CN103502465B

CN103502465B - 使用荧光标记了的l-葡萄糖衍生物检测癌细胞的方法以及含有该衍生物的癌细胞的显像剂

Info

Publication number: CN103502465B
Application number: CN201280015126.5A
Authority: CN
Inventors: 山田胜也; 尾上浩隆; 丰岛正; 山本敏弘
Original assignee: Co Of Polypeptide Institute; Hirosaki University NUC
Current assignee: Obio Co ltd; Peptide Research Institute
Priority date: 2011-03-31
Filing date: 2012-03-29
Publication date: 2016-08-17
Anticipated expiration: 2032-03-29
Also published as: WO2012133688A1; EP2703495A4; EP2703495B1; CN103502465A; KR20140020313A; JP6019500B2; JPWO2012133688A1; US20140154717A1; EP2703495A1

Abstract

本发明的目的在于提供一种精度良好地检测癌细胞的方法。本发明的特征在于，使用荧光标记了的L‑葡萄糖衍生物进行成像。通过使用本发明的方法和显像剂，与使用荧光标记了的D‑葡萄糖衍生物进行成像的情形相比，在癌细胞与正常细胞之间会得到高的对比度。另外，由于诊断时无须进行绝食，所以能够不给患者添加负担地快速实施。

Description

使用荧光标记了的L-葡萄糖衍生物检测癌细胞的方法以及含有该衍生物的癌细胞的显像剂

技术领域

本发明涉及使用荧光标记了的L-葡萄糖衍生物检测癌细胞或有患癌可能的细胞的方法。本发明还涉及含有荧光标记了的L-葡萄糖衍生物的癌细胞或有患癌可能的细胞的显像剂。

背景技术

精度良好地检测癌对于癌症的发现或治疗是重要的。通常，癌组织并不是显示相同性质的细胞的集合，而是显示多种形态或功能的特征、分化程度的细胞的集合。另外，有时也混合存于在正常细胞中。因此，在癌诊断中，为了确定诊断，进行活检标本的病理诊断，有必要在细胞水平对异常细胞进行评价。但是，在活检标本的病理诊断中，特别越是早期癌症的情形，越可能忽视癌细胞或处于前癌细胞状态的细胞，即，存在错误地诊断为阴性(False Negative，假阴性)的可能性。特别是，当内科诊断时仅取出组织的极少一部分进行活检时，得到这样的假阴性诊断后，随病症的发展如何在开始降低担心的危险性已成为课题。同样的问题在手术后复发的有无的评价中也成为一个大的课题，在面对不断增加的癌症患者的多数临床科室中，需要一种不太依赖主治医师的经验或熟练度而能够可靠诊断的方法。

活检包括有在外科手术时以确认为目的而进行的情况，在使用内窥镜、支气管镜、放大镜、鼻镜、耳镜等的内科检查时从消化道、气管、膀胱、阴道、其它各种管腔内侧进行的情况，或者在观察部位附近的身体开一个小口并在开口部位插入腹腔镜或胸腔镜等从组织的外侧进行的情况等，但是由于是侵袭性操作，所以任何一种情况中准确选定活检部位成为非常重要的课题。内窥镜检查等中，如果发现显示红肿或糜烂、白色突起、微血管结构异常的区域时，通过与扩大内窥镜并用的异型血管图像的精查等来选定活检部位。但是，因伴随活检会出血，在微小的癌症中，常常如果选错活检部位，则无法识别病变。另一方面，如果在大范围内将与正常无区别的组织摘出，则侵袭度变高。在癌症的手术中，为了避免复发或再次手术而不必要地将正常部分大范围切除，成为兼顾QOL(Quality of Life)改善的负面因素。因此，在外科手术中，为了研究摘出范围是否合适，从确实认为含有癌症的部分到距离一定距离的部分进行切除，对切割端进行快速病理诊断，而在手术中会多次重复上述过程。但是，在对切割端进行快速病理诊断，直到得到结果，每次需要数十分钟到1小时的时间，所以这成为缩短手术时间的阻碍因素之一。不仅在手术时，而且对于在内窥镜等检查时进行活检的情形，也在诊断中会对患者造成非常大的负担。因此，为了使检查尽早结束，显示何处应当进行精检、活检的成像法成为医疗现场的切实需要。另外，对于胆管癌、巴雷特食道癌等通过检查而发现的时间已经太晚的情形居多的癌症而言，期待通过早期发现能够改善生存率，这就需要能够准确、简便地发现较小的癌症的成像法。另外，一旦发现患有癌症的情况下，准确判定内腔表层稀薄地存在的癌症扩散到何处而存在(称为侧向进展或水平进展等)，有必要进行治疗，但是通过内窥镜以细胞单位进行以上操作，即使是熟练的专家也是困难的(非专利文献1)。

现在，对于内窥镜而言，为了能够更清楚地捕捉观察癌症的特征，开发了高分辨率内窥镜、利用光的散射·吸收变化的Narrow BandImaging(NBI)、将细胞的自身荧光(Autofluorescence)成像的内窥镜(AFI)、利用Optical Coherence Tomography(OCT)这一新原理的内窥镜等。其中，发现NBI的有用性，其得到快速普及。但是，NBI主要是通过将血管像可视化来间接判断癌症的进展的方法，与如上述例示的其它方法相同，不适合于直接观察每一个细胞。另一方面，由于共聚焦内窥镜Confocal Laser Endomicroscopy(非专利文献2)通过将荧光素等荧光分子进行静脉注射，利用组织发出的荧光得到断层像，由此能够观察到每个细胞的形态特征，所以如果灵敏度提高可期待能够将非典型增生、恶性程度的区别在细胞单位进行判定。将其用于手术时也是可能的。但是，由于荧光素等的细胞内摄入并不是癌细胞特异性，因此在从显微镜的视野范围来看可以说广大的组织区域所包含的几乎全部的细胞会发出荧光，如果要以荧光精密观察在内窥镜或其它检查时显示异常的癌细胞，则需要花费大量的时间。因此，需求能够迅速发现癌细胞或处于前癌状态的细胞，也可以识别由炎症等癌症以外的原因引起的细胞异常的适当的造影剂(非专利文献3和非专利文献4)。

作为能够进行癌症诊断成像的造影剂，目前最多使用的造影剂之一有以¹⁸F放射性标记的2-脱氧-D-葡萄糖的衍生物[¹⁸F]2-氟-2-脱氧-D-葡萄糖(FDG)，广泛使用将其与阳离子断层法(PET)组合的临床图像诊断(非专利文献5)。FDG法是利用癌细胞与正常细胞相比能够更多地将D-葡萄糖摄入细胞内的性质将癌可视化的方法，但是，在测定方法上存在无法实时连续观察活的单个细胞将D-葡萄糖摄入的情形的缺点(非专利文献6)。这不利于正确诊断显示不同形态、功能、分化程度的而与正常细胞混合存在的癌，例如成为难以早期发现极小的癌细胞分散存在的情况或在消化器官粘膜上稀疏产生的癌的因素之一。另外，由于D-葡萄糖也被正常细胞摄入，所以具有因在癌组织周围存在的或有时在癌组织内存在的正常细胞对FDG的摄取而导致的背景信号会降低SN比这样的原理性问题。另外，在发生炎症的细胞中FDG容易富集，所以难以将其与癌症进行区别。

另一方面，本发明人等发现由作为荧光基团的7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑基(NBD)标记的2-氨基-2-脱氧-D-葡萄糖(2-NBDG)通过哺乳动物细胞的葡萄糖转运体，以具有与放射性标记D-葡萄糖衍生物相当的动力学被摄入细胞内(非专利文献6)。以这些知识为背景，提出使用2-NBDG这类荧光标记了的D-葡萄糖衍生物代替FDG，将癌症在细胞水平进行成像(非专利文献7和专利文献1)。另外，作为对癌组织的活检或手术时摘出的标本使用2-NBDG进行的成像，报告了适用于口腔癌(非专利文献8)、乳腺癌(非专利文献9)以及巴雷特食道癌(非专利文献1)的例子。

但是，使用2-NBDG进行癌症诊断成像时，由于2-NBDG是D-葡萄糖的衍生物，所以与FDG同样，由正常细胞的摄入引起的背景信号会降低SN比，难以早期发现微小癌症。实际上，D-葡萄糖显示因血糖升高而被脂肪细胞或肌肉大量摄入的性质(非专利文献10)，所以显示与FDG同样的性质。因此，在使用FDG的PET检查中，为了提高SN比，在检查前需要进行长时间的绝食，另外，在事前的FDG摄入时间中(约30分钟～1小时左右)以及测定时间中(20～30分钟左右)，需要不使肌肉运动地一动不动(说话也受到限制)。同样地，利用2-NBDG进行的癌症成像也需要绝食等(非专利文献11)。但是，即使进行绝食，也不能完全行抑制荧光标记的D-葡萄糖衍生物被正常细胞摄入，这就需要一种精密度更高的检测方法。最近有报告指出在人组织的活检标本中存在显示较弱的2-NBDG的摄入的轻度非典型增生细胞和较强摄入2-NBDG的高度非典型增生细胞(非专利文献1)，但是由于均摄入2-NBDG，所以两者的区别不得不成为连续的区别。另外，在炎症组织也发现了2-NBDG的强摄入，使得对癌症的识别成为与FDG-PET法同样的课题(非专利文献1)。因此，不得不承认只要使用荧光标记了的D-葡萄糖衍生物就精度良好地判定是不是肿瘤细胞存在局限。另外，FDG法对糖尿病患者进行诊断是困难的，但是癌症易发年龄和糖尿病发病年龄存在重叠的问题，利用2-NBDG进行成像也同样存在受到制约的可能性。

另外，最近提出了一种介由连接体将荧光分子团键合到D型或L型葡萄糖1个位点而合成衍生物的方法，适用于正常细胞和特定肿瘤细胞通过荧光进行检测(专利文献3)。然而，专利文献3的实施例中，显示无论在肿瘤细胞和正常细胞中的哪一个，均检测到L型葡萄糖衍生物所致的充分的荧光强度的增加。

现有技术文献

专利文献

专利文献1:美国专利第6989140号说明书

专利文献2:WO2010/016587公开公报

专利文献3:美国专利申请公开第20090317829号公报

非专利文献

非专利文献1:Thekkek et al.,Technol.Cancer Res.Treat.10:431-41,2011

非专利文献2:Hsiung,PL.et al.,Nat.Med.14:454-8,2008

非专利文献3:Thekkek&Richards-Kortum,Nat.Rev.Cancer 8:725-31,2008

非专利文献4:Goetz&Wang.,Gastroenterol.138:828-33,2010

非专利文献5:Jadvar et al.,J.Necl.Med.50:1820-27,2009

非专利文献6:Yamada et al.,J.Biol.Chem.275:22278-83,2000

非专利文献7:O'Neil et al.,Mol.Imaging Biol.7:388-92,2005.

非专利文献8:Nitin et al.,Int.J.Cancer 124:2634-42,2009

非专利文献9:Langsner et al.,Biomed.Optics Express 2:1514-23,2011

非专利文献10:Foley et al.,BioChemistry 50:3048-61,2011

非专利文献11:Sheth et al.,J.Biomed.Optics 14:064014,2009

非专利文献12:Thompson RJ.et al.,Science 312,924-927,2006.

非专利文献13:Cheng et al.,Bioconjgate Chem.17:662-69,2006

非专利文献14:Etxeberria et al.,J.Experimental Botany56:1905-12,2005

非专利文献15:Yamamoto et al.,Tetrahedron Lett.49:6876-78,2008

非专利文献16:Yamada et al.,Nat.Protoc.2:753-762,2007

发明内容

因此，本发明的目的在于提供通过成像精度良好地检测癌细胞或有患癌可能的细胞的方法以及用于该方法的显像剂。

鉴于上述问题，本发明人等进行了大量深入研究，结果发现发展的肿瘤细胞(其是指例如，发展到细胞块中大量含有呈现异常细胞核的细胞的程度的阶段的构成肿瘤块的细胞)活跃地将荧光标记了的L-葡萄糖衍生物摄入，从而完成本发明。

本发明是使用分子内具有特定的荧光发色团(7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑基)的L-葡萄糖衍生物检测靶细胞是癌细胞或有患癌可能的细胞并进行判定的方法。更具体而言，为如下所述的发明。

(1)一种检测方法，该方法为检测癌细胞或有患癌可能的细胞的方法，包括以下工序，

a.使含有L-葡萄糖衍生物的组合物与靶细胞(活体的或从活体分离的细胞或组织中的细胞)接触的工序，所述L-葡萄糖衍生物在分子内具有作为荧光分子团的7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑基或其衍生物，以及

b.检测该靶细胞内存在的该L-葡萄糖衍生物的工序。

(2)如上述(1)所述的检测方法，其中，所述L-葡萄糖衍生物是7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑基或其衍生物与L-葡萄糖键合而成的物质或者是与由氨基和/或氟原子取代羟基的L-葡萄糖键合而成的物质。

(3)如上述(2)所述的检测方法，其中，所述L-葡萄糖衍生物是7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑基或其衍生物与L-葡萄糖的2位、4位或6位键合而成的物质或者是与由氨基和/或氟原子取代羟基的L-葡萄糖的2位、4位或6位键合而成的物质。

(4)如上述(3)所述的检测方法，其中，所述L-葡萄糖衍生物是2-[N-(7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑-4-基)氨基]-2-脱氧-L-葡萄糖。

(5)如上述(1)～(4)中任一项所述的检测方法，其中，所述工序b中的检测是通过将靶细胞成像而进行的。

(6)如上述(1)所述的检测方法，其中，所述工序a的组合物进一步含有在分子内具有磺基罗丹明的L-葡萄糖衍生物，且所述工序b为检测在靶细胞中存在的分子内具有作为荧光分子团的7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑基或其衍生物的L-葡萄糖衍生物的工序。

(7)如上述(6)所述的检测方法，其中，所述组合物含有2-[N-(7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑-4-基)氨基]-2-脱氧-L-葡萄糖以及在2位以磺胺键键合了磺基罗丹明101或磺基罗丹明B的2-氨基-2-脱氧-L-葡萄糖。

(8)如上述(6)或(7)所述的检测方法，其中，所述工序b中的检测是以成像的细胞的荧光色调的经时变化为指标进行的。

(9)如上述(5)～(8)中任一项所述的检测方法，其中，进一步包含以下工序，

c.以所述荧光色调的变化为基础，判定靶细胞是否是癌细胞或有患癌可能的细胞的工序。

(10)如上述(1)～(9)中任一项所述的检测方法，其中，在30分钟内进行上述全部工序。

(11)如上述(1)～(4)中任一项所述的检测方法，其中，所述L-葡萄糖衍生物为放射性标记的L-葡萄糖衍生物，且检测靶细胞内部存在的L-葡萄糖衍生物的工序至少包括PET成像。

(12)如上述(1)～(11)中任一项所述的检测方法，其中，所述组合物进一步含有在分子内具有荧光发色团的荧光标记了的D-葡萄糖衍生物。

(13)一种靶细胞的显像剂，该显像剂是用于通过将荧光标记了的L-葡萄糖衍生物摄入靶细胞(活体细胞、或从活体分离的细胞或组织中的细胞)内而将靶细胞成像的显像剂，该显像剂含有L-葡萄糖衍生物，所述L-葡萄糖衍生物在分子内具有作为荧光分子团的7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑基或其衍生物。

(14)如上述(13)所述的显像剂，用于检测癌细胞或有患癌可能的细胞。

(15)如上述(14)所述的显像剂，其中，所述L-葡萄糖衍生物是7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑基或其衍生物与L-葡萄糖键合而成的物质或者与由氨基和/或氟原子取代羟基的L-葡萄糖键合而成的物质。

(16)如上述(15)所述的显像剂，其中，所述L-葡萄糖衍生物是7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑基或其衍生物与L-葡萄糖的2位、4位或6位键合而成的物质或者与由氨基和/或氟原子取代羟基的L-葡萄糖的2位、4位或6位键合而成的物质。

(17)如上述(16)所述的显像剂，其中，所述L-葡萄糖衍生物是2-[N-(7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑-4-基)氨基]-2-脱氧-L-葡萄糖。

(18)如上述(14)～(17)中任一项所述的显像剂，其中，所述显像剂进一步含有在分子内具有磺基罗丹明的L-葡萄糖衍生物。

(19)如上述(18)所述的显像剂，其中，所述显像剂进一步含有在2位以磺胺键键合了磺基罗丹明101或磺基罗丹明B的2-氨基-2-脱氧-L-葡萄糖。

(20)如上述(13)～(17)中任一项所述的显像剂，其中，所述L-葡萄糖衍生物为放射性标记的L-葡萄糖衍生物。

(21)如上述(14)～(20)中任一项所述的显像剂，其中，进一步含有在分子内具有荧光发色团的荧光标记了的D-葡萄糖衍生物。

(22)一种试剂盒，用于检测癌细胞或有患癌可能的细胞，含有上述(14)～(20)中任一项所述的显像剂。

(23)一种诊断方法，是通过使用上述(1)～(12)中任一项所述的检测方法检测癌细胞或有患癌可能的细胞，从而诊断靶细胞的来源组织为癌或处于前癌状态(即，置之不管早晚成为癌症的可能性高的状态、被诊断为高度非典型增生的状态)。

本发明能够提供一种能够以高对比度地识别癌细胞或有患癌可能的细胞的方法以及用于该方法的显像剂。

附图说明

图1是表示在实施例2中对将肿瘤细胞(C6神经胶质瘤)移植到右后肢根部的皮下的小鼠给予2-NBDLG并每隔1分钟进行成像的结果的照片。箭头表示给予2-NBDLG的时刻。

图2是表示该实施例中给予2-NBDG并进行成像的结果的照片。箭头表示给予2-NBDG的时刻。

图3是表示该实施例中分别给予2-NBDLG和2-NBDG后的肿瘤细胞的移植部分(右后肢根部的圆、图表的菱形、Tumor+Glc)和脖子附近背侧脂肪细胞富集的部分(颈部的圆、图形的四角形、BG+Glc)中各自的累积值的经时变化的图表。

图4是实施例3中对由小鼠胰岛瘤细胞(MIN6)构成的肿瘤细胞块给予2-NBDLG并通过实时激光扫描共聚焦显微镜获得的图像。

图5是实施例4中对由小鼠胰岛瘤细胞(MIN6)构成的肿瘤细胞块给予由100微摩尔2-NBDLG和20微摩尔2-TRLG组成的混合溶液之前通过实时激光扫描共聚焦显微镜获得的图像。

图6是该实施例中给药结束经过2分钟后获得的图像。

图7是该实施例中给药结束经过4分钟后获得的图像。

图8是该实施例中给药结束经过2分钟后的绿色通道图像、红色通道图像以及DIC图像重叠而成的图像。

图9是该实施例中给药结束经过4分钟后的绿色通道图像、红色通道图像以及DIC图像重叠而成的图像。

图10是观察抑制剂对2-NBDG和2-NBDLG向小鼠胰岛瘤(MIN6)细胞内的摄入的影响的结果。

图11是实施例6中对急性分离神经细胞给予由100微摩尔2-NBDLG和20微摩尔2-TRLG组成的混合溶液之前通过实时激光扫描共聚焦显微镜获得的图像。

图12是该实施例中给药时获得的图像。

图13是该实施例中给药结束经过2分钟后获得的图像。

图14是该实施例中给药结束经过10分钟后获得的图像。

图15是该实施例中给药结束经过22分钟后获得的图像。

具体实施方式

本发明是使用荧光标记了的L-葡萄糖衍生物检测癌细胞或有患癌可能的细胞的方法以及用于该方法的显像剂。根据本发明，以含有有效量的荧光标记了的L-葡萄糖衍生物(分子内具有作为荧光分子团的7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑基或其衍生物的L-葡萄糖衍生物)的组合物(以下有时称为“本发明的组合物”或“本发明的显像剂”)作为试剂，通过与靶细胞进行接触，能够判定靶细胞是不是癌细胞(或有患癌可能的细胞)。根据本发明，另外通过使本发明的组合物与含有靶细胞的组织进行接触并进行成像，能够检测组织中的癌细胞或有患癌可能的细胞。根据本发明，进一步通过将本发明的组合物给予活体并进行成像，能够检测癌细胞(或有患癌可能的细胞)或含有这些细胞的组织，该方法作为检测癌症的方法是有用的。荧光标记了的L-葡萄糖衍生物，除了巨噬细胞或小胶质细胞这类发挥吞噬作用的特殊细胞以外，在正常细胞中，例如给药开始后20分钟以内的短时间内没有被摄入或即使摄入也是极少的，因此，根据本发明可以在短时间(例如，给药开始后15分钟以内等)实施成像，而且在癌细胞或有患癌可能的细胞、与正常细胞或构成并没有发展到核中出现异常的肿瘤细胞块的细胞之间能够得到高的对比度。

给予荧光标记的D-葡萄糖时，以降低向脂肪细胞或肌肉的摄取为目的，在给予前通常进行绝食，但是一旦进行绝食，半通道(gapjunction/hemichannel)会打开，会引起介由半通道的D-葡萄糖的摄入，存在因脏器的不同导致对比度出现降低的可能性(非专利文献12)。另外，绝食时，肌肉、肝脏、胰脏、肾脏等的正常细胞会启动自噬(Autophagy)。所谓自噬是指正常细胞将其自身消化的现象，如果多种细胞产生自噬，则不能否定伴随自噬荧光标记了的D-葡萄糖衍生物被癌细胞以外的正常细胞非特异性摄入的可能性。这样进行绝食有时成为对利用成像确定癌细胞的负面效应。即使在体外适用于活细胞的评价时，不添加葡萄糖这样的能够成为能源的糖类而将细胞维持一定的时间，也有可能发生同样的非特异性摄入。另外，将D-葡萄糖或D-葡萄糖与荧光基团结合的衍生物与正常细胞长时间(具体为30分钟以上)持续接触，则有可能出现这些衍生物与存在于正常细胞细胞膜的葡萄糖转运体或葡萄糖受体等膜蛋白结合地移动到细胞内的现象(internalization)(非专利文献13)或发生非特异性内吞(非专利文献14)。与此相对，本发明在活体不进行绝食情况下短时间(例如，给药开始后15分钟以内等)内就能够实施成像，根据本发明，与使用标记了的D-葡萄糖衍生物进行成像的情形相比，在癌细胞(或有患癌可能的细胞)与正常细胞之间能够得到高对比度。另外，由于在检测·判定时没有进行绝食的必要，所以不会给患者强加负担，且能够立即实施检查。

本说明书中所谓的“癌细胞或有患癌可能的细胞”是指，显示细胞形态异常(结构异型)的细胞、或这类细胞与构成肿瘤块的细胞、显示核形态异常(核异型)或核分裂异常的细胞、或发展为这类细胞的可能性高的细胞，通常是指被分类为恶性肿瘤诊断为癌症的细胞或构成这样的细胞集团的细胞，或发展为这样的细胞集团的可能性高的细胞。

尽管不是癌细胞但具有通过吞噬作用等非特异性地将本发明的荧光标记了的L-葡萄糖衍生物摄入细胞内的可能性的细胞、例如巨噬细胞或小胶质细胞等细胞也存在于活体内。尽管这些细胞不是癌细胞(或有患癌可能的细胞)或细胞膜不发生破裂，但是仍存在摄入荧光标记了的L-葡萄糖衍生物的可能性。这些细胞除了通过形态进行识别之外，同时给予2-TRLG时将其摄入细胞内或使用特异标记物例如CD14、CD11b，在本发明的方法中判定为拟阳性之后，也能够确定这些细胞的种类。

本发明的方法中能判定的癌细胞的种类无特别限制，例如可例举出眼睑或泪腺等眼科领域的癌、外耳或中耳等耳的癌、鼻腔或副鼻窦等鼻癌、肺癌、口腔内癌、喉头癌、咽喉癌、食管癌、胃癌、小肠、大肠癌等消化器官癌、乳腺癌、子宫癌、卵巢癌、输卵管癌等妇科领域的癌症、生殖器癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、肛门癌、皮肤癌、骨癌、肌肉癌(肉瘤)、白血病等血液癌、恶性淋巴瘤、末梢及中枢神经的癌、以及胶质的癌等的癌细胞。

作为本发明中使用的荧光标记了的L-葡萄糖衍生物，可例举为分子内具有7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑基(NBD)及其衍生物的L-葡萄糖衍生物。L-葡萄糖衍生物中与NBD键合的位置无特别限制，具体可例举为L-葡萄糖的1位、2位、3位、4位或6位，优选为2位、4位或6位，更优选为2位或6位，最优选为2位。另外，NBD与L-葡萄糖的键合可以是介由胺直接键合，也可以是介由间隔基团(スペーサー)例如-NH-(CH₂)_n-NH-(此处，n为2～20，优选为2～10，亚甲基的一部分也可以被O、NH、S、或C＝O取代)进行键合。分子内具有发出绿色荧光的7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑基及其衍生物的L-葡萄糖衍生物的荧光最大波长在530～580nm左右。

本发明中使用的荧光标记了的L-葡萄糖衍生物是指，键合有荧光发色团的L-葡萄糖或其衍生物(由氨基和/或氟原子取代羟基的L-葡萄糖等)，也可以是盐酸盐这类盐的形式。另外，本发明中7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑基及其衍生物是指包含在7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑基基础上在不损害荧光特性的范围内添加或变更取代基而成的物质，例如可例举为7-(N,N-二甲基氨基磺酰基)-2-氧杂-1，3-二唑基(DBD基)。

能够用于本发明的荧光标记了的L-葡萄糖衍生物具体为分子内具有发出绿色荧光的7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑基的L-葡萄糖衍生物(最大荧光波长为530nm～580nm左右)，例如可例举为2-[N-(7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑-4-基)氨基]-2-脱氧-L-葡萄糖(2-NBDLG)、4-脱氧-4-[N-(7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑-4-基)氨基]-L-葡萄糖(4-NBDLG)或6-脱氧-[N-(7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑-4-基)氨基]-L-葡萄糖(6-NBDLG)等。另外，分子内具有作为NBD衍生物的发出黄色～黄绿色荧光的(N,N-二甲基氨基磺酰基)苯并-2-氧杂-1,3-二唑基的L-葡萄糖衍生物，例如可例举为2-脱氧-2-[N-7-(N’,N’-二甲基氨基磺酰基)苯并-2-氧杂-1，3-二唑-4-基)氨基]-L-葡萄糖(2-DBDLG)等。

这些化合物中的几个记载于与本发明人等先期的研究成果相关的WO2010/016587公开公报中(专利文献2)。其中2-NBDLG与以下所示的2-NBDG(2-[N-(7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑-4-基)氨基]-2-脱氧-D-葡萄糖)成镜像异构体的关系，认为其不会通过葡萄糖转运体GLUT(非专利文献15、专利文献2)。2-NBDG是为了进行活体哺乳动物细胞的D-葡萄糖动态的摄入过程的研究而本发明人等提出的化合物，现在，在该研究领域内已经达到不可或缺的地位(非专利文献16)。在专利文献2中提出的D-葡萄糖向细胞内的特异性摄入的评价方法中，2-NBDG也作为荧光标记了的D-葡萄糖衍生物而使用。

本发明中使用的荧光标记了的L-葡萄糖衍生物是分子内具有NBD的L-葡萄糖衍生物，优选为2-NBDLG或其衍生物，进一步优选为2-NBDLG。2-NBDLG或其衍生物是指2-NBDLG、或在不损害本发明效果的范围内根据本发明的用途对2-NBDLG进行修饰而得的物质。例如，可以是L-葡萄糖或荧光发色团的任意一个或两个同时进行添加或变更取代基而得的物质。作为荧光分子NBD的衍生物，例如可例举为DBD。作为L-葡萄糖的衍生物，例如可举出由氨基取代羟基的L-葡萄糖、由氨基和氟原子取代羟基的L-葡萄糖、以及由氟原子取代羟基的L-葡萄糖，进一步地，例如，也包含在L-葡萄糖或这些糖的第二位、第三位、第四位、第六位等引入氟的分子，作为例子可例举为2-F-6-NBDLG、3-F-2-NBDLG、4-F-2-NBDLG、以及6-F-2-NBDLG等。

本发明中的靶细胞，无特别限制，可以是从活体分离的细胞、从活体分离的组织中存在的细胞、活体的组织中存在的细胞、从活体分离后的初代培养细胞或株化的细胞等任意细胞。

本发明的方法中，荧光标记了的L-葡萄糖衍生物被摄入到癌细胞中在细胞内被检测。癌细胞内的本发明的L-葡萄糖衍生物的检测以通常使用的检测荧光的方法进行。例如，可按照以下进行。

本发明的方法中对癌细胞内存在的荧光标记了的L-葡萄糖衍生物的检测，首先测量靶细胞的荧光，接下来使靶细胞与荧光标记的L-葡萄糖衍生物接触一定时间，然后对其进行清洗，再次测量靶细胞的荧光，以相对于接触前靶细胞的荧光强度的荧光强度的增加来进行评价。通过将荧光强度作为图像进行识别，能够将细胞内具有荧光标记了的L-葡萄糖衍生物的细胞图像化，从而检测癌细胞或有患癌可能的细胞。另外，也可使用荧光酶标仪或流式细胞仪等，以大量细胞显示的荧光强度的总和或者荧光强度的分布进行评价。

荧光的检测可以在清洗结束后任意的时间之后进行。对于直接使L-葡萄糖衍生物与从活体分离的组织或细胞接触的情况而言，例如，在清洗结束立即～20分钟后之间，优选在清洗结束立即～10分钟后之间进行检测。对于靶细胞为组织中的细胞，作为观察对象的细胞周围的细胞外组织中的L-葡萄糖衍生物的清洗花费时间的情形，可以在清洗结束后进行检测。接触后，可以在放置一段时间后以良好的对比度进行检测，然而对于使用共聚焦显微镜或多光子显微镜等可获得细胞断层像的检测装置的情形，接触时间中也检测靶细胞内的荧光强度或荧光强度的变化，与接触开始前进行比较，进行评价和/或图像化也是可能的。这样通过本发明，用于检测癌细胞的流程，在本发明的组合物与细胞刚刚开始接触至30分钟以内完成，优选在15分钟内完成。进一步通过本发明，在多数情况下，本发明的组合物与细胞开始接触后，对于分离细胞而言是数分钟以内能够检测癌细胞，即使对于组织中存在的细胞而言也是10分钟以内能够检测癌细胞。靶细胞是活体内的细胞时，使本发明的显像剂与活体直接局部接触之后进行清洗，检测荧光。或者将其给予到静脉等血管，到达靶细胞附近之后进行检测。给予到血管的情形中，无须进行特别的清洗操作。进一步地，对于本发明的荧光标记了的L-葡萄糖衍生物给予到静脉等血管的情形，也能够进行全身成像。以下，分别对其进行具体地记载。

对于给予有效量的荧光标记了的L-葡萄糖衍生物的靶标为活体内的细胞的情形，例如使用时将被标记的L-葡萄糖衍生物溶解于注射用生理盐水等制备液体状试剂，通过静脉内注射即可。另外，检测对象部位在皮肤表面或者口腔、消化道、膀胱、阴道等管腔的内表面时，可以将液体状试剂直接涂布、滴加或散布于检测对象部位，或者也可以以凝胶状例如使其接触数分钟等一定时间。另外，适用于膀胱时，首先将尿除去之后，将液体状试剂经由尿道注入来进行接触。在消化道内等中粘液等成为有效的接触阻碍时，也可以如通常内窥镜检查那样利用链霉蛋白酶等进行粘液处理以及除去，以与散布靛蓝或醋酸等的情形相同的本身公知的方法进行接触。此时，进行成像之前，将在检测对象部位残留的多余液体状试剂清洗，以相对于试剂接触前的检测对象部位的荧光图像的荧光强度的增加来评价向细胞内的摄入。其中，即使是多余的液体状试剂残留在检测对象部位的状态，如已经叙述的那样，使用具有共聚焦效果的适当的荧光显微观察装置(例如共聚焦内窥镜)，按照作为观察对象的细胞的焦点深度进行观察，则也可以在接触时间中知晓在保持细胞膜状态的细胞的内部是否摄入标记了的L-葡萄糖衍生物。成像可通过与荧光标记了的L-葡萄糖衍生物的标记相应的公知方法来进行。通过本发明，将标记了的L-葡萄糖衍生物给予到小鼠的静脉后数分钟之后，与使用标记了的D-葡萄糖衍生物的情形相比较，能够高对比度地识别肿瘤细胞和正常细胞。通过以上描述，利用成像进行评价的时机，可以是在刚刚开始将标记了的L-葡萄糖衍生物给予活体至40分钟以内进行，优选在20分钟以内进行，更优选在10分钟以内进行。利用成像进行的评价可以在特定时刻仅进行1次，也可以在多个时刻进行而利用作为观察对象的细胞之间的对比的经时变化来进行评价。

另外，对于靶细胞为从活体采集的组织或细胞的情形，将在进行活检时、外科的手术开始时或者术中采集的组织·细胞作为检测体，将检测体浸渍于使荧光标记了的L-葡萄糖衍生物溶解于注射用生理盐水而制备的液体状试剂中，或者向检测体滴加液体状试剂，或者用液体状试剂灌流之后，将在检测体的细胞外残留的多余的液体状试剂洗净，然后进行成像，检测细胞内的标记了的L-葡萄糖衍生物。该方法在检测体是从活体取出的材料这一点上与之前的方法不同，例如，有必要包括将在取出的时刻切断面受到伤害的组织在林格氏液等中恢复一定时间的公知方法，除此以外，使用的荧光标记了的L-葡萄糖衍生物的种类、成像原理等与之前的方法相同。另外，它们的成像工序也可以在标记了的L-葡萄糖衍生物与组织或细胞刚刚开始进行接触至30分钟内完成，优选在15分钟内完成，多数的情况下，本发明的组合物开始与细胞接触后对于分离细胞而言能够在几分钟内检测出癌细胞，即使是组织中的细胞也能够在10分钟内检测出癌细胞。

将本发明的荧光标记了的L-葡萄糖衍生物用于体内诊断时，能够适用于术中评价或内窥镜等的诊断，作为给药方法，除了所述的静脉给药等全身给药法以外，可考虑向患病部直接给予必要的最小量。具体而言，可举出向患病部或者手术区域直接涂布、滴加或者散布或者在利用内窥镜等检查时通过散布进行局部给药的方法，或制成凝胶状进行接触的方法等。

本发明的方法或显像剂中，在荧光标记的基础上使用放射性标记时，癌细胞的检测可通过在荧光基础上检测放射线来进行，例如，可例示检测伽马射线的PET。

将本发明用于体内诊断，利用成像确认疑似癌症或前癌病变的结果时，进行组织活检，用福尔马林等固定后，进行病理检查，可进行确诊。另外，通过事先的成像，能够提高活检部位的选定的可信度。另外，荧光标记了的癌症诊断用显像剂与内窥镜或其它荧光观察装置等并用，也能够用于对术中评价的应用，通过将标记了的L-葡萄糖衍生物作为适当确定手术摘出范围的辅助手段来使用，能够期待因手术时间的缩短而带来的患者负担或风险的降低以及QOL或预测的改善等效果。

本发明应当说明的是以标记了的L-葡萄糖衍生物在细胞内的摄入程度为基础，能够获知肿瘤细胞的发展程度。具体而言，本发明人等能够确认活跃地摄入标记了的L-葡萄糖衍生物的肿瘤细胞，是构成发展到细胞块中含有大量呈现异常的细胞核的细胞的程度的阶段的肿瘤块的细胞，即构成恶性肿瘤的癌细胞。因此，从细胞内检测出标记了的L-葡萄糖衍生物时，能够判定该细胞是构成发展的肿瘤细胞块的癌细胞或有患癌可能的细胞。

由于L-葡萄糖衍生物是L型，所以发挥显示GLUT这类对葡萄糖具有立体选择性的膜蛋白能否确保使其底物正确地立体选择性地通过的机制的作用。另外，在像癌细胞这样同时表现葡萄糖的立体选择性膜通过机制(其是指使D型和L型互为镜像异构体关系的葡萄糖中的一个选择性通过的机制)和非立体选择性膜通过机制(其是指经由使互为镜像异构体关系的D型和L型都通过的膜蛋白的机制，除了以propidium iodide这类膜不通过性标记物的通过为代表的利用细胞膜的脂质双分子层结构的破裂而通过的情形以外的摄入)的细胞中，基于后者的路径对全体通过量的贡献程度，能够进行与正常细胞的识别，或者在同种癌细胞中对恶性程度或微小环境因素所致的细胞状态的不同进行识别。

本发明的显像剂，在本发明的荧光标记了的L-葡萄糖衍生物的基础上，可进一步含有具有波长不同的荧光发色团的L-葡萄糖衍生物。由此，使在不同波长进行检测的本发明的荧光标记了的L-葡萄糖衍生物和其它荧光标记了的L-葡萄糖衍生物与细胞接触，以伴随时间的经过而产生的成像了的细胞的色调的变化为指标，能够准确判定是不是癌细胞。具体地，通过将本发明的荧光标记了的L-葡萄糖衍生物和能够识别的荧光标记了的L-葡萄糖衍生物同时使用，从而以这些L-葡萄糖衍生物向细胞内摄入的差别以及排出的时间经过的差别为基础，可以用通过两种衍生物的波长成分的混合比例所表现的连续的荧光色示出各个癌细胞的状态评价，而且可以排除由以炎症或物理损伤所致的细胞膜损伤为基础的摄入或巨噬细胞等所致的非特异性摄入带来的噪音。即，如上所述以荧光色调的变化为基础，能够精度良好地判定目标细胞是不是癌细胞或有患癌可能的细胞。

例如，本发明的显像剂，可进一步含有键合有作为与本发明的荧光标记了的L-葡萄糖衍生物波长不同的荧光发色团的、发出红色荧光的磺基罗丹明(磺基罗丹明B、磺基罗丹明G、磺基罗丹明101等)的L-葡萄糖衍生物(极大荧光波长在580nm～630nm附近)，例如、在2位以磺胺键键合磺基罗丹明101的2-氨基-2-脱氧-L-葡萄糖(2-TRLG)或其衍生物。2-TRLG或其衍生物是指2-TRLG、或在不损害本发明效果范围内根据本发明的用途对2-TRLG修饰的产物，例如，在L-葡萄糖和/或磺基罗丹明101中插入或变更取代基而得到的衍生物。此处所述的L-葡萄糖或其衍生物是指除包括L-葡萄糖本身以外，还包括由氨基取代羟基的L-葡萄糖、由氨基和氟原子取代羟基的L-葡萄糖、隔着间隔基团具有氨基的L-葡萄糖以及由氟原子取代羟基的L-葡萄糖。另外，例如，也可以考虑在L-葡萄糖的第二位、第三位、第四位、第六位等引入氟的分子，作为例子可例举出2-F-6-TRLG、3-F-2-TRLG、4-F-2-TRLG以及6-F-2-TRLG。作为发出红色荧光的衍生物，优选为2-TRLG或其衍生物，进一步优选为2-TRLG。

通过本发明人等的报告可知，2-TRLG可被细胞膜状态恶化的细胞摄入(专利文献2)。即，2-TRLG由于是L型衍生物所以其没有介由与葡萄糖转运体的结合而摄入到细胞内，而且具有体积大、脂溶性高的荧光基团，因此，2-TRLG向细胞内入侵的情形中，除通过内吞(Endocytosis)的情况等以外，可认为是细胞膜结构受到了较大的损伤的情况。这种损伤的程度越大，即使2-TRLG一度进入细胞内，通过清洗也会更快地排到细胞外部。经常使用的propidium iodide(PI)这种判定细胞死亡(necrosis)的荧光试剂，由于细胞膜损伤而侵入细胞内时，与细胞核不可逆地结合，则可知发生损伤，但是难以显示损伤的程度。另外，与像具有荧光基团的葡聚糖这样地仅仅因单纯的立体体积大而阻碍其通过细胞膜的分子不同，2-TRLG显示出如下性质，即如果侵入到细胞膜的恶化程度不像视为伴随完全的细胞膜破坏的细胞死(necrosis坏死)那样显著而仍有活动性的细胞内，则吸附在细胞膜内侧，在细胞内更长时间的保留。因此，通过将本发明的荧光标记了的L-葡萄糖衍生物与2-TRLG组合使用，从而使以不同的荧光波长检测的本发明的荧光标记了的L-葡萄糖衍生物和2-TRLG与细胞进行接触，以伴随时间经过成像的细胞的色调的变化为指标，由此与单独使用本发明的L-葡萄糖衍生物的情形相比，能够更准确地判定是不是癌细胞或有患癌可能的细胞。

本发明的荧光标记了的L-葡萄糖衍生物，例如，以2-NBDLG和荧光标记了的L-葡萄糖衍生物2-TRLG为例进行说明，后者被摄入到在发展的肿瘤细胞块中细胞膜状态或多或少恶化的肿瘤细胞中，而2-NBDLG除了被摄入到这些肿瘤细胞中，还被摄入到在发展的肿瘤细胞块中细胞膜状态完全没有恶化的细胞中。2-NBDLG被摄入到这些肿瘤细胞内的情形，通过实施例4即可得知。另一方面，2-TRLG具有一旦被摄入细胞内则比2-NBDLG更难排出的性质。因此，例如，将发出绿色荧光的2-NBDLG与发出红色荧光的2-TRLG以一定(5:1)比例混合制成溶液，在按照以适当的(488nm)激发光进行照射而两者的荧光强度接近大约1:1的方式调整绿色和红色两个检测器的检测灵敏度的基础上，使细胞摄入该溶液，进行成像，则摄入二者的细胞可以看到源自2-NBDLG的绿色荧光和源自2-TRLG的红色荧光重合得到的黄色荧光。然后，将2-NBDLG排出时，更难排出的2-TRLG残留在细胞内，可以看到细胞发出红色荧光。因此，伴随时间的经过确认细胞由黄色至红色的荧光色调的变化时，可知该细胞一度摄入2-NBDLG和2-TRLG之后将2-NBDLG排出。应予说明，根据与本发明人等的先期研究成果相关的WO2010/016587公报，可知2-TRLG存在以下所示的2种异构体(邻位异构体和对位异构体)。

这样，在构成发展的肿瘤细胞块的肿瘤细胞中，摄入2-NBDLG和/或2-TRLG，但如下述实施例所示，在同一肿瘤的肿瘤细胞块中存在不摄入2-TRLG而摄入2-NBDLG的肿瘤细胞，该细胞中的2-NBDLG的摄入受到阻碍特定运输通路的物质的阻碍。即，这些肿瘤细胞的2-NBDLG的摄入，与如WO2010/016587公报所示的因细胞膜状态的恶化导致的2-TRLG的非特异性摄入不同，其是介由特异性机制(此处所谓的“特异性”是指互为镜像异构体关系的标记了的葡萄糖衍生物、具体而言是2-NBDLG和2-NBDG均介由可通过的膜蛋白的机制，是除了以propidium iodide这类膜不透过性标记物的通过为代表的因细胞膜的脂质双分子层结构的破裂导致的通过以外的摄入)向肿瘤细胞内摄入。因此，通过检测本发明的荧光标记了的L-葡萄糖衍生物2-NBDLG向细胞内的摄入，能够检测出构成发展的肿瘤细胞块的肿瘤细胞，即能够检测癌细胞。

2-TRLG被细胞膜状态恶化的细胞摄入。即，不仅摄入到上述发展的肿瘤细胞块中细胞膜状态或多或少恶化的肿瘤细胞，而且也摄入到因炎症或物理影响而损伤的细胞(包括正常细胞)。因此，在本发明的荧光标记了的L-葡萄糖衍生物基础上，例如通过使用2-TRLG，从而能够判断靶细胞内的本发明的荧光标记了的L-葡萄糖衍生物的检测是不是受到靶细胞的细胞膜损伤的影响，由此能够精度良好地检测癌细胞。

本发明的荧光标记了的L-葡萄糖衍生物也可进一步地进行放射性标记。作为具体例子，可例举为6-[¹⁸F]-2-NBDLG、4-[¹⁸F]-2-NBDLG。通过使用在荧光标记的基础上进行了放射性标记的L-葡萄糖衍生物，从而将本发明的显像剂给予活体之后，使用PET等进行全身成像而确认癌细胞的存在部位，而且通过检测荧光能够在细胞水平检测癌细胞。

本发明的荧光标记了的L-葡萄糖衍生物，进一步地可与荧光标记了的D-葡萄糖衍生物一起使用。肿瘤细胞具有比正常细胞多地将D-葡萄糖摄入细胞内的性质(例如，非专利文献16)。因此，在使用本发明的荧光标记了的L-葡萄糖衍生物检查癌细胞或有患癌可能的细胞的基础上，通过检测D-葡萄糖的摄入程度，能够精度更高地进行判定。

将使用本发明的荧光标记了的L-葡萄糖衍生物的检测和使用荧光标记了的D-葡萄糖衍生物的摄入的辨别组合的情形中所用的荧光标记了的D-葡萄糖衍生物，只要是能被细胞摄入的D-葡萄糖衍生物即可，无特别限制，例如是分子内具有绿色或蓝色的荧光发色团的D-葡萄糖衍生物，具体而言可以是分子内具有7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑基及其衍生物的D-葡萄糖衍生物。作为这种D-葡萄糖衍生物，优选例举为2-[N-(7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑-4-基)氨基]-2-脱氧-D-葡萄糖(2-NBDG)。

由以上说明可知，本发明的荧光标记了的L-葡萄糖衍生物，对于检测癌细胞是有用的，同时，作为例如将癌细胞可视化的显像剂的有效成分也是有用的。荧光标记了的L-葡萄糖衍生物，可以溶解于用于将其溶解的溶剂(注射用生理盐水等)中以溶液的方式进行提供，也可以以与用于将其溶解的溶剂组合在使用时溶解而制成溶液的试剂盒的方式进行提供。溶液中的标记了的L-葡萄糖衍生物的浓度，例如可以在1nM～100mM的范围内进行调整。应予说明，使用本发明的标记了的L-葡萄糖衍生物以检测癌细胞的方法可与公知的方法组合使用，以实现判定精度的进一步提高。

实施例

以下，通过实施例对本发明进行详细说明，但是本发明并不局限于以下的记载所解释的内容。

实施例1:化合物的合成

(1)荧光标记L-葡萄糖衍生物的合成

(1-1)2-NBDLG的合成

2-NBDLG按照以下方式由L-葡萄糖进行合成。

3,4,6-三-O-乙酰基-L-葡萄烯糖

将L-葡萄糖(20g)溶解于吡啶(262ml)，冷却至0℃。滴加无水醋酸(171ml)，室温搅拌一夜。重复3次减压浓缩后用甲苯进行共沸的操作。向残渣中加入乙酸乙酯，用饱和碳酸氢钠水和饱和食盐水清洗，用硫酸钠干燥有机层。滤去硫酸钠，通过减压浓缩除去有机溶剂。将得到的残渣在氩气氛下溶解于脱水二氯甲烷(115ml)，冷却至0℃。滴加30％溴化氢醋酸溶液(61ml)。滴加结束后，升温至室温，搅拌3小时。3小时后，通过减压浓缩将有机溶剂除去。向残渣中加入氯仿(800ml)，用饱和碳酸氢钠水和饱和食盐水清洗。用硫酸钠干燥有机层。滤去硫酸钠。通过减压浓缩将有机溶剂除去。向得到的油状化合物中加入醋酸(72ml)和水(72ml)，冷却至0℃。一点一点加入锌(71g)，加入六氯铂(IV)酸(135mg)。进一步地加入醋酸(72ml)和水(72ml)。1.5小时后，加入氯仿，进行硅藻土过滤。向滤液加入饱和碳酸氢钠水，将有机层用饱和碳酸氢钠水和饱和食盐水清洗。用硫酸镁干燥有机层。滤去硫酸镁，通过减压浓缩除去有机溶剂。通过硅胶柱色谱法进行精制。收集目标馏分，通过减压浓缩得到油状化合物。

收量:21.0g

收率:70％(3工序)

1,3,4,6-四-O-乙酰基-2-脱氧-2-(2’,2’,2’-三氯乙氧基磺酰基氨基)-L- 吡喃型葡萄糖

在氩气氛下，向3,4,6-三-O-乙酰基-L-葡萄烯糖(20g)、2,2,2-三氯乙氧基磺酰胺(18.5g)和氧化镁(6.8g)中加入氯苯(73ml)，进一步加入醋酸铑(650mg)。冷却至-20℃，加入二乙酸碘苯(30.8g)。经过2小时恢复至室温，搅拌一夜。用氯仿进行稀释，用硅藻土过滤。对滤液进行减压浓缩得到褐色油状化合物，通过硅胶柱色谱法将其精制。收集目标馏分，得到白色固体。

收量:26.0g

收率:63％

1,3,4,6-四-O-乙酰基-2-乙酰氨基-2-脱氧-L-吡喃型葡萄糖

在氩气氛下，将1,3,4,6-四-O-乙酰基-2-脱氧-2-(2',2',2'-三氯乙氧基磺酰基氨基)-L-吡喃型葡萄糖(22.9g)溶解于醋酸(130ml)和无水醋酸(130ml)。在室温加入锌铜偶(40g)，搅拌2小时。减压浓缩，向得到的残渣中加入氯仿，用饱和碳酸氢钠水和饱和食盐水清洗。用硫酸镁干燥有机层，滤去硫酸镁。通过减压浓缩得到残渣，通过硅胶柱色谱法对其进行精制。收集目标馏分，得到白色固体。

收量:12.1g

收率:76％

盐酸L-氨基葡萄糖

将1,3,4,6-四-O-乙酰基-2-乙酰氨基-2-脱氧-L-吡喃型葡萄糖(3.5g)悬浮于6M-HCL，加热至70℃。6小时后减压浓缩，向残渣中加入水共沸。将残渣从水中冷冻干燥，得到白色固体。

收量:1.95g

收率:100％

2-[N-(7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑-4-基)氨基]-2-脱氧-L-葡萄糖 (2-NBDLG)

在褐色烧瓶中加入NBD-F(227mg)，溶于甲醇(10ml)。在氩气氛下，加入将盐酸L-氨基葡萄糖(100mg)和碳酸氢钠(65.7mg)溶解于水(2.0ml)而得的溶液，在37℃搅拌。2小时后，通过减压浓缩除去有机溶剂，用水清洗生成的沉淀(源自NBD-F的不要物质)。将滤液与清洗液合并通过HPLC精制。收集目标馏分进行冷冻干燥。

收量:125mg

收率:79％

¹H-NMR(400MHz、重水、ppm)：

δ8.52(d，1H，J＝9.1Hz，H6’)，δ6.56andδ6.54(d x 2，0.5H x 2，J＝9.1Hz and J＝9.1Hz，H5’)，δ5.38(d，0.5H，J＝2.8Hz，H-1α)，δ4.89(d，0.5H，J＝8.1Hz，H-1β)，δ3.50-δ4.02(m，6H，H-2，H-3，H-4，H-5，H-6，H-6).

ESI-MS：calcd for C₁₂H₁₅N₄O₈[M+H]⁺343.1，found 343.1

(1-2)2-DBDLG的合成

2-DBDLG根据非专利文献5记载的方法，按照以下方式进行合成。

2-脱氧-2-[N-7-(N’，N’-二甲基氨基磺酰基)苯并-2-氧杂-1，3-二唑-4- 基)氨基]-L-葡萄糖(2-DBDLG)

在褐色烧瓶中加入DBD-F(100mg)，溶解于甲醇(2.00ml)和THF(2.00ml)的混合溶剂。在氩气氛下，加入将L-GlcNH₂·HCl(49.8mg)溶解于0.3M-NaHCO₃水(1.08ml)而得的溶液，进一步用水(1.00ml)清洗后，在室温搅拌。48小时后，通过减压浓缩去除有机溶剂，用水清洗生成的沉淀(源自DBD-F的不要物质)。将滤液与清洗液合并，通过HPLC精制。收集目标馏分进行冷冻干燥。

收量：35.8mg

收率：38％

¹H-NMR(400MHz、重水、ppm)：

δ7.82andδ7.84(d x 2，0.5H x 2，J＝8.3Hz and 8.3Hz，H-6’of DBD)，δ6.42andδ6.46(d x 2，0.5H x 2，J＝8.3Hz and 8.3Hz，H-5’of DBD)，δ5.31(br.d，0.5H，J＝2.7Hz，H-1α)，δ4.79(br.d，0.5H，J＝8.3Hz，H-1β)，δ3.43-δ3.90(m，6H，H-2，H-3，H-4，H-5，H-6，H-6)，δ2.65(s，6H，Me₂NSO₂-).

ESI-MS：calcd for C₁₄H₂₁N₄O₈S[M+H]⁺405.1，found 405.1

荧光极大波长:570nm

(1-3)2,6-二脱氧-6-[F]氟-2-[N-(7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑-4-基)氨基]-L-葡萄糖(6-F-2-NBDLG)的合成

结构式如下所示。

作为其它的本发明的荧光标记L-葡萄糖衍生物的6-F-2-NBDLG按照以下方式进行合成(合成方法1)。

2-苄氧基羰基氨基-2-脱氧-L-吡喃型葡萄糖

将盐酸L-氨基葡萄糖(1.65g)溶解于水(25ml)和丙酮(25ml)。依次加入Z-ONSu(2.1g)、丙酮(25ml)、三乙基胺(2.8ml)，在室温搅拌。4小时后，通过减压浓缩将有机溶剂和水除去。滤取生成的沉淀(目标物)，水洗后减压下干燥由此得到白色固体。

收量:1.75g

收率:73％

2-苄氧基羰基氨基-2-脱氧-6-O-三苯基甲基-L-吡喃型葡萄糖

将2-苄氧基羰基氨基-2-脱氧-L-吡喃型葡萄糖(1.35g)在氩气氛下溶解于吡啶(80ml)，加入三苯基氯甲烷(5.92g)，加温至70℃进行搅拌。2小时后放冷，通过减压浓缩将有机溶剂除去，进行甲苯共沸。将得到的残渣通过硅胶柱色谱法进行精制，收集目标馏分，通过减压浓缩得到白色固体。

收量:2.2g

收率:92％

苄基3,4-二-O-苄基-2-苄氧基羰基氨基-2-脱氧-6-O-三苯基甲基-L- 吡喃型葡萄糖苷

将2-苄氧基羰基氨基-2-脱氧-6-O-三苯基甲基-L-吡喃型葡萄糖(2.1g)在氩气氛下溶解于二甲基甲酰胺(36ml)，加入苄基溴(713μl)搅拌。将反应混合物冷却至0℃，加入氢化钠(60％含量433mg)搅拌。1小时后追加氢化钠(60％含量43mg)。2小时后加入冰，然后，使用乙酸乙酯萃取，用饱和食盐水进行清洗。用硫酸钠干燥有机层，滤去硫酸钠。通过减压浓缩得到残渣，使用硅胶柱色谱法将其精制。收集目标馏分，通过减压浓缩得到油状化合物。

收量:2.0g

收率:64％

苄基3,4-二-O-苄基-2-苄氧基羰基氨基-2-脱氧-L-吡喃型葡萄糖苷

将苄基3,4-二-O-苄基-2-苄氧基羰基氨基-2-脱氧-6-O-三苯基甲基-L-吡喃型葡萄糖苷(2.0g)溶解于甲醇(40ml)和氯仿(4ml)。加入4.4M-氯化氢-二烷溶液(8ml)搅拌。2小时后，通过减压浓缩得到残渣，将其通过硅胶柱色谱法进行精制。收集目标馏分，通过减压浓缩得到白色固体。

收量:650mg

收率:46％

苄基3,4-二-O-苄基-2-苄氧基羰基氨基-2,6-二脱氧-6-氟-L-吡喃型葡萄糖苷

在氩气氛下，将苄基3,4-二-O-苄基-2-苄氧基羰基氨基-2-脱氧-L-吡喃型葡萄糖苷(95mg)溶解于二氯甲烷(1.6ml)并搅拌，冷却至-20℃。加入三氟化N,N-二甲基氨基硫(107μl)并搅拌，升温至室温。2小时后，加入甲醇，使用饱和碳酸氢钠水和乙酸乙酯进行萃取。合并有机层用饱和碳酸氢钠水和饱和食盐水清洗。用硫酸钠干燥有机层，滤去硫酸钠。通过减压浓缩得到残渣，将其用硅胶柱色谱法进行精制。收集目标馏分，通过减压浓缩得到白色固体。

收量:63mg

收率:66％

盐酸2-氨基-2,6-二脱氧-6-氟-L-吡喃型葡萄糖

将苄基3,4-二-O-苄基-2-苄氧基羰基氨基-2,6-二脱氧-6-氟-L-吡喃型葡萄糖苷(62mg)溶解于氯仿/甲醇/1M-HCl＝3/6/1(5ml)并搅拌。加入钯-黑(40mg)并搅拌，用氢置换。8天后滤去钯-黑，通过减压浓缩得到油状化合物。

收量:23.1mg

收率:100％

2,6-二脱氧-6-氟-2-[N-(7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑-4-基)氨基]-L-吡喃型葡萄糖(6-F-2-NBDLG)

将盐酸2-氨基-2,6-二脱氧-6-氟-L-吡喃型葡萄糖(23.1mg)溶解于二甲基甲酰胺/水＝10/1(2ml)并进行搅拌。加入NBD-F(23.2mg)，进一步加入三乙基胺(32.4μl)，加热至37℃。2小时后加入乙酸进行中和，加入水后通过膜过滤器。将滤液与清洗液合并由HPLC进行精制。收集目标馏分并进行冷冻干燥，得到红色固体。

收量:11.5mg

收率:32％

¹H-NMR(400MHz、重水、ppm)：

δ8.43(d，1H，J＝8.9Hz，H6’)，δ6.49andδ6.45(d x 2，0.5H x 2，J＝9.2Hz and J＝9.2Hz，H5’)，δ5.33(d，0.5H，J＝2.3Hz，H-1α)，δ4.89(d，0.5H，J＝7.8Hz，H-1β)，δ4.48-δ4.63(m，1H，H-2)，δ3.90-δ4.00(m，1H，H-3)，δ3.52-δ3.71(m，3H，H-4，H-5，H-6).

ESI-MS：calcd for C₁₂H₁₄FN₄O₇[M+H]⁺345.1，found 345.0

激发极大波长：472nm

荧光极大波长：538nm

另外，6-F-2-NBDLG也可按照以下进行合成(合成方法2)。

此处，使用K¹⁸F代替KF，能够合成作为其它的本发明的荧光和放射性标记的L-葡萄糖衍生物的6-¹⁸F-2-NBDLG。

参考例1：比较化合物的合成

(1)荧光标记D-葡萄糖衍生物的合成

(1-1)2-NBDG的合成

2-NBDG可根据非专利文献5记载的方法进行合成。

(1-2)荧光标记L-甘露糖的合成

本发明中作为键合荧光基团的糖骨架，可使用自然界中大量存在的天然型6碳糖D-葡萄糖的镜像异构体即自然界未发现的非天然型L-葡萄糖。另一方面，同样作为以自然界大量存在的6碳糖D-甘露糖的镜像异构体即非天然型L-甘露糖为骨架的荧光标记L-甘露糖衍生物，本发明人等全新合成出2-脱氧-2-[N-(7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑-4-基)氨基]-L-甘露糖(2-NBDLM)。

苄基4,6-O-苯亚甲基-α-L-吡喃型葡萄糖苷

将L-葡萄糖(6g)悬浮于苄醇(173ml)。室温下滴加三甲基氯硅烷(42.3ml)，在60℃进行搅拌。5小时后，向反应溶液中加入醚、水进行萃取。将得到的水层用醚清洗，将水层冷冻干燥。将得到的固体溶解于二甲基甲酰胺(150ml)。在氩气氛下，依次加入对甲苯磺酸一水合物(633mg)、苯甲醛二甲基缩醛(7.5ml)，在70℃进行搅拌。搅拌3小时后，追加苯甲醛二甲基缩醛(2.5ml)。进一步搅拌6小时后，恢复至室温，搅拌一夜。搅拌一夜后，向反应溶液加入乙酸乙酯和饱和碳酸氢钠水进行萃取。将得到的有机层用饱和食盐水清洗后，用无水硫酸镁进行干燥，将其滤去之后进行减压浓缩。将得到的固体用乙醇进行重结晶。

收量:2.50g

收率:21％(2工序)

苄基2-叠氮基-2-脱氧-4,6-O-苯亚甲基-α-L-吡喃型甘露糖苷

将吡啶(449μl)溶解于二氯甲烷(150ml)。在氩气氛下，在-30℃滴加三氟甲磺酸酐(257μl)。10分钟后，加入苄基4,6-O-苯亚甲基-α-L-吡喃型葡萄糖苷(500mg)，在-30℃搅拌。2小时后，向反应溶液中加入氯仿、饱和食盐水进行萃取。将得到的有机层用无水硫酸钠进行干燥，将其滤去后，进行减压浓缩。将得到的油状化合物溶于二甲基甲酰胺(10ml)，在氩气氛下，加入叠氮化钠(272mg)在50℃进行搅拌。3小时后，追加叠氮化钠(635mg)室温进行搅拌。进一步地，46小时后追加叠氮化钠(906mg)，室温搅拌。20小时后，向反应溶液中加入醚、水进行萃取。将得到的有机层用水清洗后，用无水硫酸镁干燥，将其滤去后进行减压浓缩。将得到的残渣通过硅胶柱色谱法进行精制，得到目标物。

收量:172mg

收率:32％

2-脱氧-2-[N-(7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑-4-基)氨基]-L-甘露糖 (2-NBDLM)

将苄基2-叠氮基-2-脱氧-4,6-O-苯亚甲基-α-L-吡喃型甘露糖苷(172mg)溶于甲醇(5ml)、2M-HCl水(449μl)。在氩气氛下，加入10％Pd(OH)₂/C(43mg)，添加氢进行搅拌。20小时后，滤去10％Pd(OH)₂/C，进行减压浓缩。将得到的油状化合物用水溶解后，用醚清洗，将水层减压浓缩。将得到的油状化合物溶于二甲基甲酰胺(2ml)、水(387μl)。室温下，依次加入NBD-F(82mg)、三乙基胺(124μl)进行搅拌。1.5小时后，用醋酸(80μl)淬灭，通过HPLC进行精制。收集目标馏分进行冷冻干燥。

收量：37mg

收率：24％

¹H-NMR(400MHz、重水、ppm)：

δ8.44(d，1H，J＝9.1Hz，H6’)，δ6.55andδ6.51(d x 2，0.5H x 2，J＝9.1Hz and J＝9.1Hz，H5’)，δ5.24andδ5.09(0.5H x 2，H-1)，δ3.35-δ4.14(m，6H，H-2，H-3，H-4，H-5，H-6，H-6).

ESI-MS：calcd for C₁₂H₁₅N₄O₈[M+H]⁺343.1，found 343.0

激发极大波长：472nm

荧光极大波长：539nm

实施例2：使用移植了肿瘤细胞(C6神经胶质瘤)的小鼠的研究

(实验方法)

(1)移植用大鼠神经胶质瘤细胞(C6)的制备

按照常规方法以细胞数为2×10⁷cells/mL制备C6细胞。

(1-1)C6细胞的培养

将C6细胞移植于10cm培养皿，在CO₂培养箱中静置，在37℃培养。每2天更换一次培养液。

(1-2)用于培养C6细胞的培养液的组成

向含有1g/L葡萄糖的Dulbecco′s modified Eagle′s Medium(DMEM)(Nacalai No.08456-65)中添加Fetal Bovine Serum(Equitech-Bio SFBM)使其终浓度为10％，另外添加青霉素-链霉素(Nacalai No.26253-84)使其终浓度为1％，使用如上的培养液。

(2)肿瘤模型小鼠的制作

对5～6周龄的胸腺缺失的裸鼠(BALB/cAJcl-nu/nu)，在异氟醚麻醉下，将50μL制备为2×10⁷cells/mL的细胞悬浮液在右后肢根部附近的皮下进行移植。进行观察直到移植后的肿瘤细胞生长至大约200～300mm³左右，用于活体荧光成像的摄像。

(3)使用C6肿瘤模型小鼠的活体荧光成像

将C6肿瘤模型小鼠在异氟醚麻醉下静置于活体荧光成像装置IVIS(注册商标)Kinetics(Caliper Life sciences)，测定小鼠皮肤的自身荧光，然后立刻将溶于生理盐水的2-NBDLG或2-NBDG 400nmol(100μL)由尾静脉经30秒进行给药，从给药开始1分钟后再次开始测定荧光成像。活体荧光成像是使用激发波长为465nm、GFP滤色器(透过荧光波长为515-575nm)进行测定。测定进行45分钟，在最初的20分钟内每1分钟进行摄像，在20～45分钟内每5分钟进行摄像，总计获得25张图像。通过从给予2-NBDLG或2-NBDG后撮像得到的25张图像中减去各自的自身荧光的图像，从而求得感兴趣区域中的2-NBDLG和2-NBDG的累积值(荧光值)。

(3-1)2-NBDLG和2-NBDG溶液的制备

就在实验开始前，将0.5mg 2-NBDLG或2-NBDG的小瓶溶于400μL生理盐水，制备终浓度为400nmol/100μL的溶液。

(实验结果)

图1是对在右后肢根部移植肿瘤细胞(C6神经胶质瘤)的裸鼠给予2-NBDLG后每隔1分钟获得的荧光图像。数字表示给予后的时间。2-NBDLG是在箭头表示的部分以400nmol/100μL的浓度通过尾静脉经30秒钟给予。与给予2-NBDG(图2)的情形相比，2-NBDLG在肿瘤移植部出现强的富集，由于正常组织中几乎没有摄入，因此在短时间内能够获得优异的对比度。此处，使用未进行绝食的小鼠。图2是在与给予2-NBDLG相同的条件下给予2-NBDG后每隔1分钟获得的荧光图像。可知在背部、脊骨之间的脂肪组织、肌肉等中确认2-NBDG(由黄色表示)强的富集，很难形成与肿瘤移植部的对比。

另外，将作为感兴趣区域而设定的右后肢根部附近的肿瘤细胞移植部分(Tumor+Glc)与靠近颈部的背侧脂肪细胞丰富的部分(BG+Glc)中的2-NBDLG和2-NBDG各自的累积值的经时变化示于图3。由图2可知，给予2-NBDG时，给予后立即在靠近颈部的背侧的脂肪细胞丰富的部分出现富集。给予后大约5分钟后以后，发现向移植肿瘤细胞的部分富集，但是与靠近颈部的背侧脂肪细胞丰富的部分之间的对比度不充分。与此相对，给予2-NBDLG时，由图1可知，给予后大约5分钟后以后，发现向移植肿瘤细胞的部分特异性地富集，在与靠近颈部的背侧脂肪细胞丰富的部分之间得到高的对比度。这一结果也得到了图3所示结果的支持。即，在2-NBDG给予例中，正常组织(红色四角，BG)的荧光值比肿瘤移植部(蓝色菱形，Tumor)大，与此相对，在2-NBDLG给予例中，肿瘤移植部(蓝色菱形，Tumor)总是比正常组织(BG)明亮。在全部6个例子中均得到同样的结果。由以上结果可以看出在判定是不是肿瘤细胞时2-NBDLG的有效性。

实施例3:由小鼠胰岛瘤细胞(MIN6)构成的肿瘤细胞块的使用2-NBDLG的成像

(实验方法)

(1)小鼠胰岛瘤细胞(MIN6)的制备

将以10×10⁴cells/mL的比例使MIN6细胞悬浮的培养液利用移液器进行分散，滴加在盖玻片上之后，在5％CO₂培养箱中静置20分钟，使其附着在玻璃面上，加入3mL培养液进行培养。每2天更换1次一半的培养液。

(1-1)MIN6细胞的培养

将MIN6细胞(由大阪大学宫崎纯一教授提供，且进行6-9次传代的细胞)移植于10cm培养皿，在CO₂培养箱中静置，在37℃培养。每2天更换一次一半的培养液。

(1-2)用于培养MIN6细胞的培养液的组成

将含有高葡萄糖的Dulbecco's modified Eagle's Medium(DMEM-HG)(SIGMA#D5648)13.4g、NaHCO₃(Wako，No.191-01305)3.4g、2-巯基乙醇(Wako，No.135-14352)5μL溶于1L超纯水(Mili Q)中，使其与外界大气平衡。接下来使用1N HCl，在37℃的CO₂培养箱中将pH调节为pH 7.3-7.35，通过抽滤进行灭菌。就在使用前添加Hyclone Fetal Bovine Serum(Cat#SH30070.03)使得终浓度为10％，另外添加青霉素-链霉素(Gibco#15140)使得终浓度为0.5％。

(1-3)以10×10⁴cells/mL的比例使MIN6细胞悬浮的培养液

对MIN6细胞，以细胞数为10×10⁴cells/mL，使用培养液进行调整。

(2)2-NBDLG溶液的制备

将0.5mg 2-NBDLG小瓶的全部一瓶溶于图像获得用HEPES溶液14.6mL，得到终浓度为100μM的2-NBDLG溶液。

(2-1)图像获得用HEPES溶液

NaCl 131.8mM，KCl 4.75mM，KH₂PO₄ 1.19mM，MgCl₂ 1.2mM,CaCl₂ 1mM，NaHCO₃ 5.0mM，2.8mM D-葡萄糖，HEPES 10mM(用1M NaOH调整到pH 7.35)。应予说明，以阻碍经由半通道的荧光标记葡萄糖的出入为目的，加入0.1mM Carbenoxolone(SIGMA#C4790)。应予说明，该图像获得用HEPES溶液，作为制备2-NBDLG溶液的溶液使用，另外作为制备2-NBDLG/2-TRLG溶液的溶液使用。

(3)对MIN6细胞给予DAPI溶液

将附着MIN6细胞培养10-13天的盖玻片转入装满35mm表面皿的含有D-葡萄糖5.6mM的DAPI溶液中，在37℃一边加温一边静置45分钟至1小时使细胞摄入DAPI。在另一实验中，进行在共聚焦显微镜上一边连续观察一边给予DAPI的实验，能够确认在实验时间内未发现由给予DAPI以及405nm的激光照射导致的细胞的形态变化。

(3-1)DAPI溶液的制备

将4’,6-二脒基-2-苯基吲哚DAPI(No.049-18801，Wako PureChemical Industrie，Osaka)以100mg/mL的比例溶于含有10％DMSO的水溶液，并将其冷藏保存，使用时，用作为DAPI调整用的含有5.6mMD-葡萄糖的HEPES溶液稀释至100倍使用。

(4)使用金属引导(金属ガイド)将培养MIN6细胞的盖玻片在荧光测量用灌流室内的固定方法

向在激光扫描共聚焦显微镜(Leica公司TCS SP5)上的万用旋转台(Leica 11600234)上设置的灌流室内的图像获得用HEPES溶液中，移入培养MIN6细胞的盖玻片，轻轻密合在室底部的玻璃面上。静置后，从左右与盖玻片长轴平行地使用2枚长方形的金属引导(长10mm、宽2mm、厚0.7mm、银制)将盖玻片的两侧压住，通过小心地按压，即使进行冲洗，盖玻片也不会移动。另外，在这2枚金属引导所夹住的空间内，灌流液以层流的形式顺利流过，能够达到快速进行液体更换这样优异的效果。

(4-1)激光扫描共聚焦显微镜旋转台上的荧光测定用灌流室

在底部开有物镜所用圆孔(直径18mm)的铝制加温控制平台(PH1、Warner Instruments，USA，通过温度控制装置TC-324加温至37℃，Warner Instruments)上，使用硅脂(HIVAC-G，Shin-Etsu Silicone，Tokyo)使盖玻片(宽24mm×长50mm，厚No.1，Warner InstrumentsNo.CS-24/50)与平台中央的圆孔以外的部分密合。接下来，在盖玻片上载置中央进行了流线型地开孔加工(按照与玻璃底面接触侧宽10mm×长35mm、曲率半径33mm，不与玻璃面接触侧即上方略大的方式进行加工)的厚1mm的硅板(宽20mm×长50mm)，不使用硅脂将其与盖玻片密合。

在硅板上的流线型孔的上游角落设置前端是平的、粗细为20gauge的卡特兰注射针，将其作为进口。

用于排出灌流液的不锈钢管(出口)，可使用按照非专利文献16记载的方法将前端部分弄平的基础上斜向切割而成的构件(如果加工起来困难，也可以改用将Warner公司的RC-24N等塑料制灌流室所附带的不锈钢出口拉伸为直线型而得的构件)，抽真空时，通过将空气和溶液二者同时吸取从而形成稳定的方式。

(5)向灌流室供给灌流液的系统

(a)灌流液的加温和向灌流室的供给

灌流液供给系统具有1支对照溶液用60mL注射筒和5支药剂供给用10mL注射筒，通过电磁阀能够随时切换进行灌流。在与本发明相关的实验中，使用60mL注射筒给予含有2.8mM葡萄糖的图像获得用HEPES溶液，使用系统具有的5支10mL注射筒中的1支给予2-NBDLG和2-TRLG的混合溶液。如以下所述，为了二者在灌流室内不产生气泡，首先进行加温，然后在向灌流室导入之前合并于1支管，使用流量调节器进行速度调节，再次用在线加热器加温，供给到共聚焦显微镜上的灌流室。

图像获得用HEPES溶液，由在铝制注射器加热器(Model SW-61,温度控制单元No.TC-324B，Warner Instruments)中加温的60mL注射筒，与用于冲洗溶液供给线的管内的三通活塞相连，接下来介由细地气体通过性低的软管(Pharmed管，AY242409，Saint-GobainPerformance Plastics，Ohio)连接到超小型电磁阀(EXAK-3，3way cleanvalve，Takasago Electric，Nagoya)的normally open一侧。电磁阀的开关由脉冲发生器(Master8，AMPI公司，Israel)控制。对于图像获得用HEPES溶液，使用蠕动泵(MCP pump 12rollers、Ismatec)，从试剂瓶向60mL注射筒内持续供给，实验中按照使注射筒内溶液上表面的高度不发生变化、与溶液下降速度相等地精密调整泵的溶液供给速度。由于蠕动泵的溶液供给速度以数字表示，所以如果实验中对灌流室的溶液供给速度产生变化，则可通过溶液面的高度变化而立即获知。这样因为该溶液时时更新，所以为了维持液体温度，将注射器加热器SW-61设定在38.5℃。

另一方面，2-NBDLG和2-TRLG的混合溶液，由设置在注射器加热器(Model SW-6，温度控制单元是No.TC-324,Warner Instruments)而加温到37.5℃的10mL注射筒来供给。该注射筒介由三通活塞连接在与图像获得用HEPES溶液不同的电磁阀的normally closed一侧，通过脉冲发生器的控制与对照溶液随时切换地供给。注射器加热器SW-6中可设置6支10mL注射筒，在1支中加入蒸馏水并插入加热块的温度监测用探头。

作为对照溶液的图像获得用HEPES溶液、和2-NBDLG与2-TRLG的混合溶液，从电磁阀的出口出来后，通过6端口的小型多支管(MPP-6,Warner Instruments)集中在1支内。MPP-6多支管的出口与短的Pharmed管连接，将该管连于能利用螺杆增减打开程度的流量调节器，通过调节打开程度将流量调整为1.2±0.2mL/分钟。该Pharmed管以最短距离与在线加热器(Multi-Line In-Line Solution Heater SHM-8，温度控制单元是TC-324B，Warner Instruments)连接。这是为了将导入灌流室的溶液温度在即将导入前进行加温。SHM-8在线加热器的温度与灌流速度相配合，按照室中的灌流液的实测温度在盖玻片存在的区域中为36-37℃的方式进行调整。加温的溶液介由短的Tigon管(R-3603,inner diameter 1/32 inch)以最短距离与配置于灌流室上游的不锈钢管(进口)进行连接，向灌流室内供给。

来自注射筒的溶液供给由于用静水压决定供给压力，所以为了不发生高度的差异造成灌流速度的差异而带来室内的水面高度的变化，对于2-NBDLG溶液而言因为给予时间短所以在一次的实验中不在实验中进行液体供给，而是每结束一个实验按照液体的上表面与不含有荧光葡萄糖的HEPES溶液达到几乎相同的高度来追加溶液。另外，通过调整与注射筒连接的管的长度和粗度，按照以与作为对照溶液的图像获得用HEPES溶液的灌流速度相同的速度排出的方式来进行仔细调整，从而能够避免液体交换所致的液面变动。另外，实验结束后以及开始之前，将管内部进行充分冲洗确保平滑的流动。

(b)灌流室内的层流的确保以及灌流液的去除

从灌流室上将灌流液顺利且快速除去，是在得到重现性高的结果的方面最为重要的一点。将灌流液的排出用不锈钢管(出口)用Tigon管依次导入二个大型的玻璃阱(ガラストラップ)，用真空泵(DAP-15,ULVAC KIKO,Inc)缓慢抽吸。抽吸压力是用在二个大型玻璃阱中间在从抽吸线路分支出的线路上设置的压力计进行检测的，通过控制三通活塞的开闭程度将压力调整为35kPa。

灌流室内的层流的确保，首先将蓝色色素(Pontamine sky blue，稀释到1％以下浓度使用)溶液滴加在进口附近，确保液流的左右对称性、均匀性和重现性。

使用极细热敏电阻探头(Physitemp公司IT-23)确认室内灌流溶液中各部分的温度(非专利文献16)。另外，为了防止因在出口前端部实验中附着源自HEPES溶液的盐而抽吸压力变化，用设置于室上的手术显微镜(POM-50II，KONAN MEDICAL，西宫)对每个实验进行确认，并进行清洁。该显微镜另外在盖玻片向室的设置时、在液流的状况、室的异常的确认等中也是有用的。

(6)图像获取条件

以常规模式使用激光扫描共聚焦显微镜(Leica制TCS-SP5系统，显微镜本身是DMI6000CS trino电动倒置显微镜)。对于使用激光而言，用于核染色的DAPI是使用405nm二极管激光器由声光可调滤光器(Acoustic Optical Tunable Filter，AOTF)20％进行激发的，2-NBDLG和2-TRLG是使用488nm由30-60％的Argon laser main power、20-60％的AOTF进行激发的。扫描速度是200Hz或400Hz。

对于荧光检测而言，在DAPI所致的蓝色荧光的检测中，在415-500nm的波长检测范围(检测灵敏度750V)内使用photomultiplier检测器(PMT)1，在2-NBDLG所致的绿色荧光的检测中，在500-580nm的波长检测范围内使用(检测灵敏度670V)PMT2(命名为绿色通道，以下相同)。以上的蓝(415-478nm)、绿(500-580nm)的荧光检测波长区域的分选，不通过通常所用的Emission滤色器方式，而是以将棱镜分光和狭缝组合的方式(Leica，TCS-SP5的标准)获得。分光器使用500nm(RSP500)。405nm用分光器是在SP5系统中与上述独立地成为415nm的固定模式。该实验中，在荧光激发时，最初使用488nm激发而得到2-NBDLG给药方案的随时间经过的图像，之后，重新通过405nm激发通过xyz模式获得在z轴方向的深度不同的核的状态。

为了捕捉立体的肿瘤细胞块的结构特征而使用的微分干涉(DIC)图像的获得是在488nm激发时同时使用透射光用检测器PMT Trans进行检测(典型的检测灵敏度是145-200V)而得到的。为了避免将微分干涉方式(DIC)的图像获得所需要的偏光仪、分析仪添加到光路中时的切换时间或切换冲击的问题，在利用405nm激发而获得图像时，也保持将DIC用偏光仪和分析仪添加到光路中的状态。

该方法中，需要在xy轴的高分辨率和将细胞块整体包含在视野内的视角，物镜以光圈打开地使用高分辨率的×40oil透镜(HCX PL APOCS 40.0×1.25OIL UV，NA1.25)。为了得到获得荧光强度将Pinhole尺寸设置为3airy unit。即使在该pinhole尺寸，也可在获得图像中确认在z轴方向将细胞内的核与细胞质实用地进行区别。不使用变焦(1倍)，以1024×1024的像素数，为了降低噪音而进行二次扫描，将其平均图像(Line average)以12bit的深度获得图像。

应予说明，以上的溶液的给予以及所有的图像获得，在24小时保持一定室温(24℃)的暗室内进行。

(实验结果)

图4表示对产生胰岛素的肿瘤细胞(MIN6)给予荧光标记L-葡萄糖衍生物2-NBDLG的结果。2-NBDLG被大量细胞立体地聚集并呈现异常核的细胞块摄入。A是2-NBDLG给予前的荧光图像(Excitation488nm，Emission 500-580nm)。细胞的存在可通过微弱的自身荧光进行确认。B是用含有100μM 2-NBDLG的HEPES溶液灌流细胞3分钟，接着用不含有2-NBDLG的HEPES溶液进行清洗而在其结束后立刻得到的荧光图像。画面上的细胞块(a)中，发现2-NBDLG的强烈摄入。C是微分干涉显微镜(DIC)图像与荧光图像B的重叠。细胞块a下方以点存在的两个细胞，由DIC像可确认状态恶化。D是使用DAPI的核染色图像。DIC图像中看起来十分相似的细胞块a和b中，细胞块b的细胞显示正常的核状态，与此相对，细胞块a中存在发出强光的显示异常核状态的细胞。仅在a中发现2-NBDLG的显著的摄入。A-D是共聚焦显微镜图像。以下进行更为详细地说明。

细胞块a和细胞块b是共同培养11天后的小鼠胰岛瘤细胞(MIN6)的大量细胞的集合体。对于向这些细胞供给的灌流液，从含有2.8mM葡萄糖的图像获得用HEPES溶液，通过电磁阀的操作替换为在同样的溶液中含有2-NBDLG(100μM)的溶液，从细胞外给予3分钟之后，换回图像获得用HEPES溶液，将2-NBDLG溶液洗净。2-NBDLG被摄入细胞内的情形，反映在给药前后的荧光强度的差。图像A和图像B，是捕捉2-NBDLG发出的绿色荧光的绿色通道图像(检测波长区域500-580nm)。图像A(即将给予前的荧光图像)中，由于细胞具有源自黄素蛋白等的自身荧光，所以发出淡淡的绿色光。其强弱因细胞不同而不同，细胞块c中自身荧光略强，可知状态不太好。图像B(刚刚给予后的荧光图像)中，细胞块a中发现对2-NBDLG非常强的摄入的细胞。由于荧光葡萄糖衍生物通常不侵入核内，所以这些细胞核非常干净。另一方面，由细胞块b可以看出，是完全相同种类的肿瘤细胞，而且即使是开始立体聚集的细胞块，也仅发现有略微的2-NBDLG的摄入。对于细胞块c，给予前自身荧光略强，但是几乎没有发现给予后荧光强度的增加。图像C是使微分干涉(DIC)图像与刚刚给予后的绿色通道图像重叠而得的图像。细胞块a和细胞块b中，可知2-NBDLG的摄入的情形有很大区别。图像D是在实验结束后将4,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐(DAPI)给予细胞进行核染色的图像。将图像B与图像D进行对比可知，在中心部没有出现异常核显示与正常细胞相同的核状态的细胞块(细胞块b)、二维的·平面的聚集阶段的细胞块(细胞块c)中，基本没有发现2-NBDLG的摄入。另一方面，发展到在中心部产生异常核的阶段的细胞块a的细胞中，可知出现了强摄入2-NBDLG的细胞。此处，图像D中共聚焦显微镜的焦点深度，由于按照DAPI向异常核的摄入最大的焦点深度进行拍摄照片，所以形成与图像A-C中看到的焦点深度不同的截面的断层照片。即，通过xyz扫描提示了在肿瘤细胞块中，异常核出现的层与2-NBDLG摄入强的层不同。这一事实在下面的实施例4中更加清楚。应予说明，图像A、B、D中的细胞块c在共聚焦显微镜的焦点深度外，然而，对于细胞块c的上述记述是在其它焦点深度进行确认的。

通过这些情况可判定以下情况。从利用以获知肿瘤细胞的恶性程度为目而给予的DAPI可视化了的核染色图像中，在摄入2-NBDLG的肿瘤细胞块(a)中，包含大量显示巨大核等恶性程度高的核状态的癌细胞，然而在完全是相同种类的肿瘤细胞但几乎没有摄入2-NBDLG的肿瘤细胞块(b)中，没有发现显示这种异常核状态的癌细胞(图4B和4D的比较)。因此，如果利用适当设计的由荧光标记了的L-葡萄糖衍生物，从而能够通过L-葡萄糖衍生物的摄入的不同将在由相同种类的癌细胞构成的癌组织中存在的细胞状态的不同可视化并进行评价。

实施例4:使用2-NBDLG和2-TRLG对由小鼠胰岛瘤细胞(MIN6)构成的肿瘤细胞块成像

(实验方法)

(1)小鼠胰岛瘤细胞(MIN6)的制备

与实施例3同样进行。

(2)2-NBDLG溶液以及2-NBDLG+2-TRLG混合溶液的制备

2-NBDLG+2-TRLG混合溶液的制备

将0.1mg 2-TRLG小瓶转移至干燥器内并恢复至室温。由于2-TRLG难溶于水，所以在暗处使用65μL刚开封后的二甲基亚砜(DMSO，Nacalai Tesque No.13408-64)溶解该2-TRLG小瓶的全部量。2-NBDLG溶液以与实施例3所述的方法相同的方法在即将实验前制备成终浓度为100μM，按照非专利文献16记载的方法向其中加入上述的2-TRLG/DMSO溶液，使2-TRLG浓度为20μM。具体而言，首先取上述2-NBDLG溶液6.5mL，快速搅拌。接下来使用可忽略枪头壁附着的RAININ制枪头(Mettler Toledo)将40μL DMSO加入2-TRLG小瓶，连同小瓶使用搅拌器进行搅拌使其溶解。通过停止旋转将附着在壁上的2-TRLG收集在底部，使用同一枪头由移液枪全部取出，将其溶解于搅拌中的2-NBDLG溶液。2-TRLG小瓶中略有残留的2-TRLG，以与上述相同的方法使用25μL DMSO进行回收，并进一步溶于2-NBDLG溶液。通过以上的方法，能够重现性良好地制备终浓度为100μM2-NBDLG+20μM 2-TRLG的混合溶液。

(3)2-NBDLG+2-TRLG混合溶液的给予方法以及图像获得方案

(a)100μM 2-NBDLG+20μM 2-TRLG混合溶液的给予

将肿瘤细胞块整体完全覆盖地给予100μM 2-NBDLG+20μM2-TRLG混合溶液3分钟。给予液将细胞块全部覆盖的情形，每次必需通过获得给予过程中绿、红各波长区域的荧光图像以及透射光图像进行确认。停止荧光葡萄糖混合溶液的供给的同时更换为不含有荧光葡萄糖的HEPES溶液，1分钟后背景荧光达到可以忽视的程度。

(b)具体的图像获得条件

图像获得是按照实施例3的方法，在实验开始后立即开始获取混合溶液给予前的图像，以后每隔2分钟直至实验结束为止获得蓝、绿、红各波长区域的荧光图像以及透射光图像。对于所用的激光，用于核染色的DAPI是使用405nm二极管激光器(AOTF 20％)进行激发，2-NBDLG和2-TRLG是使用488nm氩激光器(输出50％、AOTF 28％)进行激发。扫描速度为400Hz。

在荧光检测中，三个荧光检测器按照以下方式使用。对于DAPI所致的蓝色荧光的检测是在415-500nm的波长检测范围(检测灵敏度750V)使用photomultiplier检测器(PMT)1，对于2-NBDLG所致的绿色荧光的检测是在500-580nm的波长检测范围(检测灵敏度670V)使用PMT2，另外，对于红色荧光的检测是在580-740nm的波长检测范围(检测灵敏度670V)使用PMT3。此处，由于2-TRLG的荧光大部分存在于580nm以上，在580nm以下基本没有荧光成分，因此对PMT2的500-580nm的荧光强度基本没有影响。因此，2-TRLG在细胞内的检测量增加时，其效果主要体现在PMT3的580-740nm的荧光强度的增加。与此相对，2-NBDLG荧光强度的峰在540-550nm附近，但在580-740nm区域也有荧光。因此，2-NBDLG在细胞内的检测量增加时，在PMT2所检测的500-580nm的荧光强度增加的基础上，PMT3所检测的580-740nm的荧光强度也增加。此时，例如，只有2-NBDLG在细胞内的检测量增加而2-TRLG没有侵入细胞内时，PMT3所检测的580-740nm荧光波长区域的2-NBDLG的荧光强度与PMT2所检测的500-580nm荧光波长区域的2-NBDLG的荧光强度之比，依赖于2-NBDLG的浓度、检测器等的灵敏度特性以及激发光强度，存在一定关系。另一方面，2-NBDLG被摄入细胞内时，在此基础上，2-TRLG也侵入细胞内时，对于PMT3所检测的580-740nm荧光波长区域的2-NBDLG的荧光强度而言，在由上述关系可预测的与给予前相比荧光强度的增加的基础上，还能够检测到荧光强度进一步的增加。该荧光强度增加的上限能够从给予的100μM 2-NBDLG+20μM 2-TRLG混合溶液在500-580nm的荧光强度与在580-740nm的荧光强度之比而得知，下限是细胞内仅摄入有2-NBDLG时的500-580nm的荧光强度与580-740nm的荧光强度之比，实际情况中，在该下限与上限之间根据2-TRLG侵入细胞内的程度而变化。在实际的方案中，将PMT3的580-740nm的荧光获得的装置设定(即，激发光强度和检测器灵敏度)预先调整到以下程度，即只有2-NBDLG摄入细胞内而2-TRLG没有侵入细胞内时几乎不能检测到荧光强度的增加。由此，即使2-TRLG以微量侵入细胞内时，也能够立即检测到它的侵入。

在以上的蓝(415-478nm)、绿(500-580nm)、红(580-740nm)的荧光检测波长区域的选择中，使用能够同时获得2-NBDLG绿色荧光和2-TRLG红色荧光的500nm(RSP500)的分光器。405nm用的分光器在所用的Leica SP5系统中是415nm固定方式。在荧光激发时，使用最初用检测器PMT1获得405nm激发所致的DAPI图像后获得488nm激发所致的图像的顺序扫描(between frame scan)，但在488nm激发时，通过同时启动PMT2和PMT3两个检测器，能够同时获得2-NBDLG绿色荧光和2-TRLG红色荧光图像。

在实际获取图像过程中，以伴随时间经过捕捉立体的肿瘤细胞块的在各自深度的细胞的荧光变化为目的，实施xyzt扫描，即从荧光标记葡萄糖衍生物开始给予前的3分钟前启动到给药方案结束为止每2分钟重复xyz扫描操作，该xyz扫描操作是将共聚焦显微镜的载物台在z轴方向上移动一定距离来重复以上的xy扫描。此时，由于知道将激光的重复照射所致的荧光退色作为最低限度而且因细胞块中深度的不同导致的细胞应答的不同，所以预先将z轴方向的平台的移动距离设置为8-10μm。具体而言，在图6的例子中，从几乎在玻璃面正上方的Z位置开始沿z轴方向每次移动8-10μm并在不同深度每次扫描1张，合计进行2张或3张的xy扫描，将该操作每2分钟或每4分钟重复一次。该方法中使用×40倍油物镜且使用能够快速的液体交换和样品交换的灌流室，采取以下方式，即在倒置显微镜载物台上的玻璃面上密合附着有细胞的盖玻片并从下侧观察样品。因此，由于工作距离短的高分辨率物镜与玻璃面接触所致的限制，所以将焦点对准具有厚度的肿瘤块的z轴方向的上部结构存在限制。上述z轴方向的载物台的移动距离，也考虑到这一点并进行确定。肿瘤块的整体结构，可通过在给药方案开始前或其它实验中将透镜变更为低倍透镜以进行确认。

(实验结果)

将100μM 2-NBDLG+20μM 2-TRLG的混合溶液给予发展的产生胰岛素的肿瘤细胞块(MIN6)3分钟，将通过激光共聚焦显微镜观察的结果示于图5-9。

(图5～图7)示出给予100μM 2-NBDLG+20μM 2-TRLG混合液前、给予后经过2分钟的时刻、给予后经过4分钟的时刻各自的荧光图像和DIC图像。图像A(利用DAPI的核染色图像)中，发现在左右的肿瘤块各自的中央部存在显示DAPI异常累积的细胞核。图像B是反映2-NBDLG向细胞内摄入的绿色通道图像(500-580nm)。表示利用共聚焦显微镜拍摄的肿瘤块内部的一个截面的荧光图像。以下进行详细说明。

图5是产生胰岛素的肿瘤(MIN6)大量累积的细胞块在给予前的共聚焦显微镜断层图像。A是利用DAPI的核染色图像。在左上以及右下细胞集团各自的中央附近发现非常强的核染色图像。B是绿色通道(500-580nm)的给予前荧光图像。发现有自身荧光。C是红色通道(580-740nm)的荧光图像。在该波长带中，通常自身荧光非常小。D是微分干涉(DIC)图像。E是A-D的重叠图像。

图6是100μM2-NBDLG+20μM2-TRLG溶液给予结束后经过2min时刻的图像。A是利用DAPI的核染色图像。B是反映2-NBDLG摄入的绿色通道的荧光图像。细胞块中心部位发现有强的摄入，在其外侧分散存在有呈现不同程度摄入的细胞。在中心部周围也发现基本没有摄入的细胞。C是强烈反映2-TRLG摄入的红色通道的荧光图像(可以认为2-TRLG和2-NBDLG对在红色通道检测的荧光强度的贡献比例与2-TRLG和2-NBDG对红色通道的贡献比例相同)。如果除了中心部的强摄入以外，则在周边部出现二极化，即强的染色或非常弱的。D是DIC图像。左侧的细胞块中，中心部凹成环形状。E是重叠图像。发现未摄入荧光L-葡萄糖衍生物的细胞、仅仅摄入2-NBDLG的绿细胞、摄入2-NBDLG和2-TRLG的黄细胞、残留2-TRLG所致的荧光的红细胞。

图7是给予100μM 2-NBDLG+20μM 2-TRLG溶液结束后经过4min时刻的图像。在显示异常核状态的细胞块中心部，2-NBDLG已经相当程度排出其荧光强度减弱(B)，但一度摄入了的2-TRLG的荧光尚未减弱(C)。结果，中心部色调与图6不同。呈现DAPI所致的强蓝色的细胞(A)与充分摄入2-NBDLG的绿色细胞在细胞块中心部重叠，但在周边部未必出现重叠。绿色通道和红色通道的具体变化可参考图8～图9。

如上文所述，可知通过使用2-NBDLG，即使在同一细胞块中，也能够识别呈现多种2-NBDLG摄入状态的肿瘤细胞并可视化，例如像在细胞块中心部略外侧存在的细胞这样几乎没有摄入2-NBDLG的细胞、在其外侧存在的非常充分摄入2-NBDLG的细胞、中等程度摄入的细胞等。图7中白箭头示出的细胞，在该图中与在周边的同等程度微弱发出绿色光的细胞，仅通过2-NBDLG的摄入无法将其区别，但是观察同时给予的2-TRLG的摄入情形(参照图8和图9)，则可知与周围的细胞明显具有不同的性质。图像C是主要反映2-TRLG向细胞内摄入的红色通道图像(580-740nm)。图像D是立体的高度聚集的肿瘤块的DIC(微分干涉)图像。左侧的肿瘤细胞块中，细胞块繁盛，中心部呈现以弹坑状略微塌陷的状态。右侧的细胞块，与左侧的细胞块相比呈现高度稍低的状态。与使用针孔的荧光图像不同，在DIC图像中存在于不同焦点面的细胞也会出现焦点略有模糊的状态，但能够观察。图像E是A-D重叠的图像。

(图8和图9)

图8是在从给予100μM 2-NBDLG+20μM 2-TRLG混合溶液结束经过2分钟的时刻将绿和红色通道的荧光图像抽出与DIC图像进行重叠的图像。细胞块中心部呈现充分摄入2-NBDLG和2-TRLG二者的黄色。在其略外侧存在对二者均没有摄入的暗细胞。进而，在其外侧包围有不同程度摄入2-NBDLG的细胞。仅呈现红色的细胞是摄入了2-NBDLG和2-TRLG、通过冲洗迅速排出前者的细胞。细胞块周围的焦点深度不同的细胞，通过荧光图像中的共聚焦效果，在本图的焦点深度没有被图像化。这样，将图6中看到的发出绿色荧光的不同程度摄入2-NBDLG的细胞的存在可视化，在此基础上，还发现也摄入2-TRLG而呈现黄色的细胞。观察图9所示的从给药结束经过4分钟的时刻可知，这些呈现黄色的细胞几乎全部在红色系统的颜色中变化荧光色调。

作为相应的说明，从使用单一神经细胞的其它实验中可以考虑如下。2-TRLG与2-NBDLG一起被摄入细胞状态没有完全死亡但发生中等程度恶化的神经细胞内时，2-TRLG的摄入的经过时间比2-NBDLG的摄入的经过时间要慢，即缓慢地进入，相反，一旦进入细胞内的2-TRLG，即使它的量比2-NBDLG少，虽然从开始冲洗会流出到细胞外但也需要比2-NBDLG更长的时间。因此，将2-TRLG和2-NBDLG二者摄入细胞内而变为黄色的肿瘤细胞，开始清洗后，绿色的2-NBDLG先被排出，红色的2-TRLG残存在细胞内。实际上，图8中，发现不同程度摄入红色的2-TRLG的细胞，但是在2-NBDLG+2-TRLG混合溶液给予中、或者在给予结束后至获得最初图像的平均2次扫描结束之前研究这些细胞的颜色时，其基本呈现黄色。

给予结束后经过2分钟的时刻的图8中白箭头所示的细胞，仍呈现强的黄色，可知与周围的细胞不同，在2-NBDLG基础上，还摄入红色的2-TRLG，但从在给予结束后经过4分钟的时刻的图9同样地白箭头所示的细胞的颜色可知，在这2分钟时间内，绿色的2-NBDLG快速流出到细胞外部，而2-TRLG较多残留于细胞内，结果呈现红色。即，2-TRLG能够起到像记忆那样在一定时间可知曾经有大量2-NBDLG进入的情形的作用。如果不将2-TRLG与2-NBDLG同时使用，则不会发现图7中白箭头所示的细胞是与同样呈现淡绿色的周围的细胞呈现不同摄入图案的细胞。通过与同时给予的2-TRLG的摄入情形综合来观察，可知该细胞处于与初期周围的细胞明显不同的细胞状态。

在实验室以外的实际的各种条件下，将荧光标记葡萄糖与肿瘤细胞接触，考察摄入情况时，考虑到严密地追随时间的经过进行考察大多困难，所以与绿色的2-NBDLG同时使用红色的2-TRLG具有能够识别显示多样性的肿瘤细胞的细胞状态的优点。

图9是在100μM2-NBDLG+20μM2-TRLG混合溶液给予结束后经过4分钟的时刻的将绿色和红色通道的荧光图像抽出与DIC图像重叠而成的图像。细胞块中心部、白箭头的细胞，在图8的时刻，由绿色的2-NBDLG和红色的2-TRLG呈现黄色，但从图8的时刻经过2min后在本图中绿色的2-NBDLG被排出到细胞外，红色的2-TRLG的排出相对较慢，结果与图8相比红色变强。另外，如细胞块边缘所示可知，图8中已经为红色的几个细胞，在本图中红色的2-TRLG也有排出。图9中，肿瘤细胞块中心部的细胞群呈现红色系统(图7中混有DAPI蓝色而呈现粉色)的颜色，这些细胞群在图8中呈现黄色，所以可知在摄入红色2-TRLG和绿色2-NBDLG之后，绿色的2-NBDLG在2分钟以内快速被排出的细胞状态。另一方面，图8中已呈现红色的细胞，例如在细胞块的最外周存在的球形细胞的一部分等推定为2-NBDLG以给予结束后2分钟以内这样快的速度流出到细胞外，这些细胞的红色在图9中已经消失的也很多。即，2-TRLG也在4分钟以内流出到细胞外。这一事实强烈提示这些细胞的膜通透性是非常高的，作为细胞状态可推定处于接近死亡的末期状态。

另外，与这样的细胞比较，图9中，肿瘤细胞块中心部呈现红色系统颜色的细胞群，还不能说处于致命的状态，推定并没非完全死亡。参照这些细胞的核染色状态可知这一推定是得到支持的。

另一方面，图8和图9中，明确地获知对以L-葡萄糖为母核的荧光标记葡萄糖衍生物、即红色的2-TRLG和绿色的2-NBDLG均基本没有摄入的暗细胞以包围细胞块中心部略外侧的部分的形式存在(未重叠微分干涉对比(DIC)图像的图6B和图7B中显现黑色的部分)。由DIC图像可知，该部分并非没有细胞存在。即这些细胞与正常细胞一样，细胞膜保持着对葡萄糖摄入的立体选择性的状态。期待能够将维持这种与正常细胞匹敌的细胞膜状态的肿瘤细胞的存在可视化的这一情况在研究抗癌剂或治疗效果时能够发挥作用。这样对于本发明而言，将以L-葡萄糖为母核的荧光标记葡萄糖衍生物给予含有发展的肿瘤块的细胞群，根据其摄入到每个细胞内的程度，主动对每个肿瘤细胞的细胞状态的不同进行评价，除此之外，还期待以细胞内没有摄入以L-葡萄糖为母核的荧光标记葡萄糖衍生物为基础将这样的细胞浮现，具有作为用于药剂或放射线治疗的效果判定等的标记物进行广泛使用的可能性。

实施例5:

使用荧光酶标仪Flex Station(Molecular Device Japan(株))定量解析使小鼠胰岛瘤细胞(MIN6)分别对2-NBDLG(200μM)和2-NBDG(200μM)进行5分钟摄入时因各种抑制剂的有无而引起的差异。

(1)细胞的制备

用于测定的孔是具有纵A-H 8行、横1-12 12列的孔的96孔透明底微孔板μCLEAR-PLATE(Greiner bio-one，BLACK，96well，#655090)，向该板第3列和第5列的B行至G行的孔中，将按照6×10⁵cells/mL的比例对MIN6细胞制备的细胞溶液均匀地以每孔15μL进行铺板。对于培养液的更换，在0-4DIV(days in vitro)中每2日进行1次半量更换，5DIV以后每天更换，培养至第10-13天(10-13DIV)用于实验。A行和H行中，没有铺种细胞，作为用于检查是否正确进行冲洗的对照使用。另外，第4列中没有细胞，仅将克-林二氏缓冲溶液(KRB，含有缝隙结合抑制剂Carbenoxolone 0.1mM，葡萄糖5.6mM)作为空白使用。

(2)摄入的测量

向8连PCR管分别加入2-NBDLG或2-NBDG，使用8连移液器吸取，向孔内同时滴加，用以上方法进行评价。这样能够向给予2-NBDLG的孔和给予2-NBDG的孔同时给予，能够可靠性较高地进行评价。上述的第3列和第5列这二列中有细胞的孔为12个，将这些孔根据2-NBDLG和2-NBDG的差别和抑制剂有无的差别，以每3孔一组分为4组。具体而言，考察GLUT抑制剂细胞松弛素B(10μM)的有无对2-NBDLG(200μM)和2-NBDG(200μM)的摄入的影响时，首先对于预定在细胞松弛素B存在下进行测量的孔，从给予荧光标记了的葡萄糖衍生物的5分钟前提前给予细胞松弛素B。另外，在给予荧光标记了的葡萄糖衍生物前，测量各孔的自身荧光。Flex Station的测定条件设定为WellScan Mode，Bottom Read，Ex 470nm，Em 540nm,Cut off 495nm,Averaging 3，Photomultiplier灵敏度high。荧光酶标仪Flex Station在Well Scan Mode中，将一个孔中分割为9个观察区域(区域)，各自独立地进行测量。在9个分割的各自区域中，通过实时去卷积显微镜的Zsection测量能够另外确认大约存在5000个细胞。

进行2-NBDG和2-NBDLG、细胞松弛素B有无的给予(37℃、5分钟)，给药结束后，一边使用跑表测量一边重复7次将不含有荧光标记葡萄糖的KRB溶液250μL添加到孔中的50μL溶液的操作，由此进行清洗直至设定为对照组的A行和H行孔显示的荧光强度与没有细胞的空白孔的荧光强度相等。这一过程需要7分钟，细胞膜状态发生破裂的细胞与2-NBDG和2-NBDLG接触后，即使这些化合物已经被摄入细胞内，也由于在测量时刻已经流出到细胞外，所以对于观察区域整体的荧光强度的增加贡献可判断为能够忽视的程度。这一情形通过另外的药理学抑制实验，在抑制剂存在下，荧光强度的增加基本消失而得以证明。上述的方法，对于其它抑制剂的情况也同样地实施。可确认Na⁺-free的KRB液的Na⁺用胆碱取代后渗透压没有变化。

(实验结果)

图10示出利用荧光酶标仪定量评价抑制剂对2-NBDG和2-NBDLG向小鼠胰岛瘤(MIN6)细胞内的摄入的影响的结果。

A显示2-NBDG的摄入因GLUT抑制剂Cytochalasin B(10mM,CB)添加而有意义地减少，由此可知介由葡萄糖转运体GLUT的摄入的存在。另一方面，2-NBDLG的摄入并没有因Cytochalasin B而有意义的降低(N.S.)，这提示其是不介由GLUT的摄入。＊表示相对于2-NBDG给予所致的荧光强度的增加是有意义的变低(p<0.0001，ANOVA，Bonferroni/Dunn)。

B是考察2-NBDG和2-NBDLG是不是介由共同运输Na⁺离子和葡萄糖的葡萄糖转运体SGLT。在将荧光葡萄糖溶于含有Na⁺离子的缓冲液并进行给予的情形和溶于不含有Na⁺离子的缓冲液(Na(-))并进行给予的情形中，2-NBDG和2-NBDLG二者均被摄入细胞内，且没有显著性差异。由于SGLT在没有Na⁺离子存在下不发挥功能，这提示SGLT对MIN6细胞的NBDLG摄入基本没有贡献。

C是对于2-NBDG和2-NBDLG二者，通过GLUT和水通道的共同抑制剂Phloretin(150μM，PHT)能够抑制向MIN6细胞的摄入。提示2-NBDLG向细胞内的摄入，介由被PHT抑制的选择性通路。

应予说明，通过其它实验表明PHT能够抑制2-TRLG向细胞内的摄入，但是本发明没有受到抑制。

实施例6:通过对急性分离神经细胞给予2-NBDLM和2-TRLG混合溶液进行成像

(实验方法)

(A)使用以下组成的溶液和材料。

(共聚焦图像获得用HEPES溶液的组成)

NaCl 150mM，KCl 5mM，MgCl₂ 1mM，CaCl₂ 2mM，HEPES10mM，用1M Tris(2-氨基-2-羟基甲基-1,3-丙二醇)溶液调整至pH7.4。葡萄糖浓度为10mM。应予说明，以抑制经由半通道的荧光标记甘露糖的出入为目的，添加0.1mM Carbenoxolone(SIGMA#C4790)。

(分离用林格氏液的组成)

NaCl 124mM，NaHCO₃ 26mM，KCl 5mM，KH₂PO₄ 1.24mM，CaCl₂ 2.4mM，MgSO₄·7H₂O 1.3mM，葡萄糖10mM，通过通入95％O₂-5％CO₂保持pH7.4。

(盖玻片的多聚L-赖氨酸覆盖(神经细胞用))

将5mg的多聚L-赖氨酸氢溴酸盐(SIGMA P6282)溶于50mL的0.15M硼酸(使用NaOH调整pH为8.4)并进行储备，冷藏保存。将该储备溶液用0.15M硼酸稀释为1/500～1/1000，将盖玻片(13mm×22mm松浪No.0玻璃)沉于其中，室温放置20分钟后，由蒸馏水冲洗，自然干燥。

(B)2-NBDLM溶液以及2-NBDLM+2-TRLG混合溶液的制备

由于2-NBDLM是2-NBDLG的立体异构体，二者具有相同的分子量，所以以与本发明人等在先的WO2010/016587公报中详尽描述的2-NBDLG液以及2-NBDLG+2-TRLG混合溶液的制备基本相同的方法进行制备。给予溶液的浓度是将0.5mg小瓶的全部量溶于图像获得用HEPES溶液14.6mL，得到终浓度是100μM的2-NBDLM溶液。溶解法与实施例3中的2-NBDLG溶液的制备同样地实施。由于2-TRLG对水具有难溶性，所以将1mg的2-TRLG溶于二甲基亚砜(DMSO)液首先制备2mM 2-TRLG溶液后，将该2mM溶液，用预先含有100μM的2-NBDG制备的上述组成的图像获取用HEPES溶液稀释至100倍，得到100μM 2-NBDLM+20μM 2-TRLG的混合溶液。

(B)急性分离神经细胞的制备

用与本发明人等的在先WO2010/016587公报记载相同的方法，如下所示地实施。

(1)小鼠脑切片的制备

对出生后13-17日龄(幼龄期)的C57BL/6J小鼠使用氨基甲酸酯进行深度麻醉(i.p.1.6g/kg)，按照常规方法断头后，一边喷淋分离用的冷林格氏液(0℃)一边将脑取出，将其置于冰冷的培养皿上立即进行整理后，使用线形切割机(堂阪Pro7)在冷的林格氏液(0℃)中制备厚400或500μm的冠状断脑切片。接下来在充有95％O₂-5％CO₂的上述林格氏液循环室(Harvard公司制丙烯酸孵育室)中室温恢复1小时。

(2)脑切片的酶处理

将脑切片浸渍于将蛋白分解酶Pronase(10mg/60mL)溶于上述林格氏液制得的酶液(31℃，利用充有95％O₂-5％CO₂气体，保持pH7.4)进行酶处理。经过规定时间后，立即在室温，将脑切片浸渍于50-100mL的含有10mM葡萄糖的HEPES溶液终止酶反应。

(3)中脑黑质网状部的分离

在底部贴附有硅的60～100mm的塑料盘中预先装满含有10mM葡萄糖的HEPES溶液(室温，从共聚焦图像获得用HEPES溶液中去除Carbenoxolon的溶液)，将上述脑切片浸渍于该液中。使用二支27G注射针将脑切片固定之后，在显微镜下使用将18G注射针的前端制成椭圆形的工具将左右的中脑黑质网状部挑出，室温下保存于上述HEPES溶液(35mm培养皿)中。

(4)黑质网状部神经细胞的分离

用调整为各种前端直径的玻璃吸管通过trituration将神经细胞分离，并使其附着于多聚L-赖氨酸覆盖的盖玻片上。

(C)使用实时激光扫描共聚焦显微镜时的2-NBDLM+2-TRLG混合溶液的给予法以及图像获得方案

混合溶液的给予，采取与实施例3(4)～(6)记载的对MIN6细胞的给予法相同的方式进行实施。

(实验结果)

将100μM 2-NBDLM+20μM 2-TRLG的混合溶液给予急性分离神经细胞5分钟，将用激光共聚焦显微镜观察的结果示于图11～15。

(图11～图15)

分别表示100μM 2-NBDLM+20μM 2-TRLG混合溶液给予前、给予中、给予结束后经过2分钟的时刻、给予后经过10分钟的时刻、给予后经过22分钟的时刻的绿色通道(500-580nm)的荧光图像A、红色通道(580-740nm)的荧光图像B、微分干涉(DIC)图像C、以及ABC重叠的图像D。

图11是对从小鼠中脑黑质网状部急性分离的神经细胞即将给予2-NBDLM(100μM)+2-TRLG(20μM)之前的绿色通道(A)以及红色通道(B)的自身荧光图像、微分干涉(DIC)图像(C)、以及将其重叠的图像(Overlay，D)。

图12是2-NBDLM(100μM)+2-TRLG(20μM)给予中的绿色通道以及红色通道的荧光图像、微分干涉图像以及重叠图像(均保持原图像的状态)。箭头显示的健全的细胞中，由于在给予中2-TRLG没有侵入细胞内，所以在较强反映2-TRLG的荧光的红色通道的荧光图像(B)中细胞体部分成为阴影。另一方面，观察反映2-NBDLM摄入的绿色通道的荧光图像(A)，可以看出给予中2-NBDLM被摄入细胞内，细胞体的阴影比红色通道小。另外，在D的重叠图像中，可知箭头的细胞，除中心部的细胞核以外的细胞质部分变成反映2-NBDLM荧光的绿色。与此相对，短箭头所示的状态恶化的二个细胞中，绿色通道、红色通道均在给予中没有发现细胞体的阴影，显示出2-NBDLM和2-TRLG二者同时在给予中完全侵入细胞内。

图13示出2-NBDLM(100μM)+2-TRLG(20μM)给予结束后经过2分钟的时刻的图像(在同一水平强调绿色通道和红色通道，容易看见地表现荧光变化)。观察A的绿色通道，任意一个细胞均将2-NBDLM摄入。但是观察B的红色通道，可看出在箭头示出的健全的细胞中，没有摄入2-TRLG表示细胞膜是健全的，与此相对，短箭头显示的二个细胞显示2-TRLG大量的摄入，可知细胞膜出现破裂。作为结果，D的重叠图像中，箭头的细胞中细胞体显示绿色荧光，与此相对，短箭头的细胞呈现绿色和红色混合的橙色。应予说明，箭头所示的细胞中，红色通道的荧光强度与给予前相比较略有增加是因为通过图像强调而将2-NBDLM的红色通道中的荧光成分的增加进行可视化(具体请参见说明书第42页和第43页)。

图14示出2-NBDLM(100μM)+2-TRLG(20μM)给予结束后经过10分钟的时刻的图像。观察A的绿色通道和D的重叠图像，可知在箭头所示的健全的细胞中，以绿色荧光显示的2-NBDLM即使在给予结束后经过10分钟，仍然维持在细胞内。另一方面，短箭头的二个细胞中，给予后经过2分钟的时刻的图像中细胞内看到的绿色通道以及红色通道的荧光已经大幅减弱，可知由于细胞膜破裂，一度侵入细胞内的2-NBDLM以及2-TRLG随着清洗的时间的经过而流出细胞外。

图15示出2-NBDLM(100μM)+2-TRLG(20μM)给予结束后经过22分钟的时刻的图像。A和D清楚地显示，2-NBDLM所致的绿色荧光，在给予结束后即使经过22分钟也维持在细胞内。图13、14、15均以完全相同的图像处理条件进行表示。

以上结果表明2-NBDLM被摄入正常的小鼠神经细胞内。

上述具体内容是对本发明的目的和对象进行简单的说明，但是不限制本发明要求保护的范围。在不脱离本发明要求保护的范围的情况下，对记载的实施方式的各种变更以及置换是本领域技术人员根据本说明书记载的启示而容易想到的。

产业上的可利用性

本发明提供一种精度良好地判定是不是肿瘤细胞的方法，这一点具有产业上的可利用性。

Claims

1.一种非疾病诊断方法的检测方法，该方法为检测癌细胞或有患癌可能的细胞的方法，包括以下工序，

a.使含有L-葡萄糖衍生物的组合物与靶细胞接触的工序，所述L-葡萄糖衍生物是2-[N-(7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑-4-基)氨基]-2-脱氧-L-葡萄糖、4-脱氧-4-[N-(7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑-4-基)氨基]-L-葡萄糖、6-脱氧-[N-(7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑-4-基)氨基]-L-葡萄糖或2-脱氧-2-[N-7-(N’,N’-二甲基氨基磺酰基)苯并-2-氧杂-1，3-二唑-4-基)氨基]-L-葡萄糖，以及

b.检测该靶细胞内存在的该L-葡萄糖衍生物的工序。

2.如权利要求1所述的检测方法，其中，所述L-葡萄糖衍生物是2-[N-(7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑-4-基)氨基]-2-脱氧-L-葡萄糖、4-脱氧-4-[N-(7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑-4-基)氨基]-L-葡萄糖或6-脱氧-[N-(7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑-4-基)氨基]-L-葡萄糖。

3.如权利要求2所述的检测方法，其中，所述L-葡萄糖衍生物是2-[N-(7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑-4-基)氨基]-2-脱氧-L-葡萄糖。

4.如权利要求1～3中任一项所述的检测方法，其中，所述工序b中的检测是通过将靶细胞成像而进行的。

5.如权利要求1所述的检测方法，其中，所述工序a的组合物进一步含有在2位以磺胺键键合了磺基罗丹明101或磺基罗丹明B的2-氨基-2-脱氧-L-葡萄糖，且所述工序b为检测在靶细胞中存在的L-葡萄糖衍生物的工序。

6.如权利要求5所述的检测方法，其中，所述组合物含有2-[N-(7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑-4-基)氨基]-2-脱氧-L-葡萄糖以及在2位以磺胺键键合了磺基罗丹明101或磺基罗丹明B的2-氨基-2-脱氧-L-葡萄糖。

7.如权利要求5或6所述的检测方法，其中，所述工序b中的检测是以成像的细胞的荧光色调的经时变化为指标进行的。

8.如权利要求7所述的检测方法，其中，进一步包含以下工序，

c.以所述荧光色调的变化为基础，判定靶细胞是癌细胞或是有患癌可能的细胞、或是损伤细胞的工序。

9.如权利要求1～3、5和6中任一项所述的检测方法，其中，在30分钟内进行所述全部工序。

10.如权利要求1～3中任一项所述的检测方法，其中，所述L-葡萄糖衍生物为放射性标记的L-葡萄糖衍生物，即6-[¹⁸F]-2-[N-(7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑-4-基)氨基]-2-脱氧-L-葡萄糖或4-[¹⁸F]-2-[N-(7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑-4-基)氨基]-2-脱氧-L-葡萄糖，且检测靶细胞内部存在的L-葡萄糖衍生物的工序至少包括PET成像。

11.如权利要求1～3中任一项所述的检测方法，其中，所述组合物进一步含有在分子内具有荧光发色团的荧光标记了的D-葡萄糖衍生物。

12.一种靶细胞的显像剂，该显像剂是用于通过将标记的L-葡萄糖衍生物摄入靶细胞内而将靶细胞成像的显像剂，该显像剂含有L-葡萄糖衍生物，所述L-葡萄糖衍生物是2-[N-(7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑-4-基)氨基]-2-脱氧-L-葡萄糖、4-脱氧-4-[N-(7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑-4-基)氨基]-L-葡萄糖、6-脱氧-[N-(7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑-4-基)氨基]-L-葡萄糖或2-脱氧-2-[N-7-(N’,N’-二甲基氨基磺酰基)苯并-2-氧杂-1，3-二唑-4-基)氨基]-L-葡萄糖。

13.如权利要求12所述的显像剂，用于检测癌细胞或是有患癌可能的细胞。

14.如权利要求13所述的显像剂，其中，所述L-葡萄糖衍生物是2-[N-(7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑-4-基)氨基]-2-脱氧-L-葡萄糖、4-脱氧-4-[N-(7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑-4-基)氨基]-L-葡萄糖或6-脱氧-[N-(7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑-4-基)氨基]-L-葡萄糖。

15.如权利要求14所述的显像剂，其中，所述L-葡萄糖衍生物是2-[N-(7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑-4-基)氨基]-2-脱氧-L-葡萄糖。

16.如权利要求13～15中任一项所述的显像剂，其中，所述显像剂进一步含有在2位以磺胺键键合了磺基罗丹明101或磺基罗丹明B的2-氨基-2-脱氧-L-葡萄糖。

17.如权利要求13～15中任一项所述的显像剂，其中，所述L-葡萄糖衍生物为放射性标记的L-葡萄糖衍生物。

18.如权利要求13～15中任一项所述的显像剂，其中，进一步含有在分子内具有荧光发色团的荧光标记了的D-葡萄糖衍生物。

19.一种试剂盒，用于检测癌细胞或是有患癌可能的细胞，含有权利要求13～15中任一项所述的显像剂。