CN104198449B - 一种用于活细胞成像的荧光探针方法 - Google Patents

Abstract

本发明是一种用于活性细胞中Zn²⁺成像的荧光探针方法，其特征是以1,5‑二(7‑羟基‑8‑香豆素亚甲基)‑二氨基脲，简称探针s3，为微量Zn²⁺的荧光增强型探针，探针s3及Zn²⁺能分别渗透到活性细胞内，与细胞具有良好的相容性，通过探针s3对细胞内Zn²⁺染色后，用荧光倒置显微镜检测显现清晰的蓝色荧光细胞图像，探针s3是活性细胞的荧光照影试剂，探针s3的化学结构式为：

Description

一种用于活细胞成像的荧光探针方法

技术领域

本发明属分析化学领域，具体地说是一种用于活体细胞成像的荧光探针方法。

背景技术：荧光传感器与荧光显微技术的结合，使荧光传感器在生物活性物质检测和细胞成像方面得到广泛应用。对生物活性物质而言，检出灵敏度极限是单个分子。活细胞成像技术是生命科学技术领域种重要的研究手段，与固定细胞研究结合起来，可以解释活细胞中的多种生命现象。近年来，随着生命科学的不断发展，人们对细胞内的活性物种、细胞信号传导及细胞凋亡等方面的研究越来越深入。美国加州大学戴维斯分校(UC Davis)生物光子学科学技术中心(CBST)的科研人员首次通过荧光标记成功地对活肿瘤细胞内部的纳米尺寸区室的运动进行了成像。这一成果为未来理解癌症和一大批其他疾病的分子原因和生物力学的突破进展带来了希望，它还能促进神经科学和干细胞研究等领域。荧光成像分析是目前广泛应用于活细胞分析的一种高灵敏的可视化分析技术。目前用于活细胞成像分析的荧光探针多为有机荧光染料分子，为活细胞分析提供了有效的探测手段。在实际应用中，这些有机荧光染料分子存在着荧光寿命较短、容易猝灭及稳定性差的缺点。所以，实现长时间的实时动态连续测定，提高可视化分析的选择性和精度是目前迫切需要解决的问题。而金属配合物荧光探针具有荧光寿命长、发射峰窄、稳定性好等发光性质，引起了人们的重视与关注。有机染料具有良好的光稳定性、合适的水溶性及很好的细胞膜通透性，而且在细胞内具有较强的荧光，合成相对简单，收率较高。作为细胞内的成像探针，必须满足（1）良好的水溶性；（2）在生理条件下具有良好的热稳定性和动力学惰性；（3）良好的膜穿透性，并且对细胞是无毒的；（4）有较长的激发波长和较高的量子产率。

细胞内的小分子物种包括各种活性氧物种（单线态氧、过氧化氢、 超氧负离子自由基等）、Ca²⁺、Zn²⁺、Mg²⁺、Cu²⁺等是人们研究关注的焦点，因为它们调控着细胞的诸多功能与性质，在细胞内起着非常重要的作用，因此实现活体细胞内各种生理活性小分子物种的实时在线动态检测对生命科学研究与发展具有重要的价值。

锌是继铁之后人体内含量最丰富的过渡金属离子，是许多生物过程如大脑功能和病理学、基因转录、免疫功能和哺乳动物繁殖中的重要辅助因子，它的新陈代谢紊乱会引起诸多疾病。锌还参与病理过程，如阿尔茨海默氏症、癫痫、缺血性中风和婴儿腹泻等。大多数生物组织中锌离子或是被紧密地绑定于蛋白、或游离、或螯合等多种形态存在，细胞内锌离子的检测是人们研究的热点。荧光传感器的主要目标是对出现在人体各种组织中，包括大脑、肠道、胰腺和视网膜的锌离子的检测。到目前为止，对锌离子的荧光传感器已经成功应用在活体细胞、海马切片的锌离子荧光成像。目前利用探针检测锌离子的相关报道已有不少，但真正能够应用到活细胞内成像的却不多。文献报道了一种以双(2-吡啶甲基)胺为Zn²⁺螯合基团、二乙基三胺五乙酸为配体的稀土铕探针，并将其用于HeLa细胞内Zn²⁺的成像分析。

发明内容：本发明的目的在于研究一种能高灵敏、高选择的对活体细胞成像的荧光探针新方法。通过发明人研制合成的新的荧光探针，是一种对Zn²⁺高灵敏、高选择性检测识别的荧光探针，并能实现对活体细胞中微量Zn²⁺的荧光染色和成像。

本发明一种用于活细胞成像的荧光探针方法，是以1,5-二(7-羟基-8-香豆素亚甲基)-二氨基脲，简称探针s3，为细胞内微量Zn²⁺的荧光增强型探针，探针s3及Zn²⁺能分别渗透到活细胞内，与细胞具有良好的相容性，通过探针s3对细胞内Zn²⁺染色后，用荧光倒置显微镜检测出清晰的蓝色荧光细胞图像，探针s3是一种活细胞中Zn²⁺的荧光成像试剂。

本发明所述的一种用于活细胞成像的荧光探针方法，是用探针s3对细胞内Zn²⁺进行染色，用荧光倒置显微镜观测活体细胞，染色成像的具体方法为：活性PC3细胞经复苏接种于含10%胎牛血清以及含1%双抗的培养基（RPMI 1640）中，在温度为37℃，5% CO₂及饱和湿度为100%的培养箱中培养，每隔2-3天传代1次，选择生长状态良好的细胞接种于12孔板中培养，密度为2×10⁴个/ml，次日用新鲜培养基清洗细胞两次，将细胞浸入含10 μmol·L^-1探针s3（900μL培养基+100μmol·L^-1探针s3的DMF/H₂O混合溶液100μL）中，在37℃，5%CO₂、饱和湿度100%的培养箱中孵育30 min，吸出含探针s3的培养液，用新鲜培养基清洗细胞三次，荧光倒置显微镜下观察并进行亮场和暗场拍照；再浸入含50 μmol·L^-1 Zn²⁺溶液（900μL培养基+500μmol·L^-1 Zn²⁺溶液100μL），在37℃、5%CO₂、饱和湿度100%的培养箱中孵育30min，进行细胞内探针对Zn²⁺染色，吸出含Zn²⁺溶液的培养液，染色后的细胞再用新鲜培养基清洗三次，在荧光倒置显微镜下观察探针对细胞内Zn²⁺染色后的荧光成像，对细胞影像拍照获得清晰的细胞轮廓影像。

上述的一种用于活细胞成像的荧光探针方法，是细胞成像中，探针s3和Zn²⁺都能渗透到活体PC3细胞内，细胞呈圆滑饱满状，探针与细胞具有良好的相容性，未见细胞凋亡，对细胞无毒性；探针与Zn²⁺离子在细胞内染色后，荧光倒置显微镜检测显示了清晰的蓝色荧光细胞分布，染色具有特定区域的选择性聚集能力。

上述的一种用于活细胞成像的荧光探针技术，是所用的试剂为分析纯或生化试剂，所用水为二次蒸馏水或生理盐水；所用活体PC3细胞为人体前列腺癌细胞；所用的拍照设备为荧光倒置显微镜。

上述的一种用于活细胞成像的荧光探针方法，是所述探针s3化学结构式为：

s3

分子式：C₂₁H₁₄N₄O₇

分子量：434.09

熔 点：大于300℃

溶解性：微溶于氯仿、二甲亚砜、N,N-二甲基甲酰胺等，不溶于乙醇。

光谱性质：在N,N-二甲基甲酰胺（DMF）溶液与水的混合溶剂（v/v，2/3）中的荧光激发波长是310nm，发射波长是454nm，紫外吸收波长是310nm。

上述的一种用于活细胞成像的荧光探针方法，是作为细胞成像的荧光探针s3，化学名称为1,5-二(7-羟基-8-香豆素亚甲基)-二氨基脲，是本发明人合成。

本发明合成的荧光探针s3作为细胞内的成像探针，满足了（1）良好的水溶性；（2）在生理条件下具有良好的热稳定性；（3）良好的膜穿透性，并且对细胞是无毒的；（4）与Zn²⁺有选择性、高灵敏的荧光增强作用，有较长的激发波长和较高的发光产率。利用探针s3在活体细胞内与Zn²⁺的染色作用，用荧光倒置显微镜能清晰获得发射蓝色荧光的细胞图像。发明了一种新颖的活体细胞的荧光成像技术。

本发明合成的荧光探针s3的结构经核磁共振波谱、质谱和红外光谱进行了表征。结构表征数据列于表1。

附图说明：

图1 探针s3浓度为1.00×10^-5 mol·L^-1探针s3的DMF/(DMF+H₂O)（v/v，40%）溶液，分别不加金属离子或加入2.00×10^-4 mol·L^-1金属离子Zn²⁺，Li⁺，Na⁺，K⁺，Mg²⁺，Ca²⁺，Ba²⁺,Sr²⁺，Hg²⁺，Co²⁺，Ni²⁺，Cu²⁺，Cd²⁺，Pb²⁺，Ag⁺，Al³⁺， Fe³⁺，Cr³⁺后的荧光光谱。Zn²⁺的加入使探针s3在454nm处的荧光强度增强。而其他上述实验金属离子的加入几乎不会改变探针s3的荧光强度。测试的激发波长为360nm，发射波长为454nm。

图2 共存金属离子对探针s3的荧光强度检测Zn²⁺的影响。

在浓度为1.00×10^-5 mol·L^-1的探针s3的DMF /(DMF+H₂O)（v/v，40%）溶液中，加入2.00×10^-4 mol·L^-1的Zn²⁺后探针s3在波长为454nm处的荧光强度值。再分别向探针s3- Zn^{2 +}混合溶液中加入其他金属离子：Li⁺，Na⁺，K⁺，Mg²⁺，Ca²⁺，Ba²⁺，Sr²⁺，Ag⁺，Hg²⁺，Co²⁺，Ni²⁺，Cu²⁺，Cd²⁺，Pb²⁺，Al³⁺，Cr³⁺，Fe³⁺后的荧光强度值的变化。红色条表示在探针s3-Zn²⁺混合溶液再分别加入上述其他共存金属离子后在454nm处的荧光强度值的变化。表明探针s3检测Zn²⁺的荧光强度除受到Hg²⁺，Cu²⁺，Fe³⁺离子共存的影响外，其它金属离子均不影响试剂s3对Zn²⁺的荧光测定。测试的激发波长为360nm，荧光发射波长为454nm。

图3 不同浓度的Zn²⁺对探针s3的荧光滴定光谱图

在浓度为1.00×10^-5 mol·L^-1探针s3的DMF /(DMF+H₂O)（v/v，40%）溶液中分别加入不同浓度Zn²⁺到探针s3溶液中，随着Zn²⁺的加入，分别测得的荧光光谱曲线。在454nm处的发射峰逐渐降低。测试的激发波长为360nm。

图4 探针s3与Zn²⁺对PC3细胞的荧光倒置显微镜拍摄照片。

4-1为PC3细胞内只有探针s3（浓度为10 μmol·L^-1）或只有Zn²⁺溶液（浓度为10 μmol·L^-1）时的亮场显微照片，细胞呈饱满状态，证明该探针s3在实验浓度内对PC3细胞没有毒性；4-2为PC3细胞内只有探针s3（浓度为10 μmol·L^-1）或只有Zn²⁺溶液（浓度为10 μmol·L^-1）时的暗场荧光显微照片，显示无荧光现象；4-3为PC3细胞内同时有探针s3（浓度为10 μmol·L^-1）和Zn²⁺（浓度为10 μmol·L^-1）存在时的暗场荧光显微照片，荧光倒置显微镜观测到清晰的蓝色荧光的细胞分布，证明s3与Zn²⁺离子在细胞内实现了染色，呈现细胞染色荧光成像。

图5 探针s3与Zn²⁺对PC3细胞的荧光倒置显微镜拍摄照片。

5-1为PC3细胞内只有探针s3（浓度为10 μmol·L^-1）或只有Zn²⁺溶液（浓度为50 μmol·L^-1）时的亮场显微照片，细胞呈饱满状态，证明该探针s3在实验浓度内对PC3细胞没有毒性；5-2为PC3细胞内只有探针s3（浓度为10 μmol·L^-1）或只有Zn²⁺溶液（浓度为50 μmol·L^-1）时的暗场荧光显微照片，显示无荧光现象；5-3为PC3细胞内同时有探针s3（浓度为10 μmol·L^-1）和Zn²⁺（浓度为50 μmol·L^-1）存在时的暗场荧光显微照片，荧光倒置显微镜观测到清晰的蓝色荧光细胞分布，证明s3与Zn²⁺离子在细胞内实现了染色，呈现细胞染色荧光成像。

具体实施方式

实施例一：本发明中各溶液、试剂的配制方法

（1）探针s3溶液的配制方法：称取44mg的s3，用DMF/H₂O（v/v，2/3~1/19）溶解，配制成100mL溶液，浓度为1.00×10^-3mol·L^-1；

（2）Zn²⁺标准溶液：称取59.5mg分析纯Zn(NO₃)₂，用生理盐水溶解，配制成100mL溶液，浓度为2.00×10^-3 mol·L^-1；根据需要用生理盐水逐级稀释到适宜的浓度；

（3）其它共存离子溶液的配制：取分析纯的各种金属的硝酸盐或盐酸盐，用二次蒸馏水溶解，并配制成浓度为2.00×10^-3 mol·L^-1的二次蒸馏水溶液。

（4）75%的乙醇溶液：无水乙醇75mL加蒸馏水至100mL，混匀，室温保存备用。

（5）磷酸盐缓冲溶液（D-hanks平衡盐溶液）：0.4gKCl、0.06g KH₂PO₄、8.0gNaCl、1.0g C₆H₁₂O₆、0.35gNaHCO₃、0.152g Na₂HPO₄·12H₂O、10万IU双抗，调整pH为7.2~7.4，去离子水定容至1000mL，针式滤器（0.22um进口微孔滤膜）过滤除菌，分装备用。

（6）1万单位（IU）/mL双抗溶液：将青霉素钠（80万单位）溶于40mL D-hanks溶液中，配成终浓度2万单位/mL；将硫酸链霉素（160万单位）溶于80mL D-hanks溶液中，配成终浓度2万单位/mL。分别取等体积的青霉素钠溶液和硫酸链霉素溶液混合，得到青霉素钠和硫酸链霉素的终浓度均为1万单位/mL的溶液；针式滤器（0.22um进口微孔滤膜）过滤除菌，分装1mL/支，-20℃保存备用。

（7）0.25%胰蛋白酶：称取0.25g胰蛋白酶，溶解于100mL的D-hanks液中，针式滤器（0.22um进口微孔滤膜）过滤除菌，分装1mL/支，-20℃保存备用。

（8）0.02%乙二胺四乙酸（EDTA）：将0.02gEDTA，溶解于100mL的D-hanks液中，针式滤器（0.22um进口微孔滤膜）过滤除菌，分装1mL/支，-20℃保存备用。

（9）培养液：用无菌移液管量取10mL已灭活的胎牛血清、90mL培养基（改良型RPMI-1640）以及1mL双抗液混合于100mL的无菌培养瓶中，2~8℃保存备用。

本发明所用荧光分光光度计型号为 Cary Eclipse荧光分光光度计，美国VARIAN公司生产；ThermoFisher 8000储水型CO₂细胞培养箱；IX-71型荧光倒置相差显微镜，日本Olympus公司；AR1530/C电子天平；25cm²细胞培养瓶，美国Corning公司立式压力蒸汽灭菌器（LS-B75）；DHG-9230A电热恒温鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司。

实施例二：探针s3对Zn²⁺离子的选择性荧光检测

在10.0 mL 容量瓶中加入探针s3的DMF储备液（1.00×10^-4 mol·L^-1，1mL），金属离子Zn²⁺（2.00×10^-3 mol·L^-1，1 mL），用DMF /(DMF+H₂O)（v/v，40%）溶液稀释至刻度，摇匀，移入1cm的石英比色皿进行荧光光谱测定。

设置荧光激发波长为360nm，在1cm的比色皿中加入约3ml的探针s3(1.00×10^-5mol·L^-1)的DMF /(DMF+H₂O)（v/v，40%）溶液进行荧光光谱测试，探针s3在454nm波长处有微弱荧光发射。加入Zn²⁺ (2.00×10^-4 mol·L^-1)后，探针s3溶液发射强烈蓝色荧光。相同条件下，在探针s3溶液中分别加入Li⁺，Na⁺，K⁺，Mg²⁺，Ca²⁺，Ba²⁺，Sr²⁺，Hg²⁺，Co²⁺，Ni²⁺，Cu²⁺，Ag⁺，Pb^{2 +}，Cd²⁺，Al³⁺，Cr³⁺，Fe³⁺金属离子后，几乎不会改变探针s3的荧光光谱及强度。探针s3仅对Zn²⁺有选择性荧光检测响应性能，选择波长为454nm波长处的荧光强度值进行测定（附图1）。

与上述荧光法相同测试条件下，探针s3检测Zn²⁺在454nm波长处的荧光值在上述金属离子分别作为共存离子存在于探针s3-Zn²⁺混合溶液中，当共存金属离子浓度与测试的Zn²⁺离子相当时，除Hg²⁺，Cu²⁺，Fe³⁺离子共存有的影响外，探针s3检测Zn²⁺的荧光强度不受其它金属离子共存影响（附图2）。

实施例三：活体PC3细胞的荧光显微成像

（1）复苏细胞

从-80℃冰箱内取出PC3细胞，置于37℃的水中快速晃动细胞冻存管，于1-2分钟内完全解冻，在无菌操作台内，将其吸入离心管内，加约11ml培养液（含10%胎牛血清，1%双抗液）混均，并将此细胞悬液于1000r/min离心机上离心5min，去除上层清液，将底部沉淀的细胞加培养液轻吹打散混均转移到培养瓶内，使培养瓶中培养液体积在5-7mL内，并置入37℃，含5% CO₂的培养箱内进行培养。

（2）观察→传代→接板

每日更换一次培养液，并在显微镜下观察细胞生长情况，直至PC3细胞贴壁长满于整个培养瓶壁上，即可传代，在无菌操作台内倒掉旧培养液，加入1mL的EDTA液侵入细胞30s后倒掉，再加入1mL的胰蛋白酶液进行消化，在显微镜下观察直至细胞缩小变圆后，拍打培养瓶使细胞脱落并立即加入适量培养液阻止消化，将它一分为二培养于2个培养瓶中，待传代后的细胞贴壁铺满于整个培养瓶壁上时，与传代操作相同，加入EDTA和胰蛋白酶后使细胞消化脱落并立即加入3mL的培养液阻止消化，准备接种于12孔板内。在每个孔板内加入200mL的已阻止消化的细胞液，再加适量新培养液混均后将孔板置入37 ℃，含5% CO₂的培养箱内进行培养。

（3）细胞染色

次日观察孔板内的细胞生长状况，待细胞贴壁生成，弃去旧培养液，用新培养液洗涤2次，备用。

A组：往细胞培养孔板的3个孔内分别加入1×10^-5 mol·L^-1 Zn²⁺溶液（1×10^-5mol·L^-1 Zn²⁺配制：900mL的培养液+100mL用生理盐水配制的10^-4 mol·L^-1 Zn²⁺储备液），5×10^-5 mol·L^-1 Zn²⁺溶液（900uL的培养液+100uL用生理盐水配制的5×10^-4 mol·L^-1 Zn²⁺储备液），10×10^-5 mol·L^-1 Zn²⁺溶液（900mL的培养液+100mL用生理盐水配制的10^-3 mol·L^-1 Zn²⁺储备液），在37 ℃，含5% CO₂的培养箱内孵育30分钟后置于荧光倒置显微镜下进行明场和暗场拍照，细胞显示无荧光。（附图4-1、4-2、5-1、5-2）

B组：往细胞培养板的3个孔内加入1×10^-5 mol·L^-1的探针s3液(1×10^-5 mol·L^-1的探针s3：900 mL的培养液+100mL DMF/(DMF+H₂O)（v/v，20%）混合溶剂配制的10^-4 mol·L^-1 的储备液）；再往细胞培养板的另3个孔内加入2×10^-5 mol·L^-1的探针s3，在37 ℃，含5%CO₂的培养箱内孵育30分钟，用新鲜的改良型RPMI-1640培养基洗两次，置于荧光倒置显微镜下进行明场和暗场成像拍照，细胞并无荧光显示。（附图4-1、4-2、5-1、5-2）

C组：经过步骤B处理过的PC3细胞，一一对应分别浸入浓度为1×10^-5 mol·L^-1、5×10^-5 mol·L^-1、10×10^-5 mol·L^-1 的Zn²⁺溶液中，在37 ℃，含5% CO₂的培养箱内孵育30分钟后，吸出培养液，所得细胞用新鲜的改良型RPMI-1640培养基洗两次，置于荧光倒置显微镜下进行暗场荧光成像拍照，细胞呈现蓝色荧光图像。说明在PC3细胞内探针s3对Zn²⁺染色成功。（附图4-3、5-3）

实施例四：探针s3的合成制备

（1） 7-乙酸酐香豆素的合成

N₂保护下，在250mL的圆底烧瓶中，加入7-羟基香豆素（9.3g, 57.3 mmol），二氯甲烷 120 mL，搅拌，再加入乙酸酐（11.7g，114.6mmol），吡啶7-8滴，室温下反应12h，反应完成后先减压蒸馏除去溶剂，用水溶解后用乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤，硫酸钠干燥，过滤，减压蒸馏除去溶剂，粗产品柱层析分离（洗脱剂：氯仿）得白色产品7-乙酸酐香豆素11.16g，产率95.4%。

（2） 中间体原料7-羟基-8-醛基香豆素的合成

N₂保护下，冰浴下，在250mL的圆底烧瓶中，加入7-乙酸酐香豆素（15g，73.51mmol），三氟乙酸 100 mL，搅拌，待温度降至0℃时，再加入六次甲基四胺（15g，106.26mmol），冰浴下反应1h，将反应温度逐渐升至室温，再回流搅拌反应8h，减压蒸馏除去溶剂，在剩余溶液中加入水150mL，将混合物升至60℃搅拌30min，过滤，滤液用氯仿萃取，饱和食盐水洗涤，硫酸钠干燥，过滤，减压蒸馏除去溶剂，沉淀部分合并，柱层析分离（洗脱剂：氯仿/甲醇，v/v，100/1）得乳白色产品7-羟基-8-醛基香豆素2.61g，产率18.6%。

（3）探针s3即1,5-二(7-羟基-8-香豆素亚甲基)-二氨基脲的合成

N₂保护下，在250ml三口烧瓶中，加入7-羟基-8-醛基香豆素（600mg，3.16mmol）和70mL无水乙醇，搅拌，升温待其溶解后，降至室温。将碳酰肼（142mg，1.58mmol）溶于20mL无水乙醇后逐滴加入，加热回流反应5h。反应完成后过滤，用氯仿甲醇重结晶，得到乳白色目标产物470mg，产率为68.7%。m.p. ＞300 ℃; ¹H NMR (CDCl₃,400MHz), δ(ppm): 4.349(s,1H), 6.282(d, 1H, J=9.6Hz), 6.881(d, 1H, J=8.8Hz), 7.559(d, 1H, J=8.8Hz),7.969(d, 1H, J=9.2Hz), 8.822(s, 1H), 11.391(s, 1H); ESI-MS: m/z 457.0 [M+Na]⁺。

Claims (5)

1.一种用于活细胞成像的荧光探针方法，其特征是以1,5-二(7-羟基-8-香豆素亚甲基)-二氨基脲，简称探针s3，为细胞内微量Zn²⁺的荧光增强型探针，探针s3及Zn²⁺能分别渗透到活细胞内，与细胞具有良好的相容性，通过探针s3对细胞内Zn²⁺染色后，用荧光倒置显微镜检测出清晰的蓝色荧光细胞图像，探针s3是一种活细胞中Zn²⁺的荧光成像试剂。

2.根据权利要求1所述的一种用于活细胞成像的荧光探针方法，其特征是用探针s3对细胞内Zn²⁺进行染色，用荧光倒置显微镜观测活体细胞，染色成像的具体方法为：活性PC3细胞经复苏接种于含10%胎牛血清以及含1%双抗的培养基中，在温度为37℃，5% CO₂及饱和湿度为100%的培养箱中培养，每隔2-3天传代1次，选择生长状态良好的细胞接种于12孔板中培养，密度为2×10⁴个/ml，次日用新鲜培养基清洗细胞两次，将细胞浸入含10 μmol·L^-1探针s3中，在37℃，5%CO₂、饱和湿度100%的培养箱中孵育30 min，吸出含探针s3的培养液，用新鲜培养基清洗细胞三次，荧光倒置显微镜下观察并进行亮场和暗场拍照；再浸入含50 μmol·L^-1 Zn²⁺溶液，在37℃、5%CO₂、饱和湿度100%的培养箱中孵育30 min，进行细胞内探针对Zn²⁺染色，吸出含Zn²⁺溶液的培养液，染色后的细胞再用新鲜培养基清洗三次，在荧光倒置显微镜下观察探针对细胞内Zn²⁺染色后的荧光成像，对细胞影像拍照获得清晰的细胞轮廓影像。

3.根据权利要求1所述的一种用于活细胞成像的荧光探针方法，其特征是细胞成像中，探针s3和Zn²⁺都能渗透到活体PC3细胞内，细胞呈圆滑饱满状，探针与细胞具有良好的相容性，未见细胞凋亡，对细胞无毒性；探针与Zn²⁺离子在细胞内染色后，荧光倒置显微镜检测显示了清晰的蓝色荧光细胞分布，染色具有特定区域的选择性聚集能力。

4.根据权利要求2所述的一种用于活细胞成像的荧光探针方法，其特征是所用的试剂为分析纯或生化试剂，所用水为二次蒸馏水或生理盐水；所用活体PC3细胞为人体前列腺癌细胞；所用的拍照设备为荧光倒置显微镜。

5.根据权利要求1所述的一种用于活细胞成像的荧光探针方法，其特征是所述探针s3化学结构式为：

s3

分子式：C₂₁H₁₄N₄O₇

分子量：434.09

熔 点：大于300 ℃，溶解性：微溶于氯仿、二甲亚砜、N,N-二甲基甲酰胺，不溶于乙醇,光谱性质：在N,N-二甲基甲酰胺溶液与水的混合溶剂2/3，v/v中的荧光激发波长是310nm，发射波长是454nm，紫外吸收波长是310nm。