JP6406715B2 - 生体由来組織片を用いたがんの検出方法、および生体外での生体由来組織片中の細胞の維持方法 - Google Patents
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Description
組織学的に異常細胞を判定する場合、内視鏡などを用いて消化管内腔表面を観察して病変部と思われる部位の一部を採取する(生検)。生検組織はホルマリン等で固定した後に厚さ5ミクロン程度にまで薄切し、多数の標本(プレパラート)を作製、色素等で組織染色を行う。こうして得られた病理組織標本を、専門の病理医が、細胞核(nucleus)と細胞質(cytoplasm)の比(N/C比)の増大、細胞質内の核の位置と形の異常、細胞組織構築の異常の様相、等の形態学的特徴に注目して、正常であるか、あるいはがんやがんに移行する可能性が疑われる異常を示しているか診断する。
本発明はまた、生体外での生体由来組織片中の細胞を生きた状態に維持する方法を提供することを目的とする。
(1)生体由来組織片中のがんを検出するための方法であって、以下の工程、
a.生体から採取した組織片を、29〜33℃の温度にて少なくとも30分以上処理する工程、
b.前記工程aで処理した組織片を、35.5〜37.5℃の温度にて、蛍光分子団として7−ニトロベンズ−2−オキサ−1,3−ジアゾール基またはその誘導体を分子内に有するL−グルコース誘導体の存在下で処理する工程、および
c.組織片中の細胞内に存在する該L−グルコース誘導体を検出する工程、
を含む検出方法。
(2)前記L−グルコース誘導体が、2−[N−(7−ニトロベンズ−2−オキサ−1,3−ジアゾール−4−イル)アミノ]−2−デオキシ−L−グルコース(2−NBDLG)である上記(1)に記載の検出方法。
(3)工程aが、生体から採取した組織片を、約0℃に冷却した後、29〜33℃の温度にて少なくとも30分以上処理する工程である、上記(1)または(2)に記載の方法。
(4)前記工程bにおける処理時間が20分以内の時間であり、そして、工程cにおける検出が、蛍光強度の時間経過による変化を指標として行う、上記(1)〜(3)のいずれか一つに記載の検出方法。
(5)生体由来組織片中のがんを検出するための方法であって、以下の工程、
a.生体から採取した組織片を、29〜33℃の温度にて少なくとも30分以上処理する工程、
b.前記工程aで処理した組織片を、35.5〜37.5℃の温度にて、2−[N−(7−ニトロベンズ−2−オキサ−1,3−ジアゾール−4−イル)アミノ]−2−デオキシ−L−グルコース(2−NBDLG)および2位にスルホローダミン101をスルホンアミド結合した2−アミノ−2−デオキシ−L−グルコース(2−TRLG)の存在下で処理するする工程、および
c.組織片中の細胞内に存在する2−NBDLGおよび/または2−TRLGを検出する工程、
を含む検出方法。
(6)工程aが、生体から採取した組織片を、約0℃に冷却した後、29〜33℃の温度にて少なくとも30分以上処理する工程である、上記(5)に記載の方法。
(7)前記工程bにおける処理を20分以内で行う上記(5)または(6)に記載の検出方法。
(8)前記工程bにおける処理を10分以内で行う上記(7)に記載の検出方法。
(9)前記工程cにおける検出が、蛍光イメージングされた細胞の蛍光色調の時間経過による変化を指標にして行う、上記(5)〜(8)のいずれか一つに記載の検出方法。
(10)前記工程bの後に、組織片を約0℃において1〜24時間保存した後、工程cを行う、上記(1)〜(9)に記載の方法。
(11)前記組織片が、胃、食道、胆道、大腸、子宮、子宮頸部、膣、膀胱、および前立腺からなる群より由来する組織片である。上記(1)〜(10)に記載の方法。
(12)生体由来組織片中の細胞内に存在するL−グルコース誘導体を検出することによりがんを検出する方法であって、該生体由来組織片が、以下の工程:
a.生体から採取した組織片を、29〜33℃の温度にて少なくとも30分以上処理する工程、および
b.前記工程aで処理した組織片を、35.5〜37.5℃の温度にて、2−[N−(7−ニトロベンズ−2−オキサ−1,3−ジアゾール−4−イル)アミノ]−2−デオキシ−L−グルコース(2−NBDLG)および2位にスルホローダミン101をスルホンアミド結合した2−アミノ−2−デオキシ−L−グルコース(2−TRLG)の存在下で処理する工程、
により調製され、かつ、約0℃にて1〜24時間保存されたものである、
がんを検出する方法。
(13)工程aが、生体から採取した組織片を、約0℃に冷却した後、29〜33℃の温度にて少なくとも30分以上処理する工程である、上記(12)に記載の方法。
(14)細胞内のL−グルコース誘導体の検出を行った後に、さらに組織片から病理標本を作製して病理標本に基づくがんの検出を行う、上記(1)〜(13)のいずれか一つに記載の方法。
(15)前記L−グルコース誘導体の検出が寒天中に固定された組織片を用いて行う、上記(14)に記載の方法。
(16)生体由来の組織片中の細胞を生きた状態に維持する方法であって、以下の工程、
a.生体から採取した組織片を、29〜33℃の温度にて少なくとも30分以上処理する工程、および
b.前記工程aで処理した組織片を35.5〜37.5℃の温度にて処理して、(20分間以上、好ましくは30分間以上、より好ましくは1時間以上)細胞を生きた状態に維持する工程、
を含む細胞維持方法。
(17)工程aが、生体から採取した組織片を、約0℃に冷却した後、29〜33℃の温度にて少なくとも30分以上処理する工程である、前記(16)に記載の方法。
(18)前記組織片が、生体の管腔および内腔からなる群より選ばれる上記(16)または(17)に記載の方法。
(19)前記組織片が、胃、食道、胆道、大腸、子宮、子宮頸部、膣、膀胱、および前立腺からなる群より選ばれる上記(18)に記載の方法。
(20)被験者から採取した生体組織片を用いて、上記(1)〜(15)のいずれか一つに記載のがんの検出方法により得られる情報を補助として、がんを診断する方法。
(21)上記(1)〜(15)のいずれかの検出方法において、工程bにおいてまたは工程bの後に、任意の化合物の存在下で組織を処理することにより、該化合物のがん細胞に対する効果を評価することを含む、スクリーニング方法。
本発明によれば、生体由来の組織中の細胞を生かした状態に維持でき、細胞の機能的な異常を観察できる。
本発明の一つの態様では、7−ニトロベンズ−2−オキサ−1,3−ジアゾール基またはその誘導体を分子内に有するL−グルコース誘導体に加えて、他の蛍光標識L−グルコース誘導体である2位にスルホローダミン101をスルホンアミド結合した2−アミノ−2−デオキシ−L−グルコース(2−TRLG)を用いることができ、これにより、より精度よくがんを検出できる。2−TRLGも、特許出願WO2010/016587号公報、およびWO2012/133688号公報に具体的に開示されている。
具体的には、これに限定されないが、口腔内腫瘍や消化器腫瘍、子宮頸がんなどの婦人科腫瘍、膀胱がんや前立腺がん、そのほか肺やさまざまな臓器の生検などにより得た組織標本や細胞、手術時摘出組織が本発明の方法の対象となる。
その後の工程は、Krebs−Ringer溶液、またはKrebs−Ringer溶液と同等の機能を持つ生理的食塩水(Physiological saline)等の緩衝液を用いて行うことができる。
蛍光標識L−グルコース誘導体の適用は、例えば、以下のように行うことができる。潅流液を、電磁弁を用いて、あるいは静水圧による落差を用いて投与液を置き換える一般的な方法を用いて、KRB溶液から蛍光L−グルコース誘導体である2−NBDLG(100μM)と2−TRLG(20μM)の混合液に一定時間切り替えることにより組織に接触せしめ、しかる後に潅流液をKRB溶液に戻す方法によって、生きた組織に蛍光L−グルコース混合液を投与することが可能である。その際、非特異的な取り込みを押さえる目的で、ヘミチャネル阻害剤Carbenoxoloneを加えてもよい。また、溶液の調整や潅流チャンバーについては公知の方法(特許文献1、特許文献2に記載の方法)に従って行えばよい。
蛍光標識L−グルコース誘導体を組織に適用する時間は、これに限定されないが、数十分以内で十分である。例えば、適用時間は、20分以内、10分以内、或いは5分程度であっても、組織中のがん細胞への十分な2−NBDLGの取り込みを達成できる。
蛍光観察終了後は、組織を常法に従いホルマリン等で固定後、病理組織標本を作製して病理診断に付す。その際、蛍光観察した面と病理標本の薄切面が一致するように、また組織の配向が一致するように留意することが重要である。そのための有効な方法は、種々考えられるが、組織をナイロンメッシュなどで上下から挟んで固定して観察し、観察後そのままの配置を維持しながらホルマリン固定し、常法に従って薄切後、立体的に再構成した組織の形から生組織と病理標本相互の対応関係を決めてもよい。あるいはまた、市販の低融点の寒天(Low-melting agarose)中に生組織を入れ、0℃に下げることで組織の配向を固定し、そのまま低温下で寒天を通して蛍光顕微鏡観察を行い、しかる後に市販の冷却型ミクロトーム等の凍結切片作製装置上で例えばマイナス20℃等に組織温度を低下させてから観察面に平行に厚さ100−200ミクロン等の厚みにいったん組織を薄切し、これらの薄切切片をホルマリン固定した後に、通常のパラフィンによる病理切片を作製してもよい。後者は、蛍光観察の方向と病理切片の薄切方向を一致させることが容易になるというメリットがある。
また、蛍光像は組織中の深さにより変化することから、共焦点顕微鏡やデコンボリューション顕微鏡他の立体的な観察を可能にする方法等を適切に用いることで断層写真を撮影し、病理組織標本と対応させることも可能である。
高分化型胃がん患者において、内視鏡下、粘膜切除術(EMR)を施行する予定領域内で、腫瘍が疑われる中心部(A)およびその周辺部(B)から生検を実施し、組織をすぐに冷却した。
生検で得られた組織(AおよびB)をそれぞれ、消化管内腔に面した側(上皮細胞)を共焦点顕微鏡のレンズ側に向けて、共焦点顕微鏡上に設置した温度制御式の潅流チャンバーの上に置いたナイロンメッシュで上下に挟む形で生検組織を固定した。Krebs−Ringer溶液(KRB溶液:ギャップ結合阻害剤carbenoxolone 0.1 mM、グルコース 5.6 mMを含む)を潅流しながら、温度は当初32℃にて40分以上潅流して生検やトリミングにより損傷を受けた組織を回復させた後、37℃に復温した。
組織(AおよびB)のそれぞれについて、KRB溶液を潅流しながら蛍光標識グルコース誘導体を投与する前の透過光像(微分干渉コントラスト像、以下DIC)と緑色チャネルの自家蛍光像とを観察した。重ね合わせたものを図1に示す。左図と右図の暗い領域は、それぞれ内視鏡生検時に内視鏡医によって腫瘍病変部と判断された部位から採取した生検組織、および病変周囲の非腫瘍組織と判断された部位から採取した生検組織である。縦横のラインは組織が動かないように保持するためのナイロングリッドである。グリッドの中央と隣のグリッドの中央の間の距離は400ミクロンである。
次いで、潅流液を、電磁弁を用いて、KRB溶液から蛍光L−グルコースである2−NBDLG(100μM)と2−TRLG(20μM)を含有する混合液に切り替えた。混合液を、生検組織に5分間投与し、投与終了後、洗い流しを開始した。
洗い流しを開始してから10分経過した時点でのDIC像と、2−NBDLGの取り込みを反映する緑色チャネル(500−580nm)における共焦点蛍光像の重ね合わせを図2に示す。この緑色チャネルからの情報からは、左側の腫瘍が疑われる領域にも、右側の腫瘍周囲領域にも2−NBDLGの取り込みが認められる。従ってこの例に典型的にみられるように、洗い流し開始後10分経過した段階で、2−NBDLGの取り込みを反映する緑色チャネルの画像情報のみを利用した場合、腫瘍領域を周辺領域から明瞭に識別することは難しい。また、左側の腫瘍が疑われる領域内の上部に2−NBDLGの取り込みを示さない暗い領域が存在する。
投与終了後洗い流しを開始して18分経過した時点での、DIC像と、2−NBDLGの取り込みを反映する緑色チャネルで観察した共焦点蛍光像の重ね合わせを図3に示す。右側の腫瘍周囲領域に洗い流し開始後10分時点でみられた2−NBDLGの蛍光信号が細胞外への2−NBDLGの流出により大幅に低下しているのに対し、左側の腫瘍が疑われる領域の下半分には2−NBDLGの細胞内への取り込みによる強い蛍光信号が認められ、この領域に腫瘍が存在する可能性が示唆された。このように2−NBDLGのみから得られる蛍光信号を観察する場合でも、時間的に継続して同一部位を観察すれば、腫瘍領域を腫瘍周辺領域と識別することが可能である。
また、以上の方法を用いて、組織を回復させた後、少なくとも30分以上にわたる機能観察が可能であった。
投与終了後洗い流しを開始して10分経過した時点でのDIC像と、2−TRLGの取り込みを反映する赤色チャネル(580−740nm)で観察した蛍光像の重ね合わせを図4に示す。右側の腫瘍周囲領域のかなりの領域で赤色の2−TRLGの強い取り込みがみられ、損傷細胞もしくは炎症細胞等、非特異的に蛍光標識L−グルコース誘導体を取り込む細胞が存在する可能性が示唆された。一方、左側の腫瘍が疑われる領域では、2−TRLG取り込みを示す領域は限定的であった。従って、図3の左側の腫瘍が疑われる領域で見られた2−NBDLGの取り込みには、特異的な取り込みが含まれることが示唆された。
投与終了後洗い流しを開始して10分経過した時点での2−NBDLGの取り込みを反映する緑色チャネルで観察した蛍光像、2−TRLGの取り込みを反映する赤色チャネルで観察した蛍光像、およびDIC像の重ね合わせを図5に示す。緑色蛍光を発する2−NBDLGの取り込みに加えて赤色蛍光を発する2−TRLGの取り込みがあると、合成色は黄色となる。左側の腫瘍が疑われる領域の下部領域を見ると、赤色の2−TRLGが取り込まれていないことから、細胞膜が健常に保たれていると推定され、緑色の2−NBDLGの取り込みの様子からこの領域に腫瘍が存在することが示唆された。一方、右側の腫瘍周囲領域では、緑色の2−NBDLGに加えて赤色の2−TRLGの強い取り込みがみられ、重ね合わせにより黄色を呈しており、この領域に細胞膜に損傷がある細胞、もしくは炎症細胞等、非特異的取り込みを示す細胞が存在することがわかった。
投与終了後洗い流しを開始して18分経過した時点での2−NBDLGの取り込みを反映する緑色チャネルと2−TRLGの取り込みを反映する赤色チャネルで観察した蛍光像をDIC像と重ね合わせを図6に示す。図3において推定した通り、左側の腫瘍が疑われる領域の下部領域で、緑色の2−NBDLGの強い取り込みがみられた。また右側の腫瘍周囲領域では、緑色の2−NBDLGおよび赤色の2−TRLGの両者共に蛍光強度が減弱し、この領域の細胞に細胞膜の変性や炎症等による非特異的取り込みがあることがわかった。また、左側の腫瘍が疑われる領域の上部、および右側の腫瘍周囲領域の一部には2−NBDLGを全く取り込まない領域がみられ、正常組織である可能性が示唆された。
実施例2で用いた生検組織をホルマリン固定後、H&E染色を行って病理組織像を取得した。結果を図7に示す。組織病理診断の結果、図3および図6における予想の通り、左の腫瘍が疑われる領域から生検した組織の下部にあって2−NBDLGを強く取り込んだ領域には実際に腫瘍が存在した。一方左側組織上部の2−NBDLGを取り込まなかった領域は正常な組織像を示した。両者の中間領域には腸上皮化生(Metaplasia)がみられた。一方、右側の腫瘍周囲領域は予想通り、組織変性(Degeneration)が認められ、図3や図6において組織右側の2−NBDLGを取り込まなかったあたりには完全に正常な組織像がみられた。
実施例2で得られた生検組織の蛍光像に病理診断から得られた対応関係を書き加えたものを図8に示す。
Claims (12)
- 生体由来組織片中のがんを検出するための方法であって、以下の工程、
a.生体から採取した組織片を、29〜33℃の温度にて少なくとも30分以上処理する工程、
b.前記工程aで処理した組織片を、35.5〜37.5℃の温度にて、蛍光分子団として7−ニトロベンズ−2−オキサ−1,3−ジアゾール基又はその誘導体を分子内に有するL−グルコース誘導体に20分以内にわたり適用することで、処理する工程、および
c.前記L−グルコース誘導体を前記組織片から10分以上かけて洗い流した後に、組織片中の細胞内に存在する該L−グルコース誘導体を検出する工程、
を含み、
組織片が、腺組織を含む検出方法。 - 前記L−グルコース誘導体が、2−[N−(7−ニトロベンズ−2−オキサ−1,3−ジアゾール−4−イル)アミノ]−2−デオキシ−L−グルコース(2−NBDLG)である請求項1に記載の検出方法。
- 工程aが、生体から採取した組織片を、約0℃に冷却した後、29〜33℃の温度にて少なくとも30分以上処理する工程である、請求項1または2に記載の方法。
- 工程cにおける検出が、蛍光強度の時間経過による変化を指標として行う、請求項1〜3のいずれか一つに記載の検出方法。
- 生体由来組織片中のがんを検出するための方法であって、以下の工程、
a.生体から採取した組織片を、29〜33℃の温度にて少なくとも30分以上処理する工程、
b.前記工程aで処理した組織片を、35.5〜37.5℃の温度にて、2−[N−(7−ニトロベンズ−2−オキサ−1,3−ジアゾール−4−イル)アミノ]−2−デオキシ−L−グルコース(2−NBDLG)および2位にスルホローダミン101をスルホンアミド結合した2−アミノ−2−デオキシ−L−グルコース(2−TRLG)に20分以内にわたり適用することで、処理する工程、および
c.前記L−グルコース誘導体を前記組織片から10分以上かけて洗い流した後に、組織片中の細胞内に存在する2−NBDLGおよび/または2−TRLGを検出する工程、
を含み、
組織片が、腺組織を含む検出方法。 - 工程aが、生体から採取した組織片を、約0℃に冷却した後、29〜33℃の温度にて少なくとも30分以上処理する工程である、請求項5に記載の方法。
- 前記工程bにおける処理を10分以内で行う請求項5または6に記載の検出方法。
- 前記工程cにおける検出が、蛍光イメージングされた細胞の蛍光色調の時間経過による変化を指標にして行う、請求項5〜7のいずれか一つに記載の検出方法。
- 前記工程bの後に、組織片を約0℃において1〜24時間保存した後、工程cを行う、
請求項1〜8に記載の方法。 - 細胞内のL−グルコース誘導体の検出を行った後に、さらに組織片から病理標本を作製して病理標本に基づくがんの検出を行う、請求項1〜9のいずれか一つに記載の方法。
- 前記L−グルコース誘導体の検出が寒天中に固定された組織片を用いて行う、請求項10に記載の方法。
- 請求項1〜11のいずれかの検出方法において、工程bにおいてまたは工程bの後に、任意の化合物の存在下で組織を処理することにより、該化合物のがん細胞に対する効果を評価することを、含むスクリーニング方法。
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