JP5350570B2 - 蛍光性コバラミンおよびその使用 - Google Patents

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Description

本発明は、Maryland、Bethesdaの国立衛生研究所により授与されたグラント番号Ｒ０１ ＣＡ７３００３下の政府援助のもとで部分的になされた。米国合衆国政府は、本発明においてある種の権利を有する。
本発明の背景
本発明は蛍光性コバラミンおよびこれらの化合物の使用に関する。より詳細には、本発明は、コバラミンに共有結合する蛍光性、燐光性、ルミネセンス、または発光の化合物よりなる蛍光性コバラミンに関する。これらの蛍光性コバラミンは、診断および予後マーカーとして用いられ、（ａ）癌の細胞または組織と健康な細胞および組織とを区別し、（ｂ）個体が、コバラミンに基づいた治療剤バイオコンジュゲートを用いて化学療法にポジティブに反応するかを決定できる。
本発明の背景を明らかにし、特に、実施に関してさらなる詳細を提供するための本明細書に用いた刊行物および他の資料は、出典明示して本明細書の一部とみなされ、便宜上、それらは、著者および日付によって以下のテキストに引用され、添付された文献目録中に著者によってアルファベット順にリストされている。
急速に分裂する細胞は、ＤＮＡ複製に先立って一炭素代謝を支持するために酵素メチオニン合成につきコファクターとしてコバラミンを必要とする（Hogenkampら、１９９９）。急性前骨髄球性白血病において、Ｂ１２結合蛋白質のトランスコバラミンおよびハプトコリン（haptocorrin）の濃度における増大のために、血液の不飽和Ｂ１２結合能における３〜２６倍の増大が観察される（Schneiderら、１９８７；Rachimelwitzら、１９７１）。また、充実性腫瘍を持ついくらかの患者は、トランスコバラミンおよびハプトコリンの循環レベルにかなりの増大を示す（Carmelら、１９７５）。不飽和血清中コバラミン結合能の増大は、急速に分裂する細胞によるコバラミンの取込の増大に一致する。１１１Ｉｎのごときガンマー放射の放射性核種がオクタデンテートキレート化剤のジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）を介してコバラミンに結合するならば、腫瘍でさえ、診断的画像化目的のために十分なコバラミンを隔離（sequester）する（HogenkampおよびCollins、１９９７）。これは、埋込まれた線維肉腫を持つマウス（HogenkampおよびCollins、１９９７）、ならびに乳癌を持つヒト（Collinsetら、１９９９）、前立腺、肺および脳の腫瘍（Collinsら、２０００）において示されている。
黒色腫および乳癌の手術のための前哨リンパ節の概念において、腫瘍をドレイン（drain）する最初のリンパ節を同定するために色素または放射性核種が腫瘍の周囲の組織に注入される（Mortonら、１９９２；McGreevy、１９９８）。この結節を前哨節といい、診断テストのためにそれを取り出して、一次腫瘍を超える転移の範囲を決定する。それが約１２％の患者において転移性疾患を検出しない（McMastersら、１９９９）ので、この手順は論争の的になっている。注入される色素および放射性核種は癌細胞に特異的ではないが、外科医のために腫瘍の領域をドレインする一次リンパ節を単に同定する。高い偽陰性率（false-negative rate）は、癌細胞に特異的である蛍光性マーカーを用いて劇的に改善されるべきである。
かくして、改善された結果を持つ癌の組織または細胞の診断および予後のために用いることができる薬剤についての必要性が存在する。
発明の概要
本発明は、蛍光性コバラミンおよびこれらの化合物の使用に関する。より詳細には、本発明は、コバラミンに共有結合する蛍光性、燐光性、ルミネセンスのまたは発光の化合物よりなる蛍光性コバラミンに関する。これらの蛍光性コバラミンは、診断および予後マーカーとして用いて、（ａ）癌の細胞または組織と健康な細胞および組織とを区別し、（ｂ）個体が、コバラミンに基づいた治療剤バイオコンジュゲートを用いて化学療法に対してポジティブに反応するかを決定できる。本発明の蛍光性コバラミンは、（１）癌細胞による急速な輸送および貯蔵（最大取込みは、４〜６時間にて生じる）、（２）非常に低濃度にて視覚的に検出できる明るいフルオロフォア（fluorophore）、および（３）非毒性化合物の必要な特性を提供する。
本発明の一つの態様において、蛍光性コバラミンが提供され、ここに、蛍光性、燐光性、ルミネセンスのまたは発光の化合物はコバラミン（ビタミンＢ１２）に共有結合する。蛍光性、燐光性または発光の化合物は、コバラミンのコバルト原子、コリン環またはリボース部位に共有結合できる。蛍光性、燐光性、ルミネセンスのまたは発光の化合物を該コリン環またはリボース部位に共有結合することが好ましい。いずれの蛍光性、燐光性、ルミネセンスのまたは発光の化合物も蛍光性コバラミンを調製するのに利用できるが、可視光または赤外線で励起できる蛍光性、燐光性、ルミネセンスのまたは発光の化合物を利用することが好ましい。好ましい蛍光性化合物の例には、限定されるものではないが、フルオレセイン、フルオレセイン−５ＥＸ、メトキシクマリン、ナフトフルオレセイン、ＢＯＤＩＰＹ ４９３／５０３、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ Ｒ６Ｇ、ＢＯＤ ＩＰＹ ５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ ５６４／５７０、ＢＯＤＩＰＹ ５７６／５８９、ＢＯＤＩＰＹ ５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ ＴＲ、Cascade Blue、Dansyl、ジアルキルアミノクマリン、４'，５'−ジクロロ−２'，７'−ジメチオキシフルオセイン、２'，７'−ジクロロフルオレセイン、エオシン、エオシンＦ３Ｓ、エリスロシン、ヒドロキシクマリン、リサミンローダミンＢ、メトシクマリン、マフトフルオレセイン、ＮＢＤ、Oregon Green ４８８、Oregon Green ５００、Oregon Green 514、ＰｙＭＰＯ、ピレン、ローダミン６Ｇ、ローダミングリーン、ローダミンレッド、ロードールグリーン、２'，４'，５'，７'−テトラブロモスルホンフルオレセイン、テトラメチルローダミン（ＴＭＲ）、Texas Red、Ｘ−ローダミン、Ｃｙ２色素、Ｃｙ３色素、Ｃｙ５色素、Ｃｙ５．５色素、または量子ドット（quantum dot）構造が含まれる。本発明の好ましい蛍光性コバラミンは、蛍光性または燐光性の化合物とコバラミンとを分離することを必要とせずに、可視光または赤外線によって励起される場合に蛍光発光する。
本発明の第二の態様において、蛍光性コバラミンを用いて、癌細胞と健康な細胞とを区別する。本発明のこの態様の一つの具体例において、蛍光性コバラミンを手術に先立って患者に投与する。癌細胞中の蛍光性、燐光性、ルミネセンス、または発光した光の存在は、外科医によって用いられ、一次腫瘍または転移部位中を問わず、除去されるべき組織を規定する。第二の態様において、蛍光性コバラミンは、該腫瘍の位置をドレインしているリンパ節による取込みに適当な方法で患者に投与される。蛍光性、燐光性、ルミネセンスのまたは発光した光の存在は、手術中に取り除かれるべきそれらのリンパ節を同定する。
本発明の第三の態様において、蛍光性コバラミンを用いて、個人がコバラミンに基づいた治療剤バイオコンジュゲートを用いて、化学療法にポジティブに応答するかを決定する。この態様において、蛍光性コバラミンを用いて、定性的および定量的の双方にて、コバラミンを輸送し、貯蔵するための特定の癌細胞のタイプの能力を評価する。大量のコバラミンを輸送および貯蔵する種々のタイプの癌は、コバラミンに基づいた治療剤バイオコンジュゲートでの治療についての良好な候補物である。腫瘍細胞のコバラミンの結合、取込み、輸送および貯蔵の定量化は、視覚的検査（例えば、組織スライド）下の蛍光性の測定、表面蛍光顕微鏡（epifluorescence microscopy）またはフローサイトメトリーによって行うことができる。
本発明の第四の態様において、該蛍光性コバラミンを用いて、血液、血漿、血清、脳脊髄液または尿中のコバラミンレベルを決定するか、あるいは、血液、血漿、血清または脳脊髄液中の未結合コバラミン結合能の量を測定する。
発明の詳細な記載
本発明は、蛍光性コバラミンおよびこれらの化合物の使用に関する。より詳細には、本発明は、コバラミン（ビタミンＢ１２）に共有結合する蛍光性化合物（フルオロフォア）、燐光性化合物（ホスホロフォア）、ルミネセンス化合物（化学ルミネセンス発色団）または発光化合物よりなる蛍光性コバラミンに関する。これらの蛍光性コバラミンは、診断および予後マーカーとして用いて、（ａ）癌細胞または癌組織と健康な細胞および組織とを区別し、（ｂ）個体が、コバラミン−治療剤バイオコンジュゲートを用いて化学療法に対してポジティブに反応するかを決定できる。
本発明の蛍光性コバラミンは、以下の式：
Figure 0005350570
［式中、Ｒ１は、ＣＮ、ＯＨ、ＯＨ２、ＣＨ３、５'−デオキシアデノシンまたは（ＣＨ２）ｐＮＨＣ（＝Ｓ）Ｙであり；Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は、独立して、ＣＯＮＨ２またはＣＯ−ＸｍＹであり；Ｒ８はＣＨ２ＯＨまたはＯ（Ｃ＝Ｏ）ＸｍＹであり；Ｒ９は、ＯＨまたはＯ（Ｃ＝Ｏ）ＸｍＹであり；Ｘは、式Ｎ（ＣＨ２）ｎＮＨＯ（Ｃ＝Ｏ）を有するリンカーであり；Ｙは、フルオロフォア、ホスホロフォア、化学ルミネセンス発色団または発光分子であり；ｍは０または１であり、ｎは０〜５０であって、ｐは２〜１０であり、但し、少なくとも一つのＲ１〜Ｒ９基は、Ｙを含む］
によって表わすことができる。
本発明の蛍光性コバラミンは、フルオロフォア、ホスホロフォア、化学ルミネセンス発色団または発光分子にコバラミンに共有結合することによって調製される。フルオロフォア、ホスホロフォア、化学ルミネセンス発色団または発光分子が、コバルト原子、コリン環またはリボース糖に、直接的またはリンカー分子を介して共有結合される。該共有結合は、リンカー分子の使用で好ましくは達成される。フルオロフォア、ホスホロフォア、化学ルミネセンス発色団または発光分子は、コバラミンのコバルト原子に結合するならば、蛍光、燐光または発光した光は、コバルト原子のスピンによるクエンチングを介して強度内に減少する。加えて、光に対する蛍光性コバラミンの曝露の延長は、コバルト−炭素結合を開裂させ、コバラミンからフルオロフォア、ホスホロフォア、化学ルミネセンス発色団または発光分子を放出するであろう（Hawardら、１９９７）。かくして、フルオロフォア、ホスホロフォア、化学ルミネセンス発色団または発光分子をコバラミン分子のコリン環またはリボース部位に結合させることが好ましい。これらの後者の蛍光性コバラミンは、蛍光性コバラミンの不利を有さなく、ここに、フルオロフォア、ホスホロフォア、化学ルミネセンス発色団または発光分子は、コバルト原子に共有結合する。
コリン環または５'−リボースヒドロキシル基上のカルボキシレートに対するフルオロフォア、ホスホロフォア、化学ルミネセンス発色団または発光分子の結合は、低感度および光不安定性の問題を回避する。一般的には、コリン環カルボキシレート誘導体（CollinsおよびHogenkamp、１９９７）が知られているが、蛍光マーカーを含む合成化合物はない。フルオロフォア、ホスホロフォア、化学ルミネセンス発色団または発光分子は、公開された方法によりコバラミンモノカルボキシレートの誘導体化によってコバルト原子よりむしろ、コリン環に直接的に結合できる（CollinsおよびHogenkamp、１９９７およびその中に引用された参考文献）。
いずれのフルオロフォア、ホスホロフォア、化学ルミネセンス発色団または発光分子も蛍光性コバラミンを調製するのに利用できるが、可視光または赤外線で励起できるフルオロフォアを利用するすることが好ましい。蛍光性コバラミンのｉｎ ｖｉｖｏ使用について可視光または赤外線を用いるのが好ましい。好ましいフルオロフォアの例には、限定されるものではないが、フルオレセイン、フルオレセイン−５ＥＸ、メトキシクマリン、ナフトフルオレセイン、ＢＯＤＩＰＹ ４９３／５０３、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ ５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ ５６４／５７０、ＢＯＤＩＰＹ ５７６／５８９、ＢＯＤＩＰＹ ５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ ＴＲ、Cascade Blue、Dansyl、ジアルキルアミノクマリン、４'，５'−ジクロロ−２'，７'−ジメチオキシフルオセイン、２'，７'−ジクロロフルオレセイン、エオシン、エオシンＦ３Ｓ、エリスロシン、ヒドロキシクマリン、リサミン（lissamine）ローダミンＢ、メトシクマリン、マフトフルオレセイン、ＮＢＤ、Oregon Green ４８８、Oregon Green ５００、Oregon Green ５１４、ＰｙＭＰＯ、ピレン、ローダミン６Ｇ、ローダミングリーン、ローダミンレッド、ロードールグリーン、２'，４'，５'，７'−テトラブロモスルホンフルオレセイン、テトラメチルローダミン（ＴＭＲ）、Texas Red、Ｘ−ローダミン、Ｃｙ２色素、Ｃｙ３色素、Ｃｙ５色素、Ｃｙ５．５色素、または量子ドット構造が含まれる。本発明の好ましい蛍光性コバラミンは、バイオコンジュゲートからフルオロフォアを開製することを必要とせずして、可視光または赤外線によって励起される場合に蛍光発光する。
正常および白血病のヒト骨髄における蛍光性コバラミンアナログの異なる取込みが存在することが判明している。正常骨髄細胞と白血病の骨髄芽球（癌細胞）との差は特に顕著であり、検出可能なコバラミンは、正常細胞によって吸収されない。健康な個人からの骨髄試料は、蛍光性ラベリングを示さない。また、潜在的な化学療法化合物として元来合成されたドキソルビシン−コバラミンコンジュゲートの取込みが存在することも判明している。ドキソルビシン−コバラミンコンジュゲートの細胞取込みは、Ｐ−３８８ネズミ白血病細胞、ならびにＨＣＴ−１１６ヒト大腸腫瘍細胞において観察できる。かくして、コバラミンの蛍光性誘導体の取込みは、白血病および充実性腫瘍の細胞系において生じる。全ての癌細胞がコバラミンの輸送および貯蔵を増加させるという知識と組み合せて、それらの結果は、癌細胞と正常細胞とを区別するための蛍光性コバラミンの使用の一般的な適用性を示す。
かくして、本発明の蛍光性コバラミンを用いて、
・ 蛍光顕微鏡を介してまたはフローサイトメトリーによって癌組織を視覚的
に同定し；
・ 組織生体検査からの組織切片または試料中の癌細胞を同定し；
・ ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｓｉｔｕにて腫瘍縁を規定し；
・ ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｓｉｔｕにて癌を診断、検出、
予後、予測またはモニターし；
・ ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｓｉｔｕにて転移性の癌を同
定し；
・ 癌の進行段階を決定し；
・ 癌を経皮的に同定し；
・ 転移性の癌を経皮的に同定し；
・ 前哨リンパの節もしくは複数の節または腋窩リンパの節もしくは複数の節
中を含めたりンパ節中の癌を同定し；
・ 乳癌、卵巣癌、肺癌、前立腺癌、上皮癌（腺癌）、肝癌、黒色腫およびリ
ンパ腫のごとき癌の治療、検出、予後、予測またはモニタリングにおける
転移性疾患を同定し；
・ 白血病またはリンパ腫を診断、予測、予後、モニタリングまたは特徴付け
するための骨髄穿刺液または末梢血試料のフローサイトメトリー試験を行
い；
・ 患者が、コバラミン−治療剤バイオコンジュゲートの使用に基づく化学療
法にポジティブに応答するかを予測し；
・ 生体組織検査または乳腺腫瘤摘出における腫瘍マイクロマージン
（micromargin）の定義を改善し；
・ 生体組織検査、乳腺腫瘤摘出または腫瘍摘出において、癌細胞を置き去り
にする機会を減少させ、それによって、残っている癌細胞を取り除くため
のフォローアップ手術の必要性を低下させる。
予測とは、腫瘍の生物学的挙動および腫瘍が治療にどのように（有利にまたは不利に）応答するかを理解することをいう。予後とは、治療に続く、予期される患者の結果（すなわち、治療の５年または１０年後の生存の見込み）をいう。モニタリングとは、治療後の残っている疾病の治療および検出の成功を決定することをいう。一例は、白血病の治療後の骨髄芽球の存在につき骨髄をテストするための蛍光性コバラミンコンジュゲートの使用である。特徴付けとは、密接に関連するタイプの腫瘍と比較して腫瘍のタイプの記述的および定量的な分類をいう。
本発明の蛍光性コバラミンは、当該技術分野で知られた慣例の癌の診断、検出、予測、予後、モニタリングまたは特徴付けの方法に従って投与できる。例えば、蛍光性コバラミンは、静脈内、髄腔内、腫瘍内、筋肉内、リンパ内または経口的に投与できる。典型的には、本発明の蛍光性コバラミンの量は、医薬上許容される担体と混和されるでだろう。担体は、投与につき望ましい製剤の形態、例えば、経口、非経口、静脈内、髄腔内、腫瘍内、腫瘍周囲および硬膜外に依存して、非常に様々な形態を取り得る。さらに、組成物は、抗酸化剤、安定化剤、保存剤等を含み得る。技術およびプロトコールの例は、Remington's Pharmaceutical Sciencesに見出すことができる。投与されるべき蛍光性コバラミンの量は、典型的には、１〜５００ｍｇであろう。
リンパ節中の転移性疾患を同定するための外科医の能力における改善は、例えば、健康な組織を保持し、除去される腋窩リンパ節数を最小化することによって、外科的治療を進めるであろう。これは、患者のクオリティー・オブ・ライフを改善し、罹患率および長期死亡率を改善するであろう。リンパ節まで広がった癌細胞の正確な同定は、健康な腋窩リンパ節を残しつつ、病的な管および結節だけの除去を可能とするであろう。この発明は非常に価値がある。例えば、乳癌の毎年１８６，０００例の新しい事例の場合、一次腫瘍を除去し、かつ関連するリンパ節の状態を決定するための手術数が重要である。全ての腋窩リンパ節および管の機械的な除去は、局所的な浮腫および罹患率の増加に導く。転移性癌細胞を含む腋窩リンパ節および管の非除去は、生存の減少および長期死亡率の増加に導く。
前哨リンパ節生体組織検査のアプローチにおいて、青色染料および／または放射性トレーサーは腫瘍近くの乳癌に注入される。小さな切開が腕になされ、色素または放射活性の痕跡を見て、乳房の領域をドレインし、結果的に、転移性癌細胞を含むようである（複数の）リンパ節を同定する。本発明により、蛍光性コバラミンは、前哨リンパ節生体組織検査に現在用いられている青色色素および放射性同位元素トレーサーを置きかえる。本発明の蛍光性コバラミンの使用は、全てのタイプの癌に前哨リンパ節生体組織検査アプローチのさらなる適用を可能とする。
加えて、本発明の蛍光性コバラミンが癌細胞によって異なって吸収されるので、これらの蛍光性コバラミンは、改善されたマーカーであり、それは外科医が選択的に癌細胞を摘出し、それによって健康な組織を残しておくのを可能とするであろう。
本発明の蛍光性コバラミンは、手術中のマーカーとしていくつかの改善を提供する。これらの改善には：
・ 蛍光性マーカーは、結節が潮泊渠（tidal basin）をドレインしていること
を単に示すというよりはむしろ、リンパ管および節中の癌細胞に特異的で
あろう。また、該蛍光性マーカーは、癌細胞と健康な細胞とを区別するで
あろう。
・ 該マーカーは、蛍光検出によって得られた固有の感度のために低濃度にて
用いることができる。現在使用中の青色色素は、活性な節を不明瞭にする
傾向があり、病理学者による組織の手術後の検査を複雑にする。また、青
色色素は出血している血管を不明瞭にする傾向があり、それによって、結
節の外科的切除および後の傷を閉じることを厄介にする。蛍光性マーカー
の使用はこれらの問題を回避するであろう。
・ 現在実践されるごとき手順で見られるごとく、癌細胞に特異的な蛍光性マ
ーカーは、５〜１０％の偽陰性率を改善するであろう。
・ 減少した偽陰性率は、患者と外科医によるこの技術の受入を改善するであ
ろう。これは外科医がこの手順を学習するのに必要なトレーニング時間（
完全な軸結節切開を持つ典型的には３０例以上の事例）を減少できる。
本発明のさらなる具体例において、蛍光性コバラミンは、血液、血漿、血清または他の体液中で自然発生するコバラミン（ヒドロキソコバラミン、メチルコバラミン、アデノシルコバラミンまたはシアノコバラミン）の濃度または量を決定するために競合結合アッセイにおいて用いることができる。このタイプのアッセイにおいて、蛍光性コバラミンは、当業者によく知られた競合的結合アッセイにおける放射性標識コバラミンの代わりに用いられる。コバラミンについての放射活性アッセイは、米国特許第６，０９６，２９０号；第５，６１４，３９４号；第５,２２７,３１１号；第５,１８７,１０７号；第５，１０４,８１５号；第４，６８０,２７３号；第４,４６５,７７５号；第４，３５５,０１８号に記載され、各々を出典明示して本明細書の一部とみなす。このアッセイ手順を用いて、血液、血漿、血清または体液中の不飽和コバラミン結合能の量、ならびに蛋白質のトランスコバラミン、ヘプトコリンまたは内性因子に結合するコバラミンの濃度を決定できる。蛍光性コバラミンの使用は、放射活性標識コバラミンと関連する特定の輸送、取扱いおよび廃棄の手順を必要しないために、臨床的化学結合アッセイにおける放射活性標識コバラミンを超えてかなりの有利さを有する。
実施例
本発明は、以下の実施例を引用してさらに記載され、それらは例示的に提供され、何ら本発明を限定することを意図するものではない。当業者によく知られた標準的技術または特に後記された技術を利用する。
実施例１
フルオロフォアのコバルトへの結合による蛍光性コバラミンの合成
コバラミン局在性の視覚的指標として、フルオレセインをコバラミンに共有結合することによってコバラミンの５つの蛍光性アナログを調製した。緑色光の照明下、フルオレセイン分子は、０．１ｐｐｍ未満の濃度まで暗順応眼（dark-adapted eye）によって検出できる黄色光を発光する。この発光は、表面蛍光顕微鏡を介して、ならびに視覚検査によって癌細胞の敏感な検出を可能とする。５つの各蛍光性コバラミンは、固有の蛍光性を示した。これらの全化合物は、公開された技術に従って、塩化アミノプロピルとcob(I)alaminとを反応させることによって合成して、アミノプロピルcob(III)alaminを生成した。引き続いての工程において、アミノプロピルcob(III)alaminを様々なフルオロフォアイソチオシアネート（すなわち、フルオレセインイソチオシアネート、「ＦＩＴＣ」）と反応させて、アミノプロピルリンカーを介してコバラミンに結合する対応するフルオロフォア（すなわち、フルオレセイン−アミノプロピル−cob(III)alamin）を生成した。この後者の反応を図１に示す。
同様の方法にて、該フルオロフォアがナフトフルオレセインまたはOregon Greenである蛍光性コバラミンを調製した。全ての蛍光性コバラミンは、組換えトランスコバラミン（rhTCII）について高親和性を保持し、かくして、天然発生したコバラミンにつき観察されたものと同様な生物学的分布を可能とすることが判明した。
実施例２
癌細胞によるコバラミンアナログの取込み
白血病の骨髄芽球標本を急性骨髄白血病（ＡＭＬ）Ｍ１（ＦＡＢ分類における最小限の成熟骨髄芽球）を有している６１歳の患者の骨髄穿刺液から調製した。細胞は、実施例１に記載のごとく調製した蛍光性コバラミンで採取３日後に処理した。蛍光性コバラミンアナログの異なる取込みは、蛍光顕微鏡または蛍光フローサイトメトリーによって決定されるごとく、正常および白血病のヒト骨髄細胞で判明した。正常な骨髄細胞と白血病の骨髄芽球（癌細胞）の間との差は特に注目すべきものであり、正常細胞によって検出可能なコバラミンは、吸収されなかった。健康な個体からの骨髄試料は、蛍光性ラベリングを示さなかった。潜在的な化学療法化合物として元来合成されたドキソルビシン（doxorubicin）−コバラミンコンジュゲートの取込みは、Ｐ−３８８ネズミ白血病細胞およびＨＣＴ−１１６のヒト大腸腫瘍細胞において見られた。これらの結果は、白血病および充実性腫瘍の細胞系におけるコバラミンの蛍光性誘導体の取込みを示す。
実施例３
シアノコバラミンモノカルボン酸の調製
ｂ−、ｄ−およびｅ−モノカルボン酸をシアノコバラミンの酸−触媒の加水分解によって調製した。図２を参照されたし。要約すると、シアノコバラミン（５２７．０ｍｇ、０．３８９ミリモル）を１００ｍｌの丸底フラスコに入れ、４０ｍｌの０．５ ＭＨＣｌに溶解した。フラスコを５０℃の水浴に置き、４時間攪拌した。その反応は、表１に作表された勾配を用いて、ＨＰＬＣ（Waters社、３．９×３００ｍｍ DeltaPak １００Ｃ−１８カラム）によってモニターした。
Figure 0005350570
４時間後、反応物を室温まで冷却した。ｐＨをｐＨメーターを用いて、ＮａＯＨ（１０％）で７．０に調整した。粗物質を、最初に、１０ｍｌのメタノール、続いて１５ｍｌの脱イオン化Ｈ２Ｏでカラムをすすぐことによって、Ｃ−１８ SepPakカラム（Waters社、Ｐ／Ｎ ＷＡＴＯ２３６３５）を用いて脱塩した。粗物質をシリンジを介してカラムに適用し、１０〜１５ｍｌの脱イオン化Ｈ２Ｏですすぎ、続いて１０ｍｌのメタノールで溶出した。メタノールを回転式エバポレーターを介して除去し、赤色化合物を得た（５０１６−１２−３３）。
粗反応混合物を最小限の脱イオン化Ｈ２Ｏに溶解し、該溶液の半分を表２中の計算された勾配を用いて、半分取用のＨＰＬＣ（Waters社、２５．０×３００ｍｍ １００Ｃ−１８カラム）に注入した。
Figure 0005350570
２８．０分（ｂ−モノカルボン酸、ＣＢＣ−１９５）、３０．１分（ｄ−モノカルボン酸、ＣＢＣ−２２６）および３４．６分（ｅ−モノカルボン酸）のピークを大試験管を用いて集めた。純粋な画分を脱イオン化Ｈ２Ｏで１：１に希釈し、前記の同一方法にて脱塩した。全ての場合に、赤色固体を得た。
ＣＢＣ−１９５（ｂ−モノカルボン酸）：２つの分取用の試行では、７４．８ｍｇのｂ−モノカルボン酸（１４．４％）を単離した。正イオン電子スプレー質量スペクトル（ＥＳ＋）を得、それは期待されるごときＭ＋１ピーク（１３５６）およびＭ＋２２（１３７８）を示した。ｂ−モノカルボン酸（ＣＢＣ−１９５）を全収率１４％で得た。
ＣＢＣ−２２６（ｄ−モノカルボン酸）：２つの分取用の試行では、３８．６ｍｇのｄ−モノカルボン酸（７．３％）を単離した。正イオン電子スプレー質量スペクトル（ＥＳ＋）を得、それは期待されるごとき、Ｍ＋１ピーク（１３５６）および対応するＭ＋Ｎａピーク（１３７８）を示した。ｄ−モノカルボン酸（ＣＢＣ−２２６）を全収率７％で得た。
ｅ−モノカルボン酸を単離し、全収率１４％の約７８ｍｇであった。
実施例４
ＣＮＣｂｌ酸と１，１２ ジアミノドデカンとのコンジュゲート
ｂ−およびｄ−アミンを、図３に示すごとく調製した。ＣＢＣ−１９５（５５．４ｍｇ、０．０４０８ミリモル）を、小さなガラスバイアルに加え、約２．５ｍｌのＤＭＳＯに溶解し、続いてＥＤＣｌ・ＨＣｌ（１２ｍｇ、０．０６２６ミリモル）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）（２５ｍｇ、０．２１７ミリモル）を添加した。反応物を室温で一晩撹拌した。従前の試みから、いくつかの当量のＥＤＣｌおよびＮＨＳ（合計６当量）を反応を完了させるのに必要とした。２４時間後、一つのさらなる当量のＥＤＣｌを添加し、反応を２６時間内で完了した。反応を表３の勾配を用いてＨＰＬＣを介してモニターした。ＣＢＣ−１９５は、９．０７分の保持時間を有し、ＣＢＣ−１９５のＮＨＳ−エステルは、１０．５５分の保持時間を有する。
Figure 0005350570
別々のガラスバイアル中で、１,１２−ジアミノドデカン（８１．８ｍｇ、０．４０８ミリモル）を約２ｍｌのＤＭＳＯに溶解した。前記の反応混合物をシリンジポンプを用いて、二量化を最小限とするために４．０ｍｌ／時間にて滴下した。生成物は直ちに形成され、１４．５６分間の保持時間を有した。粗反応混合物を１００ｍｌの１：１のＣＨ２Ｃｌ２：Ｅｔ２Ｏに添加し、赤色沈殿物を形成した。赤色化合物は、ガラスフリットを用いて濾過し、次いで、２０ｍｌの部分のＣＨ２Ｃｌ２で２回、２０ｍｌの部分のアセトンで２回および最後に２０ｍｌの部分のＥｔ２Ｏで２回洗浄した。
粗反応生成物を最小量の脱イオン化Ｈ２Ｏに溶解し、溶液を表４にて計算された勾配を用いて、半分取用ＨＰＬＣ（Waters社および２５．０×１００ｍｍ １００Ｃ−１８カラム）に注入した。
Figure 0005350570
８．７０分（ｂ−アミン、ＣＢＣ−２０８）のピークを大試験管を用いて集めた。純粋な画分は、蒸留したＨ２Ｏで１：１に希釈し、Ｃ−１８ SepPakカラム（Waters社、P／N WATO２３６３５）を用いて、まず、１０ｍｌのメタノール、続いて１５ｍｌの脱イオン化Ｈ２Ｏでカラムをすすぐことによって脱塩した。純粋な物質をシリンジを介してカラムに適用し、１０〜１５ｍｌの脱イオン化Ｈ２Ｏですすぎ、１０ｍｌのメタノールで溶出させた。メタノールを回転式エバポレーターによって除去し、６ｍｇの赤色化合物を得た。
ＣＢＣ−２０８（ｂ−アミン）：合計６．０ｍｇのｂ−アミンを単離した。正イオン電子スプレー質量スペクトル（ＥＳ＋）を得、それは期待されるごときＭ＋１ピーク（１５３８）およびＭ＋２３ピーク（１５６０）を示した。ＣＢＣ−２０８を精製後９．５％の収率で得た。
ＣＢＣ−２２６（ｄ−アミン）：表３中と同一のＨＰＬＣ勾配を用いて、ｄ−モノカルボン酸は９．３２分間のＨＰＬＣ保持時間を有し、ＮＨＳ−エステルは１０．９６分間にて移動し、ｄ−アミン（ＣＢＣ−２２６）は、１４．９３分間にて移動する。正イオン電子スプレー質量スペクトル（ＥＳ＋）を粗物質につき得、それは期待されるごときＭ＋１ピーク（１５３８）および対応するＭ＋Ｎａピーク（１５６０）を示した。
実施例５
ＣＢＣ−２０８およびフルオレセイン−５ＥＸ−ＮＨＳのコンジュゲーション
ＣＢＣ−２０８を図４に従って、フルオレセイン誘導体フルオレセイン−５ＥＸ（Molecular Probes社から入手可能）にカップリングした。ＣＢＣ−２０８（６．０ｍｇ、３．８７マイクロモル）を小さなガラスバイアルに加え、約０．５ｍｌのＤＭＳＯに溶解し、続いて、フルオレセイン−５ＥＸ−ＮＨＳ（２．５ｍｇ、４．２３モル）を添加した。反応物は、室温にて一晩攪拌させた。反応は表５中の方法を用いて、ＨＰＬＣを介してモニターした。
Figure 0005350570
反応は最初は非常に急速に進行し、接触のわずか１０分後に所望の生成物を形成した。ＣＢＣ−２０８は１１．４７分間の保持時間を有し、生成物（ＣＢＣ−１２３）は１４．２４分の保持時間を有する。もう一つの当量のフルオレセイン化合物の添加で、反応は完了し、粗混合物は８８％純粋である。
出発物質フルオレセイン５ＥＸ−ＮＨＳのＨＰＬＣ分析は、それがわずか７５％純粋であることを示し、これは反応を完了させるためにさらなる当量が必要である理由を説明する。
ＣＢＣ−１２３（ｂ−フルオレセインコバラミン誘導体）：この化合物は、合成からの粗製の単離物として約９０％純粋であり、大多数の不純物は、未反応ＣＢＣ−２０８である。粗物質の正イオン電子スプレー質量スペクトル（ＥＳ＋）を得、それはＭ＋１ピーク（２０１３）および対応するＭ＋Ｎａピーク（２０３５）を示した。精製前の収率は２２％である。
この化合物の蛍光スペクトルは、３５０ｎｍの励起での光分解の前後にて、粗製の化合物で得た（図５参照）。光分解の前後にて重要な変化はなかったが、これは、該化合物が光安定性（photostable）であり、明らかに蛍光性であり、コバラミンの付近からの蛍光性の低下を示さないことを示唆する。
実施例６
顕微鏡を介する乳房腫瘍組織のｅｘ ｖｉｖｏ評価
乳房の腫瘍を含めた悪性および良性の腫瘍の試料を、正常縁の組織を伴って、患者から摘出する。これらの試料は、Utah大学施設内倫理委員会（ＩＲＢ）およびHuntsman癌研究所臨床癌調査委員会（ＣＣＩＣ）の承認をもって得る。生きている組織試料を前記の調製された蛍光性コバラミンの一つと４〜６時間インキュベートする。各試料の薄い組織切片をクリオミクロトーム（cryomicrotome）で調製し、蛍光性マーカー量を表面蛍光顕微鏡によって正常および癌の組織中で定量する。対応する組織切片を解剖病理学者による評価のためにヘマトキシロン／エオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色する。正常および癌の細胞間の鏡界面は、注意深く評価する。また、腫瘍の低酸素症の領域内の細胞が代謝をしばしば低下させているので、腫瘍内部からの細胞を蛍光性マーカーの取込みにつき評価する。
より詳細には、最少必須培地、アルファ修飾（α−ＭＥＭ；７．５％新生仔ウシ血清、２．５％ウシ胎仔血清、０．２％ナイスタチン、２．５％ペニシリン／ストレプトマイシン、ｐＨ７．２；Sigma）を調製し、無菌の２５ｍｌねじ蓋組織培養フラスコに等分した（１０ｍｌ）。培地を３７℃とし、組織試料をα−ＭＥＭ中の蛍光標識したコバラミン（５０ｎＭ；実施例１のコバラミン−Oregon Greenおよびコバラミン−ナフトフルオレセインコンジュゲートおよび実施例５のコバラミン−フルオレセインコンジュゲート）および組換えヒトＴＣＩＩ（５０ｐＭ）と３時間インキュベートした。ヒト乳房組織をＩＲＭに承認されたプロトコール下にて得た。該組織をフラスコから取り出し、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ；Sigma）で洗浄し、凍結切片を薄切するためにＯＣＴ化合物（Shandon）で−２０℃にて真鍮板上に貼り付けた。組織をＣＴＤ Harris クリオスタット中で−２０℃にて薄切（４〜６μｍ切片）した。薄い組織切片を小さなアーティストブラシで引き戻し、１００％エタノールで顕微鏡スライドに固定した。スライドを標準的なヘマトキシリン染色手順：９５％エタノール、２０秒；水、５秒；ヘマトキシリン（Fisher）、４５秒；水、５秒；ブルーイング（bluing）溶液（水道水）、１０秒；９５％エタノール、１０秒；１００％エタノール、１０秒；キシレン、１０秒；およびキシレン、１０秒を用いて染色した。スライドを１０倍、６０倍、１００倍にて位相差および表面蛍光顕微鏡によって評価した。
３−［４，５−ジメリルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムチアゾリルブロミド（ＭＴＴ；Sigma）を用いて、蛍光性コバラミンとの３時間のインキュベーション後に、組織の代謝能を定性的に決定した。一部分の組織を培地から取り出し、ＤＰＢＳで洗浄し、ＭＴＴ（２ｍｌ；２．５ｍｇ／ｍｌ）に浸漬した。この組織を３７℃の５％ＣＯ２雰囲気下にて３時間インキュベートした。このインキュベーション期間中、組織試料中の生細胞はコハク酸デヒドロゲナーゼ活性（CelisおよびCelis、１９９８）によってＭＴＴ色素を紫色ホルマザンに還元した。該組織をＤＰＢＳで洗浄し、組織の代謝能を保証するために前記に概説したクリオミクロトーム手順により調製した。
蛍光性コバラミンバイオコンジュゲートは、新生物および健康な乳房組織の双方において、ある程度まで蓄積し、新生物乳房組織は、健康な乳房組織より多くの蛍光性コバラミンを隔離する。健康な乳房細胞によって隔離された蛍光性コバラミン量は期待されたより大きいが、それは健康な細胞による有意な内向化のためというよりはむしろ、結合組織内の構造への非特異的な結合のためであると考えられる。
実施例７
リンパ節における癌細胞のｅｘ ｖｉｖｏ評価
転移性疾患を持つ摘出されたリンパ節は、患者から取り除かれ、前記に調製された蛍光性コバラミン誘導体のうちの１つで４〜８時間インキュベートした。各リンパ節を薄切し、癌細胞への蛍光性コバラミンの輸送につき顕微鏡的に評価した。この実験は、画像化および視覚化のために十分な蛍光性コバラミンを吸収するリンパ節内の転移性細胞の能力を示した。
実施例８
患者がコバラミンに基づいた治療剤バイオコンジュゲートでの化学療法に
有利に応答するかを決定するための蛍光性コバラミンの使用
白血病を持つ患者からの骨髄穿刺液または末梢血試料を蛍光性コバラミンコンジュゲートとインキュベートする。４〜８時間後、骨髄穿刺液または末梢血試料を洗浄して、組込まれていない蛍光性標識を除去し、次いで、該細胞試料を表面蛍光顕微鏡またはフローサイトメトリーによって定性的および質量的な蛍光分析に付した。かなりの量の蛍光性コバラミンを吸収した細胞をより明るい蛍光性を示す。かなりの量の蛍光性コバラミンの取込みは、患者が有する白血病のタイプがコバラミンに基づいた治療剤での処置に有利に応答するであろうことを示す。蛍光性コバラミンコンジュゲートでの処置後、大きな蛍光性を示さない骨髄穿刺液または末梢血試料は、患者がコバラミンに基づいた治療剤コンジュゲートに有利には応答しないことを示す。同様なアプローチを充実性腫瘍に適用できる。この場合、摘出した腫瘍組織の一部分は蛍光性コバラミンコンジュゲートとインキュベートし、約４〜８時間後、腫瘍組織中の蛍光性を定量する。腫瘍組織によって示された蛍光性が大きいほど、癌がコバラミンに基づいた化学療法での処置に有利に応答する見込みもより大きくなる。
本発明の方法および組成物は、様々な具体例の形態で取り込むことができ、そのいくつかだけが本明細書に開示されると認識されるであろう。当業者ならば、他の具体例が存在し、本発明の精神から逸脱しないことは明らかであろう。かくして、記載された具体例は例示であり、制限として構成されるものではない。
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図１は、本発明による一つの蛍光性コバラミンの合成を示す。 図２は、コバラミンモノカルボン酸の合成を示す。 図３は、１，１２−ジアミノドデカンでのコバラミンカルボン酸のコンジュゲートを示す。 図４は、ジアミノドデカンコバラミン誘導体での蛍光性−５ＥＸ−ＮＨＳのコンジュゲートを示す。 図５は、蛍光性−５ＥＸ−ｂ−コバラミン誘導体のＣＢＣ−１２３の蛍光発光スペクトルを示す。

Claims (24)

  1. 一般式（Ｉ）：
    【化１】
    Figure 0005350570
    ［式中、Ｒ１は、（ＣＨ２）ｐＮＨＣ（＝Ｓ）Ｙであり；Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は、ＣＯＮＨ２であり；Ｒ８はＣＨ２ＯＨであり；Ｒ９は、ＯＨであり；Ｙは、フルオロフォアであり；ｐは２〜１０である］を有するコバラミンであって、ここに、該コバラミンは、紫外線、可視光または赤外線で照射された場合、該コバラミンからのＹの開裂なくして、蛍光を発する該コバラミン。
  2. 請求項１記載のコバラミンと、癌であるか、あるいは癌細胞を含むことが疑われる組織とを接触させ、光で該組織を照射し、次いで、発光した蛍光を検出することにより、個体の癌組織または癌細胞を含んでいる組織の同定用の診断剤を調製するための請求項１記載のコバラミンの使用。
  3. 癌細胞を含むことが疑われる該組織がリンパ節であることを特徴とする請求項２記載の使用。
  4. 該リンパ節が前哨リンパ節または腋窩リンパ節であることを特徴とする請求項３記載の使用。
  5. 該同定が顕微鏡でまたは視覚的に行なわれることを特徴とする請求項２記載の使用。
  6. 癌であるか、あるいは癌細胞を含むことが疑われる該組織が生体組織検査によって該個体から得られることを特徴とする請求項２記載の使用。
  7. 請求項１記載のコバラミンと個体からの組織とを接触させ、該組織を照射し、次いで、蛍光を視覚的に検出し、それによって、該癌組織が蛍光を発し、健康な組織がほとんど蛍光を示さないことにより、該個体の癌組織と健康な組織とを視覚的に区別する診断剤を調製するための請求項１記載のコバラミンの使用。
  8. ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏにて腫瘍の縁を規定する方法であって、請求項１記載のコバラミンと腫瘍を含んでいることが疑われる個体からの組織とを接触させ、該組織を照射し、次いで蛍光を検出し、それによって、該腫瘍組織が蛍光を発し、腫瘍の縁を規定することを特徴とする該方法。
  9. 請求項１記載のコバラミンと個体からの転移性の癌であることが疑われる組織または細胞とを接触させ、該組織を照射し、次いで、蛍光を検出し、それによって、該転移性の癌の組織または細胞が蛍光を発することにより、該個体における転移性の癌を同定する診断剤を調製するための請求項１記載のコバラミンの使用。
  10. 該同定が視覚的にまたは顕微鏡で行なわれることを特徴とする請求項９記載の使用。
  11. 請求項１記載のコバラミンと、個体からの組織または細胞とを接触させ、該組織を照射し、次いで、蛍光を検出し、それによって、該癌の組織または細胞が蛍光を発し、健康な組織がほとんど蛍光を示さないことにより、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｓｉｔｕにて癌を診断、検出、予測またはモニターする診断剤を調製するための請求項１記載のコバラミンの使用。
  12. 該接触が、組織および細胞の臨床病理学的評価中に行なわれることを特徴とする請求項１１記載の使用。
  13. 請求項１記載のコバラミンと、個体からの組織または細胞とを接触させ、該組織を照射し、次いで、蛍光を検出し、それによって、該癌の組織または細胞が蛍光を発し、健康な組織がほとんど蛍光を示さないことにより、該個体における癌の治療、診断、検出、予測、予後またはモニタリングにおける転移性疾患を同定する診断剤を調製するための請求項１記載のコバラミンの使用。
  14. 該癌が乳癌、大腸癌、卵巣癌、肺癌、前立腺癌、肝癌、黒色腫、またはリンパ系を介して広がった癌であることを特徴とする請求項１３記載の使用。
  15. 該癌がリンパ腫または白血病であることを特徴とする請求項１３記載の使用。
  16. 該組織が骨髄穿刺液または末梢血であることを特徴とする請求項１５記載の使用。
  17. フローサイトメトリーまたは体液の自動分析を利用することを特徴とする請求項１３記載の使用。
  18. 請求項１記載のコバラミンと癌細胞とを接触させ、該細胞を照射し、次いで、蛍光を検出し、それによって、癌細胞でない細胞より大きな蛍光を示す癌細胞がコバラミンに基づいた化学療法剤での治療に対して有利に応答することを予測する診断剤を調製するための請求項１記載のコバラミンの使用。
  19. 該治療が化学療法であることを特徴とする請求項１８記載の使用。
  20. 該化学療法がコバラミン−治療剤コンジュゲートを利用することを特徴とする請求項１９記載の使用。
  21. 該治療がホルモン療法であることを特徴とする請求項１８記載の方法。
  22. 試料中のコバラミン量をアッセイする方法であって、請求項１記載のコバラミンを用いて該試料につき競合的結合アッセイを行い、次いで、該試料中に存在するコバラミン量を決定することを特徴とする該方法。
  23. ｉｎ ｖｉｔｒｏにて試料中の不飽和のコバラミン結合能の量をアッセイする方法であって、請求項１記載のコバラミンを用いて該試料から単離されたコバラミン結合蛋白質につき競合的結合アッセイを行い、次いで、該試料中の不飽和のコバラミン結合能の量を決定することを特徴とする該方法。
  24. ｉｎ ｖｉｔｒｏにて試料中のコバラミン結合蛋白質に結合したコバラミン量をアッセイする方法であって、請求項１記載のコバラミンを用いて、該試料から単離されたコバラミン結合蛋白質から分離されたコバラミンの競合的結合アッセイを行い、次いで、該試料中の該蛋白質に結合したコバラミン量を決定することを特徴とする該方法。
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