CN116830007A - 用于实时采集活体体积的体积组织学图像的护理点显微镜 - Google Patents

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E·M·C·希尔曼
K·B·帕特尔
梁文轩
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Abstract

显微镜将激发光引导通过第一组光学部件，使得激发光被投射到样本中并且以倾斜角度形成激发光的片。片的位置根据扫描元件的取向而变化。第一组光学部件将检测光引导回扫描元件，扫描元件将检测光引导到第二组光学部件中。第二组光学部件形成成像在检测器上的中间像平面。在一些实施例中，折叠式反射镜设置在第一组光学部件和第二组光学部件之间。在一些实施例中，光学透明间隔件覆盖第一物镜并且被配置成压靠被成像的组织。该间隔件设置第一物镜的工作距离以捕获组织内的特定深度范围。

Description

用于实时采集活体体积的体积组织学图像的护理点显微镜
相关申请的交叉引用
本申请要求申请2020年12月15日递交的美国临时申请63/125,817的权益，其全部内容通过引用结合于此。
关于联邦资助研究的声明
本发明是在国家卫生研究所授予的NS108213、NS09429、NS104649和CA236554以及国家科学基金会授予的1644869、0801530和0954796的资助下得到政府支持而完成的。政府享有本发明的某些权利
背景技术
自19世纪以来，组织的微观结构和细胞组织已经用于区分组织类型及其正常和患病状态。然而，尽管有重大的医学进步，组织的组织学检查仍然需要组织被切除、处理、切片、染色然后成像。活检取样移除有价值的组织，可能错过异常情况并且花费20分钟到数天来处理，这延长了程序，抬高了成本并且阻止了闭环决策。
在美国每年进行超过六百万的活检手术。然而，用于组织病理学评估的对组织进行切除、固定和染色的标准实践是昂贵且缓慢的，这延迟了治疗，同时被采样误差弄糊涂。尽管手术中冷冻切片可在20分钟内提供结果，但组织遭受冷冻假象、质量差的切片、肿胀细胞形态和染色差的影响，其中脂肪组织(如脑部)特别难以冷冻和切割。实体2D组织学载玻片的使用还阻碍了评估工作流程，因为病理学家必须通过多个切片跟踪特征以获得对3D组织形态的更好理解。实体载玻片必须通过显微镜手动观察，或者在观察之前数字化，这需要额外的时间和资源。
然而，最重要的是，冷冻和标准组织学都需要实体去除活组织。对于诸如眼睛、心脏或脑的珍贵组织，保守活检会导致采样不足以及误诊或不完全手术切除。活检的破坏性本质还意味着它们几乎从未用于一般的外科手术引导，例如组织类型的识别或用于筛选身体的大面积。离体组织也迅速丧失诸如灌注水平和代谢状态的特征，这可提供组织健康或疾病状态的有价值的生物标志物。
共焦显微内窥镜通过光纤导管利用共焦扫描来产生原位组织的2D图像，并且可以通过内窥镜的通道来实现。然而，当前的共聚焦显微内窥镜检查的商业实施例依赖于明亮荧光染料(诸如荧光素)的系统注射来提供对比度，而它们仅在小视场上捕获2D图像的能力已被证明对于可靠地解释是具有挑战性的。尽管可以用可选择性地突出疾病的荧光标记物来提高特异性，但是在大多数情况下，此类试剂的监管部门批准已证明是成本过高且复杂的。双光子荧光、二次谐波产生、荧光寿命和受激拉曼光谱也已经被证明用于体内和床边新鲜组织成像，并且已经揭示了令人印象深刻的内在或“无标记”的对比度。然而，所有这些方法具有有限的采集速度，使得它们不能容忍体内运动并阻止实时、大面积或3D成像，而它们依赖于昂贵和/或高功率脉冲激光源，这些激光源迄今为止限制了它们用于体内临床成像，除了一些例外之外。
发明内容
本发明的一个方面涉及第一成像设备，包括第一组光学部件、第二组光学部件、扫描元件、折叠式反射镜、光检测器阵列和第三物镜。第一组光学部件具有近端和远端，并且包括设置在第一组光学部件的远端处的第一物镜。第一物镜具有介于10×和70×之间的放大率和介于0.5和1.1之间的数值孔径。第二组光学部件具有近端和远端，并且包括设置在第二组光学部件的近端处的第二物镜。扫描元件相对于第一组光学部件的近端向近侧设置并且相对于第二组光学部件的远端向远侧设置。扫描元件被布置成在从近到远的方向上将激发光引导通过第一组光学部件，使得激发光被投射到定位为向远侧超过第一组光学部件的远端的样本中。投射到样本中的激发光以倾斜角度形成激发光的片，并且片的位置根据扫描元件的取向而变化。第一组光学部件将来自样本的检测光沿从远到近的方向引导回扫描元件。扫描元件还被布置成引导检测光，使得检测光将沿从远到近的方向穿过第二组光学部件，使得第二组光学部件在向近侧超过第二组光学部件的近端的位置处形成中间像平面。折叠式反射镜相对于第一组光学部件的近端向近侧设置并且相对于第二组光学部件的远端向远侧设置。第三物镜被布置成将从中间像平面到达的光朝向光检测器阵列引导。
在第一成像设备的一些实施例中，折叠式反射镜定位在扫描元件与第二组光学部件的远端之间。
在第一成像设备的一些实施例中，第一物镜具有介于50×和70×之间的放大率、介于0.9和1.1之间的数值孔径、以及介于2.5和3.5mm之间的有效焦距，并且其中第二物镜具有介于40×和60×之间的放大率、介于0.65和0.85之间的数值孔径以及介于3和5mm之间的有效焦距。
可选地，在在先段落描述的实施例中，第一物镜具有60×的放大率、1.0的数值孔径和3mm的有效焦距。可选地，在在先段落描述的实施例中，第二物镜具有50×的放大率、0.75的数值孔径和4mm的有效焦距。可选地，在在先段落描述的实施例中，第一组光学部件包括至少一个普罗素透镜。可选地，在在先段落描述的实施例中，第一组光学部件包括12.7mm直径的38.1mm EFL消色差透镜和包括两个12.7mm直径的50.8-mm-EFL消色差透镜的普罗素透镜。可选地，在在先段落描述的实施例中，第二组光学部件包括至少一个普罗素透镜。可选地，在在先段落描述的实施例中，第二组光学部件包括由两个1”直径的101.6-mm-EFL消色差透镜和一个1”直径的76.2mm-EFL消色差透镜制成的普罗素透镜。可选地，在在先段落描述的实施例中，第一组光学部件包括具有1.5×放大率的望远镜，且其中第二组光学部件包括具有1.5×放大率的望远镜。可选地，在在先段落描述的实施例中，第三物镜具有介于15×和25×之间的放大率和介于0.65和0.85之间的数值孔径。可选地，在在先段落描述的实施例中，第三物镜具有20×的放大率和0.75的数值孔径。
本发明的另一个方面涉及第二成像设备，包括第一组光学部件、第二组光学部件、扫描元件、光检测器阵列、第三物镜和光学透明间隔件。第一组光学部件具有近端和远端，并且包括设置在第一组光学部件的远端处的第一物镜。第二组光学部件具有近端和远端，并且包括设置在第二组光学部件的近端处的第二物镜。扫描元件相对于第一组光学部件的近端向近侧设置并且相对于第二组光学部件的远端向远侧设置。扫描元件被布置成在从近到远的方向上将激发光引导通过第一组光学部件，使得激发光被投射到定位为向远侧超过第一组光学部件的远端的样本中。投射到样本中的激发光以倾斜角度形成激发光的片，并且片的位置根据扫描元件的取向而变化。第一组光学部件将来自样本的检测光沿从远到近的方向引导回扫描元件。扫描元件还被布置成引导检测光，使得检测光将沿从远到近的方向穿过第二组光学部件，使得第二组光学部件在向近侧超过第二组光学部件的近端的位置处形成中间像平面。第三物镜被布置成将从中间像平面到达的光朝向光检测器阵列引导。光学透明间隔件被定位和配置成覆盖第一物镜并且压靠被成像的组织。
在第二成像设备的一些实施例中，光学透明间隔件设置第一物镜捕获进入组织中的50-350μm深度范围的工作距离。
在第二成像设备的一些实施例中，光学透明间隔件被并入到盖中，盖在光学透明间隔件与第一物镜的远端之间提供水密密封。可选地，这些实施例还可以包括位于光学透明间隔件和第一物镜之间的一定量的介质，其中介质具有被选择为与第一物镜的浸没介质匹配的折射率，并且其中一定量的介质将光学透明间隔件光学耦合到第一物镜，并且其中盖提供水密密封。
在第二成像设备的一些实施例中，光学透明间隔件由固体介质形成，固体介质具有与第一物镜的所需浸没介质匹配的折射率。在第二成像设备的一些实施例中，光学透明间隔件具有外表面，外表面定位在接近第一物镜的主焦平面的25μm与250μm之间。在第二成像设备的一些实施例中，光学透明间隔件允许对样本的快速3D成像，样本被逐渐地移动跨越间隔件的外表面，从而允许拼接样本的连续3D图像。在第二成像设备的一些实施例中，第一物镜具有介于10×和70×之间的放大率和介于0.5和1.1之间的数值孔径。
附图说明
图1描绘了扫描共焦对准平面激发显微镜的一个实施例。
图2描绘了扫描共焦对准平面激发显微镜的另一个实施例。
图3A示出了图1和图2实施例的完整组织中的单物镜光片激发和发射的几何构造。
图3B示出了如何沿扫描方向(x)收集单或双颜色yz切片以创建倾斜体积。
图4A和图4B分别示出了图1和图2实施例的消像散成像的理论操作范围。
图5示出了图2实施例在不同焦深处的光学分辨率。
图6示出了设计成覆盖图1和图2实施例中的第一物镜的远端的成像盖的示例。
下面参考附图详细描述各种实施例，其中相同的附图标记表示相同的元件。
具体实施方式
这里，我们展示了一种称为MediSCAPE的小形状因子扫描共焦对准平面激发显微镜，其能够实时地且在不需要组织切除的情况下对活组织进行原位、体积组织学成像。MediSCAPE的高速3D成像性能经得起体内运动，并能够进行漫游(roving)3D图像采集，其与3D拼接相结合允许对大的组织区域进行连续分析。MediSCAPE的高灵敏度，即使对于弱的内在荧光，仍允许在完整的、原位活组织中进行临床相关组织结构的实时多光谱3D成像，而不需要外源染色。在不同的体内和新鲜小鼠和人组织中展示了MediSCAPE，证实了组织结构、疾病标记和体内灌注和组织功能的强有力的可视化。
MediSCAPE是一种基于扫描共焦对准平面激发(SCAPE)显微镜检查的体内成像方法，其允许在显微镜水平上对组织进行快速、非破坏性、原位检查，而不需要切除、加工和染色。该方法具有提供实时的术中反馈的潜力，该术中反馈使得能够进行闭环治疗决策，包括评估手术切缘和监视大的组织区域以引导活检部位选择。MediSCAPE的非破坏性性质也可使其对于一系列非病理应用有价值，例如机器人或矫形外科手术期间的“组织分型”或灌注评估。快速的、原位组织病理学对于评价捐赠用于人移植的器官也是革命性的，特别是最常移植并且受到高的观察者间变异性影响的肾。
虽然过去十年已经看到减少对组织切片的需要的一系列新的“床边”新鲜组织病理学方法的出现，但是这些方法离体对样本成像，并且经常需要额外的组织处理。例如，最近的创新将光片层成像应用于离体组织证明了3D获取和可视化的价值。然而，它们在体内的使用受到组织染色和透明化步骤以及需要实体地移动组织以形成3D图像的限制。最近，用于未处理的新鲜组织样本的床边成像的双光子和受激拉曼光谱的展示已经揭示了令人印象深刻的固有对比度。然而，除了少数例外，它们有限的速度和对昂贵的高功率脉冲激光源的依赖迄今仍限制了它们在体内临床成像中的使用。此外，由于切除组织的成像消除了对使用宽范围的选择性染料和标记的限制，因此更简单的技术例如MUSE显微镜检查是可行的替代方案。
SCAPE显微镜检查是一种高速3D、单物镜光片方法，我们最初开发该方法用于对模型生物中的细胞水平功能和结构进行成像。然而，它提供了两种独特的能力，这使得它对于在临床环境中对人体组织进行成像是理想的。1)SCAPE可以以超过10体积/秒采集完整组织的3D图像，允许接近瞬时地捕获原位组织中的3D多层结构，相当于满盒的组织学载玻片。这种高速度还提供了对在人类外科手术环境中不可避免的自然运动的容忍度，并且允许“漫游”采集，其中连续的体积图像可以被采集并且被拼接在一起成为跨越大面积完整组织的连续3D组织病理学。2)尽管SCAPE的速度很高，但它也具有高灵敏度，允许检测已经存在于大多数组织中的内在荧光团，消除对外源染料的需要，同时也不需要使用高功率脉冲激光，这极大地促进临床转化和原位人类使用。
在一定范围的体内和新鲜切除的小鼠和人组织中展示了MediSCAPE成像，将在相同组织上显现的结构与金标准组织学进行了比较。我们强调MediSCAPE的体积数据通过以任意角度滚动通过横截面的能力，允许在其自然3D环境中检查组织微体系结构，这极大地提高了可解释性。我们通过对体内跳动的小鼠心脏进行成像示出了视频速率体积成像速度允许在大的组织区域上3D拼接“漫游扫描”并且克服运动伪影。我们还展示了使用外源染料，包括原黄素和荧光素钠，来突出H&E组织学中可见的熟悉的细胞组分。
数据集使用两个MediSCAPE实施例获得：一种优化的台式系统(图1)，以及一种新型的小型化版本的MediSCAPE，其形状因子适合术中的人使用，在性能上仅有适度的折衷(图2)。这种小型化设计展示了MediSCAPE用于可进入孔口中的体内组织成像以及在腹腔镜、机器人和旷场手术期间的潜力。所有显示的图像都是使用负担得起的、可见的、连续波激光源(488nm和637nm)获得的，具有与FDA批准的共聚焦显微内镜相当的照明水平。这些展示表明MediSCAPE可提供一种用于基于显微镜的手术内指导的新的范例。
图1描绘了适合于对体内啮齿动物模型和新鲜离体小鼠和人组织样本(例如切除的肾)进行成像的台式实施例。该实施例类似于美国专利10,061,111(其全部内容通过引用并入本文)中公开的配置，但是添加了488和637nm OBIS激光器用于激发，以及3轴电动台(Thorlabs DDSM50和MTS25-Z8)用于在需要时进行台扫描。使用在照相机前面的自制图像分割器来并行地收集光谱分辨的发射图像，实现了双色成像。用该系统的所有成像都在倒置构造中进行，其中水在物镜和样本置于其上的盖玻片之间。
图2描绘了小型化MediSCAPE设计。这种具有窄且细长的成像头的紧凑“展开”设计产生了可以是悬臂式安装的并且是用于临床用途的手动引导的形状因子，唯一的折衷是适当地减小的视场。在直立结构中拍摄了该小型化图2系统的图像，其中盖玻片在需要时使组织变平。表2列出了所有数据的成像参数。
在图1和图2的实施例中，MediSCAPE使用倾斜光片来照射样本，并通过相同的、单个的、固定的高数值孔径(NA)物镜12收集返回的发射荧光。系统内的检流计反射镜32既从一侧到另一侧(沿x)扫描光片，又对返回的荧光反向扫描(descan)，将其映射到静止的共轭倾斜图像平面上，该图像平面然后聚焦到相机48(例如，sCMOS相机，诸如Andor Zyla 4.2+)上。当检流计反射镜32在x方向上扫描片以产生体积图像时，通过照相机48获得对应于倾斜yz'截面的平面。由于除了检流计反射镜(其以每体积一行扫描)之外系统的所有部件保持静止，所以成像速度仅受照相机读出速率限制。因此，体积采集率由跨越每个体积的x步的数量以及在相机上采集的相机行的数量(其对应于z'成像的深度)来确定，其中较少的行允许更快的读出，例如在标准sCMOS相机上对于100行的每秒～2,000帧。在所有系统中，使用在照相机前面的自制图像分割器实现双色成像，将图像分割在各列上以并行收集光谱分辨的发射图像而不降低速度。
以三种成像范例之一获取图像：1)基于检流计反射镜的光片扫描，用于固定样本的体积成像(在～1×1mm2 xy的视野上)，2)漫游扫描，在此期间，在连续的基于反射镜的体积成像期间手动移动样本，以及3)利用静态光片(固定的检流计)沿着x对样本进行载物台扫描。通过拼接来自体内组织的漫游扫描的体积或来自体外组织的顺序台扫描的体积，产生更大的视场。载物台扫描非常适合于正好在大的组织切片或厚片的表面下方(例如，在50-350μm的深度处)的快速3D扫描。当执行载物台扫描时，扫描元件32被保持在固定位置，并且样本相对于整个显微镜平移(反之亦然)。可以利用与玻璃或其它平坦材料接触或抵靠玻璃或其它平坦材料放置并从上方或下方成像的探针来实现载物台扫描。离体组织可以更容易地用一系列不同的染料和染色剂染色，以及通过自发荧光成像。图3A示出SCAPE的单个物镜光片在完整组织中的激发和发射的几何构造。倾斜光片沿yz'照射单个平面，同时通过同一样本物镜收集荧光发射。
图3B示出了如何沿着扫描方向(x)收集单或双颜色yz'切片以创建倾斜体积。
在图1的实施例中，488和637nm激光通过30°Powell透镜68(PL)和50mm和75mm柱面透镜61、62(CL)以形成均匀光片。该片被引入具有二向色镜38的主光路中，并在x方向上偏离中心定位，以在样本物镜12(O1)处形成倾斜光片，这里是具有2mm工作距离的水20×1.0NA Olympus物镜。所得到的荧光平面被通过相同的物镜12收集，并通过以4f配置布置的两个望远镜映射到在第二物镜26(O2)(Nikon 20×，0.75NA，空气)和第三物镜42(Nikon10×，0.45NA，空气)之间的固定中间像平面上。望远镜1由75mm的普罗素透镜16(SL1)和150mm的消色差透镜14(TL1)组成，放大倍数为2×，望远镜2由60mm的消色差透镜22(SL2)和100mm的消色差透镜24(TL2)组成，放大倍数为1.67×。然后，固定的图像平面被成像到sCMOS照相机48上，其中，当需要时，自制的图像分割器45提供到两个发射通道中的光谱分离。对于所有台式数据集，使用给出4.6×的最终放大倍数的70mm焦距镜筒透镜46(TL)，除了对于影像2(如下所述)的数据使用70-200mm的可变焦距TL之外。在基于反射镜的扫描期间，通过使用检流计反射镜来扫描光片并且同时将发射的荧光反向扫描到静止图像平面上来对体积成像，如美国专利10,061,111中所描述的。
大多数先前的SCAPE显微系统已经被用作科研的台式仪器，因此不需要显著的小型化。然而，为了将MediSCAPE转化成临床使用，关于图1实施例的设计的一些小型化和简化可能是有利的。
这里描述的图2实施例是MediSCAPE设计，其保持成像性能，同时具有更紧凑的形状因子，这使其适合于在开放外科领域的术中使用以及用于口腔和妇科检查。对于较小的、定制的主物镜，该相同的设计可以用于诸如耳、鼻和喉的较小的孔口，并且用于关节镜检查和腹腔镜检查(特别是与机器人手术组合)。
在图2的实施例中，通过直径为2.2cm(直径仅由我们使用的商用60×物镜限制)的窄的15cm长的导管来获取图像。在小弯曲以容纳系统的检流计反射镜之后，导管接着成一直线继续直径<3cm达31cm，附接到保持额外光学器件的扫描头和连接到单独计算机的系统的相机。系统的摄像机和激光源可以位于离成像头一定距离处，如果需要的话，通过光纤耦合中继。
图2的实施例是便携式的，并且适合于手持式体内成像，同时保持细胞水平分辨率以及合适的深度范围和横向视场。任选地，它可以使用表1中列出的部件来构造。这整个单元可以安装在手术显微镜框架上，允许成像头在手术区域内灵活的手引导运动，具有小规模缩放运动和机电地稳定的扫描。杆和GRIN透镜可以延伸成像臂的较窄部分以与腹腔镜插入更兼容，而可以添加面向前向或侧面的MediSCAPE成像以用于腔内成像。
一些实施例使用具有2mm工作距离(WD)的水浸主物镜。对于临床应用，可以制造无菌护套以覆盖成像头，该无菌护套将结合光学透明间隔件以提供被成像的组织的稳定性，同时还确保物镜捕获组织中的200-300μm深度范围的最佳工作距离。在一些实施例中，深度范围为50-350μm。
MediSCAPE的进一步小型化是可能的，例如通过将基于光纤束的检测与使用MEMS反射镜和GRIN透镜的远端扫描头结合。然而，这种实施方式可能牺牲图像质量和视野，并且将主要用于胃肠内窥镜检查应用。
对于体内临床应用，图2的实施例提供了更窄、更长的成像头，其允许在手术区域中操纵而不阻挡外科医生进入该区域。如图2所示，这个特征是通过使用展开反射镜34来展开图1系统的通常正交的望远镜，并将检流计反射镜32定位在主伸长光束路径内来实现的。选择较小直径60×1.0NA的水浸主物镜12(O1)，而图1系统中的2”直径的透镜由12mm直径的光学器件代替。为了提供对对准的更多机械稳定性，激光照明经由单模光纤引入，然后被引导到物镜26中(O2)，简化了成像头，同时使得图像旋转物镜和激光发射能够全部被刚性地安装在成像头远侧的板上。
图2的实施例用从主物镜12入射的倾斜光片照射组织(O1)。由该片激发的荧光通过相同的物镜被收集。透镜望远镜14、16(TL1和SL1)在O1 12和检流计反射镜32之间映射光，该检流计反射镜用于在样本中从一侧到另一侧扫描激发片，并且将返回的光重新引导到第二成像望远镜24、22(TL2和SL2)中，再引导到次级物镜26(O2)。该透镜产生样本的中间图像，由于检流计反射镜32的反向扫描功能，该中间图像相对于扫描光片保持静止。在该中间图像空间中的光片的倾斜图像通过第三倾斜对准的物镜42传递到照相机48上(O3)。在图2所示的实施例中，该中间图像空间还用作引入激发光的位置。
主物镜12(O1)应提供尽可能高的NA和长的工作距离(WD)。我们将图1系统中使用的直径为30mm的20×1.0NA Olympus XLFLN20XW替换为直径为22mm并且在水中具有3mm有效焦距(EFL)、1.0全NA和2mm WD的小得多的60×Olympus水浸物镜(LUMPLFLN 60XW)。移动到该较高放大率物镜的主要影响是系统的可用视场(FOV)从1.0mm减小到0.4mm。在替代实施例中，主物镜具有介于50×和70×之间的放大率、介于0.9和1.1之间的数值孔径以及介于2.5和3.5mm之间的有效焦距。
为了各向同性地将由O1成像的3D样本体积复制到由O2形成的中间3D图像，O2的半孔径接受角应不小于O1的半孔径接受角。因此，我们选择具有0.75NA(在空气中)和4mm EFL的Mitutoyo平消色差物镜(#58-237，Edmund)作为O2 a 50×。该物镜的特征在于5.2mm的WD，允许用于通过O3重新成像静止中间图像和用于激发片光的发射的足够的空间和灵活性。在可选实施例中，O2具有介于40×和60×之间的放大率、介于0.65和0.85之间的数值孔径、以及介于3和5mm之间的有效焦距。
图2的实施例具有第一组光学部件10，其具有近端和远端。第一组光学部件10包括设置在第一组光学部件的远端处的第一物镜12。第一物镜12具有介于10×和70×之间的放大率和介于0.5和1.1之间的数值孔径。该实施例还具有第二组光学部件20，其具有近端和远端。第二组光学部件20包括设置在第二组光学部件20近端的第二物镜26。在图2实施例的一些(但不是全部)版本中，第一物镜12具有介于50×和70×之间的放大率、介于0.9和1.1之间的数值孔径和介于2.5和3.5mm之间的有效焦距；第二物镜26具有介于40×和60×之间的放大率、介于0.65和0.85之间的数值孔径和介于3和5mm之间的有效焦距。
扫描元件32相对于第一组光学部件10的近端向近侧设置，相对于第二组光学部件20的远端向远侧设置。扫描元件32被设置成沿从近到远的方向引导激发光通过第一组光学部件10，使得激发光被投射到定位为向远侧超过第一组光学部件10的远端的样本中。投射到样本中的激发光以倾斜角度形成激发光的片，并且该片的位置根据扫描元件32的取向而变化。第一组光学部件10将来自样本的检测光沿从远到近的方向引导回扫描元件32。扫描元件引导检测光，使得检测光沿从远到近的方向穿过第二组光学部件20，使得第二组光学部件20在向近侧超过第二组光学部件20的近端的位置处形成中间像平面。
折叠式反射镜34相对于第一组光学部件10的近端向近侧设置，相对于第二组光学部件20的远端向远侧设置。在图2所示的实施例中，折叠式反射镜34位于扫描元件32和第二组光学部件20的远端之间。但是在替代实施例(未示出)中，扫描元件32和折叠式反射镜34的位置交换，在这种情况下，折叠式反射镜34将定位在扫描元件32和第一组光学部件10的近端之间。
第三物镜42被布置成将从中间像平面到达的光朝向光检测器阵列48引导。
实验和理论表征揭示了与图1系统相比，图2系统的等效或甚至更优的分辨率和光效率，具有接近0.811±0.123μm(y)、1.07±0.115μm(x)和2.10±0.479μm(z)的束腰的分辨率，唯一的折衷是适度减小的视场(对于系统A为～1mm×1mm x-y，相比对于图2系统B为～0.4×0.6x-y)。
图4A和图4B分别示出了由图1设计和图2的这种O1-O2组合提供的消像散成像的理论操作范围。对于两个实施例，计算了在不同散焦距离处的轴上点源的斯特列尔比(Strehlratio)和散焦系数。如图所示，O1-O2组合可容纳约±80μm的散焦范围(斯特列尔比≥0.9，额外的散焦小于5μm)，这提供了～160μm的轴向范围，足以用于生物组织的光学成像。为图2实施例选择的O1-O2组合提供了操作范围和紧凑性之间的良好折衷。
在图2的实施例中，用于O1到检流计之间的中继望远镜的扫描透镜16和镜筒透镜14(SL1和TL1)被选择为满足以下标准：1)外径应当尽可能紧凑；2)整个4f系统应形成足够长的手持部分以易于操纵；3)TL1的焦距应当足够长以到达O1 12的后焦平面(其位于物镜内部19.1mm)，但不能长到使得从O1的FOV(直径约400μm)的边缘剪切边缘光线；4)O1的6mm直径后光瞳应在没有孔径损失的情况下被缩小到检流计反射镜上。考虑到这些因素，我们选择使用直径12.7mm的38.1mm EFL消色差透镜作为TL1，并使用包括两个直径12.7mm的50.8mm-EFL消色差透镜的普罗素透镜作为SL1。第二中继望远镜(SL2和TL2)位于更远离样本空间的位置，因此我们将其实体直径约束放松到1英寸，将由两个1”直径101.6mm-EFL消色差透镜制成的普罗素透镜选择为SL2，并且将1”直径76.2mm-EFL消色差透镜选择为TL2。对于所有的普罗素组件，组分消色差透镜之间的分离首先在OpticStudio 16.5(ZemaxLLC)和Solidworks 2016(Dassault Syst Same)中建模，然后通过堆叠厚度为0.4mm或1.0mm的光学间隔件(SM1S01、SM05S1M和SM1S1M，Thorlabs)以亚毫米精度实际控制。
这两种望远镜都具有1.5倍的放大率，但是O1 12(3mm)和O226(4mm)的EFL的比率产生了从样本到中间图像的1.33的有效放大率，满足了基于我们分别对O1和O2使用水浸(n＝1.33)和空气(n＝1)物镜来进行再成像的“完美3D成像条件”。使用90度银镜34将第二望远镜折叠到接近检流计反射镜，以形成如图2所示的线性配置。
为了有助于使该图2的设计小型化，激发光射入系统的位置从SL2 22和检流计32之间移动(如图1中所示的台式设计中那样)为反而在O2 26处进入。该方法有效地在中间图像处创建光片，并且以与US 2019/0317312(通过引用整体并入本文)中描述的将返回图像从样本中继到中间图像相同的方式将其中继到样本。
为了形成该片，来自具有2.8μm模场直径的单模光纤60(SM450，Thorlabs)的激光(488nm)通过15mm EFL非球面透镜准直成1/e2腰部的～3.33mm的高斯光束。该高斯光束由柱镜4f系统61、62(CL1和CL2)扩展～3.3×，然后由50mm-EFL柱透镜66(CL3)聚焦，全部沿x方向，以产生椭圆形高斯光束。将该片的束腰仔细地对准以与O2 26的焦平面重合，并以～39°的倾斜角射入O2，这对应于O2 26的后孔径上～2.5mm的侧向光束偏移。
选择Nikon平面消色差λ20×0.75NA目镜作为检测目镜O3 42。它与适当焦距(例如，用于组织成像的35mm EFL，或用于分辨率校准的135mm EFL)的镜筒透镜46(TL3)配对，以将中间图像放大到sCMOS相机48(Andor Zyla 4.2+)上。由于O3对于170μm厚的盖片是经校正的，因此使用3D打印制造盖片支架并将其安装在O3的前面以使球面像差最小化。在可选实施例中，O3具有介于15×和25×之间的放大率和介于0.65和0.85之间的数值孔径。
通过对包埋在1％琼脂糖凝胶中的200nm直径荧光珠成像来表征分辨率。135mmEFL管透镜(SAL135F18Z，Sony)用作TL3，以提供从样本到照相机(Zyla 4.2+，6.5μm像素尺寸)的总体～18×的放大率。通过沿x-、y-或z-方向手动平移样本100μm并量化珠位移来确认样本密度，分别产生Δx＝0.337μm、Δy＝0.371μm和Δz＝0.286μm。将样本处的片的角度校准为39.5°。在对MediSCAPE数据进行去偏差之后，估计该系统的FWHM分辨率在接近片的腰部处为0.811±0.123μm(y)、1.07±0.115μm(x)和2.10±0.479μm(z)。虽然x和y分辨率基本上不随深度而改变，但是如所预期的，z分辨率随着距束腰的距离而减小。
图5示出了MediSCAPE的图2实施例在不同焦深的光学分辨率。从经偏斜校正的三维数据中提取大约6,300个珠子，并且估计它们沿着所有三个方向的FWHM大小。然后根据其深度将珠子分组成5μm厚的间隔，然后计算每个深度间隔的平均FWHM和标准偏差。
表1|用于图2实施例的系统组件列表
图6描绘了成像盖82的示例，其被制造为覆盖成像头(或者，更具体地，成像头的第一物镜12的远端)。盖82结合了光学透明间隔件，以提供被成像组织的稳定性。盖82可与本文所述的图1或图2的实施例一起使用。在一些实施例中，成像盖82提供所需的水浸没以及主物镜(O1)与被成像组织的精确间隔。它还有利地固定和稳定被成像的组织。
使用3D打印制造盖82的一个示例，以安装在标准物镜12上。使用氰基丙烯酸酯胶将圆形玻璃盖片88胶合到前表面并提供水密密封。一旦放置在物镜12上，水85注入透镜和盖82之间的间隙，将物镜12连接到盖玻璃88。一旦盖的位置被调整到正确的距离并与成像平面对准，盖82的主体上的固定螺钉(未示出)允许固定。盖玻璃88的外表面通常位于距物镜12的主焦面50-150微米处(例如距2mm工作距离物镜的前表面1.85mm)。这样，如果焦平面以150微米的深度为中心，则被推靠在玻璃88的外表面上的组织可以在300微米的深度范围上成像。(这种距离选择可以机遇待成像的组织中的期望穿透深度确定。)实际上，该盖被证明对于不受约束的体内人体组织的成像是非常有用的，因为它可以被压靠在组织(例如口腔组织)上以稳定被成像的组织，并且能够在组织上滑动，同时将组织保持在期望的工作距离。在一些实施例中，盖可以是可消毒的和/或一次性的，以用于患者保护。
设计用于与图1实施例一起使用的盖的形状和尺寸适于连接到标准60×1.0NA、2mm工作距离、盖玻片校正的水浸没商业物镜(Olympus)。该方法可以应用于任何类型的物镜，包括小型化和定制的透镜。例如，透镜可以被制造成具有定位凹槽或其他引导装置，用于将盖精确地放置/附接在正确的距离处。该距离也可以通过机械、电气、气动或液压机构来调节。如果物镜是盖玻璃校正的，则使用玻璃前表面88是理想的，但是如果需要，可以使用替代的前表面介质(包括PTFE)作为与水匹配的折射率，或者使用其它材料，诸如PDMS或折射率特定的聚合物。在后一种情况下，整个间隔件可以是实心的，或者利用小滴水或折射率匹配介质耦合到物镜。如果间隔件足够刚性，则在物镜上向后延伸的盖部分可以更柔软，例如在尖端附着有间隔件的薄塑料护套。在另一实施例中，间隔件可设计在物镜本身中，提供具有～150微米工作距离的透镜。薄的、折射率匹配的护套可以提供一次性的覆盖物，或者透镜可以是化学或热灭菌的。光路中的光学部件(包括电可调透镜)可以用于调节物镜的有效工作距离，以便能够调节成像深度范围而不需要重新定位前表面。
任选地，盖可以结合或容纳与组织相互作用的方式，例如将标记染料的注射定位到成像位置，或甚至在成像位置获取样本。
用Medi-SCAPE对口腔进行体内无标记的人成像
图6中描述的盖结构成功地用于使用图2和图1的实施例在健康成人志愿者的口腔中获得体内人体数据。该盖被配置成确保相应物镜的最佳工作距离以捕获进入组织的200-300μm深度范围，同时保持透镜的水浸界面。在一些实施例中，深度范围为50-350μm。
通过要求成年受试者将适当的组织定位在图6所示的成像盖上，并在3-5VPS的连续体积成像期间缓慢移动其位置达120秒，获得舌头、内唇和外唇的无标记漫游扫描。将这些漫游扫描图拼接成连续的大3D体积。来自图1和图2实施例的数据一致地揭示了包括不同类型的舌乳头的口腔组织层的特征以及不同组织类型之间的转变，其概括了口腔粘膜的组织病理学的标准特征。在舌的丝状乳头上可以看到明亮的荧光，可能是来自角蛋白和细菌，而菌状乳头的上皮是透明的，允许无阻挡地观察到亮绿色的内部分支结构，该内部分支结构与毛细血管的结构匹配良好。有趣的是，发现体内图像对比度的主要来源之一是血管，来自于血管壁的绿色自发荧光和对应于血液本身的红色信号二者。在唇中，观察到多种不同的血管化钉突结构从内唇中的细且尖发展到从内唇到外唇过渡处的更厚且更树桩状。从嘴唇到皮肤的过渡捕获了由微脉管系统环绕的毛囊的显著特征。
MediSCAPE的对这些突起的规律性和表面上皮下面的基底膜的连续性以及固有层内的血管图案成像的能力表明了MediSCAPE能够可行地检测从溃疡和疤痕组织到鳞状细胞癌的一系列口腔粘膜疾病。重要的是，大面积的感兴趣组织被拼接至13mm以便展示，可以被仔细检查以便早期检测可疑病变和非侵入性随访和监测。选择口腔用于这种第一次体内人体示范，因为它在健康志愿者中是容易获得的，然而这个数据提供了MediSCAPE可广泛应用于在包括牙科、耳鼻喉科、眼科学、妇科和各种开放和腹腔镜手术和程序的广泛临床环境中对体内原位人体组织成像的有价值的证据。
实时无标记的体内肾和心脏的体积成像
尽管通常认为荧光成像是一种麻烦，但活组织中的自发荧光可以使组织的组织学评价中常规使用的形态学特征可视化。生物组织中固有荧光源的实例包括弹性蛋白纤维、脂色素(例如脂褐素和类蜡素)、磷脂和黄素(例如黄素腺嘌呤二核苷酸、核黄素和黄素单核苷酸)。这些荧光团在MediSCAPE中在488nm激发下可能是可见的。～525nm的发射通道可能捕获弹性蛋白、黄素、脂褐质、类蜡体、磷脂、胆红素和透明素，而～618nm的通道捕获来自脂褐质、类蜡体和卟啉的相对更多的信号。
此外，诸如弹性蛋白和FAD的本征荧光团的分布和浓度提供了丰富的分子信息范围，其甚至在结构变化变得可见之前可以指示组织健康的变化。在人体中无标记成像是特别有价值的，因为体内染料的使用受到安全限制以及获得FDA批准的复杂性和成本、有限的渗透深度、异源染色和临床环境中染料施用的时间敏感性的限制。
为了展示MediSCAPE以高速捕获体内自发荧光对比度的能力，使用基于反射镜的扫描来成像严重麻醉的野生型小鼠的暴露的肾和心脏。
MediSCAPE的益处和应用
MediSCAPE允许完整的、体内的和新鲜的组织的实时体积成像，而不需要外源染料，这可以允许在临床环境中简单但全面的组织评估。MediSCAPE相对于常规共焦显微内窥镜的独特优点是其超快3D成像速度，结合高得多的灵敏度。这些特征允许仅使用自发荧光对比度的细胞特征和3D形态的高质量体内成像，同时耐受体内运动并允许实时动态监视大面积的组织。MediSCAPE可以对一系列不同的外源荧光团成像，从而扩展其用于更广泛的临床应用的效用。
我们设想到的MediSCAPE的主要临床应用是用于病灶切除和活检部位选择的手术指导。图2实施例的形状因子当前与开放式外科手术领域兼容，包括脑、心脏、整形外科和腹部外科手术、诸如口腔和子宫颈的可进入孔内的组织，以及潜在地用于腹腔镜和机器人外科手术。胰腺癌小鼠模型中的结果提示MediSCAPE可在复杂胰十二指肠切除术(Whipple手术)期间提供有价值的指导。较小形状因子的系统，或MediSCAPE的基于GRIN透镜的扩展可以允许“探针”型成像，其可以引导或被结合到针吸活检手术中。
MediSCAPE对完整组织非破坏性成像的能力可以允许用于临床和兽医应用的评价组织健康、组织分型、神经定位、绘制微血管和使用血管内染料评价再灌注。此外，MediSCAPE对自发荧光的敏感性可被利用来揭示作为新的疾病生物标记的代谢变化。MediSCAPE还可以证明与靶向“分子探针”的广视场成像结合以显现细胞水平摄取和消除歧义标记是高度有价值的，特别是在早期临床验证研究期间。如通过新鲜的、切除的组织的成功的全面成像所证明的，MediSCAPE显微镜检查也具有在床边、使用或不使用外源造影剂的快速、3D评价活检和切除的组织的显著潜力。
尽管MediSCAPE的穿透深度受到被成像组织的散射特性的限制，但是产生的高速3D数据相当于10-100的连续薄组织学切片。在许多情况下，这种3D信息提供了关于组织结构的有价值的附加信息，同时还允许利用2D平面成像不可能实现的漫游和拼接。虽然这种穿透深度限制阻止了深部组织结构的非侵入性成像，但是在切除期间重复成像的能力使得能够在移除上覆组织时灵活地探询原位和残余的切缘。利用光片优化，或者使用红光或近红外照明，尤其是与红移造影剂协作，也可以改善穿透深度。
MediSCAPE还有利地促进在移植之前供体器官的快速、非破坏性检查。许多供体肾由于难以在捐献和移植之间的短时间窗内评估其健康而被丢弃。MediSCAPE在完整人肾中显现关键诊断特征的能力支持这种潜在应用，其可以扩展到在其它移植器官(如肝和心脏)中的原位评价和活检指导。
如通过用台扫描采集对新鲜的切除组织的全面成像所展示的，MediSCAPE显微镜检查也具有用于在床边快速、3D评价活检和切除组织的显著潜力。MediSCAPE远远超过点扫描共焦、双光子和拉曼显微镜检查方法的3D成像速度限制，同时避免了对昂贵的专用激光器的需要，这种专用激光器对于定位在床边可能是有挑战性的。此外，由于切除的组织的成像消除了对使用宽范围的新鲜组织相容性选择性染料和标记的限制，因此染色新鲜组织的MediSCAPE结果显示床旁形式的MediSCAPE可提供更全面的活检组织评估，作为其体内使用的补充/交叉验证。离体组织也可以被化学透明化以提供更全面的3D可视化。尽管组织透明化步骤可能花费过多的时间，但也可以使用图1的实施例对透明化的组织进行成像，提供了优于双物镜光片系统的优点，包括单物镜光片几何结构的简单化和对主物镜的工作距离的全深度进行成像的能力。
对比度的来源
本文所述的大多数图像是用单个488nm激光器进行荧光激发获得的。然而，更宽范围的激发波长可容易地并入MediSCAPE，包括405nm、561nm和近红外范围。附加的波长可以利用自发荧光分子(例如NADH、胶原或视黄醇)以及延伸到近红外的外来染料(例如吲哚菁绿)。
尽管我们将自发荧光成像与作为金标准的常规组织学对比度进行了比较，但是自发荧光具有揭示除了在组织学中所见之外的另外的有价值的信息的潜力。例如，在人肾中用488nm激发检测到的自发荧光在动脉壁的弹性薄层、细胞质脂褐质沉积物和尿流出物材料中特别强。还清楚可见的是假-肥大近端小管和病灶小动脉的上皮细胞内的细胞质颗粒结构，其具有强烈的点状核周自发荧光，这提示了溶酶体信号。几乎所有这些组织特征在常规组织学中显得不太明显，这表明MediSCAPE具有收集超出传统组织学可提供的附加信息的潜力。新的诊断特征可能具有重大的临床意义，特别是对于有限的或罕见的人类组织样本(例如小的针芯活检)来说。
可视化、显示和自动化分析
临床采用MediSCAPE的关键因素将会是是采集外科医生和检查病理学家都可以实时可视化和解释数据的方式。这里所描述的MediSCAPE图像的所有分析和绘制都是离线进行的，然而，使用对超声和OCT数据的实时显示和绘制工作良好的现场可编程门阵列(FPGA)技术，深度和横向截面的实时拼接和显示应该是可行的。此外，MediSCAPE数据的数字特性将允许远程病理学家(在放射学中是常见的)在线检查数据集，远程病理学家可以容易地选择他们的优选视图和颜色方案。MediSCAPE的丰富的体积数据也理想地适合于基于自动机器学习的分析，其可以自动地分类正常和可疑区域并且挑选出关键组织特征。在线分析结果可以被投射到使用增强现实可视化的外科手术区域上。在可用的情况下，MediSCAPE数据可以在空间上与立体定位坐标和其他成像模态如MRI配准，并且作为患者的电子健康记录的一部分被完全存档。
技术发展和形状因子
尽管本文所述的大多数结果利用MediSCAPE的图1实施例，我们也呈现与图2实施例接近等同的性能，其形状因子与安装在手术显微镜框架上和在手术视野内手动引导兼容。使用MEMS反射镜、光纤或杆和GRIN透镜以及定制的小直径、高NA物镜的进一步小型化都可以进一步减小系统的形状因子，以允许腹腔镜甚至内窥镜使用。
对于常规临床使用，系统任选地在主要物镜的尖端使用光学透明间隔件以在最佳工作距离处压靠组织，结合进一次性或可灭菌护套中。诸如在固定距离上的微尺度稳定和自动扫描的特征可以提高使用的容易性，而与成像相协同的标记、捕获或甚至激光消融识别的区域的能力可以为微尺度切除提供显著的益处。MediSCAPE动态放大感兴趣特征的能力也是有益的，这提供了在通过移动覆盖更大区域和捕获感兴趣组织中疾病的关键特征之间的折衷。
总之，MediSCAPE是原位组织病理学的强有力的新方法，其利用光片扫描的独特益处以允许宽范围的组织的高速3D、无标记成像。MediSCAPE具有超越替代活检和常规组织病理学的潜力，为原位非破坏性评估广泛的有价值的组织特征打开了新的大门。这些新的能力可以大大提高护理标准，同时也减少了各种外科手术的时间和成本。
数据处理
MediSCAPE数据处理包括背景减除、数据的偏斜校正以及将双色图像与定制书写的MATLAB图形用户界面(GUI)合并。通过将体积除以高斯模糊平均强度z投射，沿着x和y轴将伪平场校正应用于双色图像。为了更好地显示细节，图像集3中所示的MediSCAPE数据被用模糊掩模(半径1，量0.3)和CLAHE直方图均衡化(块大小，75，斜率2)处理。
对于用原黄素染色获得的MediSCAPE数据集的H&E假染色，Giacomelli等开发的虚拟H&E算法被用于基于Beer-Lambert定律从荧光数据创建明场H&E颜色通道。通过618/45nm带通滤波器收集的具有488nm激发的自发荧光发射用于在对数标度上指示一般非核背景结构(曙红)，而在488nm激发的原黄素荧光用于指示核结构(苏木精)。
数据拼接
MediSCAPE的关键特征是其非常快的3D成像速度，即使在对弱的自发荧光成像时。该速度可以被调节以允许通过相对于系统的3D视场“移动”或连续移动组织来探查组织的大面积。MediSCAPE的速度可以容许这种平移而在每个单独体积中没有显著的伪像，并且由于每个体积与最后一个体积具有一些空间重叠，因此可以拼接体积序列以生成跨越毫米或更大的完全连续的3D数据条。这一特征不需要连续的或运动控制的运动，并且可以忍受不可避免的体内运动(例如呼吸)，使得它对于评估组织类型之间的转变或者探索细胞和介观(mesoscopic)水平的多尺度空间模式的不均匀区域是理想的。
为了拼接来自漫游扫描的连续获取的重叠体积，使用Fiji中现有的成对拼接插件编写定制ImageJ宏，对已经作为MATLAB中的背景去除的双色tiff堆栈保存的体积起作用。将体积成对拼接以模拟可以使用FPGA实现的实时拼接。因为体积速率通常比采集期间组织平移的速度高得多，所以采集的每第n个体积(其中n＝2-5)用于拼接以减少总处理时间并减少拼接误差。通过以成对方式融合大约每第4个连续采集的体积，创建图像集1、图像集2、图像集7和影像1、3和10(如下所述)中所示的拼接体积。在每个拼接步骤期间，沿着Y和Z轴对体积进行2×下采样，并且在给定先前成功的拼接步骤中找到的对准位置的情况下粗略地对准。如果比对r值超过给定阈值(～0.8)，则使用初始粗比对值进行原始体积的精细比对，并且使用具有10％重叠的线性混合融合原始体积。如果由于过度运动，粗略对准r值低于阈值，则加载并对准下一个连续体积，依此类推，直到两个体积都可以被精确对准未知。数据在拼接后在MATLAB中进行偏斜校正。为了创建下面针对影像1和影像3描述的“实时拼接”影像，每个拼接步骤被偏斜校正并且被定位在与最终完全拼接的体积相同的3D尺寸的空白画布上。
Fiji中的Bigstitcher插件被用于拼接台扫描的数据。实施定制的MATLAB和ImageJ流水线以自动保存MATLAB中的经背景扣除、经偏斜校正的双色tiff堆栈，将HDF5格式的数据转换并加载到BigStitcher中，使用具有默认拼接向导预设的线性混合和精细ICP校准来预先校准具有工作台坐标的体积和拼接数据。
十四组样本图像(这里称为图像集1-图像集14)和十个影像(这里称为影像1-影像10)被捕获/制作以演示这里描述的硬件的能力。
更具体地：
图像集1显示了体内小鼠肾的体积绘制和各个平面，其被收集为802×861×275μm3双色xyz体积，取样密度为1×1.4×1.1μm3/体素，在0.78秒内，用基于反射镜的扫描。用488nm光激发自发荧光，并通过525/45nm和618/45nm带通滤光器收集双发射通道，使用蓝色和“黄热”色图，其允许重叠通道的更好可视化。
小管在两个发射通道中都显示强烈的自发荧光，近端小管在～525nm(黄热)比远端小管(蓝/紫)显示更高的发射。在该范围内的自发荧光可能是由于代谢活性的近端小管细胞中的黄素。细胞核可沿着小管壁区分为点状暗区。从小鼠肾皮质的相似区域处理的H&E组织学显示正常的肾小管结构。两种类型图像之间的结构信息是相似的，但是MediSCAPE提供了基于包括黄素、弹性蛋白、卟啉和脂褐质的内源性荧光团的光谱分辨发射的额外的分子对比度。
MediSCAPE的关键特征是这种自发荧光对比度可以实时捕获，允许更容易地探查组织中的大3D视场。为了捕获“漫游扫描”，麻醉的小鼠被沿3维手动平移，以模拟MediSCAPE成像探针如何漫游完整的体内组织。在9.3VPS下获得xyz中358×798×165μm3的双色体积，取样密度为2.5×1.4×1.1μm3/体元，同时连续地在完整的肾皮质表面上漫游。除了提供跨活体肾的1×3mm条的高质量体积图像的连续序列之外，该漫游数据被拼接以生成连续体积。为了生成这个更大的视场，使用ImageJ中的成对拼接插件拼接重叠的3D体积，类似于如何在现场可编程阵列(FPGA)上实时拼接体积。在更详细的图像中，细胞核表现为沿小管壁的阴性空间，基于结构和光谱发射，近端和远端小管之间有明显的区别。这些特征类似于先前的单体积扫描，尽管在减小的x范围和深度范围上较粗的2.5μm x步长，这允许实时速度。影像1(下面描述)示出了漫游扫描的实时回放，其中来自每个体积的横向和深度横截面被采集并且在采集重叠体积时拼接更大的视场。
尽管在该采样密度下可以看到细胞特征，MediSCAPE具有在分辨率与视场之间进行折衷以“放大”感兴趣特征的能力。影像2(如下所述)显示了使用可变的70-200mm焦距镜筒透镜(在常规(4.6×)和高放大(11.4×)之间切换)获得的小鼠肾数据，显示了管状结构的更清晰和更详细的可视化。这种“放大”特征可以容易地自动化，并且与在较低放大率下采集的较大视场上的较粗糙成像共同拼接。
图像集2展示了MediSCAPE对固有的体内运动的耐受性。使用相同的体内制备物对跳动的完整体内小鼠心脏成像。通过在暴露的心脏表面上移动，同时连续获得12.9VPS的双色体积(在305×798×138μm3体积尺寸上用检流计扫描，取样密度为2.5×1.4×1.1μm3/体素)，来获得数据。图像集2示出了在3D拼接视场内的xy切片，该xy切片是从15.6秒的数据创建的，该数据是在使用3轴载物台以手动漫游心脏组织时采集的。心肌中的横纹心肌细胞清晰可见。静脉和动脉作为负空间，尽管动脉可以通过沿其壁的高度自发荧光弹性蛋白来区分。在心肌表面也可以看到弹性纤维。沿肌肉纤维的颗粒自发荧光很可能是脂褐素，一种随着时间在高活性细胞中积累的脂色素。在该采集期间发生的周期性心脏脉冲在记波器中表现为沿y轴的突然横向移动，其中在15.6秒的成像期间示出x和z的最大强度投射。该系统能够获得能够成功地拼接在一起的体积，同时具有最小的可见运动伪影或模糊。影像3(下面描述)示出了跳动的心脏的横截面的实时回放以及这些体积在它们被获取的同时的拼接。注意，拼接三维组织体积补偿了所有3维中的组织运动，并且允许横向地和沿着深度轴的移动。与拼接传统的2D视场相比，体积拼接更可靠地固有地重建了3D组织结构，从而校正在体内不可避免的平面外运动。
图像集3展示了在用MediSCAPE成像的各种新鲜切除的小鼠组织中仅用自发荧光可见的组织结构的表征。图像3显示了在不同组织深度的xy侧向切片，H&E组织学显示了小鼠组织中相同或邻近的区域。影像3和4(如下所述)示出了每个3D体积的完整深度飞越影像。新切除的组织包括以下：心室中的心肌纤维、脑矢状切面中的小脑、肺中的肺泡和内脏胸膜、肝小叶中的典型肝细胞脐带形成和囊、脾中的红髓和周围囊、为了更好的可视化以对数标度显示的具有像素强度的膀胱粘膜中的浅层、大腿肌肉内深处可见的肌纤维、和结肠粘膜中的利贝昆氏腺窝(crypts of Lieberkühn)。
仅通过固有的对比度，微米级结构在所有研究的新鲜组织中都可见，并且与H&E组织学中可见的结构非常一致。例如，利贝昆氏腺窝的形状和直径可以在结肠粘膜中清楚地区分。肺组织中的肺泡明显地衬有强烈的荧光弹性蛋白，可以评价其完整，而组织学通常显示来自于纤细的充气组织切片的主要变形。组织内的层(如膀胱粘膜)是明显的，并且可以在3D中进行评估，允许比2D组织学切片和单平面共焦显微内窥镜检查更全面的评估。组织学级别分辨率可能的最远深度是组织相关的，并且也随着激发波长而变化。对于许多组织，在488nm激发下，分辨率在50μm之后开始降低。然而，在骨骼肌中，例如，观察到细胞水平对比度进入到组织121μm。在样本处以在xyz中801×1065×275-330μm3的体积大小，以1×1.4×1.1μm3/像素的取样密度，在100fps下，以5-7mW的激光功率获取图像。
与人类组织中的疾病状态相关的组织学特征的检测
为了测试MediSCAPE在人类组织中捕获疾病相关特征的能力，从外科肾切除术标本中获得新鲜的人类肾组织，并将成像结果与相同样本上的常规过碘酸-舒夫染色(PAS)和H&E组织学进行比较。
图像集4显示在来自潜在慢性肾病(CKD)患者的肾切除术标本中通过MediSCAPE进行的自发荧光成像。为了将SCAPE图像中的区域与组织学图像中的区域共同定位，我们使用机动载物台扫描对新鲜标本的整个平坦表面成像以获取和拼接13.3×10.6×0.3mm3的体积。成像数据在196秒内获得。影像7(下面描述)示出了深度飞越影像，其示出了在完全拼接的体积中的横向截面。从整个拼接体积中，获得2.1×1.6mm2 xy ROI。
由MediSCAPE识别的关键诊断特征的实例包括动脉硬化和小动脉透明性疾病。动脉的识别由动脉壁的内部弹性层的强自发荧光辅助，这在高血压动脉硬化的背景中在MediSCAPE成像上甚至更突出，在该高血压动脉硬化中，存在由内膜增厚引起的腔变窄，伴随弹性层的重复。我们可以清楚地识别肾小球并区分显示整体硬化的肾小球。我们还可以区分肾小球下结构要素，包括肾小球毛细血管束、包曼间隙和包曼囊，尤其是当后者已经经历部分硬化时(图像集4d，注意箭头)。此外，我们可以识别与CKD相关的几种肾小球特征，包括节段性肾小球硬化、局灶性透明病变和结节性肾小球硬化(数据未显示)。在肾小管间质隔室中，已知与肾结果具有最强相关性的特征性慢性变化包括肾小管萎缩和间质纤维化在MedSCAPE图像中是清楚明显的。我们可以区分萎缩性和非萎缩性小管，鉴定近端小管和管状管型的假肥大。
图像集5突出显示完整、新鲜组织的MediSCAPE各向同性3D成像的独特值。图像集5示出了临床相关病变的示例，这可能从2维薄切片是模糊不能识别的。在若干平面图像中，小的囊肿状结构是明显的，其在单个图像上可以是严重扩张的萎缩性小管或简单的肾囊肿。然而，3D数据揭示了压在囊肿状空间内壁上的残余的压缩和硬化的毛细血管簇，将该结构区分为管下肾小球(或“肾小球微囊”)而不是任何类型的管状衍生元件。检查来自正常人肾组织的肾周围脂肪，我们还发现MediSCAPE也能基于其固有的自发荧光捕获弹性纤维和脂肪细胞的3D排列。评估体积空间中的这些特征可以允许更准确地评估脂肪含量以及不同组织隔室中的纤维的结构、密度和同一性(例如，弹性对比于胶原)。
新鲜人体组织中局部染料的体积成像
图像集6展示了MediSCAPE可以使用宽范围的荧光造影剂(如果可用的话)对临床相关特征进行成像。图像集6显示了从新鲜的、正常的人肾的样本收集的MedSCAPE数据的实例，所述样本用前黄素染色，前黄素是临床成像研究中常用的局部核染料。使用载物台扫描以在5.6秒内产生7500×918×164μm体积、用488nm激发获得原黄素和红色自发荧光发射。原黄素染色揭示了核大小、形状和分布，而自发荧光提供了补充的结构信息。按照最近在组织病理学中对组织荧光的可视化惯例，我们还产生了具有假彩色H&E比色计的双色MediSCAPE数据，使用原黄素作为苏木精类似物(紫色)并用618/45nm带通滤波器收集的自发荧光信号表示的“曙红”(粉红色)。假彩色MediSCAPE图像非常类似于传统的明场H&E组织学，当需要时可以允许更容易地评价核细节。影像8(如下所述)显示假着色MediSCAPE体积的顶部30μm深的飞越。
使用血管内荧光团对灌注进行体内体积成像
图像集7展示了MediSCAPE执行微血管灌注的实时3D体内成像的能力。在静脉注射葡聚糖共轭荧光素后，我们通过玻璃颅窗对活的头部固定的小鼠的脑成像。在9VPS下获得漫游扫描，并且产生3D拼接体积和单个体积的多视图最大强度投射。影像10(如下所述)示出了实时漫游数据，其示出了观察血管中的动态流的清楚能力，同时还捕获了3D微血管架构的清楚细节而没有运动伪影。除了神经外科应用之外，该方法对于评估肿瘤边缘中的微脉管系统或肿瘤栓塞、动静脉畸形和器官再灌注之后的微脉管系统也是有价值的。MediSCAPE可以利用常用的血管内荧光团，例如荧光素和近红外荧光团吲哚菁绿，用于更深的组织穿透。
图像集8展示了包埋在凝胶中的200nm荧光珠的MediSCAPE图像。从偏斜校正的原始数据沿所有三个轴取得60μm范围上的最大强度投射。每个横截面被缩放以在390×742×145μm3的xyz视场上给出各向同性的um/像素。
为了将图2系统的成像性能与图1系统进行比较，我们对新鲜的、未染色的小鼠组织进行了成像。使用488nm激发和在样本上约4.6mW入射功率，我们使用检流计扫描来收集xyz中尺寸为400×700×162μm3的双色体积，其用xyz中1.0×1.4×1.08μm3/体素的取样密度获得。在300Hz(0.75VPS)下采集图像，以将组织结构与用图1系统采集的那些进行比较。图像集10显示了显示肾皮质、纤维囊和肝细胞下层的肾小管和肝中的窦状隙、心脏表面的心肌和结肠粘膜中的利贝昆氏腺窝的横截面。这些体积展示了与图1系统相比组织结构的穿透深度和分辨率非常相似，尽管具有更小的圆形视场(由使用如O1的更小的形状因子60×物镜引起)。
作为在新鲜组织中成像性能的进一步证明，我们在11.2VPS下连续采集250×700×136μm3 xyz体积，同时漫游穿越结肠粘膜。通过大约每隔所收集的体积成对地拼接，产生来自16秒漫游的拼接视场。沿着每个维度都可见到清晰的隐窝结构，甚至沿着x具有2μm的采样密度并且以1400fps收集帧。
在这些扫描期间，在Andor Zyla 4.2+照相机上检测到等同的信号水平。这两个系统的良好匹配的信噪比和分辨率与预测图2形式的MediSCAPE实际收集更大NA的发射光的模型一致，因此甚至比图1的系统更有光效率。较小形状因子的主要折衷是视场的尺寸，这是由于使用图2实施例中的更紧凑的60×主物镜而产生的。该展示支持即使通过较小的主物镜和较长、较窄的望远镜或中继透镜仍能实现MediSCAPE的可行性，以允许MediSCAPE成像头在外科手术区域的简单操纵和精确定位。
图像集10显示了图2实施例中新鲜小鼠组织的无标记成像。用图2系统，用488nm激发和双色发射通道获得各种新鲜小鼠组织中的xy(顶部)和yz(底部)横截面。横截面显示肾皮质中的小管、肝中肝细胞的囊和下层索、心脏中的心肌和结肠粘膜中利贝昆氏腺窝。图像质量与图1设计相似，在肾小管中可看见细胞核，在结肠粘膜中可看见利贝昆氏腺窝，在肝囊中可看见单个弹性蛋白纤维。主要的区别在于减小的视场，其可以通过穿过组织移动来拼接更大的视场而减轻。
图像集10展示了双色自发荧光显像。通过MediSCAPE在新鲜小鼠大脑皮层(包括主要血管)中获得xy图像平面。对比度对应于488nm光激发的自发荧光。使用照相机前面的图像分割器并将每个颜色通道并排地定位在照相机芯片上(沿Y)，同时获取双色发射图像。该组中的两个图像示出了分别用525/45nm和618/45nm带通滤波器获取的灰度原始发射通道。这些通道被转换成“黄热”和蓝色色图，然后合并到该组中的另一图像中。
图像集11展示了用MediSCAPE成像的糖尿病人肾组织中的自发荧光。由MediSCAPE捕获的自发荧光显示了与常规组织学上所见的那些相同和不同的特征。该组中的一幅图像是来自具有轻度糖尿病肾病特征的老年糖尿病患者的肾皮质组织的PAS组织学图像。该组中的另一图像是来自相同组织块(新鲜时)的台扫描体积的MediSCAPE xy切片，显示在488nm激发的自发荧光。在MediSCAPE和PAS图像中都看到肾包膜和尿管型。该组中的另一图像显示了具有自发荧光细胞质颗粒的小管的病灶的囊下集合。尿管型材料在xy平面中也是明显的，并且进一步通过在yx平面中的特征性强自发荧光证明。该组中的另一图像显示具有增强的小管周围自发荧光的小管。该组中的另一图像显示具有焦点自发荧光颗粒的肾小球。
图像集12展示了人肾周脂肪中的弹性纤维和脂肪细胞的MediSCAPE无标记成像。该组中的一个图像是正常人肾周脂肪切片的3D透视图(ImageJ 3DViewer)，显示了高荧光弹性纤维和脂肪细胞。该组中的另一图像是来自所示平面的yz横截面，其显示了脂肪细胞上的纤维分层，其可以被区分为圆形黄色液滴。该组中的另一图像是横向截面，其中脂肪细胞和交叉血管是可见的。
图像集12还展示了用MediSCAPE成像的染色人肾组织。将显示动脉肾硬化特征的新鲜人肾组织用亚甲基蓝或原黄素核染料染色，通过MediSCAPE成像，然后进行组织学处理，其中相同的组织块表面用PAS和/或H&E染色。这组中的三个图像证明了常规必须用PAS和H&E组织学评价的4种主要肾组织学组分如何出现在PAS组织学、用亚甲蓝染色的MediSCAPE体积的xy切片和H&E组织学中。这些图像显示肾小球、动脉、小管和间质。亚甲蓝在MediSCAPE图像中确定了细胞的细胞质、细胞核和细胞外区室，类似于H&E，但更好地突出了动脉弹性层和管状和间质区室，类似于PAS组织切片。
来自同一患者的第二份活检切片在MediSCAPE和相应的H&E组织学图像中纤维化的病灶区域显示结疤的管状间质。该组中的另一图像是在MediSCAPE上采集的较大载物台扫描体积的3D透视图(Imaris)。该图像显示纤维化、动脉和肾小球的3D结构。xz深度部分的原点是可见的。在该组中的另外两个图像更详细地显示了20μm深度上的非硬化肾小球。
通常通过H&E和PAS组织学的组合评价的所有4个肾组织学区室在MediSCAPE图像中都可以清楚地区分，尤其是用亚甲蓝染色。
图像集14展示了应用于新鲜小鼠结肠粘膜的局部染料的比较。用MediSCAPE对新鲜小鼠结肠粘膜样本中的单个xy和yz切片成像。在来自该组的三个图像中，对比度源自a)0.01％的核染料原黄素(exc.488nm，em.525/45nm)，b)1％亚甲基蓝，一种临床使用的核染料(exc.637nm，em.＞685nm)，和c)荧光素钠，FDA批准的局部和IV染料(exc.488nm，em.525/45nm)。相应的横截面和细胞核的位置是可见的。局部施用的染料的深度渗透是染色依赖性的和组织依赖性的，如在yz深度切片中所见。利贝昆氏腺窝和杯状细胞是可见的。这些结果证明MediSCAPE具有捕获各种具有高信噪比的外来对比度的能力，并且与利用内在对比度相比，还突出了确保染料渗透的挑战。
影像1展示了用MediSCAPE在9.3VPS成像的无标记体内小鼠肾。在9.3VPS下收集358×798×165μm3双色体积的xy和yz横截面，同时移动穿过体内小鼠肾。当收集重叠体积时，从重叠体积拼接3D透视图(ImageJ 3D Viewer)和更大视场的横向截面。回放是实时的，其中在后处理中完成体积的拼接。成像参数如下表2所示。
影像2展示了在MediSCAPE上以低和高放大率成像的新鲜小鼠肾脏。在不同放大倍数下对新鲜肾组织的相同区域中的自发荧光成像。可变焦距镜筒透镜允许在放大率范围内进行双色成像，该放大率范围可基于所需的分辨率、视场和体积速度进行调整。在将可变镜筒透镜设定为F＝170mm以放大4.6倍的情况下收集一组数据，而在将可变镜筒透镜设定为F＝70mm以放大11.4倍之后立即在相同区域中收集另一组数据。在～525nm范围内的自发荧光发射显示为黄热，而在～618nm的发射显示为蓝色。成像参数如下表2所示。
影像3展示了在12.9VPS下对体内小鼠心脏成像的无标记MediSCAPE成像。在12.9VPS下收集305×798×138μm3双色体积的xy和yz横截面，同时在完整的跳动小鼠心脏上漫游。可以在各个体积中以及在数据随时间的最大强度投射中周期性地看到心脏脉冲。在收集时，从重叠体积拼接来自更大3D视场的不同z深度处的横向(xy)截面。回放是实时的，其中在后处理中完成体积的拼接。在～525nm范围内的自发荧光发射以黄热显示，而在～618nm的发射以蓝色显示。成像参数如下表2所示。
影像4展示了用MediSCAPE成像的新鲜小鼠心脏、脑、肺和肝中的自发荧光。在完整的、新鲜切除的小鼠心脏、矢状切开的小脑、完整的肺和完整的肝组织中在最初50μm中对内在对比度的深度飞行图进行成像。在～525nm范围内的自发荧光发射以黄热显示，而在～618nm的发射以蓝色显示。成像参数如下表2所示。
影像5展示了用MediSCAPE成像的新鲜小鼠脾脏、膀胱、肌肉和结肠中的自发荧光。在完整的、新切除的脾表面、膀胱粘膜、大腿肌肉和结肠粘膜中在最初100μm中对深度飞行的内在对比度成像。在～525nm的自发荧光发射以黄色热显示，而在～618nm的发射以蓝色显示。成像参数如下表2所示。
影像6展示了用图2系统成像的新鲜小鼠肾、肝、心脏和结肠。在四种类型的新鲜的完整小鼠肾、肝、心脏和结肠粘膜中在前50μm中对内在对比度的深度飞越成像。在～525nm范围内的自发荧光发射以黄热显示，而在～618nm的发射以蓝色显示。成像参数如下表2所示。
影像7展示了具有慢性肾病的新鲜人肾活检的MediSCAPE自发荧光图像。从总共196秒内获得的12个台扫描的双色体积拼接13.3×10.6×0.3mm视场。在～525nm范围内的自发荧光发射以黄热显示，而在～618nm的发射以蓝色显示。成像参数如下表2所示。
影像8展示了用原黄素染色的新鲜正常人肾组织的H&E伪色MediSCAPE图像的深度飞越。原黄素荧光被编码为苏木精(紫色)并且红色自发荧光发射被编码为曙红(粉红色)(488nm激发)。通过5.6秒的载物台扫描获得了7500×918×164um xyz的全部体积。
影像9展示了用MediSCAPE成像的原黄素染色的人肾组织的A3D渲染和飞越。2732×921×273μm的台扫描体积显示了动脉肾硬化的征兆。在中心附近明显存在具有管状萎缩和间质纤维化的皮质瘢痕的病灶区域。肾小球和动脉通过自发荧光和在488nm激发的原黄素信号而清晰可见，并且它们的结构可以通过滚动横向和深度横截面而更容易地评价。
影像10展示了对具有IV FITC-葡聚糖的体内小鼠脑血管系统进行漫游MediSCAPE成像。体积通过玻璃颅窗以9VPS采集，同时围绕颅窗移动。在漫游期间执行实时数据的3D渲染。通过在收集重叠体积时拼接它们来构建更大的3D视场。回放是实时的，其中在后处理中完成体积的拼接。
表2|MediSCAPE数据的成像参数。
表2的注释：(a)除非另有说明，样本是无标记的新鲜离体组织。(b)对于双色采集，y维度被给定为单色通道的最终裁剪的y维度。照相机上的原始y尺寸是>2x最终裁剪的y尺寸，因为彩色图像是沿着照相机上的y轴并排地同时获取的。x维度作为取得体积(#x步×x步长)的未偏斜的X方向而给出。(c)除非另有说明，否则扫描是用70mm焦距的镜筒透镜获得的，其有效放大倍数为4.66倍。(d)如果扫描类型是基于反射镜的漫游扫描，则报告体积速率。对于基于反射镜的固定和台扫描(stage-scan)，总的获取类型以秒给出。(e)激光功率通常用于488nm激光激发。
将本文所述的MediSCAPE实施例与共焦和双光子显微镜检查比较。更具体地说，MediSCAPE具有488nm激发；与488nm和561nm激发共焦；并比较了800nm激发的双光子显微镜检查。为了比较自发荧光对比度，用所有三种技术对新鲜小鼠结肠粘膜和肾样本进行成像。细胞和组织水平特征在所有三种技术中都相当相似，但是点扫描对于弱的内在荧光需要过度地长的获取时间。
MediSCAPE的关键优点是其实时3D速度，其便于体内和大面积成像，以及其灵敏度，其允许检测弱的固有对比度。这里，我们解释为什么MediSCAPE的速度和灵敏度比作为光学切片荧光成像的传统选择技术的点扫描共焦和双光子显微镜检查好几个数量级。我们还展示了新鲜组织结构的MediSCAPE自发荧光图像在性质上类似于通过共焦和双光子显微镜检查在类似激发和发射波长处获得的图像。
MediSCAPE对比于点扫描共焦和双光子的快速3D扫描的可行性
由于组织体积中的整个平面的平行激发和发射检测，MediSCAPE的光片激发的使用导致灵敏度的显著改进。这种平行化允许更长的积分时间和更柔和的激光激发功率，这导致组织中的光漂白和光毒性降低。另一方面，共焦显微内窥镜系统和床边双光子系统使用点扫描，其中组织体积中的每个单独的像素被顺序地激发和捕获。点扫描大大降低了每个像素的可用积分时间，同时还需要高检流计扫描速度。下表3示出了MediSCAPE和点扫描显微镜的检流计线扫描速率之间的实质差异以及对于大致相等的体积成像速率的每像素积分时间。作为示例，针对MediSCAPE列出的成像参数来自图像集1中示出的前两个数据集。
表3：介质扫描显微镜和点扫描显微镜的等效体积比成像参数的比较
表3的注释：(1)基于体内小鼠肾脏基于反射镜的静止扫描的扫描参数；(2)基于体内小鼠肾脏基于反射镜的漫游扫描的扫描参数；(3)对于MediSCAPE的yz帧和点扫描的xy帧计算FPS。
对于小鼠肾中的单次高分辨率扫描，MediSCAPE花费0.79秒来获得双色自发荧光对比度的802×615×250xyz像素体积。为了以相同的速度获得等效的单色体积，点扫描显微镜将需要以195kHz的线速率扫描其检流计，该速率即使使用谐振扫描仪也无法实现。此外，每个像素的积分时间将是6.3ns，其接近许多荧光团的荧光寿命。相反，MediSCAPE的扫描镜将需要仅以1.27Hz移动，而每个像素的积分时间将为0.98ms。这153379倍长的积分时间突出了为什么弱的固有对比度可以用MediSCAPE成像，比通过共焦和双光子成像容易得多，同时保持合理的激光功率水平和采集时间(参见Hillman等人的其它支持模型)。对于以9.3VPS进行的漫游扫描，我们看到对于所需的检流计线扫描速率和每个像素的所得积分时间，MediSCAPE和点扫描系统之间的幅度差的相同数量级。
此外，设计用于体内和床边使用的点扫描显微镜需要探针或组织的反射镜扫描或实体移动以获取z堆栈。这可能在机械上难以实施，并且在存在体内组织运动的情况下易于产生运动伪影。介质扫描的横向扫描和同时从所有深度一次记录消除了在3D成像期间改变显微镜焦深的需要。
MediSCAPE、共焦和双光子的自发荧光对比度的比较
为了将由MediSCAPE捕获的自发荧光特征与其它显微镜技术比较，新切除的小鼠结肠粘膜和肾皮质的切片用共焦、双光子和MediSCAPE显微镜连续成像。在Nikon倒置A1R共焦上进行共焦成像。使用检流计扫描和Mai-Tai HP激光器进行双光子成像。在成像期之间将组织保持在冰上，用盐水保持湿润，并在切除三小时内成像。
捕获来自每个组织的代表性图像，用于获得每个体积的成像参数在表4中示出。在新鲜小鼠结肠粘膜中，每种成像技术在内衬利贝昆氏腺窝的上皮细胞中显示强点状绿色自发荧光，并在隐窝结构之间的固有层中显示漫射红色发射。MediSCAPE和共焦图像都相当相似，而双光子激发也揭示了上皮细胞中以及隐窝周围纤维中的强蓝光发射。在新鲜小鼠肾皮质中，所有三种成像技术都能够通过自发荧光清楚地显现小管，其中近端小管在绿色通道中显示较高发射，而远端小管在红色通道中显示较高发射。双光子成像还揭示了小管中的蓝色自发荧光，与绿色通道高度重叠。注意，此处的小管在肾皮质中更深地成像，并且在形态上与更接近皮质表面的小管不同，如MediSCAPE和共焦图像所示。还注意到，在两个组织中的体积采集过程中，样本漂移是共焦和双光子成像中的主要问题。
尽管这些数据集纯粹是为了比较在MediSCAPE上采集的对比度与在共焦和双光子上采集的对比度而采集的，但表4中所示的成像参数表明共焦和双光子成像需要几乎两个数量级的更多时间来采集与在相同组织中使用MediSCAPE采集的图像具有相似质量的单色体积。
表4：用于SCAPE MediSCAPE、共焦和双光子的成像参数
*体素率计算为总成像时间的每秒获取的颜色体素的数量计算
方法
体内小鼠组织制备和成像
根据哥伦比亚大学动物管理和使用委员会综述和批准的方案进行小鼠体内成像。在成像之前，使用异氟烷重度麻醉野生型小鼠，并将其鼻口置于小鼠面罩中。用置于小鼠顶部的加热垫维持体温，并持续监测呼吸。首先暴露腹部器官，将小鼠置于安装在3轴平台上的60mm直径玻璃底部皿上。器官被定位成抵靠玻璃盖玻片的表面以从下方成像。对于移动成像，在连续成像期间平移小鼠的位置。使用温盐水周期性地冲洗组织以使干燥最小化并维持体温。在器官成像之后，然后打开胸腔，并在安乐死之前快速定位心脏以用于成像。
为了对图像集7和影像10(如上所述)中所示的脑微血管进行成像，使用氨基甲酸乙酯麻醉小鼠，并且如前所述将密封的双侧玻璃颅窗植入躯体感觉皮质上。将金属头板粘合到头骨上，以便能够以直立构型将头部固定在MediSCAPE物镜下方。在尾静脉注射～0.1ml的5％w/v 70000MW荧光素异硫氰酸酯-葡聚糖后进行成像。在漫游成像期间，小鼠的xyz位置以3轴平台手动平移。
新鲜小鼠组织制备和成像
根据哥伦比亚大学动物管理和使用委员会综述和批准的方案，从野生型小鼠中切下新鲜的小鼠组织。将小鼠严重麻醉，然后使用颈椎脱臼处死。将切除的组织保持在冰上直至成像或直至染色前至少30分钟。所有数据在切除3小时内获得。在倒置设置中，用MediSCAPE物镜从下方在30mm直径玻璃底皿中对组织进行成像。组织用盐水保持湿润，并用盖玻片轻轻压下，以在必要时产生更平坦的成像表面。在图2的系统中，组织被放置在培养皿中并从上方(以直立的结构)成像。组织用盐水保持湿润，需要时用盖玻片压住。对于显示染色的新鲜组织的数据集，如上所述，将组织在室温下局部染色1-3分钟，用盐水漂洗并立即成像。
人肾活检收集和成像
根据IRB批准的方案，通过哥伦比亚大学病理学医疗中心的组织库获得未鉴定的新鲜人肾组织。在切除24小时内对组织进行成像，并在4℃下储存在具有盐水浸泡的布的培养皿中，并在成像前保持在冰上。组织从下方在30mm直径的玻璃底的皿中成像，该皿具有盐水以保持湿润。
新鲜组织染色
在指示的情况下，组织用0.01％的原黄素(Sigma，131105)的盐水溶液、1％的亚甲蓝(Ricca，485016)和/或0.01％的荧光素钠的水溶液局部染色。在室温下用棉签将染料轻轻地施用至组织1-3分钟，然后用盐水洗掉3次。立即对染色区域成像。
组织学
在成像后，所有新鲜组织用组织标记物标记以清楚地指示在MediSCAPE上成像的面，并将其放置在组织学盒中，成像的面平放在活检纸上。组织在10％福尔马林中在4℃下固定至少24小时。随后在CUMC赫伯特欧文癌症中心通过分子病理学组织学服务进行组织学包埋、切片、染色和封固。将所有小鼠组织水平切成跨越成像的面的前50-100μm的几个5μm的平面切片，并用H&E染色。将肾活检组织切成2μm平面切片，跨越成像的面的前50-100μm，并对H&E和PAS染色。使用Nikon AZ100载玻片扫描仪数字扫描组织学载玻片。通过人工比较MediSCAPE图像和数字组织学数据中可见的结构特征来匹配感兴趣区域。
结论
尽管已经参考某些实施例公开了本发明，但是在不背离如所附权利要求中限定的本发明的领域和范围的情况下，可以对所描述的实施例进行许多修改、变更和改变。因此，本发明不局限于所描述的实施例，而是具有由所附权利要求的语言及其等同物限定的全部范围。

Claims (20)

1.一种成像设备，包括：
具有近端和远端的第一组光学部件，其中所述第一组光学部件包括设置在所述第一组光学部件的远端处的第一物镜，其中所述第一物镜具有介于10×和70×之间的放大率和介于0.5和1.1之间的数值孔径；
具有近端和远端的第二组光学部件，其中所述第二组光学部件包括设置在所述第二组光学部件的近端处的第二物镜；
扫描元件，所述扫描元件相对于所述第一组光学部件的近端向近侧设置并且相对于所述第二组光学部件的远端向远侧设置，
其中所述扫描元件被布置成在从近到远的方向上将激发光引导通过所述第一组光学部件，使得所述激发光被投射到定位为向远侧超过所述第一组光学部件的远端的样本中，
其中投射到所述样本中的所述激发光以倾斜角度形成激发光的片，其中，所述片的位置根据所述扫描元件的取向而变化，
其中所述第一组光学部件将来自所述样本的检测光沿从远到近的方向引导回所述扫描元件，以及
其中所述扫描元件还被布置成引导所述检测光，使得所述检测光将沿从远到近的方向穿过所述第二组光学部件，使得所述第二组光学部件在向近侧超过所述第二组光学部件的近端的位置处形成中间像平面；
折叠式反射镜，所述折叠式反射镜相对于所述第一组光学部件的近端向近侧设置并且相对于所述第二组光学部件的远端向远侧设置，
光检测器阵列；以及
第三物镜，被布置成将从所述中间像平面到达的光朝向所述光检测器阵列引导。
2.根据权利要求1所述的设备，其中所述折叠式反射镜定位在所述扫描元件与所述第二组光学部件的远端之间。
3.根据权利要求1所述的设备，其中所述第一物镜具有介于50×和70×之间的放大率、介于0.9和1.1之间的数值孔径、以及介于2.5和3.5mm之间的有效焦距，并且
其中所述第二物镜具有介于40×和60×之间的放大率、介于0.65和0.85之间的数值孔径以及介于3和5mm之间的有效焦距。
4.根据权利要求3所述的设备，其中所述第一物镜具有60×的放大率、1.0的数值孔径和3mm的有效焦距。
5.根据权利要求3所述的设备，其中所述第二物镜具有50×的放大率、0.75的数值孔径和4mm的有效焦距。
6.根据权利要求3所述的设备，其中所述第一组光学部件包括至少一个普罗素透镜。
7.根据权利要求3所述的设备，其中所述第一组光学部件包括12.7mm直径的38.1mmEFL消色差透镜和包括两个12.7mm直径的50.8-mm-EFL消色差透镜的普罗素透镜。
8.根据权利要求3所述的设备，其中所述第二组光学部件包括至少一个普罗素透镜。
9.根据权利要求3所述的设备，其中，所述第二组光学部件包括由两个1”直径的101.6-mm-EFL消色差透镜和一个1”直径的76.2mm-EFL消色差透镜制成的普罗素透镜。
10.根据权利要求3所述的设备，其中所述第一组光学部件包括具有1.5×放大率的望远镜，且其中所述第二组光学部件包括具有1.5×放大率的望远镜。
11.根据权利要求3所述的设备，其中所述第三物镜具有介于15×和25×之间的放大率和介于0.65和0.85之间的数值孔径。
12.根据权利要求3所述的设备，其中所述第三物镜具有20×的放大率和0.75的数值孔径。
13.一种成像设备，包括：
具有近端和远端的第一组光学部件，其中所述第一组光学部件包括设置在所述第一组光学部件的远端处的第一物镜；
具有近端和远端的第二组光学部件，其中所述第二组光学部件包括设置在所述第二组光学部件的近端处的第二物镜；
扫描元件，所述扫描元件相对于所述第一组光学部件的近端向近侧设置并且相对于所述第二组光学部件的远端向远侧设置，
其中所述扫描元件被布置成在从近到远的方向上将激发光引导通过所述第一组光学部件，使得所述激发光被投射到定位为向远侧超过所述第一组光学部件的远端的样本中，
其中投射到所述样本中的所述激发光以倾斜角度形成激发光的片，其中，所述片的位置根据所述扫描元件的取向而变化，
其中所述第一组光学部件将来自所述样本的检测光沿从远到近的方向引导回所述扫描元件，以及
其中所述扫描元件还被布置成引导所述检测光，使得所述检测光将沿从远到近的方向穿过所述第二组光学部件，使得所述第二组光学部件在向近侧超过所述第二组光学部件的近端的位置处形成中间像平面；
光检测器阵列；
第三物镜，被布置成将从所述中间像平面到达的光朝向所述光检测器阵列引导；以及
光学透明间隔件，被定位和配置成覆盖所述第一物镜并且压靠被成像的组织。
14.根据权利要求13所述的设备，其中所述光学透明间隔件设置所述第一物镜捕获进入所述组织中的50-350μm深度范围的工作距离。
15.根据权利要求13所述的设备，其中，所述光学透明间隔件被并入到盖中，所述盖在所述光学透明间隔件与所述第一物镜的远端之间提供水密密封。
16.根据权利要求15所述的设备，还包括位于所述光学透明间隔件和所述第一物镜之间的一定量的介质，其中所述介质具有被选择为与所述第一物镜的浸没介质匹配的折射率，并且其中所述一定量的介质将所述光学透明间隔件光学耦合到所述第一物镜，并且其中所述盖提供水密密封。
17.根据权利要求13所述的设备，其中所述光学透明间隔件由固体介质形成，所述固体介质具有与所述第一物镜的所需浸没介质匹配的折射率。
18.根据权利要求13所述的设备，其中所述光学透明间隔件具有外表面，所述外表面定位在接近所述第一物镜的主焦平面的25μm与250μm之间。
19.根据权利要求13所述的设备，其中所述光学透明间隔件允许对样本的快速3D成像，所述样本被逐渐地移动跨越所述间隔件的外表面，从而允许拼接所述样本的连续3D图像。
20.根据权利要求13所述的设备，其中所述第一物镜具有介于10×和70×之间的放大率和介于0.5和1.1之间的数值孔径。
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