して、蛍光、燐光またはルミネセンスを放つ物質を検出し除去することができる。そのような物質としては、本明細書中に記載の分子及び化合物、並びに蛍光、燐光、またはルミネセンスの分子または化合物で標識化したいずれかの組織を挙げることができる。本デバイスは、生物学的に標的化した蛍光分子を光で励起することができ、励起した光よりも長波長の派生蛍光の発光を検出することができる。
【００１５】
具体的な外科用テレスコープ型デバイスとしては、たとえば内視鏡、腹腔鏡、関節鏡、結腸鏡または顕微鏡が挙げられる。この外科用テレスコープ型デバイスは、少なくとも一つの光除去または遮蔽部材及び／または赤色光照射源を含むように変形してある。これらの変形によって、蛍光、燐光またはルミネセンスを放つ物質を可視化し易くなる。特定の態様では、本装置は、癌細胞を含んでいても含んでいなくてもよい腋窩リンパを同定及び除去するための腹腔鏡である。そのような腹腔鏡の一例を、図15〜18及び21に関連して、以下詳細に記載する。
【００１６】
上記の如く、本装置は少なくとも一つの光除去部材を含む。本明細書中、「光除去（light-removing）」とは、光の所定の波長を吸収、反射、及び／または偏向させるような全ての光遮蔽メカニズムを含むが、これらに限定されない。代表的な部材としては、フィルター、プリズム、グレーティング、鏡または同様の波長選択デバイスが挙げられる。装置は、そのような部材を二つ以上、及び／またはそのような部材の組合せを含んでもよい。
【００１７】
好適なフィルターとしては、ノッチフィルター、ロングパスフィルターまたは熱線フィルターが挙げられる。特定の態様によれば、このフィルターは、蛍光、燐光またはルミネセンスを放つ材料を励起するのに使用する光発生源の波長に対応する非常に狭い波長だけを遮蔽するホログラフィックノッチフィルターである。ホログラフィックノッチフィルターは、ヒトの目から見ると透明のように見える。このホログラフィックノッチフィルターによって、異なる種類のフィルター及びカメラを繰り返し置き換えることなく、手順を見られるようにカラーCCDカメラを使用することができる。ホログラフィックノッチフィルターは周知であり、たとえばKaiser Optical Systemsより市販されている。
【００１８】
ロングパスまたはバンドパスフィルターも使用して、短波長を除去するが、長波長の光は通過するようにできる。分子の蛍光によって発生した光は、フルオロフォアを照射するのに使用する光の波長に対して長波長にシフトしているため、ロングパスフィルターは有用である。
【００１９】
このフィルターは、光発生源からの反射及び直接入射光が、カメラによってもたらされる画像を歪曲または不明瞭にしないようにする。このフィルターは、非白色光発生源の波長を除去するように選択する。たとえば約625 nmの波長の赤色光レーザーまたはレーザーダイオードの場合には、約625 nmの光波長だけを除去するホログラフィックノッチフィルターを使用する。かくして、カメラによってもたらされたカラー画像は、赤色光によって歪曲されないだろう。
【００２０】
この光除去部材は、ユーザーが所望の観察モードをベースとする種々の光除去部材の間で容易に入れ替えができるように、外科用テレスコープ型デバイス上に取り外し可能に固定されていてもよい。たとえば、カメラの正面にフィルターを断続的に導入するために、機械シャッターを用意することができよう。
【００２１】
この光発生源は、レーザー、レーザーダイオード、光放射性ダイオード、光ファイバー光源、発光ガス放電、熱フィラメントランプ、及び同様の光源などのいずれかの好適なデバイスであってもよい。特定の態様では、本発明の光発生源は、Cy5染料を含む蛍光コバラミンの場合には、たとえば、少なくとも約625 nm、特に約630〜約635 nmの波長範囲の光などの赤色光を発生する。具体的な光発生源は、約633 nmの波長の赤色光を放出するHeNeレーザーである。このHeNeレーザーは、組織をよりよく照射するために少なくとも約10 mWで放射する。赤色光源は数センチメートルまで組織に透通することができ、これを使用してフルオロフォア及び全ての関連する癌細胞を照射及び同定する。
【００２２】
より見慣れたフルカラーの画像化を可能にするために、白色光源も準備することができる。そのようなフルカラーの画像化は、受容者内部での解剖学的な方向付けのために、及びビデオモニターで見るために有用である。赤色光源（またはいずれかの非白色光）と白色光源との両方を含む二重光源を使用して、普通に見るための白色光と蛍光を見るための非白色光との間を迅速に切り替えるために簡単なメカニズムを提供することができる。そのような切り替えは、たとえば音声作動型切り替え、機械的操作による切り替え（たとえばフットペダル）、光学的に操作するスイッチ、または電気的に操作するスイッチなどのいずれかのメカニズムによって実施することができる。たとえば、市販の光ファイバー・デュアルランプ・キセノン光源は、ランプの一つを赤色光ダイオードレーザーまたは赤色HeNeレーザーで置き換えることによって変更することができる。もう一つの変形例としては、二つの内部光源（一つは白色光で、もう一つは非白色光）と、この二つの光源の間を切り替えるために機械的または電気機械的制御下で鏡またはプリズムとを含むデバイスであってもよい。
【００２３】
本発明のカメラは、蛍光、燐光またはルミネセンスの画像を検出、捕捉または伝達することができるいずれかのデバイスであってもよい。具体的なカメラとしては、ビデオカメラまたは写真用カメラが挙げられる。特定の態様では、このカメラはCCDカメラである。具体的なCCDカメラとしては、Santa Barbara Instrument Group（たとえば、STVなる商品名のもとに市販のカメラ）、Stryker及びKarl Storz製のものが挙げられる。
【００２４】
本装置の具体的な態様は、図15、16、及び21に示す。図15を参照して、外科用伸縮系5は、CCDカメラ系11と、光発生源12とに結合した外科用テレスコープ型デバイス10を含む。この外科用テレスコープ型デバイスは、シャフト25、患者の切り口または開口部に挿入する遠位端部14と、CCDカメラ系11に結合している近位端部15とをもつ剛性または可撓性の筒状光学機器である。この外科用テレスコープ型デバイス10は、照射した組織によって放出された光を、CCDカメラ系11内のCCD光センサーに伝達し得るいずれかの接続構造体13によって、CCDカメラ系11と結合することができる。この接続構造体13は、図17と関連して、以下詳細に述べる。このCCDカメラ系は、この接続構造体13上に据え付けられたカメラヘッド16を含む。このカメラヘッド16は、カメラヘッド16のCCD光センサーから発生したビデオ出力シグナルから全国テレビジョン規格委員会（NTSC）またはビデオヘリカルスキャン（VHS）フォーマットを受け取ることができるビデオ・プロセシング・モジュール26とケーブルを介して連絡している。このCCDカメラ系11は、外科手術の間に画像を見たり記録したりするためのビデオモニター27と、ビデオ・プロセシング・モジュール26を制御するためのコンピューター28とをも含む。他の好適なCCDカメラ制御及び視聴システムをこの外科用テレスコープ型デバイスと共に使用することができる。
【００２５】
図16を参照すると、光発生源12は、外科用テレスコープ型デバイス10のシャフト25と連通する継手24に受容される光ファイバーケーブル23を介して外科用テレスコープ型デバイス10に接続している。この光発生源は、光ファイバーケーブルを受容するためにカメラヘッド16内の開口部の入口を介して外科用テレスコープ型デバイスに接続することもできる。この光発生源12からの光は通常、外科用テレスコープ型デバイス10のシャフト25内に配置された光ファイバーまたはケーブル（示されていない）を通って伝わって、所望の受容者領域を照射する。あるいは、この光発生源12は、外科用テレスコープ型デバイス10には結合しないが、受容者の切り口に挿入された光ファイバーなどの独立した手段によって、所望の受容者領域を照射する。
【００２６】
外科用テレスコープ型デバイス10の近位端部15とカメラヘッド16との間のこの接続構造体13は、種々の部品を含むことができる。この接続構造体13は、カメラヘッド16のレンズと外科用テレスコープ型デバイス10の接眼レンズとに合ったフィルター用のホルダーであってもよい。図17は、この接続構造体13の一態様のより詳細な例を図示している。
【００２７】
図21は、特定の光源をより詳細に示している。HeNeレーザー50は光ビーム51を放出し、この光ビームは第一の鏡52と第二の鏡53とから反射して、次いで第一のプリズム54によって偏向され、バンドパスフィルター55を通って第二のプリズム56によってデュアルランプキセノン光源57へ偏向させる。このデュアルランプキセノン光源57は、第一の出口58を画定し、この中を通ってレーザー光は光ファイバーケーブル23内へ出る。このデュアルランプキセノン光源57は、第二の出口59も画定し、キセノン光源から白色光がこの中を通って出る。第一の鏡52、第二の鏡53、第一のプリズム54、バンドパスフィルター55及び第二のプリズム56は、光学テーブル（optical table）上に配置されていてもよい。図21に示されている第一の鏡52、第二の鏡53、第一のプリズム54、バンドパスフィルター55及び第二のプリズム56は、特定のHeNeレーザー50の非干渉を分散するが、他の光源に関しては必要ないかもしれない。
【００２８】
図17を参照して、外科用テレスコープ型デバイス10の近位端部15には、接触している接眼レンズ17が備えられている。ホログラフィックノッチフィルター18は、この接眼レンズ17とフィルターホルダー19との間に配置されている。図18に示されているように、ホログラフィックノッチフィルター18を受容するために、接眼レンズ17内に窪み20を準備することができる。このホログラフィックノッチフィルター18は、通常、円形ディスクであるが、楕円、長方形または正方形などのいずれかの形状をとることができる。このホログラフィックノッチフィルター18の厚さは、所望の遮蔽波長及び他の性能特徴に応じて、当該技術分野において公知の如く変えることができる。このフィルターホルダー19は、接眼レンズ17の外周の周りにスリーブとして適合するような寸法にする。この接眼レンズ17の外周表面及びフィルターホルダー19の内部表面は、フィルターホルダー19と接眼レンズ17とが取り外し可能に噛み合うようにねじ山がつけられている。焦点レンズ22は、フィルターホルダー19に据え付けられている。アダプター21（たとえば、C-マウント）は、当該技術分野において公知の手段を介してCCDカメラヘッド16に焦点レンズ22を接続する。
【００２９】
フィルターを配置するには、他の多くの可能な配置があると考えられる。たとえば、フィルターは、焦点レンズとCCDカメラヘッドとの間に備えてもよい。他には、内視鏡または腹腔鏡のシャフトの内部にフィルターをつけることがある。一つの装置に複数のフィルターを含めてもよい。たとえば、フィルターホルダーは二つ以上のフィルターを保持してもよいし、また第一のフィルターは接眼レンズと焦点レンズとの間に配置し、且つ第二のフィルターは焦点レンズとCCDカメラヘッドとの間に配置してもよい。ノッチフィルター、ロングパスフィルター及び／または熱線フィルターの組合せなどの、種々のフィルタータイプの組合せを使用してもよい。別の特定の態様では、第一の熱線フィルターを接眼レンズと焦点レンズとの間に配置し、第二及び第三の熱線フィルターを焦点レンズとCCDカメラヘッドとの間に配置する。この態様では、熱線フィルターによって、フルオロフォアの検出用により良いコントラストを提供し得る白黒CCDカメラを使用することができる。
【００３０】
腫瘍の微小な縁（micromargin）を視覚化するのに有用である、拡大装置も開示する。通常、そのような装置は、拡大レンズ、接眼レンズ、及び顕微鏡の接眼レンズと受容者との間に配置されたフィルターを含む。
【００３１】
一つの例は、図19に示されている外科用顕微鏡である。この外科用顕微鏡は、二つの接眼レンズ31を支えるヘッドまたはハウジング30を含む。このハウジング30は、シーリングマウント（ceiling mount）（示されていない）に固定されたフリーバランスアーム（articulating arm）33によって支持されている。この接眼レンズ31は、物体から反射または放出された光を受容する集光レンズ32と光学的に連通する。ホログラフィックノッチフィルター34は、スクリュー、クリップまたは同様の付属手段によって、集光レンズ32に固定される。光ファイバー束（示されていない）を連接型外科用顕微鏡ヘッドに固定して、照射光を提供することができる。増倍スクリーン（示されていない）を別の接眼レンズ上で顕微鏡に据え付けて、検出感度を高くすることができる。乳腺腫瘤摘出により腫瘍を小さくした後で、残っている腫瘍を示す蛍光の痕跡に関して、腫瘍の微小な縁を拡大して観察するために、外科用顕微鏡を配置することができる。
【００３２】
腫瘍の微小な縁を観察するための装置のもう一つの変形例を、図20に示す。この装置は、上記の如きCCDカメラ系40を含むが、内視鏡または腹腔鏡ではなく、拡大ビデオレンズ41をCCDカメラヘッドに据え付けている。フリーバランス位置決めアーム42はCCDカメラ40を支持する。ホログラフィックノッチフィルター43をCCDカメラ40と拡大ビデオレンズ41との間に配置するか、または上記の如くフィルターホルダーによって拡大ビデオレンズ41の遠位端部に固定してもよい。乳腺腫瘤摘出により腫瘍を小さくした後で、残存する腫瘍を示す蛍光の痕跡に関して、腫瘍の微小な縁を拡大して観察するために、CCDカメラを配置することができる。
【００３３】
いずれかのタイプの蛍光、燐光、またはルミネセンスを放つ物質を、上記デバイスと共に使用することができよう。特に有用な物質は、コバラミン（ビタミンB12）に共有結合している蛍光化合物（フルオロフォア）、燐光化合物（ホスホロフォア）、ルミネセンスの化合物（化学ルミネセンス発色団）または光発生化合物を含む蛍光コバラミンである。これらの蛍光コバラミン類は、診断及び予後診断マーカーとして使用して、（a）癌細胞を含むリンパ節を同定することを含む、健常細胞と組織から癌細胞と癌性組織を区別し、（b）コバラミンベースの治療用バイオコンジュゲートを使用する化学療法に対して個体が積極的な反応を示すかどうかを検出することができる。
【００３４】
この蛍光コバラミン類は、以下の式：
【００３５】
【化１】
【００３６】
[式中、R1はCN、OH、OH2、CH3、5'-デオキシアデノシンまたは（CH2）pNHC（=S）Yであり；R2、R3、R4、R5、R6及びR7は独立してCONH2またはCO-XmYであり；R8はCH2OH、O（C=O）XmYまたはCH2O（C=O）XmYであり；R9はOHまたはO（C=O）XmYであり；Xは式N（CH2）nNHO（C=O）またはNH-（CH2）n-NHをもつリンカーであり；Yはフルオロフォア、ホスホロフォア、化学ルミネセンス発色団または光発生分子であり；mは0または1であり、nは0〜50であり、pは2〜10であり、但し、R1〜R9基の少なくとも一つはYを含む]により表わすことができる。
【００３７】
この蛍光コバラミン類は、フルオロフォア、ホスホロフォア、化学ルミネセンス発色団または光発生分子をコバラミンに共有結合させることにより製造することができる。このフルオロフォア、ホスホフォア、化学ルミネセンス発色団または光発生分子は、コバルト原子、コリン環またはリボース糖に直接またはリンカー分子を介して共有結合する。この共有結合は、リンカー分子を使用して得るのが好ましい。フルオロフォア、ホスホロフォア、化学ルミネセンス発色団または光発生分子がコバラミンのコバルト原子に結合していると、蛍光、燐光または放出した光は、コバルト原子の回転による消光のため強度が減退する。さらにこの蛍光コバラミンを長時間、光に暴露すると、このコバルト-炭素結合が開裂して、コバラミンからフルオロフォア、ホスホロフォア、化学ルミネセンス発色団または光発生分子を放出する（Howardら、1997年）。かくして、フルオロフォア、ホスホロフォア、化学ルミネセンス発色団または光発生分子をコバラミン分子のコリン環またはリボース部分に結合させるのが好ましい。これら後者のコバラミン類は、そのフルオロフォア、ホスホロフォア、化学ルミネセンス発色団または光発生分子がコバルト原子に共有結合している蛍光コバラミン類の欠点をもたない。
【００３８】
コリン環または5'-リボースヒドロキシル基上のカルボキシレートにフルオロフォア、ホスホロフォア、化学ルミネセンス発色団または光発生化合物を結合させると、感度が低いことや光に不安定であるという問題が回避される。通常、コリン環カルボキシレート誘導体（Collins及びHogenkamp、1997年）が公知であるが、合成されたどの化合物も蛍光マーカーを含んでいなかった。このフルオロフォア、ホスホロフォア、化学ルミネセンス発色団または光発生分子は、刊行物に記載された方法に従ってコバラミンモノカルボキシレートを誘導体化することにより、コバルト原子よりも、むしろコリン環に直接結合させることができる（Hogenkamp、1997年、本明細書中で参照した文献）。図22は、変形に使用し得るコバラミン上の部位を示している。
【００３９】
いずれかのフルオロフォア、ホスホロフォア、化学ルミネセンス発色団または光発生分子をこの蛍光コバラミン類の製造で使用し得るとはいえ、可視光または赤外光で励起可能なフルオロフォアを使用するのが好ましい。蛍光コバラミン類のin-vivo利用には、可視光または赤外光を使用するのが好ましい。好ましいフルオロフォアの例としては、フルオレセイン、フルオレセイン-5EX、メトキシクマリン、ナフトフルオレセイン、BODIPY 493/503、BODIPY FL、BODIPY R6G、BODIPY 530/550、BODIPY TMR、BODIPY 564/570、BODIPY 576/589、BODIPY 581/591、BODIPY TR、Cascade Blue、Dansyl、ジアルキルアミノクマリン、4',5'-ジクロロ-2',7'-ジメトキシフルオレセイン、2',7'-ジクロロフルオレセイン、エオシン、エオシンF3S、エリトロシン、ヒドロキシクマリン、リサミンローダミンB、メトキシクマリン（methosycoumarin）、ナフトフルオレセイン（maphthofluorescein）、NBD、Oregon Green 488、Oregon Green 500、Oregon Green 514、PyMPO、ピレン、ローダミン6G、ローダミングリーン、ローダミンレッド、ロドール（rhodol）グリーン、2',4',5',7'-テトラブロモスルホンフルオレセイン、テトラメチルローダミン（TMR）、Texas Red、X-ローダミン、Cy2染料、Cy3染料、Cy5染料、Cy5.5染料、Cy7染料、IC Greenまたは量子ドット構造が挙げられるが、これらに限定されない。可視光または赤外光で励起したときに、好ましい蛍光コバラミン類は、コバラミンから蛍光または燐光化合物を分離する必要なく蛍光を発生する。この光は、適当なフィルターを使用するレーザーまたは光ファイバー光源によって供給してもよい。赤色光は組織によく浸透するので好ましい。
【００４０】
正常及び白血病のヒトの骨髄では、蛍光コバラミン類似体の取り込みに差があることが見いだされている。正常な骨髄細胞と白血病の骨髄芽球（癌細胞）との違いは特に著しく、正常な細胞では検出可能なコバラミンは取り込まれない。健常個体からの骨髄サンプルは、蛍光標識を示さない。潜在的な化学療法化合物として元々は合成された、ドキソルビシン-コバラミン結合体の取り込みがあることも見いだされている。このドキソルビシン-コバラミン結合体の細胞による取り込みは、P-388マウス白血病細胞、並びにHCT-116ヒト結腸癌細胞で観察することができる。かくして、白血病及び充実性腫瘍細胞系では、コバラミンの蛍光誘導体の取り込みが起きる。これらの結果は、全ての癌細胞でコバラミン輸送及び貯蔵が増加するという知見と組み合わせて、正常細胞から癌細胞を区別するために蛍光コバラミン類を使用する一般的な適用可能性を示している。
【００４１】
かくして、この蛍光コバラミン類を使用して、
・蛍光顕微鏡法、蛍光腹腔鏡法、蛍光内視鏡法またはフローサイトメトリーによって、癌性組織を視覚的に同定する；
・組織バイオプシーによって組織切片またはサンプル中の癌細胞を同定する；
・in-vivo、ex-vivoまたはin-situで腫瘍の縁を画定する；
・in-vivo、ex-vivoまたはin-situで癌を診断、検出、予後診断、予見またはモニターする；
・in-vivo、ex-vivoまたはin-situで転移癌を同定する；
・癌の進行段階を決定する；
・皮膚的にまたは経皮的に癌を同定する；
・皮膚的にまたは経皮的に転移癌を同定する；
・腹腔鏡法または内視鏡法などの最低限に侵襲的な方法を使用することを含む、単数若しくは複数のセンチネルリンパ節で、または単数若しくは複数の腋窩リンパ節を含むリンパ節の癌を同定する；
・癌、たとえば乳癌、卵巣癌、肺癌、前立腺癌、上皮癌（腺癌）、肝臓癌、メラノーマ及びリンパ腫などの処置、検出、予測、予後診断またはモニタリングにおいて転移性疾患を同定する；
・白血病またはリンパ腫の診断、予測、予後診断、モニタリングまたは特徴付けの為に骨髄吸引液（aspirate）または末梢血液サンプルをフローサイトメトリー研究にかける；
・コバラミン-治療用バイオコンジュゲートの使用をベースとした化学療法に対して患者が積極的な反応を示すかどうかを予測する；
・バイオプシーまたは乳腺腫瘤摘出において腫瘍の微小な縁の画定を改善する；
・バイオプシー、乳腺腫瘤摘出、または腫瘍摘出の後に癌細胞が残る可能性を減少させて、それにより残存している癌細胞を除去するための追尾手術の必要性を減少させることができる。
【００４２】
予測とは、腫瘍の生物学的挙動を理解すること、及びどのように腫瘍が治療に（良くも悪くも）応答するかを指す。予後診断（prognosis）とは、治療後の予測した患者の結果（則ち、治療後、5年または10年生存可能性）を指す。モニタリングとは、処置後の治療の成功及び残留疾患（residual disease）の検出を決定することを指す。一例としては、白血病の処置後に、骨髄芽球の存在に関して骨髄を試験するために蛍光コバラミン結合体を使用することがある。特徴付けとは、非常に関連した種類の腫瘍と比較して、腫瘍の種類を記述的または定量的に分類することを指す。
【００４３】
この蛍光コバラミン類は、当該技術分野において公知の慣例的な癌の診断、検出、予測、予後診断、モニタリングまたはキャラクタリゼーション法に従って、実施することができる。たとえば、この蛍光コバラミン類は、静脈内、くも膜下（intrathecally）、腫瘍内、筋肉内、リンパ組織内（intralymphatically）または経口的に投与することができる。通常、本発明の蛍光コバラミンの量は、医薬的に許容可能なキャリヤと混合する。このキャリヤは、経口、非経口、静脈内、くも膜下、腫瘍内、腫瘍周囲（circumtumoral）及び硬膜外などの、投与に好適な剤形に依存して広範な形を取ることができる。この組成物は、酸化防止剤、安定剤、防腐剤などをさらに含むことができる。方法及びプロトコルの例は、Remington's Pharmaceutical Sciencesに見いだすことができる。投与すべき経口コバラミンの量は、通常、1〜500 mgである。
【００４４】
本明細書中に示されているように、コバラミン類似体は、高い親和性をもつ、ハプトコリン（haptocorrin）（TCI若しくはHC）、内性因子（IF）またはトランスコバラミン（TCII）等のコバラミン輸送タンパク質によって認識される。コバラミンに大きな分子を結合させても、タンパク質結合に悪影響は与えないようである。
【００４５】
リンパ節で転移疾患を同定する外科医の能力が改善されると、たとえば健常組織を残しておくこと、及び除去した腋窩リンパ節の数を最小化することによって、外科的治療が進歩するだろう。これによって、患者のクオリティ・オブ・ライフが高まり、且つ罹患率及び長期の死亡率が改善するだろう。リンパ節に広がった癌細胞を詳細に同定することによって、健常腋窩リンパ節を痛めずに、病気の管及び節のみを除去することができるだろう。年間、186,000例もの新規乳癌のケースに関して、原発腫瘍を除去し、関連するリンパ節の状態を決定するための手術の数は、非常に多い。全ての腋窩リンパ節及び管を機械的に除去すると、局所的な浮腫をもたらし、死亡率を高めることになる。転移癌細胞を含む腋窩リンパ節及び管を除去しないと、生存率が低くなり、長期死亡率が高くなる。
【００４６】
センチネルリンパ節バイオプシーアプローチでは、青色染料及び／または放射性トレーサーを腫瘍近くの乳房に注射する。腕の下を少し切開して、微量の染料または放射能を探索して、乳房部分から流出する（単数または複数の）リンパ節を同定すると、結果として、たいがい転移性癌細胞を含んでいる。上記の蛍光コバラミンは、センチネルリンパ節バイオプシーで現在使用されている青色染料及び放射性トレーサーの代わりになる。この蛍光コバラミン類を使用すると、全ての種類の癌にセンチネルリンパ節バイオプシーを適用することが可能になる。さらには、この蛍光コバラミン類により、癌の分析、特にリンパ節の癌細胞の分析において、腹腔鏡、内視鏡及び顕微鏡法などの最低限に侵襲的な方法を使用することができる。この蛍光コバラミンを使用すると、陽性のリンパ節の同定及び回収（retrieval）が容易になるだろう。かくして、この蛍光コバラミン類は、以下の癌：乳、皮膚（黒色腫）、婦人科（卵巣、前立腺、子宮、子宮頚、外陰、陰茎（penal）、精巣）、頭及び首（唇、舌、口、咽頭）、消化器官（食道、胃、小腸、大腸、直腸、結腸、肝臓、膵臓）、骨、結合組織、泌尿器管（膀胱、腎臓）、目、脳及び中枢神経系、内分泌腺（甲状腺）、リンパ組織、ホジキン病、非-ホジキン病リンパ腫及び複数の骨髄腫で使用することができる。
【００４７】
さらに、蛍光コバラミン類を使用すると、癌細胞を含み且つ除去しなければならないリンパ節の同定に関して、腹腔鏡及び内視鏡法などの最低限に侵襲的な方法を利用することが可能になる。この蛍光コバラミン類は、白色光下で肉眼で視覚的に検出し得る、十分に明るい光（たとえばCobalaFluor Yの場合には明るい青色）も放出することができる。この提案された方法を設計して、手術可能な乳癌を有する患者で腋窩リンパ節を外科的に検査する現行の二つの方法を、より正確で且つより痛みの少ない方法に置き換える。この現在使用されている二つの操作法は、大きな切開部（約5インチ）を使用し、低レベルのリンパ節を全て（10〜15）除去する、標準的な腋窩リンパ節切開法である。第二の、現在実験段階の方法は、センチネルリンパ節バイオプシーである。この方法では、乳房から流出する最初のリンパ節を同定するために目に見える染料またはガンマエミッタを使用する。この方法も同様に、大きな切開部と、リンパ経路の技術的に難しい検査とが必要である。本明細書で開示されているコバラミン分子は、癌に冒されている節に対して発光器を利用する。このリンパ節を、腹腔鏡装置を使用して3つの小さな切開部（3〜5 mm）を通して直接検査する。閉鎖操作法（closed operative technique）により、レーザー励起用の暗視野を提供する。腫瘍を持っているリンパ節中のコバラミン-発光器結合体からの誘導光が明るく放出されることによって、陽性のリンパ節の同定及び回収が容易になるだろう。この方法によって、切開部が小さくなり、痛みが少なく、精度も高まる。内視鏡法を使用して癌細胞を検出するために、この蛍光コバラミン類を使用することにも同様の原理が当てはまる。
【００４８】
この蛍光コバラミン類のさらに好都合な点とは、このコバラミン類がリンパ管を実質的に通過しないという点である。センチネルリンパ節方法で慣用的に使用された二種類の青色染料（Lymphazurine：商標及びメチレンブルー）は、リンパ管から流出する組織に注射された直後に、リンパ管から周囲組織に流れる傾向がある。そのような漏れにより、発生した青色で操作領域が不明瞭になってしまう。
【００４９】
さらに、この蛍光コバラミン類は、癌細胞によって特異的に取り込まれるので、これらの蛍光コバラミン類は、外科医が選択的に癌組織を切除できる優れたマーカーであり、そのため健常組織を残しておくことができる。
【００５０】
腹腔鏡的にまたは内視鏡的に検出すべき癌細胞に蛍光コバラミン類が結合する能力は、蛍光分子を使用して、腹腔鏡的にまたは内視鏡的にセンチネルリンパ節を検出できることを示している。かくして、いずれかの蛍光分子（癌-標的化または非-標的化）は、腹腔鏡または内視鏡視覚化法を利用してリンパ節中で検出することができる。一例として、赤色のフルオロフォアは、センチネルリンパ節法で現在実施されているように、腫瘍内に注射することができよう。腋窩に注射することによって、外科医は蛍光を放つ節を（二つの小さな切開部を通して）腹腔鏡的に見つけることができるだろうから、それによりセンチネル節のだいたいの場所を外科医が見つけ易いように、非-癌細胞-特異的放射性トレーサーを使用しなくてよい。
【００５１】
この蛍光コバラミン類は、手術中に利用するマーカーとして幾つかの改良点を提供する。これらの改良点としては、以下の点が挙げられる：
・この蛍光マーカーは、どの節がダイダルベイシン（tidal basin）から流出しているかを単に示すのではなく、リンパ管及びリンパ節中の癌細胞に特異的である。この蛍光マーカーは、健常細胞と癌細胞とを区別もする；
・蛍光検出法により与えられる固有の感度により、このマーカーは低濃度で使用することができる。現在使用している青色染料は、活性な節を不明瞭化し、病理学者による外科手術後の組織検査を複雑化させる傾向がある。この青色染料は、出血している導管を不明瞭化する傾向もあるので、それにより節の外科的摘出及び、続く傷の縫合を複雑化させてしまう。蛍光マーカーを使用して、このような問題点を避けられる；
・癌細胞に特異的な蛍光マーカーは、現在実施されている手順で見られるように、12％という偽陰性の割合を改善するだろう；
・偽陰性の割合が低くなると、患者及び外科医によってこの方法が許容され易くなるだろう。これによって、この方法を修得するのに外科医に必要な研修時間（複雑な腋窩節切開に関しては、通常30ケース以上）が少なくなるだろう；
・この蛍光マーカーにより、癌細胞の視覚化のための腹腔鏡、内視鏡及び顕微鏡法を利用できるようになる。これらの方法は、原発腫瘍、転移腫瘍、腋窩リンパ節、鼠径リンパ節及び頸部リンパ節の視覚化に使用することもできる。これらの方法によって、癌の分析でリンパ経路の技術的に難しい検査及び大きな切開部の必要性を減少させることができよう。これらの方法によって、切開部が小さく、痛みが少なく、そして精度が高くなるだろう。
【００５２】
この蛍光コバラミン類は、血液、血漿、血清または他の体液中の自然発生的なコバラミン（ヒドロキソコバラミン、メチルコバラミン、アデノシルコバラミン、またはシアノコバラミン）の量または濃度を検出する競合的結合アッセイでも使用することができる。この種のアッセイでは、当業者に公知の競合的結合アッセイで放射性標識化したコバラミンの代わりに、蛍光コバラミンを使用する。コバラミンに関する放射性アッセイは、中でも、本明細書中、参照として含まれる、米国特許第6,096,290号；同第5,614,394号；同第5,227,311号；同第5,187,107号；同第5,104,815号；同第4,680,273号；同第4,465,775号；同第4,355,018号に記載されている。このアッセイ手順を使用して、血液、血漿、血清または体液中の不飽和コバラミン結合能の量、並びにタンパク質、トランスコバラミン、ハプトコリン、または内性因子に結合するコバラミンの濃度を決定することができる。蛍光コバラミン類を使用する場合には、放射性標識化コバラミンの場合に関連する特別な出荷、取り扱い及び廃棄処置などが必要ないので、臨床化学結合アッセイでの放射性標識化コバラミンよりもずっと好都合である。
【００５３】
実施例
以下の実施例は、説明のために提供するものであって、付記請求の範囲をいかなる方法にも限定するものではない。当該技術分野において公知の標準的な方法及び、以下に具体的に記載した方法を使用した。
【００５４】
実施例 1
フルオロフォアをコバルトに結合させることによる蛍光コバラミンの合成
コバラミン局在化の視覚指標として、フルオレセインをコバラミンに共有結合させることにより、5種類のコバラミンの蛍光類似体を製造した。緑色光の照射下で、このフルオレセイン分子は、暗順応した眼で0.1 ppm未満の濃度まで検出し得る黄色光を放出する。この放出によって、エピ蛍光顕微鏡法により、並びに目視検査により感度の高い癌細胞の検出が可能になる。この5種類の蛍光コバラミン類は、それぞれ固有の蛍光を示した。これらの化合物は全て、刊行物に記載された方法に従って、塩化アミノプロピルとコブ（I）アラミンとを反応させて、アミノプロピルコブ（III）アラミンを製造することにより合成した。続く段階では、アミノプロピルコブ（III）アラミンを種々のフルオロフォアイソチオシアネート類（則ち、フルオレセインイソチオシアネート：FITC）と反応させて、アミノプロピルリンカーを介してコバラミンに結合する対応するフルオロフォアを製造した（則ち、フルオレセイン-アミノプロピル-コブ（III）アラミン）。この後者の反応は、図1に示す。
【００５５】
同様の方法により、フルオロフォアがナフトフルオレセインまたはOregon Greenである、蛍光コバラミン類を製造した。これら蛍光コバラミン類は全て、組換えトランスコバラミン（rhTCII）に対して高い親和性を保持していることが見いだされたので、自然発生的なコバラミンに関して見いだされたものと同様の生化学的分布が可能になる。
【００５６】
実施例 2
癌細胞によるコバラミンバイオコンジュゲートの取り込み
白血病骨髄芽球調製物は、急性骨髄性白血病（AML）M1（FAB分類で最低限の成熟骨髄芽球）に罹患している61歳の患者の骨髄吸引液から調製した。実施例1に記載の如く製造した蛍光コバラミンで、入手後3日間、細胞を処理した。正常及び白血病のヒト骨髄細胞において、蛍光顕微鏡法または蛍光フローサイトメトリーにより決定したように、蛍光コバラミン類似体の差別的な取り込みが見いだされた。正常な骨髄細胞と白血病の骨髄芽球（癌細胞）との違いは特に注目すべきであり、正常な細胞によって検出可能なコバラミンは取り込まれなかった。健常個体からの骨髄サンプルは、蛍光標識を示さなかった。潜在的な化学療法薬化合物としてもともと合成されたドキソルビシン-コバラミン結合体の取り込みは、P-388ネズミ白血病細胞及びHCT-116ヒト結腸腫瘍細胞で見られた。これらの結果は、白血病及び充実性腫瘍細胞系ではコバラミンの蛍光誘導体が取り込まれることを示している。
【００５７】
実施例 3
シアノコバラミンモノカルボン酸の製造
b-、d-及びe-モノカルボン酸は、シアノコバラミンの酸触媒化加水分解により製造した。図2を参照されたい。手短に言えば、シアノコバラミン（527.0 mg，0.389 mmol）を100 mlの丸底フラスコに入れ、40 mlの0.5 M HClに溶解した。このフラスコを50℃の水浴に入れ、4時間撹拌した。この反応物を、表1にまとめた勾配液を使用して、HPLC（Waters，Inc.3.9×300 mm DeltaPak 100 C-18カラム）によりモニターした。
【００５８】
【表１】
【００５９】
4時間後、反応物を室温に冷却した。このpHを、pHメーターを使用して、NaOH（10％）で7.0に調節した。粗な物質を、C-18 SepPakカラム（Waters,Inc. PIN WATO23635）を使用して、最初に10 mlのメタノールで、続いて15 mlの脱イオンH2Oで濯いで脱塩した。この粗な物質をシリンジでカラムに適用し、10〜15 mlの脱イオンH2Oで濯ぎ、続いて10 mlのメタノールで溶出した。メタノールをロータリーエバポレーター処理により除去すると、赤色化合物が得られた（5016-12-33）。
【００６０】
この粗な反応混合物を最小量の脱イオンH2Oに溶解し、この溶液の半分を、表に計算した勾配液を使用して、セミ-プレップHPLC（Waters,Inc.25.0×300 mm，100 C-18カラム）上に注入した。
【００６１】
【表２】
【００６２】
28.0分（b-モノカルボン酸，CBC-195）、30.1分（d-モノカルボン酸，CBC-226）、及び34.6分（e-モノカルボン酸）におけるピークを、大きな試験管を使用して集めた。純粋な画分を脱イオンH2Oで1：1に希釈し、上記と同じ方法により脱塩した。全ての場合において、赤色固体が得られた。
【００６３】
CBC-195（b-モノカルボン酸）：二つの分取実験で、74.8 mgのb-モノカルボン酸（14.4％）を単離した。予想通り、M+1ピーク（1356）とM+22ピーク（1378）を示す陽イオン・エレクトロスプレイ・マススペクトル（ES+）が得られた。このb-モノカルボン酸（CBC-195）は、全収率14％で得られた。
【００６４】
CBC-226（d-モノカルボン酸）：二つの分取実験で、38.6 mgのd-モノカルボン酸（7.3％）を単離した。予想通り、M+1ピーク（1356）と対応するM+Naピーク（1378）を示す陽イオン・エレクトロスプレイ・マススペクトル（ES+）が得られた。このd-モノカルボン酸（CBC-226）は、全収率7％で得られた。
【００６５】
e-モノカルボン酸は、全収率7％で、約78 mg得られた。
実施例 4
CNCbl 酸と 1,12 ジアミノドデカンとの結合
b-アミド及びd-アミドは、図3に示す通りに製造した。CBC-195（55.4 mg，0.0408 mmol）を小さなガラスバイアルに添加し、約2.5 mlのDMSOに溶解し、続いてEDCIHCl（12 mg，0.0626 mmol）とN-ヒドロキシスクシンイミド（NMS）（25 mg，0.217 mmol）を添加した。この反応物を室温で一晩撹拌した。従前の試みから、反応を完了させるには、EDCIとNHSの数当量（全部で6当量）が必要であった。24時間後、EDCIの追加の1当量を添加し、全部で26時間で反応が完了した。この反応は、表3の勾配液を使用してHPLCでモニターした。CBC-195は9.07分の保持時間であり、CBC-195のNHS-エステルは10.55分の保持時間であった。
【００６６】
【表３】
【００６７】
別のガラスバイアルに、1,12-ジアミノドデカン（81.8 mg，0.408 mmol）を約2 mlのDMSOに溶解した。上記反応混合物を、4.0 ml/時間でシリンジポンプを使用して滴下添加して、ダイマー形成を最小化させた。生成物は即座に形成し、14.56分の保持時間であった。粗な反応混合物を100 mlの1：1のCH2Cl2：Et2Oに添加すると、赤い沈殿物が形成した。この赤色化合物をガラスフリットを使用して濾過し、CH2Cl2の20 ml分を2回と、アセトン20 ml分2回と、最終的にEt2Oの20 ml分2回で洗浄した。
【００６８】
粗な反応生成物を最小量の脱イオンH2Oに溶解し、この溶液を表4に計算した勾配液を使用して、セミプレップHPLC（Waters,Inc.25.0×100 mm、100 C-18カラム）に注入した。
【００６９】
【表４】
【００７０】
8.70分（b-アミン、CBC-208）のピークを、大きな試験管を使用して集めた。純粋な画分を蒸留H2Oを使用して1：1に希釈し、最初にカラムを10 mlメタノール、続いて15 ml脱イオンH2Oを使用して濯ぐことにより、C-18 SepPakカラム（Waters,Inc，P/N WATO23635）を使用して脱塩した。純粋な物質をシリンジでカラムに適用し、10〜15 mlの脱イオンH2Oで濯ぎ、続いて10 mlメタノールで溶出した。このメタノールをロータリーエバポレーター処理により除去すると、赤色化合物6 mgが得られた。
【００７１】
CBC-208（b-アミン）：全部で6.0 mgのb-アミンを単離した。予想通り、M+1ピーク（1538）とM+23ピーク（1560）を示す陽イオン・エレクトロスプレイ・マススペクトル（ES+）が得られた。CBC-208は、精製後に収率9.5％で得られた。
【００７２】
CBC-226（d-アミン）：表3と同一のHPLC勾配液を使用すると、このd-モノカルボン酸は、9.32分のHPLC保持時間であり、そのNHS-エステルは10.96分で移動し、d-アミン（CBC-226）は14.93分で移動した。予想通り、M+1ピーク（1538）と対応するM+Naピーク（1560）を示す粗な物質の陽イオン・エレクトロスプレイ・マススペクトル（ES+）が得られた。
【００７３】
実施例 5
CBC-208 とフルオレセイン -5EX-NHS の結合
CBC-208は、図4に従って、フルオレセイン誘導体フルオレセイン-5EX（Molecular Probes，Inc.製）に結合させた。CBC-208（6.0 mg，3.87μmol）を小さなガラスバイアルに添加し、約0.5 mlのDMSOに溶解し、続いてフルオレセイン-5EX-NHS（2.5 mg，4.23μmol）を添加した。この反応物を室温で一晩撹拌した。この反応は、表5の方法を使用してHPLCでモニターした。
【００７４】
【表５】
【００７５】
この反応は、最初非常に早く進み、接触させて約10分後には、所望の生成物が形成した。CBC-208の保持時間は11.47分であり、生成物（CBC-123）は、14.24分の保持時間であった。フルオレセイン化合物をもう一当量添加すると、反応が完了し、粗な混合物は88％の純度であった。
【００７６】
出発物質のフルオレセイン-5EX-NHSのHPLC分析により、これは75％純度でしかないことが判明し、このことで、反応を完了させるのにどうして追加の当量が必要であったかということが明らかになった。
【００７７】
CBC-123（b-フルオレセインコバラミン誘導体）：この化合物は、合成からの粗な単離物としてだいたい90％の純度であり、不純物の殆どは未反応CBC-208であった。M+1ピーク（2013）と対応するM+Naピーク（2035）を示す粗な物質の陽イオン・エレクトロスプレイ・マススペクトル（ES+）が得られた。精製前の収率は22％であった。
【００７８】
この化合物の蛍光スペクトルは、350 nmにおける励起による光分解前後で、粗な化合物についてとった（図5を参照されたい）。光分解前後で蛍光に有意な変化はなく、このことは、この化合物が光安定性であり、且つ明らかに蛍光を発して、コバラミン近傍由来の弱い蛍光は示さないことを示唆している。
【００７９】
実施例 6
顕微鏡による乳癌組織の ex-vivo 検査
正常な辺縁組織をもつ、乳癌を含む悪性腫瘍と良性腫瘍のサンプルを患者より摘出した。これらのサンプルはUniversity of Utah Institutional Review Board（IRB）及びHuntsman Cancer Institute Clinical Cancer Investigation Committee（CCIC）の承認を得ている。この生組織サンプルを、上記の如く製造した蛍光コバラミン誘導体の一つと一緒に4〜6時間インキュベートした。それぞれのサンプルの薄切組織切片は冷凍式ミクロトームで作成し、蛍光マーカー量はエピ蛍光顕微鏡法により正常組織及び癌組織において定量化する。対応する組織切片を解剖病理学者の評価用にヘマトキシリン/エオシン（H&E）染色した。正常細胞と癌細胞との境界面は慎重に検査した。腫瘍の低酸素領域内の細胞はしばしば代謝が低下しているので、腫瘍内部の細胞は、蛍光マーカーの取り込みに関しても調べた。
【００８０】
より具体的には、最少必須培地、α修飾（α-MEM：7.5％新生児ウシ血清、2.5％ウシ胎児血清、0.2％ナイスタチン、2.5％ペニシリン/ストレプトマイシン、pH7.2；Sigma製）を調製し、25 mL滅菌ねじ蓋組織培養フラスコにアリコート（10 mL）を入れた。この培地を37℃にし、組織サンプルを蛍光標識化コバラミン類（50 nM；コバラミン-Oregon Green及び実施例1のコバラミン-ナフトフルオロセイン結合体と実施例5のコバラミン-フルオレセイン結合体）と、組換えヒトTCII（50 pM）と一緒にα-MEM中で3時間インキュベートした。ヒト乳房組織サンプルは、IRM-承認プロトコルの元で入手した。この組織をフラスコから取り出し、ダルベッコのリン酸塩緩衝塩類溶液（DPBS；Sigma）で洗浄し、凍結切片スライス形成用にOCTコンパウンド（Shandon）で-20℃で真鍮プレート上に据え付けた。組織を-20℃でCTD Harrisクリオスタット中でスライス（4〜6μm切片）した。薄切組織切片を小さな絵描き用ブラシで引き戻し、100％エタノールで顕微鏡スライドに固定した。標準的なヘマトキシリン染色手順：95％エタノール、20秒；水、5秒；ヘマトキシリン（Fisher）、45秒；水、5秒；青味つけ溶液（bluing solution）（水道水）、10秒；95％エタノール、10秒；100％エタノール、10秒；キシレン、10秒；及びキシレン、10秒で、スライドを染色した。相コントラスト及びエピ蛍光顕微鏡法により、10倍、60倍及び100倍の倍率でスライドを評価した。
【００８１】
3-[4,5-ジメチルチアゾール-2-イル]-2,5-ジフェニルテトラゾリウムチアゾリルブロミド（MTT；Sigma）を使用して、蛍光コバラミンで3時間のインキュベート後で組織の代謝能力を定性的に測定した。組織の一部を培地から取り出し、DPBSで洗浄し、MTT（2 mL；2.5 mg/mL）に浸した。この組織を、5％CO2雰囲気下、37℃で3時間インキュベートした。このインキュベーション時間の間に、スクシネートデヒドロゲナーゼ活性により組織サンプル中の生存細胞がMTT染料を還元して紫色のホルマザンにした（Cells and Celis，1998年）。この組織をDPBSで洗浄し、上記概説した冷凍ミクロトーム手順に従って調製して、組織の代謝能力を確保した。
【００８２】
この蛍光コバラミンバイオコンジュゲートは、腫瘍性乳房組織及び健常乳房組織のいずれにも凝集したが、健常乳房組織よりも腫瘍性乳房組織にはたくさんの蛍光コバラミンを隔離していた。健常乳房組織により隔離された蛍光コバラミンの量は予想よりも多かったが、これは、健常細胞により有意に内在化されたものではなく、結合組織内の構造体への非特異的結合によるものと考えられる。
【００８３】
実施例 7
リンパ節中の癌細胞の ex-vivo 検査
転移性疾患に冒された摘出したリンパ節を患者から取りだし、上記の如く製造した蛍光コバラミン誘導体の一つと一緒に4〜8時間インキュベートした。リンパ節をそれぞれ薄切して、癌細胞への蛍光コバラミンの輸送に関して顕微鏡的に検査した。この実験から、リンパ節内の転移細胞が画像化及び視覚化用に十分な蛍光コバラミンを取り込む能力が示された。
【００８４】
実施例 8
患者がコバラミン - ベースの治療用バイオコンジュゲートを用いる化学療法に対して良好に応答するかを測定蛍光するためのコバラミンの使用
白血病患者からの骨髄吸引液または末梢血液サンプルを、蛍光コバラミン結合体と一緒にインキュベーションした。4〜8時間後、骨髄吸引液または末梢血液サンプルを洗浄して、取り込まれなかった蛍光標識を除去し、この細胞サンプルを、エピ蛍光顕微鏡法またはフローサイトメトリーによる定性的または定量的分析にかけた。有意量の蛍光コバラミンを取り込んだ細胞は、明るい蛍光を示す。患者の白血病のタイプを示す有意量の蛍光コバラミンの取り込みは、コバラミンベースの治療を使用する処置に対して良好に応答するだろう。蛍光コバラミン結合体を用いる処置後でも有意な蛍光を示さない骨髄吸引液または末梢血液サンプルは、その患者がコバラミンベースの治療結合体にうまく応答しないことを示している。充実性腫瘍について同様のアプローチを適用することができる。この場合、切開した腫瘍組織の一部を蛍光コバラミン結合体と一緒にインキュベートし、約4〜8時間後、腫瘍組織中の蛍光を定量化する。腫瘍組織により示された蛍光が強い程、癌がコバラミンベースの化学療法による処置にうまく応答している可能性が高い。
【００８５】
実施例 9
CobalaFluor Y の合成
一般的な脱塩手順：
コバラミン類は全て、カートリッジを2カラム容積分のメタノールと、3カラム容積分の脱イオン水で調整することにより、10 gのC-18 SepPak（Waters,Inc）を用いて脱塩した。コバラミンをカラムに適用し、3カラム容積分の脱イオン水で洗浄し、メタノール（10 mL）で溶出した。ロータリーエバポレーション処理によりメタノールを除去して、生成物を凍結乾燥した。
【００８６】
シアノコバラミン-b-モノカルボン酸の製造：
シアノコバラミン-b-モノカルボン酸は、刊行物に記載されたプロトコルを変更して製造した（Antonら、1980年）。手短に言えば、CNCbl（3.5 g，2.6 mmol）を350 mLの1.0 M HClに溶解した。この反応物を37℃に4時間加熱し、逆相HPLCでモニターした。粗な物質を脱塩し、次いでセミプレップHPLCで精製できた。しかし、粗な反応混合物は45％を超えるシアノコバラミン（HPLCにより）を含んでいたので、イオン交換カラムを使用して、未反応シアノコバラミンを分離した。粗な物質をddH2Oに溶解し、2.5×30 cmのDowex AG-X1（酢酸塩形）カラムに適用した。CNCblを脱イオン水でカラムから溶出した。次いで三種類のモノカルボン酸を0.04 M酢酸ナトリウム（pH4）で溶出し、さらにセミプレップHPLCで精製した。b-モノカルボン酸を分析用HPLCにより97％純度で単離した（全体で10％収率）；ES+MS：（1：1 H2O：CH3CN）M+H＝1356.3（C63H88CoN13O15Pの計算値＝1356.5），M＋Na+=1378.4（C63H88CoN13O15PNaの計算値＝1378.5）。d-モノカルボン酸とe-モノカルボン酸はいずれも、それぞれ全体収率4％及び7％で単離した。
【００８７】
シアノコバラミン-b-モノカルボン酸の分析用HPLC法：
Waters DeltaPak C-18 300×3.9 mmカラムを使用して、2 mL/分の流速で分析用クロマトグラフィー法を実施した。最初の2分間の90％溶液A（0.05 Mリン酸塩緩衝液，pH3.0）と10％溶液B（9：1アセトニトリルと水）の定組成で流した後、83.7％Aと16.3％Bへの16分の線状勾配液により、15.7分の保持時間の所望のb-モノカルボン酸誘導体が溶出した。このd-モノカルボン酸は16.9分の保持時間であり、e-モノカルボン酸は19.5分の保持時間であった。
【００８８】
シアノコバラミン-b-モノカルボン酸のセミプレップHPLC：
Waters DeltaPak C-18 2.5×30 cmセミプレップカラムを使用し、40 mL/分の流速でクロマトグラフィー法を実施した。最初の4.1分間の90％溶液A（0.05 Mリン酸塩緩衝液，pH3.0）と10％溶液B（9：1アセトニトリルと水）の定組成で流した後、83.7％Aと16.3％Bへの32.9分の線状勾配液により、コバラミン酸誘導体を溶出した。この三種類のCNCbl-モノカルボン酸の保持時間は、以下のようであった：b-モノカルボン酸は23.1分で、d-モノカルボン酸は26.6分で、e-モノカルボン酸は32.1分で溶出した。
【００８９】
シアノコバラミン-b-（5-アミノペンチルアミド）の合成：
シアノコバラミン-b-モノカルボン酸1（50 mg，0.037 mmol）を、EDCI（71 mg，0.37 mmol）とNHS（25 mg，0.22 mmol）の入った乾燥した10 mLの丸底フラスコに溶解した。窒素ガスで5分間フラッシュすることにより、このフラスコを脱ガスした。ジメチルスルホキシド（5 mL）をシリンジを介して添加し、この反応混合物を6時間撹拌した。この混合物を気密性シリンジを使用して丸底フラスコから取り出し、1,5-ジアミノペンタン（43μL，0.37 mmol）をフラスコに入れた。このCBl混合物を、5分間かけて1,5-ジアミノペンタンに滴下添加して、2：1付加物の形成を最小化した。逆相HPLCを使用して、この反応をモニターした。出発物質が消費されたら、1：1のCH2Cl2：ジエチルエーテル（60 mL）の溶液でコバラミン類を沈澱させた。得られた固体を中位のフリットフィルターで濾過し、ジエチルエーテル（2×10 mL）で洗浄し、フィルターからメタノールで溶出した。この粗な混合物を等容積の水で希釈し、セミプレップカラムに注入して、シアノコバラミン-b-（5-アミノペンチルアミド）2を精製した。所望の生成物を含有する画分を上記の如く脱塩し、ロータリーエバポレーター処理により乾燥した。シアノコバラミン-b-（5-アミノペンチルアミド）が得られた。70％の収率；分析用HPLCにより98％の純度；ES+MS：（1：1 H2O：CH3CN）M+H＝1440.5（C63H100CoN15O14Pの計算値＝1440.7），M＋Na+=1462.4（C68H100CoN15O14PNaの計算値＝1462.6）；ε362nm＝19500 M-1cm-1（H2O中）。
【００９０】
シアノコバラミン-b-（5-アミノペンチルアミド）2の分析用HPLC法：
Waters DeltaPak C-18 300×3.9 mmカラムを使用して、2 mL/分の流速で分析用クロマトグラフィー法を実施した。最初の2分間の95％溶液A（0.05 Mリン酸塩緩衝液，pH3.0）と5％溶液B（9：1アセトニトリルと水）の定組成で流した後、70％Aと30％Bへの16.4分の線状勾配液により、11.8分の保持時間の当該化合物が溶出した。
【００９１】
シアノコバラミン-b-（5-アミノペンチルアミド）2のセミプレップHPLC：
Waters DeltaPak C-18 25×30 cmセミプレップカラムを使用し、40 mL/分の流速でクロマトグラフィー法を実施した。95％溶液A（0.05 Mリン酸塩緩衝液，pH3.0）と5％溶液B（9：1アセトニトリルと水）の定組成で4.1分間流した後、70％Aと30％Bへの18分の線状勾配液により、所望の生成物を溶出した。
【００９２】
CobaraFluor Y（Cy5-コバラミン＝Cy5-Cbl＝Cy5 CobalaFluor）の合成：
この合成は図6に示されている。手短に言えば、シアノコバラミン-リボース-5'-0-（6-アミノヘキシルアミド）は、刊行物に記載されたプロトコル（McEwanら，1999年）に従って、シアノコバラミン（Sigma Chemical Co.）を使用して製造した。コバラミン類は、2：1のジエチルエーテル：塩化メチレン（50 mL）を使用して沈澱させ、この溶媒混合物（2×10 mL）でも洗浄した。この反応物をモニターし、逆相HPLCを使用して生成物を精製した。この生成物を標準的な手順により脱塩した。
【００９３】
シアノコバラミン-リボース-5'-0-（6-アミノヘキシルアミド）（20 mg，0.013 mmol）を、乾燥した10 mLの丸底フラスコに入れ、窒素ガスで5分間フラッシュすることにより脱ガスし、ジメチルスルホキシド（1 mL）をシリンジを介して添加して、コバラミンを溶解した。Cy5スクシンイミジルエステル（10 mg，0.013 mmol；Amersham Pharmacia）とDIPEA（15μL，0.13）をこのフラスコに添加して、この反応混合物を1時間撹拌した。逆相HPLCを使用して反応をモニターした。出発物質が消費されたら、2：1のジエチルエーテル：CH2Cl2（50 mL）の溶液でコバラミン類を沈澱させた。得られた固体を微細フリットフィルターで濾過し、ジエチルエーテルとCH2Cl2混合物（2×10 mL）で洗浄し、メタノールでフィルターから溶出した。粗な混合物をセミプレップカラムに注入して、CobalaFluor Yを精製し、標準的な手順により脱塩した。図7は、CobalaFluor Yの蛍光放出スペクトルを示す。
【００９４】
シアノコバラミン-リボース-5'-0-（6-アミノヘキシルアミド）の分析用HPLC法：
Waters DeltaPak C-18 300×3.9 mmカラムを使用して、2 mL/分の流速で、分析用クロマトグラフィー法を実施した。最初の2分間の95％溶液A（0.05 Mリン酸塩緩衝液，pH3.0）と5％溶液B（9：1アセトニトリルと水）の定組成で流した後、70％Aと30％Bへの18分の線状勾配液により、所望のシアノコバラミン-リボース-5'-0-（6-アミノヘキシルアミド）を、保持時間12.5分で溶出した。
【００９５】
シアノコバラミン-リボース-5'-0-（6-アミノヘキシルアミド）のセミプレップHPLC：
Waters DeltaPak C-18 2.5×30 cmセミプレップカラムを使用し、40 mL/分の流速でクロマトグラフィー法を実施した。最初の4.1分間の95％溶液A（0.05 Mリン酸塩緩衝液，pH3.0）と5％溶液B（9：1アセトニトリルと水）の定組成で流した後、70％Aと30％Bへの27.4分の線状勾配液により、コバラミン酸誘導体を溶出した。所望のシアノコバラミン-リボース-5'-0-（6-アミノヘキシルアミド）の保持時間は、15.5分であった。
【００９６】
CobalaFluor Yの分析HPLC法：
Waters DeltaPak C-18 300×3.9 mmカラムで、2 mL/分の流速で分析用クロマトグラフィー法を実施した。最初の2分間の95％溶液A（0.01 M TEA緩衝液，pH7.0）と5％溶液B（9：1アセトニトリルと水）の定組成で流した後、45％Aと55％Bへの16.4分の線状勾配液により、13.6分でCobalaFluor Yを溶出した。
【００９７】
CobalaFluor YのセミプレップHPLC：
Waters DeltaPak C-18 25×30 cmカラムを使用して、20 mL/分の流速でセミプレップクロマトグラフィー法を実施した。95％溶液A（0.01 M TEA緩衝液，pH7.0）と5％溶液B（9：1アセトニトリルと水）の定組成を2分間流した後、70％Aと30％Bへの27.4分の線状勾配液により、12.2分で所望の生成物を溶出した。
【００９８】
実施例 10
競合アッセイ
材料
コバラミン類、ブタ非内性因子（HCとIFの50：1混合物）及びブタ内性因子は、Sigma Chemical Co.より購入した。HPLCトレースは、Waters 2487二重波長吸光度検出器を装備したWaters Delta 600システムを使用して得た。BIACORE 2000及び3000（BIACORE AB）装置は、表面プラスモン共鳴バイオセンサー分析に関して使用した。
【００９９】
CNCbl-b-（5-アミノペンチルアミド）の固定化
全てのSPR研究は、BIACORE 2000光学バイオセンサーで実施した。標準CM5センサーチップ（BIACORE AB）のフローセルのカルボキシメチルデキストラン表面は、20μL/分で15分間、チップを通して0.1 M EDCIと0.025 M NHSの混合物を37℃で流すことにより活性化した。pH4.5で10 mM酢酸ナトリウムで希釈したCNCbl-b-（5-アミノペンチルアミド）2を、図8に示すチップの3つのフローセルに固定化した。高密度センサ表面（500〜700 RU）は、2μL/分の速度で40分間、フローセル上にCbl類似体をパルスをかける（pulsing）ことにより作り出した。4つ全てのフローセルのチップ表面に残っている結合部位は、5μL/分で16分間、1.0 Mエタノールアミン、pH8.0でブロックした。フローセル3を参照表面として使用して、非特異的結合と装置のノイズを差し引いた。
【０１００】
タンパク質標準曲線
全ての標準曲線及び競合アッセイは、30℃でHBSランニング緩衝液（150 mM NaCl，10 mM HEPES，pH7.5，3.4 mM EDTA，1 mg/mL BSA，及び0.005％ P20界面活性剤）を使用して実施した。rhTCII、NIF及びIF結合CNCbl-b-（5-アミノペンチルアミド）の較正曲線は以下のようにして出した。HBS緩衝液に希釈したそれぞれのタンパク質のストック溶液（15.6〜500 pM）を、20μL/分でフローセルに10分で注入して、結合を分析した。結合したタンパク質は、8 M尿素、0.125％SDS及びランニング緩衝液で移動した。タンパク質サンプルをそれぞれ二重に分析した。
【０１０１】
みかけの溶液平衡解離定数の測定
rhTCII、NIF及びIFの種々のコバラミン類似体への結合は、溶液競合結合アッセイ（Niebaら、1996年）により分析した。0.01〜100 nMの範囲の濃度の類似体を、200 pMのrhTCII、200 pMのNIF、または500 pMのIFを含む等容積でインキュベートした。結合データは、30℃、20μL/分の速度で10分間、競合Cbl類似体とタンパク質のアリコートを注入することにより出し、次いで8 M尿素、0.125％SDS、及び緩衝液のパルスで表面を刷新した。それぞれのコバラミンについての競合アッセイは、二重に実施した。
【０１０２】
データ分析
バイオセンサーデータは、参照表面から観察した結合応答を引き、3回のブランクの注射の平均を引くことによって分析から得た（Myszka、1999年）。この競合アッセイからのデータは、BIAevaluations 3.0ソフトウエアをつけた非線形最小回帰分析と適合させた。図9は、この競合アッセイセンサグラムを示す。図10は、TCII結合に関するコバラミンの競合を示す。この結合データは、図11A〜Cに示されている。これらの結果は、コバラミン類似体が、高い親和性でコバラミン輸送タンパク質（トランスコバラミン、ハプトコリン及び内性因子）により認識されることを示している。この認識は、表面プラスモン共鳴によっても示された。コバラミンに大きな分子を結合させても、タンパク質結合に影響しないようである。
【０１０３】
実施例 11
動物モデル研究
腫瘍を持つマウスにおけるin-vivo取り込み
雌のマウスの右後肢の皮下に、1×106RD995腫瘍細胞を移植することによって、腫瘍をマウスに移植した。このマウスの腫瘍細胞系は、in-vitroで増殖させた。細胞を移植してから6週間後、10 mmの腫瘍が認識できた。この時点で、マウスに、滅菌塩類溶液中に溶解した2.2μgのCobalaFluor Yを眼窩後に静脈注射した。注射6時間後、ハロタン吸入によりマウスを鎮静させた。この腫瘍を切開し、633 nm HeNeレーザーを照射した。マウスの腫瘍は、HeNeレーザーを使用して、CobalaraFluor Yの注射54時間後でも分析した。マウスを解剖して、内臓と健常組織を分析することができた。結果を図12に示す。この結果は、マウスの腫瘍組織中に蛍光標識化コバラミンが局在化したことを示している。
【０１０４】
実施例 12
組織取り込み研究
蛍光コバラミン取り込み
最少必須培地、α修飾（α-MEM、7.5％新生児ウシ血清、2.5％ウシ胎児血清、0.2％ナイスタチン、2.5％ペニシリン/ストレプトマイシン、pH7.2；Sigma）を調製し、スクリュートップ組織培養フラスコとして滅菌25 mLにアリコート（10 mL）を入れた。培地を37℃とし、組織サンプル（腫瘍性乳房組織、健常乳房組織、腫瘍リンパ節組織及び健常リンパ節組織）を、α-MEM中、蛍光標識化コバラミン類（10 pM）、シアノコバラミン（1 nM）と3時間インキュベートした。ヒト組織サンプルは、IRB-認可プロトコルのもとで、入手した。この組織をフラスコから取り出し、ダルベッコのリン酸塩緩衝塩類溶液（DPBS；Sigma）で洗浄し、凍結切片スライス形成用にOCTコンパウンド（Shandon）で-20℃で真鍮プレート上に据え付けた。組織を-20℃でCTD Harris低温保持装置中でスライス（4〜6μm切片）した。薄切組織切片を小さな絵描き用ブラシで引き戻し、100％エタノールで顕微鏡スライドに固定した。標準的なヘマトキシリン染色手順：95％エタノール、20秒；水、5秒；ヘマトキシリン（Fisher）、45秒；水、5秒；青味つけ溶液（bluing solution）（水道水）、10秒；95％エタノール、10秒；100％エタノール、10秒；キシレン、10秒；及びキシレン、10秒で、スライドを染色した。相コントラスト及びエピ蛍光顕微鏡法により、10倍、60倍及び100倍の倍率でスライドを測定した。（a）腫瘍性乳房組織における腫瘍画像化を図13に、（b）腫瘍性リンパ節組織における腫瘍画像化を図14に示す。
【０１０５】
細胞生存率及び組織代謝活性のアッセイ
3-[4,5-ジメチルチアゾール-2-イル]-2,5-ジフェニルテトラゾリウムチアゾリルブロミド（MTT；Sigma）を使用して、蛍光コバラミンで3時間のインキュベート後で組織の代謝能力を定性的に測定した。組織の一部を培地から取り出し、DPBSで洗浄し、MTT（2 mL；2.5 mg/mL）に浸した。この組織を、5％CO2雰囲気下、37℃で3時間インキュベートした。このインキュベーション時間の間に、スクシネートデヒドロゲナーゼ活性により組織サンプル中の生存細胞がMTT染料を還元して紫色のホルマザンにした。この組織をDPBSで洗浄し、上記概説した冷凍ミクロトーム手順に従って調製して、組織の代謝能力を明らかにした。in-vitroにおいて健常組織と腫瘍性組織のいずれもが、蛍光コバラミン類を取り込んだことが見いだされた。
【０１０６】
実施例 13
ブタ手術における外科用テレスコープ型デバイスの使用
解剖学的領域から流出するリンパ組織を同定及び／または悪性細胞を同定するためのデバイスの外科的利用を、ブタの手術で説明する。以前に行った解放式解剖に慣れていたので、鼠径節領域を使用した。10 mmのトロカールを腿の付け根の皮下層（subcutaneous layer）に挿入し、この領域を15 mmHgの圧力で二酸化炭素で通気した。切開装置用に2つの5 mmトロカールを挿入した。リンパ節領域と、下部外肢（lower extremity）からの主リンパ流出経路を、図15〜18に示されている腹腔鏡を用いる鋭鈍解剖（sharp and blunt dissection）で暴露させた。Cobala Fluor Y（1 mL容積中、1.5 mg/mL）を、主リンパ流出路近くの皮下層に注射した。CobalaFluor Yは、633 nmの波長を持つ赤色レーザー光により刺激した蛍光と白色光とにより、リンパ幹（lymphatic trunk）とセンチネルリンパ節中、図15〜18に示す腹腔鏡で、2〜5分で同定した。
【０１０７】
実施例 14
他の手術におけるデバイスの利用
開示した方法及び／または装置は、外科的に除去されなかった特定の解剖学的領域及び／または腫瘍性組織から流出するリンパ節及び血管を同定するための様々な手術において実施例13で記載した方法と同様に使用することができる。特に所定の領域は、そこから腫瘍を除去すべきであるか、または既に除去した組織などの、切除領域であってもよい。たとえば、当該解剖学的領域は、腫瘍の位置から流出しているリンパ節及び／または腫瘍を同定するために、蛍光コバラミンを注射または注入してもよい。注射した蛍光コバラミン量は大きく変動可能であるが、具体的な範囲は約10 mL/分〜約100 mL/分である。次いでこの腫瘍及び／またはリンパ節は以下の公知の外科手順により摘出し、外科用テレスコープ（たとえば、本明細書で開示の装置の一つ）を、腫瘍微小縁の拡大視診のために配置する。この蛍光コバラミンは、腫瘍細胞に対して選択的親和性をもつので、切除した組織の外科的辺縁に蛍光コバラミンが存在するということは、蛍光を発している組織または細胞の存在がもはや検出されなくなるまで、さらに辺縁組織を除去しなければならないことを示す。
【０１０８】
本発明の開示の方法及び組成物は、様々な態様の形態で含まれ、そのほんの一部が開示されたに過ぎないと考えるべきである。他の態様も存在し、本開示の趣旨から逸脱しないことは、当業者には明らかであろう。従って、本記載の態様は例示的であって、限定的であると理解すべきではない。
【０１０９】
参照文献
【０１１０】
【表６−１】
【０１１１】
【表６−２】

【図面の簡単な説明】
【０１１２】
【図１】図1は、本発明で開示した蛍光コバラミンの一態様の合成を示す図である。
【図２】図2は、コバラミンモノカルボン酸の合成を示す図である。
【図３】図3は、コバラミンカルボン酸と1,12-ジアミノドデカンとの結合を示す図である。
【図４】図4は、フルオレセイン-5EX-NHSエステルとジアミノドデカンコバラミン誘導体との結合を示す図である。
【図５】図5は、フルオレセイン-5EX-b-コバラミン誘導体CBC-123の蛍光発光スペクトルを示す図である。
【図６】図6は、CobalaFluor Yの合成を示す図である。
【図７】図7は、CobalaFluor Y（Cy5 CobalaFluor）の蛍光発光スペクトルを示す図である。
【図８】図8は、CM5 BIAcoreチップ上におけるコバラミン類似物質の固定化を示す図である。
【図９】図9は、競合アッセイセンサグラムを示す図である。
【図１０】図10は、TCII結合に関するコバラミンの競合を示す図である。
【図１１−Ａ】図11A〜11Cは、コバラミン、コバラミン類似体及びCobalaFluorのKd値を示す図である。
【図１１−Ｂ】図11A〜11Cは、コバラミン、コバラミン類似体及びCobalaFluorのKd値を示す図である。
【図１１−Ｃ】図11A〜11Cは、コバラミン、コバラミン類似体及びCobalaFluorのKd値を示す図である。
【図１２】図12は、動物モデルにおける腫瘍画像化を示す図である。
【図１３】図13は、新生物乳房組織における腫瘍画像化を示す図である。
【図１４】図14は、新生物リンパ節組織における腫瘍画像化を示す図である。
【図１５】図15は、ビデオモニターと制御系とを含む外科用テレスコープ型デバイスの略図である。
【図１６】図16は、外科用テレスコープ型デバイスの斜視図である。
【図１７】図17は、外科用テレスコープ型デバイスの一部の斜視図である。
【図１８】図18は、外科用テレスコープ型デバイスの一端の平面図である。
【図１９】図19は、フィルターを含む外科用顕微鏡ヘッドの斜視図である。
【図２０】図20は、フィルターを含むテレスコープ型デバイスの斜視図である。
【図２１】図21は、外科用テレスコープ型デバイスの光源の一態様の略図である。
【図２２】図22は、コバラミン分子上の変形部位を示す図である。

Claims (37)

  1. 受容者において蛍光、燐光またはルミネセンスを放つ物質を検出し、画像化するための装置であって、
    （a）蛍光、燐光またはルミネセンスを放つ物質を照射する光発生源；
    （b）遠位端部と近位端部とをもつ外科用テレスコープ型デバイス；
    （c）前記外科用テレスコープ型デバイスの近位端部に近接して配置された第一の端部をもつ焦点レンズ；
    （d）前記焦点レンズの第二の端部に結合したカメラ；及び
    （e）前記外科用テレスコープ型デバイスの近位端部と前記カメラとの間に挿入された少なくとも一つの部材であって、光発生源によって伝達された波長の少なくとも一部を除去する前記部材を含む前記装置。
  2. 前記部材が、フィルター、プリズム、グレーティング、及び鏡の少なくとも一つから選択される、請求項1に記載の装置。
  3. 前記部材がホログラフィックノッチフィルターである、請求項1に記載の装置。
  4. 前記外科用テレスコープ型デバイスと前記カメラとの間に配置された少なくとも一つの第二のフィルターをさらに含む、請求項3に記載の装置。
  5. 前記外科用テレスコープ型デバイスが、内視鏡、腹腔鏡、または顕微鏡を含む、請求項1に記載の装置。
  6. 前記外科用テレスコープ型デバイスが腹腔鏡を含む、請求項1に記載の装置。
  7. 前記カメラが電荷結合素子カメラを含む、請求項1に記載の装置。
  8. 受容者において蛍光、燐光またはルミネセンスを放つ物質を検出し、画像化するための装置であって、
    （a）遠位端部と近位端部とをもつ外科用テレスコープ型デバイス；
    （b）前記外科用テレスコープ型デバイスの近位端部に結合したカメラ；及び
    （c）前記カメラと前記外科用テレスコープ型デバイスの近位端部との間に挿入されたホログラフィックノッチフィルターを含む前記装置。
  9. 前記外科用テレスコープ型デバイスの近位端に近接して配置された第一の端部をもつ焦点レンズをさらに含む、請求項8に記載の装置。
  10. 蛍光、燐光またはルミネセンスを放つ物質を照射する光発生源をさらに含む、請求項8に記載の装置。
  11. 前記光発生源が、レーザー、レーザーダイオード、発光ダイオード、光ファイバー、発光ガス放電または熱フィラメントランプから選択される、請求項10に記載の装置。
  12. 光発生源が、レーザー、レーザーダイオード、発光ダイオード、光ファイバー、発光ガス放電または熱フィラメントランプから選択される、請求項1に記載の装置。
  13. 前記ホログラフィックノッチフィルターが、光発生源の波長だけを実質的に遮蔽する、請求項10に記載の装置。
  14. 前記部材がノッチフィルターを含む、請求項1に記載の装置。
  15. 前記外科用テレスコープ型デバイスに光学的に結合した赤色光発生レーザーまたはレーザーダイオードをさらに含み、前記ホログラフィックノッチフィルターが前記赤色光発生レーザーまたはレーザーダイオードによって伝達された波長だけを実質的に偏向させる、請求項8に記載の装置。
  16. 前記光発生源が、白色光源と非白色光源とを含む、請求項10に記載の装置。
  17. 前記光発生源が、白色光源と非白色光源とを含む、請求項1に記載の装置。
  18. 受容者において蛍光、燐光またはルミネセンスを放つ物質を検出するための装置であって、
    （a）拡大レンズを含むハウジング；
    （b）前記拡大レンズと受容者との間に挿入されたホログラフィックノッチフィルター；及び
    （c）蛍光、燐光またはルミネセンスを放つ物質を照射するための光発生源を含む、前記装置。
  19. さらにカメラを含む、請求項18に記載の装置。
  20. 前記カメラが電荷結合素子カメラを含む、請求項19に記載の装置。
  21. 前記光発生源が、約630 nm〜約635 nmの波長の光を発生するレーザーまたはレーザーダイオードを含む、請求項12に記載の装置。
  22. 前記光発生源が、約630 nm〜約635 nmの波長の光を発生する、請求項15に記載の装置。
  23. 前記部材が赤外線フィルターを含む、請求項1に記載の装置。
  24. 受容者において蛍光、燐光またはルミネセンスを放つ物質を検出する方法であって、
    非白色光で物質を照射し；次いで
    非白色光の波長だけを実質的に除去する少なくとも一つの部材を含む外科用テレスコープ型デバイスで、放出された蛍光、燐光またはルミネセンスを検出することを含む、前記方法。
  25. 前記外科用テレスコープ型デバイスに結合したカメラで前記物質を画像化することをさらに含む、請求項24に記載の方法。
  26. 前記外科用テレスコープ型デバイスが内視鏡または腹腔鏡を含む、請求項24に記載の方法。
  27. 白色光及び非白色光で物質を交互に照射することをさらに含む、請求項24に記載の方法。
  28. 前記部材が、フィルター、プリズム、グレーティング、及び鏡の少なくとも一つから選択される、請求項24に記載の方法。
  29. 前記部材が、ホログラフィックノッチフィルターである、請求項24に記載の方法。
  30. 前記カメラが電荷結合素子カメラを含む、請求項24に記載の方法。
  31. 材料に交互に照射するために、音声作動式スイッチ、機械式スイッチ、光学的スイッチまたは電気式スイッチを使用する、請求項27に記載の方法。
  32. 外科用テレスコープ型デバイスを使用して受容者から蛍光、燐光またはルミネセンスを放つ物質を除去することをさらに含む、請求項24に記載の方法。
  33. 個体の異型細胞を含む組織または癌組織を同定する方法であって、蛍光コバラミンと、癌であるかまたは異型細胞を含むものと疑われる組織とを接触させ、ここで前記蛍光コバラミンは、一般式：
    [式中、R1はCN、OH、OH2、CH3、5'-デオキシアデノシンまたは（CH2）pNHC（=S）Yであり；R2、R3、R4、R5、R6及びR7は独立してCONH2またはCO-XmYであり；R8はCH2OH、O（C=O）XmYまたはCH2O（C=O）XmYであり；R9はOHまたはO（C=O）XmYであり；Xは式N（CH2）nNHO（C=O）またはNH-（CH2）n-NHをもつリンカーであり；Yはフルオロフォア、ホスホロフォア、化学ルミネセンス発色団または光発生分子であり；mは0または1であり、nは0〜50であり、pは2〜10であり、但し、R1〜R9基の少なくとも一つはYを含む]により表される構造をもち；
    前記組織を照射し；次いで
    放出された蛍光、燐光またはルミネセンスを内視鏡、腹腔鏡、関節鏡または直腸鏡で検出することを含む、前記方法。
  34. 前記組織が赤色光発生源で照射される、請求項33に記載の方法。
  35. 前記組織を電荷結合素子カメラで画像化することをさらに含む、請求項33に記載の方法。
  36. 癌であるかまたは異型細胞を含むものと疑われる前記組織が蛍光、燐光またはルミネセンスを発光する請求項33に記載の方法であって、前記方法は、癌であるかまたは異型細胞を含むものと疑われる組織を受容者から内視鏡、腹腔鏡、関節鏡または結腸鏡により除去することをさらに含む、前記方法。
  37. 前記内視鏡、腹腔鏡、関節鏡または結腸鏡が、赤色光発生源の波長だけを実質的に除去する少なくとも一つの部材を含む、請求項34に記載の方法。
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