ES2622399T3 - Cobalaminas fluorescentes y usos de las mismas - Google Patents

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Charles B. Grissom
Michelle J. Cannon
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Abstract

Cobalamina que tiene la fórmula general**Fórmula** en la que R1 es CN, OH, OH2, CH3 o 5'-desoxiadenosilo; R2, R3, R4, R5, R6 y R7 son CONH2; R8 es CH2O(C>=O)XmY; R9 es OH o O(C>=O)XmY; X es un grupo de unión que tiene la fórmula NH-(CH2)n- NHO(C>=O) o NH-(CH2)n-NH; Y es un fluoróforo, un fosforóforo, un cromóforo quimioluminiscente o un sustituyente productor de luz; m es 0 ó 1, n es 0-50 y p es 2-10, en la que dicha cobalamina produce fluorescencia, produce fosforescencia, produce luminiscencia o emite luz cuando se ilumina con luz ultravioleta, visible o infrarroja sin escisión de Y de la cobalamina.

Description

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DESCRIPCION
Cobalaminas fluorescentes y usos de las mismas
Esta invencion se realizo en parte con el respaldo gubernamental con las subvenciones n.os R01 CA73003 y CA87685 concedidas por los Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, Maryland. El gobierno de los Estados Unidos tiene ciertos derechos en la invencion.
Antecedentes de la invencion
La presente invencion se refiere a cobalaminas fluorescentes (denominadas a veces en el presente documento cobalafluor) y a usos de estos compuestos. Mas particularmente, esta invencion se refiere a cobalaminas fluorescentes que se componen de un compuesto fluorescente, fosforescente, luminiscente o productor de luz que se une covalentemente a cobalamina. Estas cobalaminas fluorescentes pueden usarse como marcadores de diagnostico y pronostico (a) para distinguir celulas y tejidos cancerosos de celulas y tejidos sanos, incluyendo la identificacion de ganglios linfaticos que contienen celulas cancerosas, y (b) determinar si un individuo respondera positivamente a quimioterapia que usa bioconjugados terapeuticos basados en cobalamina.
Las publicaciones y otros materiales usados en el presente documento para ilustrar los antecedentes de la invencion, y en casos particulares, para proporcionar detalles adicionales con respecto a la practica, se incorporan como referencia, y por conveniencia se hace referencia a los mismos en el siguiente texto por autor y fecha y se enumeran alfabeticamente por autor en la bibliografia adjunta.
Las celulas en division rapida requieren cobalamina como cofactor para la enzima metionina sintasa para soportar el metabolismo de un carbono antes de la replicacion de ADN (Hogenkamp et al.). En la leucemia promielocitica aguda, se observa un aumento de 3-26 veces de la capacidad de union a B12 insaturada de la sangre, debido a un aumento de la concentracion de las proteinas de union a B12, transcobalamina y haptocorrina (Schneider, et al., 1987; Rachimelwitz, et al., 1971). Algunos pacientes con tumores solidos tambien presentan un aumento significativo de los niveles circulantes de transcobalamina y haptocorrina (Carmel, et al., 1975). El aumento de la capacidad de union a cobalamina serica insaturada corresponde al aumento de la captacion de cobalamina por celulas en division rapida. Los tumores secuestran incluso suficiente cobalamina con fines de obtencion de imagenes de diagnostico si un radionuclido emisor gamma, tal como 111In, se une a cobalamina a traves del quelante octadentado, acido dietilentriaminopentaacetico (DTPA) (Hogenkamp y Collins, 1997). Esto se ha demostrado en ratones con un fibrosarcoma implantado (Hogenkamp y Collins, 1997), asi como en seres humanos con cancer de mama (Collinset al., 1999), y en tumores de prostata, pulmon y cerebro (Collins et al., 2000).
En el concepto de ganglio linfatico centinela para la cirugia de cancer de mama y melanoma, se inyecta un colorante o radionuclido en el tejido alrededor del tumor para identificar el primer ganglio linfatico que drena el tumor (Morton et al., 1992; McGreevy, 1998). Este ganglio se denomina ganglio centinela, y se extirpa para pruebas de diagnostico para determinar la extension de la metastasis mas alla del tumor primario. Este procedimiento es controvertido, ya que no puede detectar enfermedad metastasica en aproximadamente el 12% de los pacientes (McMasters et al., 1999). El colorante o radionuclido que se inyecta no es especifico para celulas cancerosas, sino que simplemente identifica al cirujano el ganglio linfatico primario que drena la region del tumor. La alta tasa de falsos negativos debe mejorarse enormemente usando un marcador fluorescente que sea especifico para celulas cancerosas.
Por tanto, existe la necesidad de un agente que pueda usarse para el diagnostico y pronostico de celulas o tejido cancerosos con resultados mejorados.
Sumario de la invencion
La presente invencion se refiere a cobalaminas fluorescentes y a usos de estos compuestos. Mas particularmente, esta invencion se refiere a cobalaminas fluorescentes que se componen de un compuesto fluorescente, fosforescente, luminiscente o productor de luz que se une covalentemente a cobalamina. Estas cobalaminas fluorescentes pueden usarse como marcadores de diagnostico y pronostico (a) para distinguir celulas y tejidos cancerosos de celulas y tejidos sanos, incluyendo la identificacion de ganglios linfaticos que contienen celulas cancerosas, y (b) determinar si un individuo respondera positivamente a quimioterapia que usa bioconjugados terapeuticos basados en cobalamina. Las cobalaminas fluorescentes de la presente invencion ofrecen las propiedades necesarias de (1) rapido transporte y almacenamiento por celulas cancerosas (la captacion maxima se produce a las 4-6 horas), (2) un fluoroforo brillante que puede detectarse visualmente a concentraciones muy bajas, y (3) componentes no toxicos.
En un aspecto de la presente invencion, se proporcionan cobalaminas fluorescentes en las que compuestos fluorescentes, fosforescentes, luminiscentes o productores de luz se unen covalentemente a cobalamina (vitamina B12). Los compuestos fluorescentes, fosforescentes o productores de luz se unen covalentemente al resto de ribosa de la cobalamina. Aunque, puede utilizarse cualquier compuesto fluorescente, fosforescente, luminiscente o productor de luz en la preparacion de las cobalaminas fluorescentes, se prefiere utilizar compuestos fluorescentes,
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fosforescentes, luminiscentes o productores de luz que puedan excitarse con luz visible o infrarroja. Los ejemplos de compuestos fluorescentes preferidos incluyen, pero no se limitan a, fluoresceina, fluoresceina-5EX, metoxicumarina, naftofluoresceina, BODIPY 493/503, BODIPY FL, BODIPY R6G, BODIPY 530/550, BODIPY TMR, BODIPY 564/570, BODIPY 576/589, BODIPY 581/591, BODIPY tR, Cascade Blue, dansilo, dialquilaminocumarina, 4’,5’-dicloro-2’,7’- dimetoxifluoresceina, 2’,7’-diclorofluoresceina, eosina, eosina F3S, eritrosina, hidroxicumarina, lisamina-rodamina B, metoxicumarina, naftofluoresceina, NBD, Oregon Green 488, Oregon Green 500, Oregon Green 514, PyMPO, pireno, rodamina 6G, verde de rodamina, rojo de rodamina, verde de rodol, 2’,4’,5’,7’-tetrabromosulfona- fluoresceina, tetrametil-rodamina (TMR), Texas Red, X-rodamina, colorante Cy2, colorante Cy3, colorante Cy5, colorante Cy5.5 o una estructura de puntos cuanticos. Las cobalaminas fluorescentes preferidas de la presente invencion producen fluorescencia cuando se excitan mediante luz visible o infrarroja sin la necesidad de separar el compuesto fluorescente o fosforescente de la cobalamina. La luz puede proporcionarse mediante un laser o una fuente de luz de fibra optica con un filtro apropiado. Se prefiere la luz roja para una mejor penetracion en el tejido.
En un segundo aspecto de la presente invencion, las cobalaminas fluorescentes se usan para distinguir celulas cancerosas de celulas sanas. La cobalamina fluorescente puede administrarse a un paciente antes de cirugia. La presencia de fluorescencia, fosforescencia, luminiscencia o luz emitida en celulas cancerosas la usa el cirujano para definir el tejido que va a extirpar, ya sea en un tumor primario o en un sitio metastasico. En una segunda realizacion, se administra una cobalamina fluorescente a un paciente de manera adecuada para la captacion por los ganglios linfaticos que drenan el sitio del tumor. La presencia de fluorescencia, fosforescencia, luminiscencia o luz emitida identifica aquellos ganglios linfaticos que deben extirparse durante la cirugia. En esta ultima realizacion, pueden utilizarse tecnicas laparoscopicas, endoscopicas y microscopicas para identificar ganglios linfaticos con celulas cancerosas. El uso de estas tecnicas facilita la identificacion y extraccion de ganglios linfaticos positivos.
En un tercer aspecto de la presente invencion, las cobalaminas fluorescentes se usan para determinar si un individuo respondera positivamente a quimioterapia que usa bioconjugados terapeuticos basados en cobalamina. En este aspecto, se usa una cobalamina fluorescente para evaluar la capacidad del tipo de celula cancerosa particular para transportar y almacenar cobalamina, tanto cualitativa como cuantitativamente. Diversos tipos de cancer que transportan y almacenan grandes cantidades de cobalamina son buenos candidatos para terapia con bioconjugados terapeuticos basados en cobalamina. La cuantificacion de la union, captacion, el transporte y almacenamiento de cobalamina de celulas tumorales puede llevarse a cabo midiendo la fluorescencia con inspeccion visual (por ejemplo, portaobjetos para tejido), mediante microscopia de epifluorescencia, laparoscopia de fluorescencia, endoscopia de fluorescencia o citometria de flujo.
En un cuarto aspecto de la presente invencion, las cobalaminas fluorescentes se usan para determinar los niveles de cobalamina en sangre, plasma, suero, liquido cefalorraquideo u orina o para determinar la cantidad de capacidad de union a cobalamina no unida en sangre, plasma, suero o liquido cefalorraquideo.
Cualquier molecula fluorescente (dirigida o no dirigida a cancer) puede detectarse en un ganglio linfatico usando visualizacion laparoscopica o endoscopica.
Breve descripcion de los dibujos
La figura 1 muestra sitios para la modificacion en la molecula de cobalamina.
La figura 2 muestra la sintesis de una cobalamina fluorescente segun la presente invencion.
La figura 3 muestra la sintesis de acidos monocarboxilicos de cobalamina.
La figura 4 muestra la conjugacion de acidos carboxilicos de cobalamina con 1,12-diaminododecano.
La figura 5 muestra la conjugacion de ester de NHS de fluoresceina-5EX con el derivado de cobalamina de diaminododecano.
La figura 6 muestra el espectro de emision de fluorescencia del derivado de fluoresceina-5EX-b-cobalamina CBC- 123.
La figura 7 muestra la sintesis de cobalafluor Y.
La figura 8 muestra el espectro de emision de fluorescencia de cobalafluor Y (Cy5-cobalafluor).
La figura 9 muestra la inmovilizacion de un analogo de cobalamina en un chip CM5 de BIAcore.
La figura 10 muestra un sensograma de ensayo competitivo.
La figura 11 muestra la competencia de cobalamina por la union a TCII.
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Las figuras 12A-12C muestran los valores de Kd para cobalamina, analogos de cobalamina y cobalafluor.
La figura 13 muestra la obtencion de imagenes tumorales en modelos animales.
La figura 14 muestra la obtencion de imagenes tumorales en tejido de mama neoplasico.
La figura 15 muestra la obtencion de imagenes tumorales en tejido de ganglio linfatico neoplasico.
Descripcion detallada de la invencion
La presente invencion se refiere a cobalaminas fluorescentes y a usos de estos compuestos. Mas particularmente, esta invencion se refiere a cobalaminas fluorescentes que comprenden un compuesto fluorescente (fluoroforo), un compuesto fosforescente (fosforoforo), un compuesto luminiscente (cromoforo quimioluminiscente) o un compuesto productor de luz que se une covalentemente a cobalamina (vitamina B12). Estas cobalaminas fluorescentes pueden usarse como marcadores de diagnostico y pronostico (a) para distinguir celulas cancerosas y tejido canceroso de, celulas y tejidos sanos, incluyendo la identificacion de los ganglios linfaticos que contienen celulas cancerosas, y (b) determinar si un individuo respondera positivamente a quimioterapia que usa bioconjugados terapeuticos basados en cobalamina.
Las cobalaminas fluorescentes de la presente invencion estan representadas por la siguiente formula
imagen1
en la que R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, Rs y Rg son segun se define en la reivindicacion 1 adjunta.
Las cobalaminas fluorescentes de la presente invencion se preparan mediante la union covalente de un fluoroforo, un fosforoforo, un cromoforo quimioluminiscente o una molecula productora de luz a cobalamina. El fluoroforo, fosforoforo, cromoforo quimioluminiscente o la molecula productora de luz se une covalentemente al azucar ribosa a traves de una molecula de grupo de union. Si el fluoroforo, fosforoforo, cromoforo quimioluminiscente o la molecula productora de luz se une al atomo de cobalto de la cobalamina, la fluorescencia, fosforescencia o luz emitida disminuye en intensidad a traves de extincion por el espfn del atomo de cobalto. Ademas, la exposicion prolongada de la cobalamina fluorescente a la luz escindira el enlace cobalto-carbono y liberara el fluoroforo, fosforoforo, cromoforo quimioluminiscente o la molecula productora de luz de la cobalamina (Howard et al., 1997). Por tanto, se prefiere unir el fluoroforo, fosforoforo, cromoforo quimioluminiscente o la molecula productora de luz al resto de ribosa de la molecula de cobalamina. Estas ultimas cobalaminas fluorescentes no tienen las desventajas de las cobalaminas fluorescentes en las que el fluoroforo, fosforoforo, cromoforo quimioluminiscente o la molecula productora de luz se une covalentemente al atomo de cobalto.
Fuera del alcance de la invencion reivindicada, la union del fluoroforo, fosforoforo, cromoforo quimioluminiscente o la molecula productora de luz a un carboxilato en el anillo de corrina o en el grupo hidroxilo de la 5’-ribosa elude el problema de menor sensibilidad y fotolabilidad. En general, se conocen derivados de carboxilato de anillo de corrina (Collins y Hogenkamp, 1997), pero ninguno de los compuestos sintetizados contiene un marcador fluorescente. El
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fluoroforo, fosforoforo, cromoforo quimioluminiscente o la molecula productora de luz puede unirse directamente al anillo de corrina, en lugar de al atomo de cobalto mediante derivatizacion del monocarboxilato de cobalamina segun metodos publicados (Collins y Hogenkamp, 1997 y las referencias citadas en ese documento). La figura 1 muestra sitios en la cobalamina que pueden usarse para su modificacion.
Aunque puede utilizarse cualquier fluoroforo, fosforoforo, cromoforo quimioluminiscente o molecula productora de luz en la preparacion de las cobalaminas fluorescentes, se prefiere utilizar fluoroforos que pueden excitarse con luz visible o infrarroja. Se prefiere usar luz visible o infrarroja para el uso in vivo de las cobalaminas fluorescentes. Los ejemplos de fluoroforos preferidos incluyen, pero no se limitan a, fluoresceina, fluoresceina-5EX, metoxicumarina, naftofluoresceina, BODIPY 493/503, BODIPY-FL, BODIPY R6G, BODIPY 530/550, BODIPY TMR, BODIPY 564/570, BODIPY 576/589, BODIPY 581/591, BODIPY TR, Cascade Blue, dansilo, dialquilaminocumarina, 4’,5’-dicloro-2’,7’- dimetoxifluoresceina, 2’,7’-diclorofluoresceina, eosina, eosina F3S, eritrosina, hidroxicumarina, lisamina-rodamina B, metoxicumarina, naftofluoresceina, NBD, Oregon Green 488, Oregon Green 500, Oregon Green 514, PyMPO, pireno, rodamina 6G, verde de rodamina, rojo de rodamina, verde de rodol, 2’,4’,5’,7’-tetrabromosulfona- fluoresceina, tetrametil-rodamina (TMR), Texas Red, X-rodamina, colorante Cy2, colorante Cy3, colorante Cy5, colorante Cy5.5 o una estructura de puntos cuanticos. Las cobalaminas fluorescentes preferidas de la presente invencion producen fluorescencia cuando se excitan mediante luz visible o infrarroja sin la necesidad de escindir el fluoroforo del bioconjugado. La luz puede proporcionarse mediante un laser o una fuente de luz de fibra optica con un filtro apropiado. Se prefiere la luz roja para una mejor penetracion en el tejido.
Se ha encontrado que hay captacion diferencial de analogos de cobalamina fluorescentes en medula osea humana normal y leucemica. La diferencia entre celulas de medula normales y mieloblastos leucemicos (celulas cancerosas) es particularmente notable, sin captarse cobalamina detectable por las celulas normales. Las muestras de medula osea de individuos sanos no muestran marcaje fluorescente. Tambien se ha encontrado que hay captacion de un conjugado de doxorubicina-cobalamina, sintetizado originariamente como posible compuesto quimioterapico. La captacion celular del conjugado de doxorubicina-cobalamina puede observarse en celulas de leucemia murina P388, asi como en celulas tumorales de colon humanas HCT-116. Por tanto, la captacion de derivados fluorescentes de cobalamina se produce en lineas celulares de tumores solidos y leucemia. Estos resultados, en combinacion con el conocimiento de que todas las celulas cancerosas aumentan el transporte y almacenamiento de cobalamina, demuestran la aplicabilidad general del uso de cobalaminas fluorescentes para distinguir celulas cancerosas de celulas normales.
Por tanto, las cobalaminas fluorescentes de la presente invencion pueden usarse para:
• identificar visualmente tejido canceroso, mediante microscopia de fluorescencia, laparoscopia de fluorescencia, endoscopia de fluorescencia o citometria de flujo;
• identificar celulas cancerosas en secciones de tejido o muestras de biopsias de tejido;
• definir margenes tumorales in vivo, ex vivo o in situ;
• diagnosticar, detectar, pronosticar, predecir o monitorizar cancer in vivo, ex vivo o in situ;
• identificar cancer metastasico in vivo, ex vivo o in situ;
• determinar el estadio de progresion del cancer;
• identificar cancer por via transdermica;
• identificar cancer metastasico por via transdermica;
• identificar cancer en ganglios linfaticos, incluyendo en el ganglio o ganglios linfaticos centinela o en un ganglio o ganglios linfaticos axilares, incluyendo el uso de tecnicas minimamente invasivas, tales como laparoscopia o endoscopia;
• identificar enfermedad metastasica en el tratamiento, la deteccion, prediccion, el pronostico o la monitorizacion de cancer, tal como cancer de mama, cancer de ovario, cancer de pulmon, cancer de prostata, cancer del epitelio (adenocarcinoma), cancer de higado, melanoma y linfoma;
• realizar estudios de citometria de flujo de aspirados de medula osea o muestras de sangre periferica para diagnosticar, predecir, pronosticar, monitorizar o caracterizar leucemia o linfoma;
• predecir si un paciente respondera positivamente a quimioterapia que se basa en el uso de un biconjugado terapeutico basado en cobalamina;
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• mejorar la definicion de micromargenes tumorales en una biopsia o tumorectomia;
• disminuir la posibilidad de dejar celulas cancerosas en una biopsia, tumorectomia o mastectomia y reducir de ese modo la necesidad de cirugia de seguimiento para extirpar las celulas cancerosas restantes.
Prediccion se refiere al entendimiento del comportamiento biologico del tumor, y como respondera el tumor (favorable o desfavorablemente) a la terapia. Pronostico se refiere al desenlace previsto para el paciente tras la terapia (es decir, cual es la probabilidad de supervivencia a los cinco o diez anos tras la terapia). Monitorizacion se refiere a determinar el exito de la terapia y la deteccion de enfermedad residual tras el tratamiento. Un ejemplo es el uso de un conjugado de cobalamina fluorescente para someter a prueba la medula osea para determinar la presencia de mieloblastos tras el tratamiento de leucemia. Caracterizacion se refiere a una clasificacion descriptiva o cuantitativa del tipo de tumor en comparacion con tipos de tumores estrechamente relacionados.
Las cobalaminas fluorescentes de la presente invencion pueden administrarse segun metodos habituales de diagnostico, deteccion, prediccion, pronostico, monitorizacion o caracterizacion de cancer conocidos en la tecnica. Por ejemplo, las cobalaminas fluorescentes pueden administrarse por via intravenosa, por via intratecal, por via intratumoral, por via intramuscular, por via intralinfatica o por via oral. Normalmente, una cantidad de la cobalamina fluorescente de la presente invencion se mezclara con un portador farmaceuticamente aceptable. El portador puede adoptar una amplia variedad de formas dependiendo de la forma de preparacion deseada para la administracion, por ejemplo, oral, parenteral, intravenosa, intratecal, intratumoral, circuntumoral y epidural. Las composiciones pueden contener ademas agentes antioxidantes, agentes estabilizantes, conservantes y similares. Pueden encontrarse ejemplos de tecnicas y protocolos en Remington's Pharmaceutical Sciences. La cantidad de cobalamina fluorescente que va a administrarse sera normalmente de 1-500 mg.
Tal como se muestra en el presente documento, se reconocen analogos de cobalamina por proteinas de transporte de cobalamina, tales como haptocorrina (TCl o HC), factor intrinseco (FI) o transcobalamina (TCII), con alta afinidad. La union de moleculas grandes a cobalamina no parece afectar a la union a proteinas.
Una mejora en la capacidad del cirujano para identificar enfermedad metastasica en ganglios linfaticos supondra un avance en la terapia quirurgica al conservar, por ejemplo, tejido sano y minimizar el numero de ganglios linfaticos axilares extirpados. Esto mejorara la calidad de vida del paciente y mejorara la morbimortalidad a largo plazo. La identificacion precisa de celulas cancerosas que se han diseminado a los ganglios linfaticos permitira la extirpacion solo de los conductos y ganglios enfermos, mientras que se respetan los ganglios axilares sanos. Esta invencion es extremadamente valiosa. Por ejemplo, con 186.000 nuevos casos de cancer de mama cada ano, el numero de cirugias para extirpar tumores primarios y determinar el estado de los ganglios linfaticos asociados es significativo. La extirpacion superficial de todos los conductos y ganglios linfaticos axilares conduce a edema local y aumento de la morbilidad. El hecho de no extirpar conductos y ganglios linfaticos axilares que contienen celulas cancerosas metastasicas conduce a la disminucion de la supervivencia y al aumento de la mortalidad a largo plazo.
En el enfoque de biopsia de ganglios linfaticos centinela, se inyectan colorante azul y/o indicador radiactivo en la mama, cerca del tumor. Se realiza una pequena incision debajo del brazo para buscar trazas del colorante o radiactividad para identificar el/los ganglio(s) linfatico(s) que drenan la zona de la mama y, como consecuencia, tiene(n) la mayor probabilidad de contener celulas cancerosas metastasicas. Segun la presente invencion, una cobalamina fluorescente sustituye al colorante azul y al indicador radioisotopico usados actualmente en biopsias de ganglios linfaticos centinela. El uso de las cobalaminas fluorescentes de la presente invencion permite la aplicacion del enfoque de biopsia de ganglios linfaticos centinela a todos los tipos de cancer. Ademas, las cobalaminas fluorescentes de la presente invencion permiten el uso de tecnicas minimamente invasivas, tales como tecnicas laparoscopicas, endoscopicas y microscopicas, en el analisis de cancer, especialmente el analisis de celulas cancerosas en ganglios linfaticos. El uso de las cobalaminas fluorescentes facilitara la identificacion y extraccion de ganglios linfaticos positivos. Por tanto, segun la presente invencion, las cobalaminas fluorescentes pueden usarse con los siguientes canceres o canceres de: mama, piel (melanoma), ginecologicos (de ovario, de prostata, uterino, de cuello uterino, de vulva, de pene, de testiculo), cabeza y cuello (labio, lengua, boca, faringe), organos digestivos (esofago, estomago, intestino delgado, intestino grueso, recto, colon, higado, pancreas), hueso, tejido conjuntivo, organos urinarios (vejiga, rinon), ojo, cerebro y sistema nervioso central, glandulas endocrinas (tiroides), tejidos linfaticos, enfermedad de Hodgkin, linfoma no Hodgkin y mieloma multiple.
Ademas, el uso de cobalaminas fluorescentes de la presente invencion permiten el uso de tecnicas minimamente invasivas, tales como tecnicas laparoscopicas y endoscopicas, para la identificacion de ganglios linfaticos que contienen celulas cancerosas y que deben extirparse. Esta tecnologia propuesta esta disenada para sustituir los dos metodos actuales de examinar quirurgicamente los ganglios linfaticos axilares en pacientes con cancer de mama operable con un metodo mas preciso y menos doloroso. Las dos operaciones ahora en uso son la diseccion de ganglios axilares convencional usando una incision grande (de aproximadamente 5 pulgadas) y extirpando todos los ganglios linfaticos de nivel inferior (10-15). El segundo metodo, y actualmente experimental, es la biopsia de ganglios linfaticos centinela. Este metodo usa o bien un colorante visual o bien un emisor gamma para identificar el primer
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ganglio linfatico que drena la mama. Esto requiere una incision grande de forma similar y un examen tecnicamente dificil de las rutas linfaticas. Las moleculas de cobalamina de la presente invencion llevaran un fotoforo hasta los ganglios con cancer. Los ganglios linfaticos se examinan directamente a traves de tres pequenas incisiones (35 mm) usando instrumentos laparoscopicos. La tecnica operatoria cerrada proporciona un campo oscuro para la excitacion con laser. La emision brillante de luz estimulada a partir del conjugado de cobalamina-fotoforo en los ganglios linfaticos portadores de tumor facilitara la identificacion y extraccion de ganglios linfaticos positivos. Este metodo dara como resultado menos diseccion, menos dolor y mejor precision. Se aplican principios similares al uso de las cobalaminas fluorescentes para detectar celulas cancerosas con tecnicas endoscopicas.
Ademas, puesto que las cobalaminas fluorescentes de la presente invencion se captan de manera diferencial por celulas cancerosas, estas cobalaminas fluorescentes son un marcador mejorado que permitirla a los cirujanos resecar tejido canceroso selectivamente, dejando de ese modo el tejido sano.
La capacidad de cobalaminas fluorescentes unidas a celulas cancerosas que van a detectarse de manera laparoscopica o endoscopica demuestra que las moleculas fluorescentes pueden usarse para determinar un ganglio linfatico centinela de manera laparoscopica o endoscopica. Por tanto, cualquier molecula fluorescente (dirigida o no dirigida a cancer) puede detectarse en un ganglio linfatico usando visualizacion laparoscopica o endoscopica. Como ejemplo, podria inyectarse un fluoroforo rojo por via intratumoral como se hace ahora en el procedimiento de ganglios linfaticos centinela. La insuflacion de las axilas permitira al cirujano encontrar el ganglio fluorescente de manera laparoscopica (a traves de 2 pequenas incisiones) y evitar de ese modo el uso de un indicador radiactivo para ayudar al cirujano a encontrar la ubicacion general del ganglio centinela.
Las cobalaminas fluorescentes de la presente invencion ofrecen varias mejoras como un marcador intraoperatorio. Estas mejoras incluyen:
• El marcador fluorescente sera especifico para celulas cancerosas en conductos y ganglios linfaticos, en lugar de simplemente indicar que ganglio esta drenando la cuenca ganglionar. El marcador fluorescente tambien distinguira celulas cancerosas de las celulas sanas.
• El marcador puede usarse a bajas concentraciones debido a la sensibilidad inherente proporcionada por la deteccion de fluorescencia. El colorante azul ahora en uso tiende a oscurecer el ganglio activo y complica el examen posquirurgico del tejido por un patologo. El colorante azul tambien tiende a oscurecer los vasos con hemorragia, complicando de ese modo la resecacion quirurgica del ganglio y el posterior cierre de la herida. El uso de un marcador fluorescente debe evitar estos problemas.
• Un marcador fluorescente que es especifico para celulas cancerosas mejorara la tasa de falsos negativos del 5-10%, tal como se observa con el procedimiento puesto en practica actualmente.
• Una disminucion de la tasa de falsos negativos mejoraria la aceptacion de esta tecnica por los pacientes y cirujanos. Esto podria disminuir el tiempo de formacion necesario (normalmente 30 casos o mas con diseccion de ganglios axiales completa) para que un cirujano aprenda este procedimiento.
• El marcador fluorescente permite el uso de tecnicas laparoscopicas, endoscopicas y microscopicas para la visualizacion de celulas cancerosas. Estas tecnicas tambien pueden usarse para visualizar tumores primarios, tumores metastasicos, ganglios linfaticos axilares, ganglios linfaticos inguinales y ganglios linfaticos cervicales. Estas tecnicas reduciran la necesidad de grandes incisiones y un examen tecnicamente dificil de las rutas linfaticas en el analisis de cancer. Estas tecnicas daran como resultado menos diseccion, menos dolor y mejor precision.
En una realizacion adicional de la presente invencion, las cobalaminas fluorescentes pueden usarse en un ensayo de union competitiva para determinar la concentracion o cantidad de cobalamina que se produce de manera natural (hidroxocobalamina, metilcobalamina, adenosilcobalamina o cianocobalamina) en sangre, plasma, suero u otros liquidos corporales. En este tipo de ensayos, se usa una cobalamina fluorescente en lugar de una cobalamina marcada de manera radiactiva en un ensayo de union competitiva, que conoce bien un experto en la tecnica. Se han descrito ensayos radiactivos para cobalamina en las patentes estadounidenses n.os 6.096.290; 5.614.394; 5.227.311; 5.187.107; 5.104.815; 4.680.273; 4.465.775; 4.355.018, entre otras. Este procedimiento de ensayo puede usarse para determinar la cantidad de capacidad de union a cobalamina no saturada en sangre, plasma, suero o liquidos corporales, asi como la concentracion de cobalamina que esta unida a las proteinas transcobalamina, haptocorrina, para el factor intrinseco. El uso de cobalaminas fluorescentes tiene una ventaja significativa con respecto a la cobalamina marcada de manera radiactiva en un ensayo de union de bioquimica clinica porque no requiere los procedimientos especiales de envio, manipulacion y eliminacion asociados con cobalamina marcada de manera radiactiva.
Ejemplos
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La presente invencion se describe adicionalmente mediante referenda a los siguientes ejemplos, que se ofrecen a modo de ilustracion. Se utilizaron tecnicas convencionales bien conocidas en la tecnica o las tecnicas descritas especificamente a continuacion. Cualquier ejemplo o figura en el que se une el grupo luminiscente al Co o al anillo de corrina ha de considerase comparativo, en el sentido de que su contenido no forma parte de la invencion tal como se reivindica.
EJEMPLO 1
Sintesis de cobalamina fluorescente mediante union del fluoroforo a cobalto
Como indicador visual de la localizacion de cobalamina, se prepararon cinco analogos de cobalamina fluorescentes uniendo covalentemente fluoresceina a cobalamina. Bajo iluminacion con luz verde, la molecula de fluoresceina emite luz amarilla que puede detectarse a simple vista adaptada a la oscuridad hasta concentraciones menores de 0,1 ppm. Esta emision permite la deteccion sensible de celulas cancerosas mediante microscopia de epifluorescencia, asi como mediante inspeccion visual. Cada una de las cinco cobalaminas fluorescentes presento fluorescencia intrinseca. Se sintetizaron todos estos compuestos haciendo reaccionar cloruro de aminopropilo con cob(I)alamina para producir aminopropilcob(III)alamina segun tecnicas publicadas. En una etapa posterior, se hizo reaccionar aminopropilcob(III)alamina con una variedad de isotiocianatos fluoroforos (es decir, isotiocianato de fluoresceina, “FITC”) para producir el fluoroforo correspondiente que se une a cobalamina a traves de un grupo de union de aminopropilo (es decir, fluoresceina-aminopropil-cob(III)alamina) Esta ultima reaccion se muestra en la figura 2.
De manera similar, se prepararon cobalaminas fluorescentes en las que el fluoroforo es naftofluoresceina u Oregon Green. Se encontro que todas las cobalaminas fluorescentes conservaban una alta afinidad por la transcobalamina recombinante (rhTCII), permitiendo por tanto una distribucion biologica similar a la observada a partir de cobalamina que se produce de manera natural.
EJEMPLO 2
Captacion de analogos de cobalamina por celulas cancerosas
Se produjo una preparacion de mieloblastos leucemicos a partir de un aspirado de medula osea de un paciente de 61 anos de edad que tenia leucemia mielogena aguda (AML) M1 (mieloblastos minimamente maduros en la clasificacion FAB). Se trataron las celulas tres dias tras la recogida con una cobalamina fluorescente preparada tal como se describe en el ejemplo 1. Se encontro captacion diferencial de analogos de cobalamina fluorescentes, tal como se determino mediante microscopia de fluorescencia o citometria de flujo de fluorescencia, en celulas de medula osea humana normales y leucemicas. La diferencia entre celulas de medula normales y mieloblastos leucemicos (celulas cancerosas) es particularmente notable, sin captarse cobalamina detectable por las celulas normales. Una muestra de medula osea de un individuo sano no mostro marcaje fluorescente. Se observo la captacion de un conjugado de doxorubicina-cobalaminas, sintetizado originariamente como posible compuesto quimioterapico, en celulas de leucemia murina P-388 y en celulas tumorales de colon humanas HCT-116. Estos resultados ilustran la captacion de derivados fluorescentes de cobalamina en lineas celulares de tumores solidos y leucemia.
EJEMPLO 3
Preparacion de acido monocarboxilico de cianocobalamina
Se prepararon los acidos b-, d- y e-monocarboxilicos mediante hidrolisis catalizada por acido de cianocobalamina. Vease la figura 3. En resumen, se puso cianocobalamina (527,0 mg, 0,389 mmol) en un matraz de fondo redondo de 100 ml y se disolvio en 40 ml de HCl 0,5 M. Se puso el matraz en un bano de agua a 50°C y se agito durante 4 horas. Se monitorizo la reaccion mediante HPLC (columna DeltaPak C-18, 100 3,9 x 300 mm de Waters, Inc.) usando el gradiente tabulado en la tabla 1.
TABLA 1
Tiempo (min)
Caudal (ml/min) H3PO4 0,5 M ((pH 3,0 con NH3OH) CH3CN:H2O 9:1
0,0
2,0 90,0 10,0
2,0
2,0
90,0 10,0
18,0
2,0 83,7 16,3
23,0
2,0 30,0 70,0
25,0
2,0 30,0 70,0
Tiempo (min)
Caudal (ml/min) H3PO4 0,5 M ((pH 3,0 con NH3OH) CH3CN:H2O 9:1
30,0
2,0 90,0 10,0
Despues de 4 horas, se enfrio la reaccion hasta temperatura ambiente. Se ajusto el pH a 7,0 con NaOH (al 10%) usando un pHmetro. Se desalo el material en bruto usando una columna SepPak C-18 (P/N WATO23635 de Waters, Inc.) enjuagando en primer lugar la columna con 10 ml de metanol seguido por 15 ml de H2O desionizada. Se aplico 5 el material en bruto a la columna mediante una jeringa y se enjuago con 10-15 ml de H2O desionizada seguido por elucion con 10 ml de metanol. Se elimino el metanol mediante evaporacion rotatoria y se obtuvo un compuesto de color rojo (5016-12-33).
Se disolvio la mezcla de reaccion en bruto en la cantidad minima de H2O desionizada y se inyecto la mitad de la 10 disolucion en un HPLC semipreparativo (columna 100 C-18, 25,0 x 300 mm de Waters, Inc.) usando el gradiente calculado en la tabla 2.
TABLA 2
Tiempo (min)
Caudal (ml/min) H3PO4 0,5 M ((pH 3,0 con NH3OH) CH3CN:H2O 9:1
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40,0 90,0 10,0
4,1
40,0 90,0 10,0
37,0
40,0 83,7 16,3
47,3
40,0 30,0 70,0
51,4
40,0 30,0 70,0
61,6
40,0 90,0 10,0
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Se recogieron los picos a 28,0 min (acido b-monocarboxilico, CBC-195), 30,1 min (acidos d-monocarboxilicos, CBC- 226) y 34,6 min (acido e-monocarboxilico) usando tubos de ensayo grandes. Se diluyeron 1:1 las fracciones puras con H2O desionizada y se desalaron en el mismo metodo anterior. En todos los casos, se obtuvo un solido de color rojo.
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CBC-195 (acido b-monocarboxilico): En las dos series preparativas, se aislaron 74,8 mg del acido b-monocarboxilico (14,4 %). Se obtuvo un espectro de masas de electropulverizacion de ion positivo (ES+) que muestra un pico de M+1 (1356) y un pico de M+22 (1378) tal como se esperaba. Se obtuvo el acido b-monocarboxilico (CBC-195) con un rendimiento global del 14%.
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CBC-226 (acido d-monocarboxilico): En las dos series prep., se aislaron 38,6 mg del acido d-monocarboxilico (7,3%). Se obtuvo un espectro de masas de electropulverizacion de ion positivo (ES+) que mostraba un pico de M+1 (1356) y el pico de M+Na correspondiente (1378) tal como se esperaba. Se obtuvo el acido d-monocarboxilico (CBC- 226) con un rendimiento global del 7%.
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Se aislo el acido e-monocarboxilico, ~78 mg con un rendimiento global del 14%.
EJEMPLO 4
35 Conjugacion de acidos de CNCb1 con 1.12-diaminododecano
Se prepararon las b- y d-aminas tal como se muestra en la figura 4. Se anadio CBC-195 (55,4 mg, 0,0408 mmol) a
un vial de vidrio pequeno y se disolvio en ~2,5 ml de DMSO seguido por la adicion de EDCI-HCl (12 mg, 0,0626
mmol) y N-hidroxisuccinimida (NHS) (25 mg, 0,217 mmol). Se agito la reaccion a temperatura ambiente durante la 40 noche. A partir de intentos anteriores, se requerian varios equivalentes de EDCI y NHS (un total de 6 equivalentes) para llevar la reaccion a completarse. Despues de 24 horas, se anadio un equivalente adicional de EDCI y se completo la reaccion en un total de 26 horas. Se monitorizo la reaccion mediante HPLC usando el gradiente de la tabla 3. CBC-195 tiene un tiempo de retencion de 9,07 min y el ester de NHS de CBC-195 tiene un tiempo de retencion de 10,55 min.
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TABLA 3
Tiempo (min)
Caudal (ml/min) H3PO4 0,5 M ((pH 3,0 con NH3OH) CH3CN:H2O 9:1
0,0
2,0 90,0 10,0
2,0
2,0
90,0 10,0
20,0
2,0 55,0 45,0
25,0
2,0 9,0 10,0
En un vial de vidrio independiente, se disolvio 1,12-diaminododecano (81,8 mg, 0,408 mmol) en ~2 ml de DMSO. Se
anadio gota a gota la mezcla de reaccion anterior usando una bomba de jeringa a 4,0 ml/h para minimizar la dimerizacion. Se formo el producto inmediatamente y tiene un tiempo de retencion de 14,56 min. Se anadio la mezcla de reaccion en bruto a 100 ml de Cl-bC^^O 1:1 y se formo un precipitado de color rojo. Se filtro el compuesto de color rojo usando una frita de vidrio y se lavo con dos porciones de 20 ml de C-^Cb, dos porciones de 20 ml de acetona y finalmente mediante dos porciones de 20 ml de Et2O.
Se disolvio el producto de reaccion en bruto en la cantidad minima de H2O desionizada y se inyecto la disolucion en un HPLC semipreparativo (columna 100 C-18, 25,0 x 100 mm de Waters, Inc.) usando el gradiente calculado en la tabla 4.
TABLA 4
Tiempo (min)
Caudal (ml/min) H3PO4 0,5 M ((pH 3,0 con NH3OH) CH3CN:H2O 9:1
0,0
40,0 90,0 10,0
2,0
40,0 90,0 10,0
13,7
40,0 55,0 45,0
17,1
40,0 90,0 10,0
Se recogio el pico a 8,70 min (b-amina, CBC-208) usando tubos de ensayo grandes. Se diluyeron 1:1 las fracciones puras con H2O destilada y se desalaron usando una columna SepPak C-18 (P/N WATO23635 de Waters, Inc.) enjuagando en primer lugar la columna con 10 ml de metanol seguido por 15 ml de H2O desionizada. Se aplico el material puro a la columna mediante una jeringa y se enjuago con 10-15 ml de H2O desionizada seguido por elucion con 10 ml de metanol. Se elimino el metanol mediante evaporacion rotatoria y se obtuvieron 6 mg de un compuesto de color rojo.
CBC-208 (b-amina): Se aislo un total de 6,0 mg de la b-amina. Se obtuvo un espectro de masas de electropulverizacion de ion positivo (ES+) que muestra un pico de M+1 (1538) y un pico de M+23 (1560) tal como se esperaba. Se obtuvo CBC-208 con un rendimiento del 9,5% despues de purificacion.
CBC-226 (d-amina): El acido d-monocarboxilico tiene un tiempo de retencion de HPLC de 9,32 min, el ester de NHS migra a 10,96 min, y la d-amina (CBC-226) migra a 14,93 min usando el mismo gradiente de HPLC que el de la tabla 3. Se obtuvo un espectro de masas de electropulverizacion de ion positivo (ES+) del material en bruto que mostraba un pico de M+1 (1538) y el pico de M+Na correspondiente (1560) tal como se esperaba.
EJEMPLO 5
Conjugacion de CBC-208 y fluoresceina-5EX-NHS
Se ha acoplado CBC-208 al derivado de fluoresceina fluoresceina-5EX (disponible de Molecular Probes, Inc.) segun
la figura 5. Se anadio CBC-208 (6,0 mg , 3,87 pmol) a un vial de vidrio pequeno y se disolvio en ~0,5 ml de DMSO
seguido por la adicion de fluoresceina-5EX-NHS (2,5 mg, 4,23 pmol). Se permitio que agitase la reaccion a temperatura ambiente durante la noche. Se monitorizo la reaccion mediante HPLC usando el metodo en la tabla 5.
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TABLA 5
Tiempo (min)
Caudal (ml/min) H3PO4 0,5 M ((pH 3,0 con NH3OH) CH3CN:H2O 9:1
0,0
2,0 90,0 10,0
2,0
2,0
90,0 10,0
10,0
2,0 65,0 35,0
15,0
2,0 5,0 95,0
28 =
2,0 90,0 10,0
La reaccion avanzo muy rapido inicialmente formando el producto deseado despues de solo 10 minutos de contacto. CBC-208 tiene un tiempo de retencion de 11,47 min y el producto (CBC-123) tiene un tiempo de retencion de 14,24 min. Con la adicion de otro equivalente del compuesto de fluoresceina la reaccion llega a completarse y la mezcla en bruto es pura al 88%.
El analisis de HPLC del material de partida fluoresceina-5EX-NHS muestra que solo es puro al 75%, lo que explica por que fue necesario un equivalente adicional para llevar la reaccion a completarse.
CBC-123 (derivado de b-fluoresceina-cobalamina): Este compuesto es puro casi al 90% como el aislado en bruto procedente de la sintesis, siendo la mayoria de la impureza CBC-208 sin reaccionar. Se obtuvo un espectro de masas de electropulverizacion de ion positivo (ES+) del material en bruto que mostraba un pico de M+1 (2013) y el pico de M+Na correspondiente (2035). El rendimiento antes de la purificacion es del 22%.
Se tomo un espectro de fluorescencia de este compuesto del compuesto en bruto antes y despues de fotolisis con excitacion a 350 nm (vease la figura 6). No hay ningun cambio significativo en la fluorescencia antes y despues de la fotolisis, indicando que el compuesto es fotoestable y es claramente fluorescente y no presenta una disminucion de la fluorescencia debido a la proximidad de la cobalamina.
EJEMPLO 6
Ex vivo Examen de tejido de tumor de mama mediante microscopia
Se resecan de pacientes muestras de tumores malignos y benignos, incluyendo tumores de mama, con tejido marginal normal adherido. Se toman estas muestras con la aprobacion de la Junta de Revision Institucional (IRB, Institutional Review Board) de la Universidad de Utah y el Comite de Investigacion Clinica del Cancer (CCIC) del Instituto del Cancer Huntsman. Se incuban las muestras de tejido vivo con uno de los derivados de cobalamina fluorescentes preparados anteriormente durante 4-6 horas. Se preparan secciones de tejido delgadas de cada muestra con un criomicrotomo y se cuantifica la cantidad de marcador fluorescente en tejido normal y canceroso mediante microscopia de epifluorescencia. Se tinen secciones de tejido correspondientes con tincion de hematoxilina/eosina (H&E) para la evaluacion por un anatomopatologo. Se examina cuidadosamente la superficie de contacto entre celulas normales y cancerosas. Tambien se examinan las celulas del interior del tumor para determinar la captacion de marcador fluorescente, puesto que las celulas dentro de regiones hipoxicas de un tumor tienen a menudo una disminucion del metabolismo.
Mas especificamente, se preparo medio esencial minimo, con modificacion alfa (a-MEM; suero de ternero recien nacido al 7,5%, suero bovino fetal al 2,5%, nistatina al 0,2%, penicilina/estreptomicina al 2,5%, pH 7,2; Sigma) y se tomaron alicuotas (10 ml) en frascos de cultivo tisular con tapon de rosca de 25 ml esteriles. Se llevaron los medios a 37°C, y se incubaron muestras de tejido con cobalaminas marcadas de manera fluorescente (50 nM; conjugados de cobalamina-Oregon Green y cobalamina-naftofluoresceina del ejemplo 1 y conjugado de cobalamina-fluoresceina del ejemplo 5) y TCII humana recombinante (50 pM) en a-MEM durante 3 horas. Se adquirieron muestras de tejido de mama humano segun un protocolo aprobado por la IRM. Se retiro el tejido del frasco, se lavo con solucion salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DpBS; Sigma), y se preparo sobre una placa de laton a -20°C con compuesto de OCT (Shandon) para los cortes de secciones congeladas. Se corto el tejido (secciones de 4-6 pm) en un criostato CTD Harris a -20°C. Se tiro hacia atras de las secciones de tejido delgadas con un pincel pequeno y se fijaron a un portaobjetos de microscopio con etanol al 100%. Se tineron los portaobjetos usando un procedimiento de tincion con hematoxilina convencional: etanol al 95%, 20 segundos; agua, 5 segundos; hematoxilina (Fisher), 45 segundos; agua, 5 segundos; disolucion de azulado (agua corriente), 10 segundos; etanol al 95%, 10 segundos; etanol al 100%, 10 segundos; xileno, 10 segundos; y xileno, 10 segundos. Se evaluaron los portaobjetos mediante microscopia de contraste de fase y de epifluorescencia a aumentos 10x, 60x y 100x.
Se uso tiazolilbromuro de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolio (MTT; Sigma) para determinar cualitativamente la competencia metabolica del tejido despues de un tiempo de incubacion de 3 horas con cobalamina fluorescente. Se retiro una porcion del tejido de los medios, se lavo con DPBS y se sumergio en MTT (2 ml; 2,5 mg/ml). Se incubo
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este tejido durante 3 horas bajo una atmosfera con el 5% de CO2 a 37°C. Durante este periodo de incubacion, las celulas viables en la muestra de tejido redujeron el colorante MTT a formazano de color purpura mediante actividad succinato deshidrogenasa (Celis y Celis, 1998). Se lavo el tejido con DPBS y se preparo segun el procedimiento con criomicrotomo expuesto anteriormente para garantizar la competencia metabolica del tejido.
Los bioconjugados de cobalamina fluorescentes se acumularon en cierta medida en tejido de mama tanto neoplasico como sano, secuestrando el tejido de mama neoplasico mas cobalamina fluorescente que el tejido de mama sano. La cantidad de cobalamina fluorescente secuestrada por tejido de mama sano es mayor de la esperada, pero se cree que se debe a la union inespecifica a estructuras dentro del tejido conjuntivo mas que a una internalizacion significativa por celulas sanas.
EJEMPLO 7
Examen ex vivo de celulas cancerosas en ganglios linfaticos
Se extirpan ganglios linfaticos resecados con enfermedad metastasica de pacientes y se incuban durante 4-8 horas con uno de los derivados de cobalamina fluorescentes preparados anteriormente. Se secciona cada ganglio linfatico y se examina al microscopio para determinar el transporte de la cobalamina fluorescente a las celulas cancerosas. Este experimento mostro la capacidad de las celulas metastasicas dentro de los ganglios linfaticos para captar suficiente cobalamina fluorescente para la obtencion de imagenes y la visualizacion.
EJEMPLO 8
Use de cobalamina fluorescente para determinar si un paciente respondera favorablemente a quimioterapia con un bioconjugado terapeutico basado en cobalamina
Se incuba una muestra de aspirado de medula osea o de sangre periferica de un paciente con leucemia, con un conjugado de cobalamina fluorescente. Despues de 4-8 horas, se lava la muestra de aspirado de medula osea o de sangre periferica para retirar el marcador fluorescente no incorporado y se somete la muestra celular a analisis de fluorescencia cualitativo o cuantitativo mediante microscopia de epifluorescencia o citometria de flujo. Las celulas que han captado una cantidad significativa de cobalaminas fluorescentes presentan una fluorescencia mas brillante. La captacion de una cantidad significativa de cobalamina fluorescente indica que el tipo de leucemia que tiene el paciente respondera favorablemente al tratamiento con un agente terapeutico basado en cobalamina. Una muestra de aspirado de medula osea o de sangre periferica que no muestra una fluorescencia significativa despues del tratamiento con un conjugado de cobalamina fluorescente indica que el paciente no respondera favorablemente a un conjugado terapeutico basado en cobalamina. Puede aplicarse un enfoque similar a tumores solidos. En este caso, se incuba una porcion del tejido tumoral resecado con el conjugado de cobalamina fluorescente y, despues de aproximadamente 4-8 horas, se cuantifica la fluorescencia en el tejido tumoral. Cuanto mayor es la fluorescencia presentada por el tejido tumoral, mayor es la probabilidad de que el cancer responda favorablemente al tratamiento con un agente quimioterapico basado en cobalamina.
EJEMPLO 9
Sintesis de cobalafluor Y
Procedimiento general de desalacion. Se desalaron todas las cobalaminas con una columna SepPak C18 de 10 g (Waters, Inc.) mediante acondicionamiento del cartucho con dos volumenes de columna de metanol y tres volumenes de columna de agua desionizada. Se aplico la cobalamina a la columna, se lavo con tres volumenes de columna de agua desionizada, y se eluyo con metanol (10 ml). Se elimino el metanol mediante evaporacion rotatoria y se seco el producto mediante liofilizacion.
Preparacion de acido cianocobalamina-b-monocarboxllico. Se preparo acido cianocobalamina-b-monocarboxilico segun un protocolo publicado modificado (Anton et al., 1980). En resumen, se disolvio CNCbl (3,5 g, 2,6 mmol) en 350 ml de 1,0 M HCl. Se calento la reaccion hasta 37°C durante 4 h y se monitorizo mediante HPLC de fase inversa. Se desalo el material en bruto y entonces pudo purificarse mediante HPLC semiprep. Sin embargo, puesto que la mezcla de reaccion en bruto contenia mas del 45% de cianocobalamina (mediante HPLC) se uso una columna de intercambio ionico para separar la cianocobalamina sin reaccionar. Se disolvio el material en bruto en ddH2O y se aplico a una columna Dowex AG-X1 de 2,5 x 30 cm (en forma de acetato). Se eluyo CNCbl de la columna con agua desionizada. Entonces se eluyeron los tres acidos monocarboxilicos con acetato de sodio 0,04 M (pH 4) y se purificaron adicionalmente mediante HPLC semipreparativa. Se aislo el acido b-monocarboxilico (rendimiento global del 10%) con una pureza del 97% mediante HPLC analitica; EM-ES+: (H2O:CH3CN 1:1) M+H = 1356,3 (calc. C63H88CoN13O15P = 1356,5), M+Na+ = 1378,4 (calc. C63He8CoN13O15PNa = 1378,5). Tambien se aislaron los dos acidos d- y e-monocarboxilicos con rendimientos globales del 4% y el 7%, respectivamente.
Metodo de HPLC analitica para acido cianocobalamina-b-monocarboxllico: Se llevo a cabo una cromatografia analitica a un caudal de 2 ml/min usando una columna DeltaPak C-18, 300 x 3,9 mm de Waters. Despues de un flujo
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isocratico de 2 min inicial del 90% de disolucion A (tampon fosfato 0,05 M, pH 3,0) y el 10% de disolucion B (acetonitrilo y agua 9:1), un gradiente lineal de 16 min hasta el 83,7% de A y el 16,3% de B, se eluyo el derivado b- monocarboxilico deseado con un tiempo de retencion de 15,7 min. El acido d-monocarboxilico tenia un tiempo de retencion de 16,9 min y el acido e-monocarboxilico tenia un tiempo de retencion de 19,5 min.
HPLC semipreparativa para acido cianocobalamina-b-monocarboxflico: Se llevo a cabo una cromatografia a un caudal de 40 ml/min usando una columna semipreparativa DeltaPak C-18, 2,5 x 30 cm de Waters. Despues de un flujo isocratico de 4,1 min del 90% de disolucion A (tampon fosfato 0,05 M, pH 3,0) y el 10% de disolucion B (acetonitrilo y agua 9:1), un gradiente lineal de 32,9 minutos hasta el 83,7% de A y el 16,3% de B eluyo el derivado de cobalamina. Los tiempos de retencion de los tres acidos CNCbl-monocarboxilicos fueron los siguientes: el acido b-monocarboxilico eluyo a 23,1 min, el acido d-monocarboxilico a 26,6 min y el acido e-monocarboxilico a 32,1 min.
Sintesis de cianocobalamina-b-(5-aminopentilamida). Se disolvio acido cianocobalamina-b-monocarboxilico 1 (50 mg, 0,037 mmol) en un matraz de fondo redondo de 10 ml seco con EDCI (71 mg, 0,37 mmol) y NHS (25 mg, 0,22 mmol). Se desgasifico el matraz mediante purga con nitrogeno durante 5 min. Se anadio dimetilsulfoxido (5 ml) mediante una jeringa y se agito la mezcla de reaccion durante 6 h. Se retiro esta mezcla del matraz de fondo redondo usando una jeringa estanca a los gases, y se puso 1,5-diaminopentano (43 pl, 0,37 mmol) en el matraz. Se anadio gota a gota la mezcla de Cbl al 1,5-diaminopentano a lo largo de un periodo de 5 min para minimizar la formacion del aducto 2:1. Se uso HPLC de fase inversa para monitorizar la reaccion. Cuando se consumio el material de partida, una disolucion de CH2Cl2:dietil eter 1:1 (60 ml) precipito las cobalaminas. Se filtro el solido resultante sobre un filtro de frita media, se lavo con dietil eter (2 x 10 ml), y se eluyo del filtro con metanol. Se diluyo la mezcla en bruto con un volumen igual de agua y se inyecto en una columna semipreparativa para purificar la cianocobalamina-b-(5-aminopentilamida) 2. Se desalo una fraccion que contenia el producto deseado tal como se describio anteriormente y se seco mediante evaporacion rotatoria. Se obtuvo cianocobalamina-b-(5- aminopentilamida): rendimiento del 70%; pura al 98% mediante HPLC analitica; EM-ES+: (H2O:CH3CN 1:1) M+H = 1440,5 (calc. C68H100CoN15OuP = 1440,7), M+Na+ = 1462,4 (calc. C68H100CoN15OuPNa = 1462,6); £332 nm = 19500 M-1cm-1 en H2O.
Metodo de HPLC analitica para cianocobalamina-b-(5-aminopentilamida) 2: Se llevo a cabo una cromatografia analitica a un caudal de 2 ml/min en una columna DeltaPak C-18, 300 x 3,9 mm de Waters. Despues de un flujo isocratico de 2 min del 95% de disolucion A (tampon fosfato 0,05 M, pH 3,0) y el 5% de disolucion B (acetonitrilo y agua 9:1), un gradiente lineal de 16,4 min hasta el 70% de A y el 30% de B eluyo el compuesto de interes a 11,8 min.
HPLC semipreparativa para cianocobalamina-b-(5-aminopentilamida) 2: Se llevo a cabo una cromatografia semipreparativa a 40 ml/min usando una columna semipreparativa DeltaPak C-18, 25 x 30 cm de Waters. Despues de un flujo isocratico del 95% de disolucion A (tampon fosfato 0,05 M, pH 3,0) y el 5% de disolucion B (acetonitrilo y agua 9:1) durante 4,1 min, un gradiente lineal de 18 min hasta el 70% de A y el 30% de B eluyo el producto deseado.
Sintesis de cobalafluor Y (Cy5-cobalamina = Cy5-Cbl = Cy5-cobalafluor). Esta sintesis se muestra en la figura 7. En resumen, se preparo cianocobalamina-ribosa-5’-O-(6-aminohexilamida) usando cianocobalamina (Sigma Chemical Co.) segun un protocolo publicado (McEwan et al., 1999). Se precipitaron las cobalaminas usando dietil eter:cloruro de metileno 2:1 (50 ml) y tambien se lavo con esta mezcla de disolventes (2 x 10 ml). Se monitorizo la reaccion y se purifico el producto mediante HPLC de fase inversa. Se desalo el producto segun un procedimiento convencional. Se puso cianocobalamina-ribosa-5’-O-(6-aminohexilamida) (20 mg, 0,013 mmol) en un matraz de fondo redondo de 10 ml seco y se desgasifico mediante purga con nitrogeno durante 5 min. Se anadio dimetilsulfoxido (1 ml) mediante una jeringa para disolver la cobalamina. Se anadieron ester succinimidilico de Cy5 (10 mg, 0,013 mmol; Amersham Pharmacia) y DIPEA (15 pl, 0,13) al matraz y se agito la mezcla de reaccion durante 1 h. Se uso HPLC de fase inversa para monitorizar la reaccion. Cuando se consumio el material de partida, una disolucion de dietil eter:CH2Cl2 2:1 (50 ml) precipito las cobalaminas. Se filtro el solido resultante sobre un filtro de frita fina, se lavo con la mezcla de dietil eter y CH2Cl2 (2 x 10 ml), y se eluyo del filtro con metanol. Se inyecto la mezcla en bruto en una columna semipreparativa para purificar el cobalafluor Y y se desalo segun un procedimiento convencional. La figura 8 muestra el espectro de emision de fluorescencia de cobalafluor Y.
Metodo de HPLC analitica para cianocobalamina-ribosa-5'-O-(6-aminohexilamida): Se llevo a cabo una cromatografia analitica a un caudal de 2 ml/min usando una columna DeltaPak C-18, 300 x 3,9 mm de Waters. Despues de un flujo isocratico de 2 min inicial del 95% de disolucion A (tampon fosfato 0,05 M, pH 3,0) y el 5% de disolucion B (acetonitrilo y agua 9:1), un gradiente lineal de 18 min hasta el 70% de A y el 30% de B eluyo la cianocobalamina-ribosa-5’-O-(6-aminohexilamida) deseada con un tiempo de retencion de 12,5 min.
HPLC semipreparativa para cianocobalamina-ribosa-5'-O-(6-aminohexilamida): Se llevo a cabo una cromatografia a un caudal de 40 ml/min usando una columna semipreparativa DeltaPak C-18, 2,5 x 30 cm de Waters. Despues de un flujo isocratico de 4,1 min del 95% de disolucion A (tampon fosfato 0,05 M, pH 3,0) y el 5% de disolucion B (acetonitrilo y agua 9:1), un gradiente lineal de 27,4 min hasta el 70% de A y el 30% de B eluyo el derivado de cobalamina. El tiempo de retencion de la cianocobalamina-ribosa-5’-O-(6-aminohexilamida) deseada fue de
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15,5 min.
Metodo de HPLC analitica para cobalafluor Y: Se llevo a cabo una cromatografia analitica a un caudal de 2 ml/min en una columna DeltaPak C-18, 300 x 3,9 mm de Waters. Despues de un flujo isocratico de 2 min del 95% de disolucion A (tampon TEA 0,01 M, pH 7,0) y el 5% de disolucion B (acetonitrilo y agua 9:1), un gradiente lineal de 16,4 min hasta el 45% de A y el 55% de B eluyo el cobalafluor Y a 13,6 min.
HPLC semipreparativa para cobalafluor Y: Se llevo a cabo una cromatografia semipreparativa a 20 ml/min usando una columna semipreparativa DeltaPak C-18, 25 x 30 cm de Waters. Despues de un flujo isocratico del 95% de disolucion A (tampon TEA 0,01 M, pH 7,0) y el 5% de disolucion B (acetonitrilo y agua 9:1) durante 2 min, un gradiente lineal de 27,4 min hasta el 70% de A y el 30% de B eluyo el producto deseado a 12,2 min.
EJEMPLO 10
Ensayo competitivo
Materiales. Se adquirieron cobalaminas, factor no intrinseco porcino (mezcla 50:1 de HC e FI) y factor intrinseco porcino de Sigma Chemical Co. Se obtuvieron perfiles de HPLC usando un sistema Delta 600 de Waters equipado con un detector de absorbancia de doble longitud de onda 2487 de Waters. Se usaron los instrumentos BlACORE 2000 y 3000 (BlACORE AB) para el analisis con biosensor de resonancia de plasmon superficial.
Inmovilizacion de CNCbl-b-(5-aminopentilamida). Se llevaron a cabo todos los estudios de SPR en un biosensor optico BlACORE 2000. Se activaron las superficies de carboximetil-dextrano en las celdas de flujo de un chip sensor CM5 convencional (BlACORE AB) mediante el flujo de una mezcla de EDCI 0,1 M y NHS 0,025 M a 37°C a traves del chip a 20 pl/min durante 15 min. Se inmovilizo CNCbl-b-(5-aminopentilamida) 2, diluida en acetato de sodio 10 mM a pH 4,5, en tres celdas de flujo del chip tal como se muestra en la figura 9. Se crearon superficies de sensor de alta densidad (500-700 UR) pulsando el analogo de Cbl por las celdas de flujo durante 40 min a una velocidad de 2 pl/min. Se bloquearon los sitios de union restante en la superficie del chip en las cuatro celdas de flujo con etanolamina 1,0 M, pH 8,5, durante 16 min a 5 pl/min. Se uso la celda de flujo 3 como superficie de referencia para restar la union inespecifica y el ruido del instrumento.
Curva patron de proteinas. Se realizaron todos los ensayos competitivos y con curvas patron usando tampon de ejecucion de HbS (NaCl 150 mM, HEPES 10 mM, pH 7,5, EdTa 3,4 mM, BSA 1 mg/ml y tensioactivo P20 al 0,005%) a 30°C. Se generaron curvas de calibracion para rhTCII, FNI e FI que se unian a CNCbl-b-(5- aminopentilamida) de la siguiente manera. Se inyectaron disoluciones madre de cada proteina (15,6-500 pM) diluidas en tampon HBS a traves de las celdas de flujo a 20 pl/min durante 10 min para analizar la union. Se retiro la proteina unida con urea 8 M, SDS al 0,125% y tampon de ejecucion. Se analizo cada muestra de proteina por duplicado.
Determinacion de las constantes de disociacion de equilibrio en disolucion aparentes. Se analizo la union de rhTCII, FNI e FI a diversos analogos de cobalamina mediante un ensayo de union competitiva en disolucion (Nieba et al., 1996). Se incubaron concentraciones de analogo que oscilaban entre 0,01-100 nM en un volumen igual con rhTCII 200 pM, FNI 200 pM o FI 500 pM. Se generaron datos de union inyectando una alicuota del analogo de Cbl competidor y proteina a una velocidad de 20 ul/min durante 10 min a 30°C, y se regenero la superficie con pulsos de urea 8 M, SDS al 0,125% y tampon. Se realizo el ensayo competitivo para cada cobalamina por duplicado.
Analisis de datos. Se prepararon datos de biosensor para analisis restando las respuestas de union observadas a partir de la superficie de referencia y restando el promedio de tres inyecciones de blanco (Myszka, 1999). Se ajustaron los datos de los ensayos competitivos con analisis de regresion por minimos cuadrados no lineal suministrado con el software BIAevaluations 3.0. La figura 10 muestra el sensograma de ensayo competitivo. La figura 11 muestra la competencia de cobalamina por la union a TCII. Se muestran los datos de union en las figuras 12A-12C. Estos resultados demuestran que los analogos de cobalaminas los reconocen proteinas de transporte de cobalamina (transcobalamina, haptocorrina y factor intrinseco) con alta afinidad. Tambien se ha mostrado este reconocimiento mediante resonancia de plasmon superficial. La union de grandes moleculas a cobalamina no parece afectar a la union a proteinas.
EJEMPLO 11
Estudio de modelo animal
Captacion in vivo en ratones con tumores. Se implantan tumores en ratones mediante la implantacion de 1 x 106 celulas tumorales RD995 por via subcutanea en la pata trasera derecha de ratones hembra. Se propago in vitro la linea de celulas tumoral de raton. Seis semanas despues de la implantacion de las celulas, era visible un tumor de 10 mm. En este momento, se les administro a los ratones una inyeccion intravenosa retroorbitaria de 2,2 pg de cobalafluor Y disuelto en solucion salina esteril. A las 6 horas tras la inyeccion, se sedo el raton con la inhalacion de
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halotano. Se corto y abrio el tumor y se irradio con un laser de HeNe de 633 nm. Tambien se analizo un tumor en un raton a las 54 horas tras la inyeccion de cobalafluor Y usando el laser de HeNe. Se sometieron los ratones a diseccion de modo que pudieran analizarse los organos internos y el tejido sano. Se muestran los resultados en la figura 13, que demuestra que la cobalamina marcada de manera fluorescente se localiza en tejido tumoral en ratones.
EJEMPLO 12
Estudio de captacion tisular
Captation de cobalamina fluorescente. Se preparo medio esencial minimo, con modificacion alfa (a-MEM; suero de ternero recien nacido al 7,5%, suero bovino fetal al 2,5%, nistatina al 0,2%, penicilina/estreptomicina al 2,5%, pH 7,2; Sigma) y se tomaron alicuotas (10 ml) en frascos de cultivo tisular con tapon de rosca de 25 ml esteriles. Se llevaron los medios a 37°C, y se incubaron muestras de tejido (tejido de mama neoplasico, tejido de mama sano, tejido de ganglio linfatico neoplasico y tejido de ganglio linfatico sano) con cobalaminas marcadas de manera fluorescente (10 pM) cianocobalamina (1 nM) y en a-MEM durante 3 h. Se adquirieron muestras de tejido humano segun un protocolo aprobado por la IRB. Se retiro el tejido del frasco, se lavo con solucion salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS; Sigma), y se preparo sobre una placa de laton a -20°C con compuesto de OCT (Shandon) para los cortes de secciones congeladas. Se corto el tejido (secciones de 4-6 pm) en un criostato CTD Harris a -20°C. Se tiro hacia atras de las secciones de tejido delgadas con un pincel pequeno y se fijaron a un portaobjetos de microscopio con etanol al 100%. Se tineron los portaobjetos usando un procedimiento de tincion con hematoxilina convencional: etanol al 95%, 20 segundos; agua, 5 segundos; hematoxilina (Fisher), 45 segundos; agua, 5 segundos; disolucion de azulado (agua corriente), 10 segundos; etanol al 95%, 10 segundos; etanol al 100%, 10 segundos; xileno, 10 segundos; y xileno, 10 segundos. Se evaluaron los portaobjetos mediante microscopia de contraste de fase y de epifluorescencia a aumentos 10x, 60x y 100x. Se muestra la obtencion de imagenes de tumor en (a) tejido de mama neoplasico en la figura 14 y (b) tejido de ganglio linfatico neoplasico en la figura 15.
Ensayo de viabilidad celular y actividad metabolica tisular. Se uso tiazolilbromuro de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5- difeniltetrazolio (MTT; Sigma) para determinar cualitativamente la competencia metabolica del tejido despues de un tiempo de incubacion de 3 h con cobalamina fluorescente. Se retiro una porcion del tejido de los medios, se lavo con DPBS y se sumergio en MTT (2 ml; 2,5 mg/ml). Se incubo este tejido durante 3 h bajo una atmosfera con el 5% de CO2 a 37°C. Durante este periodo de incubacion, las celulas viables en la muestra de tejido redujeron el colorante MTT a formazano de color purpura mediante actividad succinato deshidrogenasa. Se lavo el tejido con DPBS y se preparo segun el procedimiento con criomicrotomo expuesto anteriormente para garantizar la competencia metabolica del tejido. Se encontro que in vitro tanto el tejido sano como el neoplasico captan cobalaminas fluorescentes.
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Claims (12)

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REIVINDICACIONES
Cobalamina que tiene la formula general
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en la que R1 es CN, OH, OH2, CH3 o 5’-desoxiadenosilo; R2, R3, R4, R5, R6 y R7 son CONH2; R8 es CH2O(C=O)XmY; R9 es OH o O(C=O)XmY; X es un grupo de union que tiene la formula NH-(CH2)n- NHO(C=O) o NH-(CH2)n-NH; Y es un fluoroforo, un fosforoforo, un cromoforo quimioluminiscente o un sustituyente productor de luz; m es 0 o 1, n es 0-50 y p es 2-10,
en la que dicha cobalamina produce fluorescencia, produce fosforescencia, produce luminiscencia o emite luz cuando se ilumina con luz ultravioleta, visible o infrarroja sin escision de Y de la cobalamina.
Cobalamina segun la reivindicacion 1, en la que R8 contiene el fluoroforo, fosforoforo, cromoforo quimioluminiscente o sustituyente productor de luz.
Cobalamina segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, para su uso en:
(a) la identificacion de tejido canceroso o tejido que contiene celulas cancerosas en tejido que se sospecha que es canceroso o que contiene celulas cancerosas en los que las celulas o el tejido cancerosos producen fluorescencia, producen fosforescencia o producen luminiscencia y el tejido sano presenta menos fluorescencia, fosforescencia o luminiscencia o
(b) identificar celulas o cancer metastasicos en los que las celulas o el tejido cancerosos metastasicos producen fluorescencia, producen fosforescencia o producen luminiscencia
(c) identificar enfermedad metastasica en el tratamiento, diagnostico, la deteccion o monitorizacion de cancer en un individuo en el que las celulas o el tejido cancerosos producen fluorescencia, producen fosforescencia o producen luminiscencia y el tejido sano presenta menos fluorescencia, fosforescencia o luminiscencia.
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Cobalamina segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, para su uso segun la reivindicacion 3, en la que dicho tejido que se sospecha que contiene celulas cancerosas para la identificacion de tejido canceroso es un ganglio linfatico.
Cobalamina segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, para su uso segun la reivindicacion 4, en la que dicho ganglio linfatico es un ganglio linfatico centinela o un ganglio linfatico axilar.
Cobalamina segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, para su uso segun la reivindicacion 3, en la que dicho cancer en la identificacion de cancer metastasico en (c) es cancer de mama, cancer de colon,
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cancer de ovario, cancer de pulmon, cancer de prostata, cancer de higado o melanoma.
Cobalamina segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, para su uso segun la reivindicacion 3, en la que dicho cancer en la identificacion de cancer metastasico en (c) es carcinoma que se ha diseminado a traves del sistema linfatico.
Cobalamina segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, para su uso segun la reivindicacion 3, en la que dicho cancer en la identificacion de cancer metastasico en (c) es linfoma o leucemia.
Cobalamina segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 -2, para su uso en:
(a) diferenciar visualmente tejido canceroso de tejido sano en los que el tejido canceroso produce fluorescencia, produce fosforescencia o produce luminiscencia y el tejido sano presenta menos fluorescencia, fosforescencia o luminiscencia o
(b) definir margenes tumorales in vivo o in situ en los que el tejido tumoral produce fluorescencia, produce fosforescencia o produce luminiscencia y define el margen del tumor.
Uso de cobalamina segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en la definicion de margenes tumorales ex vivo en los que el tejido tumoral produce fluorescencia, produce fosforescencia o produce luminiscencia y define el margen del tumor.
Cobalamina segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 -2, para su uso en el pronostico, la prediccion, el diagnostico, la deteccion o monitorizacion de cancer in vivo o in situ en los que las celulas o el tejido cancerosos producen fluorescencia, producen fosforescencia o producen luminiscencia y el tejido sano presenta menos fluorescencia, fosforescencia o luminiscencia.
Uso de cobalamina segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en el pronostico, la prediccion, el diagnostico, la deteccion o monitorizacion de cancer ex vivo, en los que las celulas o el tejido cancerosos producen fluorescencia, producen fosforescencia o producen luminiscencia y el tejido sano presenta menos fluorescencia, fosforescencia o luminiscencia.
Cobalamina segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 -2, para su uso en:
(a) predecir la respuesta de celulas cancerosas al tratamiento con una cobalamina segun la reivindicacion 1, en la que una mayor fluorescencia, fosforescencia o luminiscencia de las celulas cancerosas en comparacion con celulas no cancerosas es indicativa de que las celulas cancerosas responderan favorablemente a dicho tratamiento o
(b) determinar el estadio de progresion del cancer en el que la respuesta de las celulas cancerosas a la terapia basada en cobalamina es directamente proporcional a la fluorescencia, fosforescencia o luminiscencia de dichas celulas cancerosas en comparacion con celulas no cancerosas.
Cobalamina segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 -2, para su uso segun la reivindicacion 11, en la que dicho tratamiento en (a) es terapia quimioterapica con cobalamina.
Cobalamina segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 -2, para su uso segun la reivindicacion 11, en la que dicho tratamiento en (a) es terapia hormonal.
Metodo para someter a ensayo una cantidad de cobalamina en una muestra que comprende realizar un ensayo de union competitiva con dicha muestra usando una cobalamina segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-2 y determinar la cantidad de cobalamina presente en dicha muestra.
Metodo para someter a prueba la cantidad de capacidad de union a cobalamina no saturada de proteinas de union a cobalamina en una muestra que comprende realizar un ensayo de union competitiva con proteinas de union a cobalamina aisladas de dicha muestra usando una cobalamina fluorescente segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-2 y determinar la cantidad de capacidad de union a cobalamina no saturada en dicha muestra.
Metodo para someter a prueba la cantidad de cobalamina unida a proteinas de union a cobalamina en una muestra que comprende realizar un ensayo de union competitiva de cobalamina separada de proteinas de union a cobalamina aisladas de dicha muestra usando una cobalamina fluorescente segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-2 y determinar la cantidad de cobalamina unida a dichas proteinas en dicha muestra.
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