JP6019500B2 - 蛍光標識されたl−グルコース誘導体を用いたがん細胞を検出するための方法及び該誘導体を含むがん細胞のイメージング剤 - Google Patents
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Description
(1)がん細胞又はそのおそれがある細胞を検出するための方法であって、以下の工程、
a.標的細胞(生体の又は生体から分離した細胞又は組織中の細胞)に、蛍光分子団として7−ニトロベンズ−2−オキサ−1,3−ジアゾール基又はその誘導体を分子内に有するL−グルコース誘導体を含有する組成物を接触させる工程、及び
b.該標的細胞内に存在する該L−グルコース誘導体を検出する工程、
を含む検出方法。
(2)前記L−グルコース誘導体が、7−ニトロベンズ−2−オキサ−1,3−ジアゾール基又はその誘導体を、L−グルコース又はアミノ基及び/又はフッ素原子により水酸基が置換されたL−グルコースに結合したものである、前記(1)に記載の検出方法。
(3)前記L−グルコース誘導体が、7−ニトロベンズ−2−オキサ−1,3−ジアゾール基又はその誘導体を、L−グルコース又はアミノ基及び/又はフッ素原子により水酸基が置換されたL−グルコースの2位、4位又は6位に結合したものである、前記(2)に記載の検出方法。
(4)前記L−グルコース誘導体が、2−[N−(7−ニトロベンズ−2−オキサ−1,3−ジアゾール−4−イル)アミノ]−2−デオキシ−L−グルコースである前記(3)に記載の検出方法。
(6)前記工程aにおける組成物が、スルホローダミンを分子内に有するL−グルコース誘導体をさらに含み、かつ、前記工程bが、標的細胞中に存在する蛍光分子団である7−ニトロベンズ−2−オキサ−1,3−ジアゾール基又はその誘導体を分子内に有するL−グルコース誘導体を検出する工程である、前記(1)に記載の検出方法。
(7)前記組成物が、2−[N−(7−ニトロベンズ−2−オキサ−1,3−ジアゾール−4−イル)アミノ]−2−デオキシ−L−グルコース及び2位にスルホローダミン101又はスルホローダミンBをスルホンアミド結合せしめた2−アミノ−2−デオキシ−L−グルコースを含む、前記(6)に記載の検出方法。
(8)前記工程bにおける検出がイメージングされた細胞の蛍光色調の時間経過による変化を指標にして行う、前記(6)又は(7)に記載の検出方法。
c.前記蛍光色調の変化をもとに標的細胞ががん細胞又はそのおそれがある細胞であるか否かを判定する工程、
を含む、前記(5)〜(8)のいずれか一つに記載の検出方法。
(10)前記全ての工程を30分以内に行う前記(1)〜(9)のいずれか一つに記載の検出方法。
(11)前記L−グルコース誘導体が放射性標識されたL−グルコース誘導体であり、かつ標的細胞内に存在するL−グルコース誘導体を検出する工程が少なくともPETイメージングを含む、前記(1)〜(4)のいずれか一つに記載の検出方法。
(12)前記組成物が、蛍光発色団を分子内に有する蛍光標識されたD−グルコース誘導体をさらに含む、前記(1)〜(11)のいずれか一つに記載の検出方法。
(14)がん細胞又はそのおそれがある細胞を検出するための前記(13)に記載のイメージング剤。
(15)前記L−グルコース誘導体が、7−ニトロベンズ−2−オキサ−1,3−ジアゾール基又はその誘導体を、L−グルコース又はアミノ基及び/又はフッ素原子により水酸基が置換されたL−グルコースに結合したものである、前記(14)に記載のイメージング剤。
(16)前記L−グルコース誘導体が、7−ニトロベンズ−2−オキサ−1,3−ジアゾール基又はその誘導体を、L−グルコース又はアミノ基及び/又はフッ素原子により水酸基が置換されたL−グルコースの2位、4位又は6位に結合したものである、前記(15)に記載のイメージング剤。
(17)前記L−グルコース誘導体が2−[N−(7−ニトロベンズ−2−オキサ−1,3−ジアゾール−4−イル)アミノ]−2−デオキシ−L−グルコースである前記(16)に記載のイメージング剤。
(19)前記イメージング剤がさらに、2位にスルホローダミン101又はスルホローダミンBをスルホンアミド結合せしめた2−アミノ−2−デオキシ−L−グルコースを含む前記(18)に記載のイメージング剤。
(20)前記L−グルコース誘導体が、放射性標識されたL−グルコース誘導体である前記(13)〜(17)のいずれか一つに記載のイメージング剤。
(21)蛍光発色団を分子内に有する蛍光標識されたD−グルコース誘導体をさらに含む、前記(14)〜(20)のいずれか一つに記載のイメージング剤。
(22)前記(14)〜(20)のいずれか一つに記載のイメージング剤を含むがん細胞又はそのおそれがある細胞を検出するためのキット。
(23)前記(1)〜(12)のいずれか一つに記載の検出方法を用いてがん細胞又はそのおそれがある細胞を検出することによって、標的細胞が由来する組織ががんであるか、または前がん状態(すなわち放置すれば早晩がんになる可能性の高い状態、高度異形成と診断される状態)にあると診断する方法。
がん細胞ではないが食作用等により非特異的に本発明の蛍光標識されたL−グルコース誘導体を細胞内に取り込む可能性のある細胞、例えば、マクロファージやマイクログリアなどの細胞も生体内には存在する。それらの細胞は、がん細胞(又はそのおそれがある細胞)でもなくまた細胞膜に破綻をきたしていないにも関わらず、蛍光標識されたL−グルコース誘導体を取り込む可能性がある。それらの細胞は、形態による識別の他、2-TRLGを同時に投与した際に細胞内に取り込むことや、特異マーカー、たとえばCD14やCD11bを用いて、本発明の方法において擬陽性と判定した後に、それらの細胞の種類を確認することもできる。
の腫瘍細胞内へも取り込まれることは、実施例4によっても明らかである。一方で、2−TRLGは、細胞にいったん取り込まれると2−NBDLGよりも排出されにくい性質を有する。従って、例えば、緑色の蛍光を発する2−NBDLGと赤色の蛍光を発する2−TRLGを一定(5:1)の割合で混合した溶液を作成し、適切な(488nm)励起光で照射することにより両者の蛍光強度がおよそ1:1に近くなるように緑と赤の二つの検出器の検出感度を調整した上で、本溶液を細胞に取り込ませ、イメージングを行うと、両者を取り込んだ細胞は、2−NBDLGに由来する緑色の蛍光と2−TRLGに由来する赤色の蛍光を重ね合わせることで黄色の蛍光で可視化される。その後、2−NBDLGが排出されると、より排出されにくい2−TRLGが細胞内に残り、細胞は赤色の蛍光で可視化される。従って、時間の経過に伴う細胞の黄色から赤色の蛍光色調の変化が確認された場合、その細胞は、いったん2−NBDLGと2−TRLGを取り込んだ後に2−NBDLGを排出したことがわかる。なお、本発明者らの先の研究成果に関するWO2010/016587公報によれば、2−TRLGは以下に示す2種類の異性体(オルト体とパラ体)で存在する。
(1)蛍光標識L−グルコース誘導体の合成
(1−1)2−NBDLGの合成
2−NBDLGは以下のようにしてL−グルコースより合成した。
L-グルコース (20 g) をピリジン (262 ml) に溶解し、0℃に冷却した。無水酢酸 (171 ml) を滴下し、室温で終夜攪拌した。減圧濃縮後にトルエンで共沸する操作を3回繰り返した。残渣に酢酸エチルを加え、飽和重曹水と飽和食塩水で洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥した。硫酸ナトリウムを濾去し、減圧濃縮により有機溶媒を除いた。得られた残渣をアルゴン雰囲気下、脱水ジクロロメタン (115 ml) に溶解し、0℃に冷却した。30%臭化水素酢酸溶液 (61 ml) を滴下した。滴下終了後、室温に昇温し、3時間攪拌した。3時間後、減圧濃縮により有機溶媒を除いた。残渣にクロロホルム (800 ml) を加え、飽和重曹水と飽和食塩水で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥した。硫酸ナトリウムを濾去した。減圧濃縮により有機溶媒を除いた。得られたオイル状化合物に酢酸 (72 ml) と水 (72 ml) を加え、0℃に冷却した。亜鉛 (71 g) を少しずつ加え、ヘキサクロロ白金(IV)酸 (135 mg) を加えた。さらに酢酸 (72 ml) と水 (72 ml) を加えた。1.5時間後、クロロホルムを加え、セライト濾過した。濾液に飽和重曹水を加え、有機層を飽和重曹水と飽和食塩水で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥した。硫酸マグネシウムを濾去し、減圧濃縮により有機溶媒を除いた。シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。目的の画分を集め、減圧濃縮によりオイル状化合物を得た。
収量:21.0 g
収率:70% (3工程)
3,4,6-Tri-O-acetyl-L-glucal (20 g) と2,2,2-Trichloroethoxysulfonylamine (18.5 g) と酸化マグネシウム (6.8 g) に対してアルゴン雰囲気下、クロロベンゼン (73 ml) を加え、さらに酢酸ロジウム (650 mg) を加えた。-20℃に冷却し、ヨードソベンゼンジアセテート (30.8 g) を加えた。2時間かけて室温に戻し、終夜攪拌した。クロロホルムで希釈し、セライトで濾過した。濾液を減圧濃縮して得られた褐色オイル状化合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。目的の画分を集め、白色固体を得た。
収量:26.0 g
収率:63 %
1,3,4,6-Tetra-O-acetyl-2-deoxy-2-(2',2',2'-trichloroethoxysulfonylamino)-L-glucopyranose (22.9 g) をアルゴン雰囲気下、酢酸 (130 ml) と無水酢酸 (130 ml) に溶解した。室温で亜鉛銅カップル (40 g) を加え、2時間攪拌した。減圧濃縮し、得られた残渣にクロロホルムを加え、飽和重曹水と飽和食塩水で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、硫酸マグネシウムを濾去した。減圧濃縮により得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。目的の画分を集め、白色固体を得た。
収量:12.1 g
収率:76 %
1,3,4,6-Tetra-O-acetyl-2-acetamido-2-deoxy-L-glucopyranose (3.5 g) を6M-HCLに懸濁させ、70℃に加熱した。6時間後に減圧濃縮し、残渣に水を加えて共沸した。残渣を水から凍結乾燥を行い、白色固体を得た。
収量:1.95 g
収率:100 %
褐色フラスコにNBD-F (227 mg) を入れ、メタノール (10 ml) に溶解した。アルゴン雰囲気下、L-glucosamine hydrochoride (100 mg) と炭酸水素ナトリウム (65.7 mg) を水 (2.0 ml) に溶解したものを加え、37℃で攪拌した。2時間後に減圧濃縮により有機溶媒を除き、生じた沈殿 (NBD-F由来の不要物) を水で洗浄した。濾液と洗浄液を合わせてHPLCで精製した。目的の画分を集めて凍結乾燥した。
収量:125 mg
収率:79 %
1H-NMR (400 MHz、重水、ppm):
δ8.52 (d, 1H, J=9.1 Hz, H6'), δ6.56 and δ6.54 (d x 2, 0.5H x 2, J=9.1 Hz and J=9.1 Hz, H5'), δ5.38 (d, 0.5H, J=2.8 Hz, H-1α), δ4.89 (d, 0.5H, J=8.1 Hz, H-1β), δ3.50-δ4.02 (m, 6H, H-2, H-3, H-4, H-5, H-6, H-6).
ESI-MS:calcd for C12H15N4O8 [M+H]+ 343.1, found 343.1
2−DBDLGは、非特許文献5に記載の方法に従って以下のようにして合成した。
褐色フラスコにDBD-F (100 mg) を入れ、メタノール (2.00 ml) およびTHF (2.00 ml) の混合溶媒に溶解した。アルゴン雰囲気下、L-GlcNH2.HCl (49.8 mg) を0.3 M-NaHCO3水 (1.08 ml) に溶解したものを加え、さらに水 (1.00 ml) で洗い込んだ後に室温で攪拌した。48時間後に減圧濃縮により有機溶媒を除き、生じた沈殿 (DBD-F由来の不要物) を水で洗浄した。濾液と洗浄液を合わせてHPLCで精製した。目的の画分を集めて凍結乾燥した。
収量:35.8 mg
収率:38 %
1H-NMR (400 MHz、重水、ppm):
δ7.82 and δ7.84 (d x 2, 0.5H x 2, J=8.3 Hz and 8.3 Hz, H-6' of DBD), δ6.42 and δ6.46 (d x 2, 0.5H x 2, J=8.3 Hz and 8.3 Hz, H-5' of DBD), δ5.31 (br.d, 0.5H, J=2.7 Hz, H-1α), δ4.79 (br.d, 0.5H, J=8.3 Hz, H-1β), δ3.43-δ3.90 (m, 6H, H-2, H-3, H-4, H-5, H-6, H-6), δ2.65 (s, 6H, Me2NSO2-).
ESI-MS:calcd for C14H21N4O8S [M+H]+ 405.1, found 405.1
蛍光極大波長:570 nm
構造式を以下に示す。
L-glucosamine hydrochoride (1.65 g) を水 (25 ml) とアセトン (25 ml) に溶解した。Z-ONSu (2.1 g) 、アセトン (25 ml) 、トリエチルアミン (2.8 ml)を順次加えて室温で攪拌した。4時間後に減圧濃縮により有機溶媒および水を除いた。生じた沈殿 (目的物) を濾取し、水洗後に減圧下で乾燥することにより白色固体を得た。
収量:1.75 g
収率:73 %
2-benzyloxycarbonylamino-2-deoxy-L-glucopyranose (1.35 g) をアルゴン雰囲気下、ピリジン (80 ml) に溶解し、塩化トリチル(5.92 g) を加え70℃に加温して攪拌した。2時間後に放冷し、減圧濃縮により有機溶媒を除き、トルエン共沸した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、目的の画分を集め、減圧濃縮により白色固体を得た。
収量:2.2 g
収率:92 %
2-benzyloxycarbonylamino-2-deoxy-6-O-triphenylmethyl-L-glucopyranose (2.1 g) をアルゴン雰囲気下、ジメチルホルムアミド (36 ml) に溶解し、臭化ベンジル (713 μl) を加えて攪拌した。反応混合物を0℃に冷却し、水素化ナトリウム (60%含量 433 mg) を加えて攪拌した。1時間後に水素化ナトリウム (60%含量 43 mg) を追加した。2時間後に氷を加えた後に酢酸エチルで抽出し、飽和食塩水で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、硫酸ナトリウムを濾去した。減圧濃縮により得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。目的の画分を集め、減圧濃縮によりオイル状化合物を得た。
収量:2.0 g
収率:64 %
Benzyl 3,4-di-O-benzyl-2-benzyloxycarbonylamino-2-deoxy-6-O-triphenylmethyl-L-glucopyranoside (2.0 g) をメタノール (40 ml) とクロロホルム (4 ml) に溶解した。4.4 M-塩化水素-ジオキサン溶液(8 ml)を加えて攪拌した。2時間後に減圧濃縮により得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。目的の画分を集め減圧濃縮により白色固体を得た。
収量:650 mg
収率:46 %
Benzyl 3,4-di-O-benzyl-2-benzyloxycarbonylamino-2-deoxy-L-glucopyranoside (95 mg) をアルゴン雰囲気下、ジクロロメタン (1.6 ml) に溶解して攪拌し、-20℃に冷却した。三フッ化N,N-ジエチルアミノ硫黄 (107μl) を加えて攪拌し、室温に昇温した。2時間後にメタノールを加え、飽和重曹水と酢酸エチルで抽出した。有機層を合わせて飽和重曹水と飽和食塩水で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、硫酸ナトリウムを濾去した。減圧濃縮により得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。目的の画分を集め、減圧濃縮により白色固体を得た。
収量:63 mg
収率:66 %
Benzyl 3,4-di-O-benzyl-2-benzyloxycarbonylamino-2,6-dideoxy-6-fluoro-L-glucopyranoside (62 mg) をクロロホルム/メタノール/1M-HCl=3/6/1 (5 ml)に溶解し、攪拌した。パラジウム−黒 (40 mg) を加えて攪拌し、水素で置換した。8日後パラジウム−黒を濾去し、減圧濃縮によりオイル状化合物を得た。
収量:23.1 mg
収率:100 %
2-Amino-2,6-dideoxy-6-fluoro-L-glucopyranose hydrochloride (23.1 mg) をジメチルホルムアミド/水=10/1 (2 ml) に溶解し、攪拌した。NBD-F (23.2 mg) を加え、さらにトリエチルアミン (32.4μl) を加えて37℃に加温した。2時間後に酢酸を入れて中和し、水を入れてメンブランフィルターを通した。濾液と洗浄液を合わせてHPLCで精製した。目的の画分を集めて凍結乾燥し、赤色固体を得た。
収量:11.5 mg
収率:32 %
1H-NMR (400 MHz、重水、ppm):
δ8.43 (d, 1H, J=8.9 Hz, H6'), δ6.49 and δ6.45 (d x 2, 0.5H x 2, J=9.2 Hz and J=9.2 Hz, H5'), δ5.33 (d, 0.5H, J=2.3 Hz, H-1α), δ4.89 (d, 0.5H, J=7.8 Hz, H-1β), δ4.48-δ4.63 (m,1H, H-2), δ3.90-δ4.00 (m, 1H, H-3), δ3.52-δ3.71 (m, 3H, H-4, H-5, H-6).
ESI-MS:calcd for C12H14FN4O7 [M+H]+ 345.1, found 345.0
励起極大波長:472 nm
蛍光極大波長:538 nm
(1)蛍光標識D−グルコース誘導体の合成
(1−1)2−NBDGの合成
2−NBDGは非特許文献5に記載の方法に従って合成した。
本発明では蛍光基を結合する糖の骨格として、自然界に多量に存在する天然型の6炭糖であるD-グルコースの鏡像異性体であって、自然界にみられない非天然型であるL-グルコースを用いている。一方、同様に自然界に多量に存在する6炭糖であるD-マンノースの鏡像異性体であって、非天然型であるL-マンノースを骨格とする蛍光標識L-マンノース誘導体として、発明者らは、2-Deoxy-2-[N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl) amino]-L-mannose (2-NBDLM)を新規に合成した。
L-グルコース(6 g)をベンジルアルコール(173 ml)にサスペンドした。室温下、クロロトリメチルシラン(42.3 ml)を滴下し、60℃で攪拌した。5時間後、反応溶液にエーテル、水を加え抽出した。得られた水層をエーテルで洗浄し、水層を凍結乾燥した。得られた固体をジメチルホルムアミド(150 ml)に溶解した。アルゴン雰囲気下、p-トルエンスルホン酸一水和物(633 mg)、ベンズアルデヒド ジメチルアセタール(7.5 ml)を順次加えて70℃で攪拌した。3時間攪拌後、ベンズアルデヒド ジメチルアセタール(2.5 ml)を追加した。さらに6時間攪拌後、室温に戻して終夜攪拌した。終夜攪拌後、反応溶液に酢酸エチルと飽和重曹水を加え、抽出した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾去した後に減圧濃縮した。得られた固体をエタノールから再結晶した。
収量:2.50 g
収率:21% (2工程)
ピリジン(449 μl)をジクロロメタン(150 ml)に溶解した。アルゴン雰囲気下、-30℃でトリフルオロメタンスルホン酸無水物 (257 μl)を滴下した。10分後、Benzyl 4,6-O-benzylidene-α-L-glucopyranoside(500 mg)を加え、-30℃で攪拌した。2時間後、反応溶液にクロロホルム、飽和食塩水を加え、抽出した。得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾去後に減圧濃縮した。得られたオイル状化合物をジメチルホルムアミド(10 ml)に溶解し、アルゴン雰囲気下、アジ化ナトリウム(272 mg)を加えて50℃で攪拌した。3時間後、アジ化ナトリウム(635 mg)を追加し、室温攪拌した。さらに46時間後、アジ化ナトリウム(906 mg)を追加し、室温攪拌した。20時間後、反応溶液にエーテル、水を加えて抽出した。得られた有機層を水で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾去後に減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、目的物を得た。
収量:172 mg
収率:32%
Benzyl 2-azido-2-deoxy-4,6-O-benzylidene-α-L-mannopyranoside(172 mg)をメタノール(5 ml)、2M-HCl水(449 μl)に溶解した。アルゴン雰囲気下、10% Pd(OH)2/C(43 mg)を加え、水素を添加し、攪拌した。20時間後、10% Pd(OH)2/Cを濾去し、減圧濃縮した。得られたオイル状化合物を水で溶解後、エーテルで洗浄し、水層を減圧濃縮した。得られたオイル状化合物をジメチルホルムアミド(2 ml)、水(387 μl)に溶解した。室温下、NBD-F(82 mg)、トリエチルアミン(124 μl)を順に加えて攪拌した。1.5時間後、酢酸(80 μl)でクエンチし、HPLCで精製した。目的の画分を集めて凍結乾燥した。
収量:37 mg
収率:24%
1H-NMR (400 MHz、重水、ppm):
δ8.44 (d, 1H, J=9.1 Hz, H6'), δ6.55 and δ6.51 (d x 2, 0.5H x 2, J=9.1 Hz and J=9.1 Hz, H5'), δ5.24 and δ5.09 (0.5H x 2, H-1), δ3.35-δ4.14 (m, 6H, H-2, H-3, H-4, H-5, H-6, H-6).
ESI-MS:calcd for C12H15N4O8 [M+H]+ 343.1, found 343.0
励起極大波長:472 nm
蛍光極大波長:539 nm
(実験方法)
(1)移植用ラットグリオーマ細胞(C6)の調製
常法に従い細胞数が2 x 107 cells/mLになるようにC6細胞を調製した。
(1−1)C6細胞の培養
C6細胞は10 cmシャーレに蒔き、CO2インキュベーター中に静置し、37℃にて培養した。2日に1回培養液の交換を行った。
(1−2)C6細胞の培養に用いた培養液の組成
1 g/Lグルコース含有Dulbecco's modified Eagle's Medium(DMEM)(Nacalai No. 08456-65)に、Fetal Bovine Serum(Equitech-Bio SFBM)を終濃度10 %となるように、またペニシリン-ストレプトマイシン(Nacalai No. 26253-84)を終濃度1 %となるよう添加したものを用いた。
5〜6週齢の胸腺欠損ヌードマウス(BALB/cAJcl-nu/nu)にイソフルレン麻酔下において、2 x 107 cells/mLに調製した細胞懸濁液50 μLを右後肢付け根付近の皮下に移植した。移植した腫瘍細胞がおよそ200〜300 mm3程度に成長するまで観察し、生体蛍光イメージングの撮像に使用した。
C6腫瘍モデルマウスをイソフルレン麻酔下で、生体蛍光イメージング装置IVIS(登録商標) Kinetics(Caliper Life sciences)に静置しマウス皮膚の自家蛍光を測定し、その直後に、生理的食塩水に溶かした2-NBDLG又は2-NBDG 400 nmol(100 μL)を尾静脈から30秒かけて投与し、投与開始1分後から再び蛍光イメージングの測定を開始した。生体蛍光イメージングは、励起波長465 nm、GFPフィルター(透過蛍光波長515-575 nm)を用いて測定を行った。測定は45分間行い、最初の20分間は1分ごとに、20〜45分までは5分ごとに撮像を行い、総計25枚の画像を得た。2-NBDLG又は2-NBDGを投与した後に撮像した25枚の画像からそれぞれの自家蛍光の画像を引き算することによって、関心領域における2-NBDLGおよび2-NBDGの集積値(蛍光値)を求めた。
(3−1)2-NBDLGおよび2-NBDG溶液の調製
実験直前に、0.5 mg 2-NBDLG又は2-NBDGのバイアルを生理的食塩水400 μLに溶解することで、最終濃度 400 nmol/100 μLの溶液を調製した。
図1は、右後肢付け根部に腫瘍細胞(C6グリオーマ)を移植したヌードマウスに、 2-NBDLGを投与後、1分おきに取得した蛍光画像である。数字は投与後の時間を示す。2-NBDLGは、矢印で表した部分で400nmol/100 μLの濃度にて、尾静脈より30秒間かけて投与した。2-NBDG(図2)を投与した場合と比較して、2-NBDLGは腫瘍移植部に強い集積を認め、正常組織にはほとんど取り込まれていないため、短時間で優れたコントラストが得られる。ここでは、絶食させていないマウスを使用している。図2は、2-NBDLG投与と同一条件で、2-NBDGを投与後1分おきに取得した蛍光画像である。2-NBDG(黄色で表示)の強い集積が背中や背骨の間の脂肪組織、筋肉などに認められ、腫瘍移植部とのコントラストに難がある様子がわかる。
また、関心領域として設定した右後肢付け根付近の腫瘍細胞の移植部分(Tumor+Glc)と首の近くの背側の脂肪細胞が豊富な部分(BG+Glc)における2-NBDLGと2-NBDGのそれぞれの集積値の経時的変化を図3に示す。図2から明らかなように、2-NBDGを投与した場合、投与後ただちに首の近くの背側の脂肪細胞が豊富な部分などに集積が認められた。投与から5分後以降あたりからは腫瘍細胞を移植した部分への集積が認められたが、首の近くの背側の脂肪細胞が豊富な部分との間のコントラストは十分ではなかった。これに対し、2-NBDLGを投与した場合、図1から明らかなように、投与から5分後以降あたりからは腫瘍細胞を移植した部分への特異的な集積が認められ、首の近くの背側の脂肪細胞が豊富な部分との間で高いコントラストが得られた。この結果は図3に示す結果からも支持された。即ち、2-NBDG投与例では正常組織(赤色四角、BG)における蛍光値が腫瘍移植部(青色菱形、Tumor)より大きいのに対して、2-NBDLG投与例では腫瘍移植部 (青色菱形、Tumor)の方が正常組織(BG)より一貫して明るいことがわかる。全6例で同様の結果が得られた。以上の結果から、腫瘍細胞であるか否かの判定を行う際における2-NBDLGの有効性が明らかになった。
(実験方法)
(1)マウスインスリノーマ細胞(MIN6)の調製
MIN6細胞を10 x 104 cells/mLの割合で懸濁させた培養液を、ピペッティングにより分散し、ガラスカバースリップ上に滴下した後、5%CO2インキュベーター中で20分間静置することでガラス面に付着させ、培養液を 3 mL加えて培養した。培養液は2日に一回半量を交換した。
(1−1)MIN6細胞の培養
MIN6細胞(大阪大学の宮崎純一教授より供与を受けて6-9回継代した細胞)を10 cmシャーレに蒔き、CO2インキュベーター中に静置し、37℃にて培養した。培養液は2日に一回半量を交換した。
(1−2)MIN6細胞の培養に用いた培養液の組成
高グルコース含有Dulbecco's modified Eagle's Medium(DMEM-HG)(SIGMA #D5648) 13.4 g, NaHCO3(Wako, No.191-01305) 3.4 g, 2-Mercaptoethanol(Wako, No.135-14352) 5 μLを1 Lの超純水(Mili Q)に溶解し、外気と平衡化させた。次に1NのHClを用いて、37℃のCO2インキュベーター中でpH 7.3 - 7.35となるようpHを調整し、吸引ろ過により滅菌した。使用直前にHyclone Fetal Bovine Serum(Cat# SH30070.03)を終濃度10 %となるように、またペニシリン-ストレプトマイシン(Gibco #15140)を終濃度0.5 %となるよう添加した。
(1−3)MIN6細胞を10 x 104 cells/mLの割合で懸濁させた培養液
MIN6細胞を、細胞数が10 x 104 cells/mLになるよう培養液を用いて調整した。
0.5 mg 2-NBDLGバイアル一本全量を画像取得用HEPES溶液14.6 mLに溶解することで、終濃度 100 μMの2-NBDLG溶液とした。
(2−1)画像取得用HEPES溶液
NaCl 131.8 mM, KCl 4.75 mM, KH2PO4 1.19 mM MgCl2 1.2 mM, CaCl2 1 mM, NaHCO3 5.0 mM, 2.8 mM D-Glucose, HEPES 10 mM (1M NaOHにてpH 7.35に調整)。なおgap junction/hemichannelを経由する蛍光標識グルコースの出入りを阻害する目的で0.1 mM Carbenoxolone(SIGMA #C4790)を加えた。なお本画像取得用HEPES溶液は、2-NBDLG溶液を作成するための溶液として、また2-NBDLG/2-TRLG溶液を作成するための溶液として使用した。
MIN6細胞を付着させ10-13日間培養したガラスカバースリップを、35 mmディッシュに満たしたD−グルコース5.6 mMを含有するDAPI溶液中に移し、37℃で加温しながら45分から1時間静置して細胞にDAPIを取り込ませた。別実験で、共焦点顕微鏡上で継時的に観察しながらDAPIを投与する実験を行い、実験時間内にDAPI投与および405 nmのレーザー光照射による細胞の形態変化は認められないことを確認した。
(3−1)DAPI溶液の調製
4',6-Diamidino-2-phenylindole DAPI(No. 049-18801, Wako Pure Chemical Industries, Osaka)を100 mg/mL の割合でDMSOを10 %含有する水溶液に溶かしたものを冷蔵保存しておき、使用時はDAPI調整用として5.6 mMのD-Glucoseを含有するHEPES溶液にて100倍に希釈して用いた。
レーザースキャン共焦点顕微鏡(ライカ社TCS SP5)上のユニバーサルステージ(Leica 11600234)上にセットされた灌流チャンバー内の画像取得用HEPES溶液中に、MIN6細胞を培養したガラスカバースリップを移し、チャンバー底部のガラス面上に軽く密着させた。静置後、カバースリップの両側を左右からカバースリップの長軸に平行に2枚の長方形の金属ガイド(長さ10 mm、幅2 mm、厚み0.7 mm、銀製)を用いて押さえ、慎重に押し当てることで、流れの中でもカバースリップが動かないようにした。またこの2枚の金属ガイドに挟まれた空間内では、灌流液が層流となってスムーズに流れ、すみやかな液交換が可能となるという優れた効果がある。
(4−1)レーザースキャン共焦点顕微鏡ステージ上の蛍光測定用灌流チャンバー
底部に対物レンズ用の丸穴(直径18 mm)のあいたアルミ製加温制御プラットフォーム(PH1、Warner Instruments, USA、温度制御装置TC-324により37℃に加温, Warner Instruments)上に、シリコングリース(HIVAC-G, Shin-Etsu Silicone, Tokyo)を用いて、カバーガラス(幅24 mm x 長さ50 mm、厚さ No. 1, Warner Instruments No. CS-24/50)をプラットフォーム中央の丸穴以外の部分に密着させた。次いでカバーガラス上に、中央に流線型に穴開け加工(ガラス底面に接する側は幅10 mm x 長さ35 mm、曲率半径33 mm、ガラス面に接しない側すなわち上方がわずかに広くなるように加工した)を施した厚さ1 mmのシリコン板(幅20 mm x 長さ50 mm)を載せ、シリコングリースを用いずにカバーガラスと密着させた。
シリコン板上の流線型穴の上流隅に、先端をフラットにした太さ20ゲージのカテラン針をセットして、インレットとして用いた。
灌流液の排出用ステンレス管(アウトレット)は、非特許文献16に記載の方法に準じて先端部を平らにつぶした上で斜めにカットしたものを用い(加工が難しければ、Warner社のRC-24Nなどのプラスチック製灌流チャンバーに付属するステンレスアウトレットを直線に伸ばしたものを流用してもよい)、真空吸引時、空気と溶液の両者を同時に吸引することで安定させる方式とした。
(a)灌流液の加温と灌流チャンバーへの供給
灌流液供給システムは、コントロール溶液用の60 mL注射筒一本と、薬剤供給用の10 mL注射筒5本を備え、電磁バルブで随時切り替えて灌流することができる。本発明に関わる実験では、60 mL注射筒を用いて2.8 mMグルコース含有画像取得用HEPES溶液を、5系統ある10 mL注射筒のうち一本を用いて2-NBDLGと2-TRLGとの混合溶液を投与した。以下に述べるように、両者は灌流チャンバー内でバブルを生じないよう、あらかじめ加温された上、灌流チャンバーに導かれる前に一本のチューブに合同し、流量調節器で速度調節されてから、再度インラインヒーターにて加温し共焦点顕微鏡上の灌流チャンバーに供給された。
画像取得用HEPES溶液は、アルミ製シリンジヒーター(Model SW-61, 温度制御ユニットはNo. TC-324B, Warner Instruments)中で暖められた60 mL注射筒から、溶液供給ラインのチューブ内をフラッシュするための3方活栓に接続され、続いて細くガス透過性も低いソフトチューブ(Pharmedチューブ, AY242409, Saint-Gobain Performance Plastics, Ohio)を介して超小型電磁バルブ(EXAK-3, 3 way clean valve, Takasago Electric, Nagoya)のnormally open側に接続した。電磁バルブの開閉はパルス発生装置(Master 8, AMPI社, Israel)で制御した。画像取得用HEPES溶液についてはペリスタルティックポンプ(MCPポンプ12 rollers、Ismatec)を用いてメジウムビンから60 mL注射筒内に持続的に供給し、実験中に注射筒内の溶液上面の高さが変化しないよう、溶液落下速度と等しくなるようにポンプの溶液供給スピードを精密に調整した。ペリスタルティックポンプの溶液供給速度はデジタル表示されるため、もしも灌流チャンバーへの溶液供給速度に実験中に変化があれば溶液面の高さが変わることで直ちにわかる。このように本溶液は常時更新されるため、液温維持のためシリンジヒーターSW-61は38.5℃に設定した。
一方、2-NBDLGと2-TRLG混合溶液は、シリンジヒーター(Model SW-6, 温度制御ユニットはNo. TC-324, Warner Instruments)にセットされ37.5℃に加温された10 mL注射筒から供給した。本注射筒は三方活栓を介して、画像取得用HEPES溶液とは別個の電磁バルブのnormally closed側に接続されており、パルス発生装置の制御によりコントロール溶液と随時切り替えて供給できる。シリンジヒーターSW-6には6本の10 mL注射筒がセットでき、1本には蒸留水を入れて加温ブロックの温度モニター用プローブを挿入した。
コントロール溶液である画像取得用HEPES溶液と、2-NBDLGと2-TRLGの混合溶液とは、電磁バルブのアウトレットを出た後、6ポートの小型マニフォールド(MPP-6, Warner Instruments)により1本に集められた。MPP-6マニフォールドのアウトレットは短いPharmedチューブに接続し、このチューブをスクリューにより開度を増減できる流量調節器にはさみこみ、開度の調整により流量を1.2 ± 0.2 mL/分に調整した。本Pharmedチューブは、最短距離でインラインヒーター(Multi-Line In-Line Solution Heater SHM-8、温度制御ユニットはTC-324B、Warner Instruments)に接続した。これは灌流チャンバーに導入する溶液温度を、導入直前に加温するためである。SHM-8インラインヒーターの温度は灌流速度にあわせて、チャンバー中での灌流液の実測温度が、カバースリップの存在する領域で36-37℃になるように調整した。加温された溶液は短いタイゴンチューブ(R-3603, inner diameter 1/32 inch)を介して最短距離で灌流チャンバー上流に配置されたステンレスパイプ(インレット)に接続し、灌流チャンバー内に供給した。
注射筒からの溶液供給は静水圧を用いて供給圧力を決めるため、高さの違いが灌流速度の違いとなってチャンバー内の水面高の変化をもたらさないように、2-NBDLG溶液については投与時間が短いことから一回の実験では実験中に液供給は行わず、各実験が終了するごとに液の上面が蛍光グルコースを含有しないHEPES溶液とほぼ同じ高さになるように溶液を追加した。また注射筒に接続されたチューブの長さと太さの調整により、コントロール溶液である画像取得用HEPES溶液の灌流速度と同じ速度で排出されるように慎重に調整することで、液交換による液面の変動を避けることができる。また実験終了後および開始前にはチューブ内部を十分フラッシュしてスムーズな流れを確保した。
灌流チャンバー上からの灌流液の滑らかで速やかな除去は再現性の高い結果を得る上で最も重要なポイントである。灌流液の排出用のステンレス管(アウトレット)をタイゴンチューブで二つの大型ガラストラップに順次導き、真空ポンプ(DAP-15, ULVAC KIKO, Inc)で緩やかに吸引した。吸引圧は二つの大型ガラストラップの中間で吸引ラインから枝分かれさせたラインに設置した圧力計でモニターし、三方活栓の開閉度の制御により35kPaとなるように調整した。
灌流チャンバー内の層流の確保は、まず青色色素(Pontamine sky blue, 1 %以下の濃度に希釈して用いる)溶液をインレット付近に滴下して、流れの左右対称性、均一性と再現性を確保した。
チャンバー内灌流溶液中の各部の温度の確認は極細サーミスタープローブ(Physitemp社IT-23)を用いた(非特許文献16)。またアウトレット先端部には実験中にHEPES溶液由来の塩が付着することで吸引圧が変化するのを防ぐため、チャンバー上に設置されたオペレーション顕微鏡(POM-50II, KONAN MEDICAL, 西宮)で実験ごとに確認し、クリーニングを行った。本顕微鏡は、その他チャンバーへのカバースリップの設置時や、流れの状況、チャンバーの異常の確認などに有用である。
レーザースキャン共焦点顕微鏡(Leica製TCS-SP5システム、顕微鏡本体はDMI6000 CS trino電動倒立顕微鏡)をコンベンショナルモードで使用した。使用レーザーは、核染色に使用したDAPIは405 nmダイオードレーザーを用いて音響光学偏光素子(Acoustic Optical Tunable Filter, AOTF) 20 %で励起、2-NBDLGおよび2-TRLGは488 nmを用いてArgon laser main power30-60%、AOTF 20-60%で励起した。スキャンスピードは200Hzもしくは400Hzを用いた。
蛍光検出は、DAPIによる青色蛍光の検出用にphotomultiplier検出器(PMT)1を415-500 nmの波長検出範囲(検出感度750 V)で、2-NBDLGによる緑色蛍光の検出用にPMT2(緑チャネルと名付けた、以下同じ)を500-580 nmの波長検出範囲で使用した(検出感度670 V)。以上の青(415-478 nm)、緑(500-580 nm)の蛍光検出波長領域の選別は通常用いられるEmissionフィルター方式によらず、プリズム分光とスリットを組み合わせた方式(Leica,TCS-SP5の標準)により取得した。ビームスプリッターは500 nm(RSP500)を使用した。405 nm用のビームスプリッターはSP5システムでは上記と独立に415 nmの固定式となる。この実験では、蛍光励起に際し、最初に488 nm励起を使用して2-NBDLG投与プロトコルの時間経過に従った画像取得をおこなった後、改めて405 nm励起によりz軸方向の深さで異なる核の様態をxyzモードで取得した。
立体的な腫瘍細胞塊の構造的特徴を捉えるために用いた微分干渉(DIC)画像の取得は、488 nm励起時に透過光用検出器PMT Transを同時に使用して検出(典型的な検出感度は145-200 V)したものを用いた。微分干渉方式(DIC)の画像取得に必要なポラライザーやアナライザーを光路に入れる為の切り替え時間や切り替えショックの問題を回避するため、405 nm励起による画像取得時にもDIC用ポラライザーとアナライザーは光路に入れたままとした。
本法では、xy軸への高い解像力と細胞塊の全体を視野内に含む画角を求めて対物レンズは高解像力のx40oilレンズ(HCX PL APO CS 40.0x1.25 OIL UV, NA1.25)を絞り開放で使用した。取得蛍光強度を稼ぐためPinholeサイズは3 airy unitとした。このpinhole sizeでもz軸方向に細胞内の核と細胞質を実用的に区別し得ることが取得画像で確認された。ズームは使用せず(1倍)、1024x1024の画素数で、ノイズを減らすため二回のスキャニングを行い、その平均画像(Line average)を12 bitの深さで画像取得した。
なお以上の溶液の投与およびすべての画像取得は24時間一定室温(24℃)に保持された暗室内で行った。
図4に、蛍光標識L-グルコース誘導体2-NBDLGのインスリン産生腫瘍細胞 (MIN6)への投与の結果を示す。2-NBDLGは多数の細胞が立体的に集積し、異常核を呈する細胞塊に取り込まれる。Aは、2-NBDLG投与前の蛍光像 (Excitation 488nm, Emission 500-580 nm)である。細胞の存在はかすかな自家蛍光により確認される。Bは、100 μMの2-NBDLG含有HEPES溶液で3分間細胞を灌流し、続いて2-NBDLGを含まないHEPES溶液による洗い流しが終了した直後の蛍光像である。画面上の細胞塊(a)で、2-NBDLGの強い取り込みを認める。Cは、微分干渉顕微鏡(DIC)像と、蛍光像Bの重ね合わせである。細胞塊aの下に点在する二つの細胞は、DIC像から状態悪化が確認される。Dは、DAPIを用いた核染色像である。DIC像ではよく似て見える細胞塊aとbのうち、細胞塊 b の細胞は正常な核様態を示すのに対し、細胞塊aには強く光り異常な核様態を示す細胞が存在する。2-NBDLGの顕著な取り込みはaのみで認められる。A-Dは、共焦点顕微鏡像である。以下に更に詳しく記す。
細胞塊aと細胞塊bは共に11日間培養したマウスインスリノーマ細胞(MIN6)の多数の細胞の集合体である。これらの細胞に供給していた灌流液を、2.8 mMのグルコースを含有する画像取得用HEPES溶液から電磁バルブの操作により同じ溶液に2-NBDLG(100 μM)を含有させた溶液に切り替え、3分間細胞外から投与した後、画像取得用HEPES溶液に戻し、2-NBDLG溶液を洗い流した。2-NBDLGが細胞内に取り込まれた場合は、投与前後の蛍光強度の差に反映される。画像Aと画像Bは、2-NBDLGの発する緑色の蛍光を捉えた緑チャネル画像(検出波長領域500-580 nm)である。画像A(投与直前の蛍光像)では、細胞はフラビンタンパクなどに由来する自家蛍光を有する為、うっすらと緑色に光っている。その強弱は細胞により異なり、細胞塊cでは自家蛍光がやや強く、状態があまりよくないことがうかがわれる。画像B(投与直後の蛍光像)では、細胞塊aには、2-NBDLGを非常に強く取り込む細胞が認められる。蛍光グルコース誘導体は通常核内には侵入しないため、これらの細胞の核はきれいに抜けている。一方、細胞塊bに見られるように、全く同一種類の腫瘍細胞であり、かつ3次元的集積を開始している細胞塊であっても、2-NBDLGの取り込みがわずかしか認められない。細胞塊cについては、投与前から自家蛍光がやや強かったが、投与後もほとんど蛍光強度の増加は認められない。画像Cは、投与直後の緑チャネル画像に微分干渉(DIC)画像を重ね合わせたものである。細胞塊aと細胞塊bでは、2-NBDLGの取り込みの様子が大きく異なることがわかる。画像Dは、実験終了後、細胞に4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride(DAPI)を投与して、核染色を行った像である。画像Bと画像Dとを見比べると、中心部に異常核が出現しておらずに正常細胞と同様の核様態を示している細胞塊(細胞塊b)や、2次元的・平面的な集積段階にある細胞塊(細胞塊c)には、2-NBDLGの取り込みがほとんどみられないことがわかる。一方、中心部に異常核を生じる段階まで発達した細胞塊aの細胞には、2-NBDLGを強く取り込むものが出現していることがわかる。ここで、画像Dにおける共焦点顕微鏡の焦点深度は、異常核へのDAPIの取り込みが最も大きい焦点深度にあわせて写真撮影しているため、画像A-Cで見ている焦点深度とは異なる断面の断層写真となっている。すなわち、腫瘍細胞塊の中で、異常核の出現している層と、2-NBDLGの取り込みが大きい層とは同一でないことがxyzスキャンにより示唆された。このことは次の実施例4において、一層明瞭となる。なお、画像A,B,Dにおける細胞塊cは、共焦点顕微鏡の焦点深度外となっているが、細胞塊cについての上記の記述は別途の焦点深度において確認している。
(実験方法)
(1)マウスインスリノーマ細胞(MIN6)の調製
実施例3と同様にして行った。
2-NBDLG + 2-TRLG混合溶液の作製
0.1 mg 2-TRLGバイアルをデシケーター内に移して室温に戻した。2-TRLGは水に難溶性のため、暗所にてこの2-TRLGバイアル全量を65 μLの開封直後のdimethyl sulfoxide(DMSO, Nacalai Tesque No.13408-64)を用いて溶解した。2-NBDLG溶液は実施例3に述べたのと同様の方法で、実験直前に終濃度100 μMとなるように作製し、これに上記2-TRLG/DMSO溶液を非特許文献16に準じた方法で加えることで、2-TRLG濃度が20 μMとなるようにした。具体的には、あらかじめ上記2-NBDLG溶液を6.5 mLとり、激しく攪拌しておく。次いで40 μL DMSOを、チップ壁への付着が無視しうるRAININ製チップ(Mettler Toledo)を用いて2-TRLGバイアル瓶に加え、バイアルごとミキサーで攪拌して溶解させる。スピンダウンにより壁に付着した2-TRLGを底部に集め、同チップを使ってピペットマンで全量とり、攪拌中の2-NBDLG溶液に溶解した。2-TRLGバイアル瓶中にわずかに残った2-TRLGは、上記と同様の方法で25 μL DMSOを用いて回収し、2-NBDLG溶液に更に溶解した。以上の方法により、再現性良く、終濃度100 μM 2-NBDLG + 20 μM 2-TRLG混合溶液を作製することができた。
(a)100 μM 2-NBDLG + 20 μM 2-TRLG混合溶液の投与
100 μM 2-NBDLG + 20 μM 2-TRLG混合溶液を、腫瘍細胞塊全体を完全に覆うように3分間投与した。投与液が細胞塊全体にかかっていることは投与中の緑、赤の各波長領域の蛍光像、および透過光像の取得により毎回かならず確認した。蛍光グルコース混合溶液の供給をストップすると同時に蛍光グルコース不含HEPES溶液に切り替えると、1分後には背景の蛍光は無視できる程度となった。
(b)画像取得条件の詳細
画像取得は実施例3に準じた方法で、実験開始後直ちに混合溶液投与前の画像取得を開始し、以降2分おきに実験終了まで青、緑、赤の各波長領域の蛍光像、および透過光像を取得した。使用レーザーは、核染色に使用したDAPIは405 nmダイオードレーザーを用いて(AOTF 20%)で励起、2-NBDLGおよび2-TRLGは488 nmアルゴンレーザーを用いて(出力50 %、AOTF 28%)で励起した。スキャンスピードは400 Hzを用いた。
蛍光検出には、三つの蛍光検出器を以下のように用いた。DAPIによる青色蛍光の検出用にphotomultiplier検出器(PMT)1を415-500 nmの波長検出範囲(検出感度750 V)で、2-NBDLGによる緑色蛍光の検出用にPMT2を500-580 nmの波長検出範囲(検出感度670 V)で、更に赤色蛍光の検出用にPMT3を580-740 nmの波長検出範囲で使用した(検出感度670 V)。ここで2-TRLGの蛍光は大部分が580 nm以上に存在し、580 nm以下にはほとんど蛍光成分を有していないことから、PMT2の500-580 nmの蛍光強度にはほとんど影響を与えない。このため2-TRLGの細胞内における検出量が増加する場合には、その効果は主にPMT3の580-740 nmにおける蛍光強度の増加として現れる。これに対して2-NBDLGは、蛍光強度のピークは540-550 nm付近にあるが、580-740 nm領域にも蛍光を有している。このため2-NBDLGの細胞内における検出量が増加する場合には、PMT2で検出される500-580 nmにおける蛍光強度の増加に加えて、PMT3で検出される580-740 nmにおける蛍光強度も増加する。その際、例えば専ら2-NBDLGの細胞内における検出量のみが増加して2-TRLGは細胞内に侵入していない場合、PMT2で検出される500-580 nmの蛍光波長領域における2-NBDLGの蛍光強度に対するPMT3で検出される580-740 nmの蛍光波長領域における2-NBDLGの蛍光強度の比は、2-NBDLGの濃度、検出器等の感度特性、ならびに励起光強度に依存して一定の関係となる。一方、細胞内に2-NBDLGが取り込まれた際に、これに加えてもし2-TRLGも細胞内に侵入した場合には、PMT3で検出される580-740 nmの蛍光波長領域における2-NBDLGの蛍光強度について上記関係から予測される投与前に比較した蛍光強度の増加に加えて、更なる蛍光強度の増加として検出される。その蛍光強度増加の上限は、投与した100 μM 2-NBDLG + 20 μM 2-TRLG混合溶液の500-580 nmにおける蛍光強度と580-740 nmにおける蛍光強度の比から知ることができ、下限は細胞内に2-NBDLGのみが取り込まれた場合における500-580 nmにおける蛍光強度と580-740 nmにおける蛍光強度の比であり、実際にはこの下限と上限の間で細胞内への2-TRLGの侵入の程度に応じて変化する。実際のプロトコルにおいては、PMT3の580-740 nmにおける蛍光取得の装置設定(すなわち励起光強度および検出器感度)を、専ら2-NBDLGのみが細胞内に取り込まれて2-TRLGが細胞内に侵入しない場合にはほとんど蛍光強度の増加として検出できない程度に調整しておく。これにより、2-TRLGがわずかでも細胞内に侵入した場合には直ちにその侵入を検出することが出来る。
実際の画像取得にあたっては、立体的な腫瘍細胞塊のそれぞれの深さにおける細胞の蛍光変化を、時間経過を追って捉える目的で、以上のxyスキャンを、共焦点顕微鏡のガルバノステージをz軸方向に一定距離動かしては繰り返すxyzスキャン動作を蛍光標識グルコース誘導体投与開始前3分前からスタートし、投与プロトコル終了まで2分ごとに繰り返すxyztスキャンを実施した。その際、レーザーの繰り返し照射による蛍光退色を最小限としつつ細胞塊中の深さの違いによる細胞応答の違いを知るため、z軸方向のステージ移動距離は8-10 μmおきとした。具体的に図6の例では、ほぼガラス面の直上にあたるZ位置からスタートしてz軸方向に8-10 μmずつずらして異なる深さで一枚ずつ、合計2枚もしくは3枚のxyスキャニングを行い、この操作を2分、もしくは4分に一度ずつ繰り返した。本法ではx40倍oil対物レンズを使用し、かつ速やかな液交換とサンプル交換を可能にする灌流チャンバーを用い、倒立顕微鏡ステージ上のガラス面上に細胞を付着させたカバースリップを密着させた上で下側からサンプルを観察する方式を取っている。このためworking distanceの短い高解像度対物レンズがガラス面に接触することによる限界から、厚みのある腫瘍塊のz軸方向の上部構造にピントを合わせることには限界がある。上記のz軸方向のステージ移動距離はこの点についても考慮して決定している。腫瘍塊の全体の構造は、投与プロトコル開始前もしくは別実験にてレンズを低倍率レンズに変更することで確認することが可能である。
100 μM 2-NBDLG + 20 μM 2-TRLG混合液を、発達したインスリン産生腫瘍細胞塊(MIN6)に3分間投与し、レーザー共焦点顕微鏡で観察した結果を図5-9に示す。
(図5〜図7) それぞれ100 μM 2-NBDLG + 20 μM 2-TRLG混合液投与前、投与後2分経過した時点、投与後4分経過した時点での蛍光画像およびDIC画像を示す。画像A(DAPIによる核染色像)では、左右の腫瘍塊のそれぞれ中央部にDAPIの異常蓄積を示す細胞核の存在を認める。画像Bは、2-NBDLGの細胞内への取り込みを反映する緑チャネル画像(500-580 nm)である。共焦点顕微鏡により撮影された腫瘍塊内部の一断面の蛍光像が表示されている。以下に詳細に記す。
図8は、100 μM 2-NBDLG + 20 μM 2-TRLG混合液を投与終了から2分経過した時点での緑と赤チャネルの蛍光像を抜き出してDIC像と重ね合わせたものである。細胞塊中心部は、2-NBDLGと2-TRLGの両者をよく取り込み黄色を呈する。そのすぐ外側には両者とも取り込まない暗い細胞が存在する。更にその外側を様々な程度に2-NBDLGを取り込む細胞が取り囲む。赤色のみ呈する細胞は2-NBDLGと2-TRLGを取り込み、前者を洗い流しにより速やかに排出した細胞である。細胞塊周辺の焦点深度が異なる細胞は、蛍光像では共焦点効果により本図の焦点深度では画像化されていない。このように、図6で見た緑色の蛍光を発する2-NBDLGを様々な程度に取り込む細胞が存在することが可視化されることに加えて、2-TRLGをも取り込んで黄色となっている細胞が認められる。これらの黄色を呈する細胞のほとんど全ては、図9に示した投与終了から4分経過した時点を見るとわかるように、赤色系統の色に蛍光色調が変化している。
その説明として、単一神経細胞を用いた別の実験から、次のようなことが考えられる。2-TRLGが2-NBDLGと共に細胞状態が完全に死んではいないが中程度に悪化したことのわかっている神経細胞内に取り込まれた場合、2-TRLGの取り込みの時間経過は2-NBDLGの取り込みの時間経過より遅く、つまりゆっくりと入っていき、逆にいったん細胞内に入った2-TRLGは、仮にその量が2-NBDLGより少なかった場合でも、洗い流しを開始してから細胞外に流出するのに、2-NBDLGよりも長時間を要した。従って、2-TRLGを2-NBDLGの両者を細胞内に取り込んで黄色となった腫瘍細胞は、洗い流しを開始してからは緑色の2-NBDLGが先に排出され、赤色の2-TRLGが細胞内に残ったものである。実際、図8では、既に様々な程度に赤色の2-TRLGを取り込んだ細胞が認められるが、これらの細胞の色を2-NBDLG + 2-TRLG混合溶液投与中、あるいは投与終了してから最初の画像取得の2回のアベレージングスキャンが終了する前に調べると、そのほとんどが黄色に見える。
投与終了から2分経過した時点の図8において白矢印で示した細胞は、未だ強い黄色を呈しており、周辺の細胞とは異なり2-NBDLGに加えて赤色の2-TRLGを取り込んだことがわかるが、投与終了から4分経過した時点の図9で同じく白矢印で示した細胞の色に明らかなように、この2分の間に緑色の2-NBDLGが細胞外にすみやかに流出し、2-TRLGが多く細胞内に残った結果、赤色を呈している。つまり2-TRLGは、過去に2-NBDLGが大量に入ったことをメモリーのようにしばらくの間知らせてくれる役割を果たすことができる。もしも2-TRLGを2-NBDLGと同時に使用しなければ、図7において白矢印で示された細胞が、同じように淡い緑色を呈する周辺の細胞と違う取り込みパターンを示す細胞であることはわからない。この細胞は、同時投与した2-TRLGの取り込みの様子とあわせてみることで、初めて周りの細胞と明瞭に異なる細胞状態にあることがわかるのである。
実験室以外の実際の種々の条件下で蛍光標識グルコースを腫瘍細胞に接触させてその取り込みの様子を調べる際には、厳密な時間経過を追って調べることは困難な場合も多いと考えられることから、赤色の2-TRLGを緑色の2-NBDLGと同時に用いることは多様性を示す腫瘍細胞の細胞状態の識別においてメリットとなる。
一方、図8と図9では、L-グルコースを母核とする蛍光標識グルコース誘導体、すなわち赤色の2-TRLGも緑色の2-NBDLGも、ほとんど取り込まない暗い細胞が、細胞塊中心部のすぐ外側の部分を取り囲むように存在している様子が明瞭にわかる(微分干渉コントラスト(DIC)画像を重ねていない図6Bおよび図7Bでは黒く見える部分となる)。DIC画像からわかるように、この部分には細胞が存在していないわけではない。すなわちこれらの細胞は、正常細胞と同様に細胞膜がグルコース取り込みについて立体選択性を保った状態にある。このような正常細胞に匹敵する細胞膜の状態を維持している腫瘍細胞の存在を可視化できることは、抗がん剤や治療の効果を調べる際に役立つものと期待される。このように本発明は、L-グルコースを母核とする蛍光標識グルコース誘導体を、発達した腫瘍塊を含む細胞群に投与し、その個々の細胞内への取り込みの程度に応じて積極的に個々の腫瘍細胞の細胞状態の違いを評価できることに加えて、細胞内にL-グルコースを母核とする蛍光標識グルコース誘導体を取り込まないことをもってそのような細胞を浮き彫りにし、薬剤や放射線治療の効果判定などのためのマーカーとして広い応用の可能性を有するものと期待される。
2-NBDLG(200 μM)および2-NBDG(200 μM)をマウスインスリノーマ細胞(MIN6)にそれぞれ5分間取り込ませた際の各種阻害剤の有無による違いを、蛍光マイクロプレートリーダーFlex Station (Molecular Device Japan(株))を用いて定量的に解析した。
(1)細胞の調製
測定に用いたウェルは、縦A-Hの8行、横1-12の12列のウェルを有する96穴クリア底ウェルプレートμCLEAR-PLATE (Greiner bio-one, BLACK, 96 well, #655090)で、この3列目と5列目のB行からG行のウェルに、MIN6細胞を6 x 105 cells/mLの割合で調製した細胞溶液をおのおの15μLづつ均一に蒔いた。培地交換は、0-4 DIV(days in vitro)では2日に1回半量交換、5 DIV以降は毎日交換し、培養10-13日目(10-13 DIV)で実験に供した。A行およびH行は、細胞を蒔かず、洗い流しが正確に行われたか否かをチェックするためのコントロールとして用いた。また、4列目には細胞はなく、クレブスーリンガーバッファ溶液(KRB, ギャップ結合阻害剤carbenoxolone 0.1 mM、グルコース5.6 mMを含む)のみのブランクとして使用した。
8連のPCRチューブのそれぞれに、2-NBDLGまたは2-NBDGを入れ、8連ピペットを用いて吸い、ウェルに同時に滴下する方法で評価した。これにより、2-NBDLGを投与するウェルと、2-NBDGを投与するウェルとに、同時に投与することが可能となり、信頼性よく評価できる。上記したように3列目と5列目の二つの列において細胞のあるウェルは12個で、これらのうち2-NBDLGと2-NBDGの違いと阻害剤の有る無しの違いで各3ウェルづつ4群に割り振った。具体的に、2-NBDLG(200 μM)および2-NBDG(200 μM)の取り込みに対するGLUT阻害剤サイトカラシンB(10 μM)の有無による影響を見る場合、まずサイトカラシンB存在下で計測する予定のウェルには、蛍光標識されたグルコース誘導体投与の5分前からあらかじめサイトカラシンBを前投与した。また、蛍光標識されたグルコース誘導体投与前に、各ウェルの自家蛍光を計測した。Flex Stationの測定条件は、Well Scan Mode、Bottom Readで、Ex 470 nm, Em 540 nm, Cut off 495 nm, Averaging 3 、Photomultiplier感度 highにておこなった。蛍光マイクロプレートリーダーFlex StationのWell Scan Modeでは、一つのウェル中を9つの観察領域(エリア)に分割して、それぞれ独立に計測する。9分割されたそれぞれのエリアには、およそ5000個の細胞が存在することをリアルタイムデコンボリューション顕微鏡のZ section計測により別途確認した。
2-NBDGおよび2-NBDLG、サイトカラシンB有り無しの投与を行い(37℃、5分間)、投与終了後は、蛍光標識グルコースを含まないKRB溶液250 μLを、ウェル中の50 μLの溶液に加える操作をストップウォッチで測りながら7回繰り返すことにより、対照群として設定したA行およびH行のウェルの示す蛍光強度が、細胞のないブランクのウェルの蛍光強度と等しくなるまで洗い流しをおこなった。この過程は7分を要し、細胞膜状態の破綻を来たした細胞が2-NBDGおよび2-NBDLGに接触後、これらの化合物をいったん細胞内に取り込んだとしても、計測時点では既に細胞外に流出し洗い流されているために、観察エリア全体の蛍光強度の増加に対する寄与は無視しうる程度と判断された。このことは別途薬理学的阻害実験で、阻害剤存在下に蛍光強度の増加がほぼ消失することにより裏付けられた。上記の方法は、他の阻害剤の場合にも同様に実施した。Na+-freeのKRB液はNa+をcholineで置換して浸透圧の変化のないことを確認した。
図10に、マウスインスリノーマ(MIN6)細胞内への2-NBDGおよび2-NBDLGの取り込みに対する阻害剤の影響を蛍光プレートリーダーにより定量的に評価した結果を示す。
A, 2-NBDGの取り込みはGLUT阻害剤Cytochalasin B (10 mM, CB)添加により有意な減少を示し、グルコーストランスポーターGLUTを介した取り込みの存在がわかる。一方、2-NBDLGの取り込みはCytochalasin Bにより有意な低下を示さず(N.S.)、GLUTを介さない取り込みであることが示唆される。*は、2-NBDG投与による蛍光強度の増加に対して、有意に低いことを示す(p< 0.0001, ANOVA, Bonferroni/Dunn)。
B, 2-NBDGならびに2-NBDLGが、Na+イオンとグルコースを共輸送するグルコーストランスポーターであるSGLTを介するか否かを調べたものである。蛍光グルコースを、Na+イオンを含むバッファーに溶かして投与した場合と、Na+イオンを含まないバッファー(Na(-))に溶かして投与した場合とで、2-NBDGと2-NBDLGの両者ともに細胞内取り込みには有意な差が認められなかった。SGLTはNa+イオン非存在下では機能しないため、MIN6細胞のNBDLG取り込みにSGLTはほとんど寄与していないことが示唆される。
C, 2-NBDGと2-NBDLGの両者とも、GLUTおよび水チャネルの共通阻害剤である Phloretin (150 μM, PHT)によりMIN6細胞への取り込みが阻害された。2-NBDLGの細胞内取り込みは、PHTで阻害される選択的経路を介することが示唆される。
なお、別の実験によりPHTによる2-TRLGの細胞内への取り込み阻害を確認したが、阻害されなかった。
(実験方法)
(A)以下の組成の溶液と材料を用いた。
(共焦点画像取得用HEPES溶液の組成)
NaCl 150 mM, KCl 5 mM, MgCl2 1 mM, CaCl2 2 mM, HEPES 10 mM, 1M Tris(2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol)溶液にてpH7.4に調整。Glucose 濃度は10 mMとした。なおgap junction/hemichannelを経由する蛍光標識マンノースの出入りを阻害する目的で0.1 mM Carbenoxolone(SIGMA #C4790)を加えた。
(単離用リンガー液の組成)
NaCl 124 mM, NaHCO3 26 mM, KCl 5 mM, KH2PO4 1.24 mM, CaCl2 2.4 mM, MgSO4・7H2O 1.3 mM, Glucose 10 mM, 95%O2-5%CO2通気によりpH7.4に保持した。
(カバースリップのpoly-L-lysineコート(神経細胞用))
5 mgのpoly-L-lysine hydrobromide(SIGMA P6282)を50 mLの0.15 Mホウ酸(NaOHにてpH 8.4に調整)に溶解したものをストックし、冷蔵保存する。本ストック溶液を0.15 Mホウ酸 で1/500〜1/1000に希釈したものにカバースリップ(13 mm x 22 mm松浪No.0ガラス)を沈め、室温にて20分放置した後、蒸留水ですすぎ、自然乾燥させた。
(B)2-NBDLM溶液ならびに2-NBDLM + 2-TRLG混合溶液の調製
2-NBDLMは2-NBDLGの立体異性体であり、両者の分子量は同一であるため、本発明者らによる先のWO2010/016587公報に詳述した2-NBDLG液ならびに2-NBDLG + 2-TRLG混合溶液の調製と基本的に同様の方法で調製した。投与溶液の濃度は、0.5 mgのバイアルの全量を、画像取得用HEPES溶液14.6 mLに溶解することで、終濃度100 μMの2-NBDLM溶液とした。溶解法は実施例3における2-NBDLG溶液の調製と同様に実施した。2-TRLGは水に難溶性のため、1 mgの2-TRLGをdimethyl sulfoxide (DMSO)液に溶解してまず2 mM 2-TRLG溶液とした後、この2 mM溶液を、あらかじめ100 μMの2-NBDGを含有するよう調製した下記組成の画像取得用HEPES溶液で100倍に希釈し、100 μM 2-NBDLM + 20 μM 2-TRLG混合溶液を得た。
本発明者らによる先のWO2010/016587公報に記したのと同様の方法で、以下のように実施した。
(1)マウス脳スライスの作製
生後13-17日令(幼若期)のC57BL/6Jマウスにウレタン深麻酔(i.p. 1.6g/kg)を施行し、常法に従い断頭後、単離用の冷リンガー液(0℃)をかけながら脳を取り出し、氷冷したシャーレ上に載せて直ちにトリミングを行った後、リニアスライサー(堂阪Pro7)にて冷リンガー液(0℃)中で厚さ400もしくは500μmの冠状断脳スライスを作製した。次いで95%O2-5%CO2を通気した上記リンガー液が循環するチャンバー(ハーバード社製アクリルインキュベーションチャンバー)中にて室温で1時間回復させた。
(2)脳スライスの酵素処理
蛋白分解酵素Pronase(10mg/60mL)を上記リンガー液に溶解して作製した酵素液(31℃;95%O2-5%CO2通気によりpH7.4に保持したもの)に脳スライスを浸漬して酵素処理を行った。所定時間経過後、直ちに室温にて50-100mLの10mM glucose含有HEPES溶液に脳スライスを浸漬して酵素反応を停止させた。
(3)中脳黒質網様部の分離
底部にシリコンを貼付した60ないし100mmプラスチックディッシュに10mM glucose含有HEPES溶液(室温、共焦点画像取得用HEPES溶液からCarbenoxolonを除いたもの)を満たしておき、上記脳スライスを液中に浸漬した。二本の27G注射針で脳スライスを固定した上、顕微鏡下にて左右の中脳黒質網様部を18G注射針の先端を楕円形にしたものでパンチアウトし、室温で上記HEPES溶液(35mmカルチャーディッシュ)中に保存した。
(4)黒質網様部神経細胞の単離
各種先端径に調整したガラスピペットにてtriturationにより神経細胞を単離し、poly-L-lysineコートしたガラスカバースリップに付着させた。
(C)リアルタイムレーザースキャン共焦点顕微鏡を使用した場合の2-NBDLM+2-TRLG混合溶液の投与法および画像取得プロトコル
混合溶液の投与は、実施例3(4)〜(6)に記載したMIN6細胞への投与法と同様に実施した。
100 μM 2-NBDLM + 20 μM 2-TRLG混合液を、急性単離神経細胞に5分間投与し、レーザー共焦点顕微鏡で観察した結果を図11〜15に示す。
(図11〜図15)
それぞれ100 μM 2-NBDLM + 20 μM 2-TRLG混合液投与前、投与中、投与終了後2分経過した時点、投与後10分経過した時点、投与後22分経過した時点での、緑チャネル(500-580 nm)における蛍光画像A、赤チャネル(580-740 nm)における蛍光画像B、微分干渉(DIC)画像C、およびABCの重ね合わせ画像Dを示す。
図11は、マウスの中脳黒質網様部から急性単離した神経細胞に、2-NBDLM (100 μM) + 2-TRLG (20 μM)を投与する直前の緑チャネル(A)および赤チャネル(B)における自家蛍光像、微分干渉(DIC)像(C)、およびこれらの重ねあわせ画像(Overlay、D)である。
図12は、2-NBDLM (100 μM) + 2-TRLG (20 μM) 投与中の緑チャネルおよび赤チャネルの蛍光像、微分干渉像および重ね合わせ画像(いずれも原画像のまま)である 。矢印で示された健全な細胞では、投与中に2-TRLGが細胞内に侵入しないため、2-TRLGの蛍光を強く反映する赤チャネルの蛍光像(B)では細胞体部分が影となっている。一方、2-NBDLMの取り込みを反映する緑チャネルの蛍光像(A)を見ると、投与中に2-NBDLMが細胞内に取り込まれ、細胞体の影が赤チャネルのそれより小さい。またDの重ね合わせ像において、矢印の細胞は、中心部の細胞核を除く細胞質部分が2-NBDLMの蛍光を反映して緑色となっている様子がわかる。これに対して、矢頭で示した状態の悪化している二つの細胞では、緑チャネル、赤チャネルのいずれも投与中に細胞体の影が認められず、2-NBDLMと2-TRLGの両者共に投与中に細胞内に完全に侵入している様子が示されている。
図13は、2-NBDLM (100 μM) + 2-TRLG (20 μM) 投与終了後2分経過した時点のイメージ(緑チャネルと赤チャネルとを同一レベルで強調して、蛍光変化を見やすく表現している)を示している。Aの緑チャネルで見ると、いずれの細胞も2-NBDLMを取り込んでいる。しかしBの 赤チャネルを見ると、矢印で示された健全な細胞では2-TRLGが取り込まれておらず細胞膜が健全であることが示されるのに対し、矢頭で示された二つの細胞は2-TRLGの多量の取り込みを示し、細胞膜が破綻を来たしている様子がわかる。結果として、Dの重ね合わせ画像において、矢印の細胞では細胞体が緑色蛍光を示しているのに対し、矢頭の細胞では緑色と赤色が混じり橙色を呈している。なお矢印で示された細胞で赤チャネルの蛍光強度が投与前に比較してわずかに増加してみえるのは、2-NBDLMの赤チャネルにおける蛍光成分の増加が画像強調によって可視化されたものである(詳細は[0096])。
図14は、2-NBDLM (100 μM) + 2-TRLG (20 μM) 投与終了後10分経過した時点のイメージを示している。Aの緑チャネルおよびDの重ね合わせ画像を見ると、矢印の健全な細胞では、緑色蛍光で示される2-NBDLMが投与終了後10 分経っても細胞内に維持されている様子がわかる。一方、矢頭の二つの細胞では、投与後2分経過した時点の画像では細胞内に見られていた緑チャネルおよび赤チャネルの蛍光が既に大きく減弱しており、細胞膜破綻により細胞内に一端侵入した2-NBDLMおよび2-TRLGが洗い流しの時間経過と共に細胞外に流出した様子がわかる。
図15は、2-NBDLM (100 μM) + 2-TRLG (20 μM) 投与終了後22分経過した時点のイメージを示している。AおよびDに明らかなように、2-NBDLMによる緑蛍光は、投与終了後22分を経過しても細胞内に維持されている。図13, 14, 15はいずれも全く同一の画像処理条件で表示している。
以上の結果は、2-NBDLMが、正常なマウス神経細胞内に取り込まれることを示している。
Claims (21)
- がん細胞又はそのおそれがある細胞を検出するための方法であって、以下の工程、
a.生体外の標的細胞に、蛍光分子団として7−ニトロベンズ−2−オキサ−1,3−ジアゾール基又はその誘導体を分子内に有するL−グルコース誘導体を含有する組成物を接触させる工程、及び
b.該標的細胞内に存在する該L−グルコース誘導体を検出する工程、
を含み、
該方法が、蛍光分子団を分子内に有するD−グルコース誘導体を標的細胞に接触させる工程を含まないことを特徴とする検出方法。 - 前記L−グルコース誘導体が、7−ニトロベンズ−2−オキサ−1,3−ジアゾール基又はその誘導体を、L−グルコース又はアミノ基及び/又はフッ素原子により水酸基が置換されたL−グルコースに結合したものである、請求項1に記載の検出方法。
- 前記L−グルコース誘導体が、7−ニトロベンズ−2−オキサ−1,3−ジアゾール基又はその誘導体を、L−グルコース又はアミノ基及び/又はフッ素原子により水酸基が置換されたL−グルコースの2位、4位又は6位に結合したものである、請求項2に記載のがん細胞の検出方法。
- 前記L−グルコース誘導体が、2−[N−(7−ニトロベンズ−2−オキサ−1,3−ジアゾール−4−イル)アミノ]−2−デオキシ−L−グルコースである請求項3に記載のがん細胞の検出方法。
- 前記工程aにおける検出が標的細胞をイメージングすることにより行う請求項1〜4のいずれか一つに記載の検出方法。
- 前記工程aにおける組成物が、スルホローダミンを分子内に有するL−グルコース誘導体をさらに含み、かつ、前記工程bが、標的細胞中に存在する蛍光分子団である7−ニトロベンズ−2−オキサ−1,3−ジアゾール基又はその誘導体を分子内に有するL−グルコース誘導体を検出する工程である、請求項1に記載の検出方法。
- 前記組成物が、2−[N−(7−ニトロベンズ−2−オキサ−1,3−ジアゾール−4−イル)アミノ]−2−デオキシ−L−グルコース及び2位にスルホローダミン101又はスルホローダミンBをスルホンアミド結合せしめた2−アミノ−2−デオキシ−L−グルコースを含む、請求項6に記載の検出方法。
- 前記工程bにおける検出がイメージングされた細胞の蛍光色調の時間経過による変化を指標にして行う、請求項6又は7に記載の検出方法。
- さらに以下の工程、
c.前記蛍光色調の変化をもとに標的細胞ががん細胞であるか損傷細胞であるかを判定する工程、
を含む、請求項5〜8のいずれか一つに記載の検出方法。 - 前記全ての工程を30分以内に行う請求項1〜9のいずれか一つに記載の検出方法。
- 標的細胞内への標識されたL−グルコース誘導体の取り込みによって標的細胞をイメージングするためのイメージング剤であって、蛍光分子団である7−ニトロベンズ−2−オキサ−1,3−ジアゾール基又はその誘導体を分子内に有するL−グルコース誘導体を含み、蛍光分子団を分子内に有するD−グルコース誘導体を含まないことを特徴とする標的細胞のイメージング剤。
- がん細胞を検出するための請求項11に記載のイメージング剤。
- 前記L−グルコース誘導体が、7−ニトロベンズ−2−オキサ−1,3−ジアゾール基又はその誘導体を、L−グルコース又はアミノ基及び/又はフッ素原子により水酸基が置換されたL−グルコースに結合したものである、請求項12に記載のイメージング剤。
- 前記L−グルコース誘導体が、7−ニトロベンズ−2−オキサ−1,3−ジアゾール基又はその誘導体を、L−グルコース又はアミノ基及び/又はフッ素原子により水酸基が置換されたL−グルコースの2位、4位又は6位に結合したものである、請求項13に記載のイメージング剤。
- 前記L−グルコース誘導体が2−[N−(7−ニトロベンズ−2−オキサ−1,3−ジアゾール−4−イル)アミノ]−2−デオキシ−L−グルコースである請求項14に記載のイメージング剤。
- 前記イメージング剤がさらに、スルホローダミンを分子内に有するL−グルコース誘導体を含む請求項12〜15のいずれか一つに記載のイメージング剤。
- 前記イメージング剤がさらに、2位にスルホローダミン101又はスルホローダミンBをスルホンアミド結合せしめた2−アミノ−2−デオキシ−L−グルコースを含む請求項16に記載のイメージング剤。
- 前記L−グルコース誘導体が、放射性標識されたL−グルコース誘導体である請求項11〜15のいずれか一つに記載のPET用イメージング剤。
- 請求項12〜18のいずれか一つに記載のイメージング剤を含むがん細胞を検出するためのキット。
- 前記工程bが、該標的細胞に該L−グルコース誘導体を接触させる前の標的細胞の蛍光強度に対する蛍光強度の増加をもって評価を行うことを含む、請求項1に記載のがん細胞の検出方法。
- 前記工程aが、該標的細胞に該L−グルコース誘導体を一定時間接触させ、しかる後にこれを洗い流す工程をさらに含み、
前記工程bが、接触前の標的細胞の蛍光強度に対する蛍光強度の増加をもって評価を行うことを含む、請求項1に記載のがん細胞の検出方法。
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