CN107849441A - 用于癌症的可视化和治疗的aie发光体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于癌症的可视化和治疗的AIE发光体、其应用及其制备方法，尤其是用于癌细胞可视化和鉴别的AIE发光探针，用于成像和自噬可视化的溶酶体靶向AIEgen，用于监测药物分布并对特定癌细胞具有抗肿瘤活性的具有强荧光的AIE活性诊疗试剂，包含用于癌细胞成像和染色的AIE发光体的探针，具有团簇发光特征的AIE发光体。

Description

用于癌症的可视化和治疗的AIE发光体
相关申请
本专利申请要求2015年6月24日提交的临时美国申请专利No.62/231,069、2015年7月20日提交的临时美国申请专利No.62/231,932、2015年9月22日提交的临时美国申请专利No.62/284,162以及2015年11月30日提交的临时美国申请专利No.62/386,380的优先权，这些由发明人提交并且其全部内容以引用的方式并入本文。
技术领域
本发明的主题涉及用于癌症的可视化和治疗的聚集诱导发光(AIE)发光体。尤其，本发明涉及用于癌细胞的可视化和区分的AIE荧光探针，用于成像和自噬可视化的溶酶体靶向AIEgen，用于监测药物分布且对特定癌细胞有抗肿瘤活性的高荧光亮度AIE活性的诊断治疗试剂，包含用于癌细胞成像和染色的AIE发光体的探针，具有簇发光特征及其应用的AIE发光体及其制备方法。
背景技术
每年全世界大约有1400万的癌症新病例，目前癌症仍然是一种难以治疗的疾病，并且是导致发病率和死亡率的主要原因。随着对疾病的了解，发现和开发安全有效的药物更加有前景。然而，不同于用于其他病症的药物开发过程，抗癌药物的开发仍然是一项漫长的、高风险的、耗资巨大的工程。例如，小分子药物通常是通过与一种或多种蛋白质靶标结合来发挥其药效。但是由于缺少观测药物-靶标在生物体系中参与过程的直接方法，这种关键的相互作用往往很难被理解，并且在活细胞或整个生物体中通常不能进行可视化.
例如，它莫西芬(TMX)(US 5,192,525A)，一种三苯乙烯衍生物，药理学分类为用于治疗乳腺癌的选择性ER调节剂(SERM)。TMX是治疗患有ER+乳腺癌的患者的最常用的化疗药物，占所有病例的近70％。然而，很少有数据能够说明TMX是如何在细胞层面上分布和发挥药效的。人们推测TMX充当的是“雌激素竞争者”，它与肿瘤的雌激素受体结合，形成核复合体来阻止基因被雌性激素激活，从而抑制雌性激素的作用。然而，一个主要的临床挑战是，ER+乳腺癌最初对TMX是敏感的，但大约50％的ER+乳腺癌最终将发展成TMX抗性。尽管人们已经提出了几个看似合理的解释，但对TMX治疗的抵抗机制仍有待验证。最近，TMX被证明能够诱导乳腺癌细胞自噬，但自噬在治疗反应中的作用尚不清楚。因此，开发可精确可视化并能在治疗期间进行信息化跟踪的抗乳腺癌药物将对制定有效的治疗方案和阐明其作用机制起着至关重要的作用。
区分癌细胞和正常细胞是本世纪面临的最大挑战之一。诸如计算机断层扫描(CT)、X射线和超声波等传统技术都是低分辨率的。由于癌细胞转移的威胁，其可能发生在癌症晚期，手术切除癌细胞通常是通过切除大面积的肿瘤和广泛的正常组织和皮肤来完成。因此，迫切需要一种可以追踪嵌入正常细胞中的癌细胞的新材料或产品.
自噬负责维持细胞质代谢平衡，由于自噬与癌症、衰老、寿命和神经退行性疾病(如溶酶体储积症、庞贝氏症等)密切相关，因而已经成为一个热门的研究课题。适当的自噬潮对于控制个体的健康是必需的。例如，在神经退变性疾病中，已经证实上调自噬会增强对一些易聚集蛋白，如突变体tau、α-突触核蛋白和亨廷顿蛋白的清除，并减缓症状，而下调自噬或自噬诱导受损可能导致蛋白质聚集体的积累和症状的加重。在另一种神经变性疾病中，阿尔茨海默病会在患者和小鼠模型的大脑中都观察到活性自噬，但是自噬溶酶体降解被破坏，导致大量的含有淀粉样蛋白和β-淀粉样蛋白前体的自噬室积累。
典型的自噬过程如图22所示，图22给出了自噬过程和雷帕霉素治疗过程的示意图。在自噬的早期阶段，被称为吞噬泡的膜囊进行扩张并包裹部分细胞质，直到闭合。然后最终形成双层囊泡，其称为自噬体，并将受损的片段输送到溶酶体。自噬体与溶酶体的融合将形成自噬溶酶体。然后被包裹的内容物被溶酶体水解酶消化降解。溶酶体在消化完成后重组，并能与下一个自噬体融合。因此，溶酶体是自噬过程中起决定性作用的亚细胞器。由于溶酶体与自噬过程的关联，可视化和跟踪溶酶体活动将丰富对自噬过程的认识。多种溶酶体靶向探针被发展用于探索与溶酶体有关的细胞活动。例如，证实用雷帕霉素进行治疗时，其能通过自噬诱导增加溶酶体的数量.
合适的溶酶体靶向探针不仅有助于自噬过程的研究，而且能拓宽相应药物的机理探究。除了利用小的有机分子外，溶酶体标记还可以通过利用多种与溶酶体相关的膜糖蛋白和金属络合物进行。一系列具有不同发射颜色的溶酶体靶向的商业荧光探针也可用于溶酶体标记。然而，这些探针可能存在非特异性背景信号，特异性不足，孵育时间长以及光稳定性低的问题。
因此，多种溶酶体靶向探针已经被开发用于探索与溶酶体有关的细胞活动，其中，Lyso Red DND-99(LTR)就是一个典型的代表。由于在溶酶体中LTR弱碱性基团的质子化，去除了光诱导电子转移(PET)效应，因而LTR发射荧光。遗憾的是，PET诱导LTR的荧光猝灭过程在溶酶体外是无效的，因此很难对溶酶体进行准确定位。另一方面，为了避免聚集引发的淬灭(ACQ)效应，LTR的使用浓度通常较低。结果，LTR的光稳定性就比较低。而且，LTR具有比较小的斯托克斯位移，其吸收和荧光发射最大波长分别在577nm和590nm。因此，只能通过选择适当的激发和发射范围来获得高分辨率图像。溶酶体标记也可以通过金属配合物来进行。但是，它们可能存在背景噪声高，特异性不足，孵育时间长以及光稳定性低的问题。
在现有技术下，人们已经报道了具有不同功能的溶酶体靶向探针，比如Cong Li(CN 103122154 A)、Zhen Shen(CN 103242355 A)、Baoxiang Zhao(CN 103320120 A)、Praveen Pande(US 8715944 B2)以及Yasuteru Urano(US 20140248654 A1)报道的溶酶体探针。但是总的来说，这些探针面临几个问题，比如斯托克斯位移比较小，光稳定性低，聚集引发荧光淬灭或者合成路径复杂。
相比于其他方法，荧光方法具有灵敏度高、选择性高、操作简单、反应灵敏等优点。一些商业荧光染料可用于癌细胞染色，但不具有区分癌细胞与正常细胞的特性。因此，在微观层面上特异地识别癌细胞是非常困难的，而荧光探针技术在解决这个问题上发挥重要作用。然而，一些荧光示踪剂在用于癌细胞染色时没有选择性，或着甚至存在荧光猝灭问题.
发明内容
在一个实施方案中，本发明涉及用于癌细胞成像和染色的探针，该探针包含具有选自由以下化学结构构成的组中的化学结构的AIE发光体：
其中抗衡阴离子X-选自具有一个或多个电荷的阴离子；并且
其中每个R独立选自由烷基、不饱和烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基构成的组。本发明的一个实施方案涉及用于溶酶体成像的AIEgen，其包含：选自由以下结构构成的组中的骨架结构的吗啉功能化AIE衍生物：
其中R、R’、R”和R”’中至少有一个是并且
其中R、R’、R”和R”’独立地选自由以下基团构成的组：
本发明的一个实施方案涉及溶酶体成像和自噬过程可视化的方法，包括：将本发明的AIEgen引入样品；进行溶酶体成像，通过观察AIEgen的荧光来可视化自噬过程，AIEgen的荧光发射是通过AIE分子的质子化和渗透性的改变进入溶酶体并在其中积累实现的。
在一个实施例中，本发明涉及用于溶酶体成像的AIEgen，其包含：具有以下化学结构的吗啉功能化AIE衍生物：
在一个实施方案中，本发明涉及用于抗肿瘤活性的治疗和成像的生物荧光探针，其包括：包含氨基官能团并具有选自以下化学结构所构成的组中的化学结构的AIE荧光团：
其中R1、R2和R3独立选自H、烷基、不饱和烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基。
本发明的一个实施方案涉及抗肿瘤活性的治疗和成像方法，包括：将本发明的生物探针引入含细胞的样品；并通过荧光显微镜或激光共聚焦扫描显微镜检测细胞成像，其中荧光是由细胞摄取并在线粒体中积累的探针发射的。
在一个实施方案中，本发明涉及用于癌细胞成像和染色的探针，其包括：具有选自以下结构所构成的组中的化学骨架结构的AIE发光体：
其中AIE发光体是簇发光；和
其中TTE用作癌细胞成像的染料.
在一个实施方案中，本发明涉及具有选自以下化学结构所构成的组中的化学结构的发光体：
在一个实施方案中，本发明涉及用于癌细胞成像和染色的探针，其包括具有以下化学结构的AIE发光体：
其中AIE发光体被癌细胞摄取，图像显示癌细胞内的细胞器被染色。
附图说明
图1示出了TPE-IQ-2O在CDCl3中的1H-NMR谱。
图2示出了TPE-IQ-2O在负离子模式下的质谱图。
图3A-B示出了(A)TPE-IQ-2O在具有不同己烷分数(fH)的己烷/THF混合溶剂中的PL光谱和(B)相对PL强度与不同己烷分数的关系图。激发波长：420nm。
图4示出了DPA-IQ在DMSO中的吸收光谱(10μM)。
图5示出了MTT方法评估细胞存活率：Hela细胞在培养基中用不同浓度的DPA-IQ培养24小时。
图6示出了从460nm到700nm发射波长的扫描图，带宽为15nm。用442nm激光器激发。
图7示出了DPA-IQ在Hela细胞中的信噪比(S/N)。Hela细胞用50nM DPA-IQ在PBS中染色10分钟。用442nm激光器激发。
图8示出了ROIs随激发波长变化图。Hela细胞用50nM DPA-IQ在PBS中染色10分钟。
图9A-B示出了DPA-IQ在Hela细胞中的保留信号与扫描时间的关系图：实验中连续拍摄50帧，每帧的扫描时间为5.24秒。(A)用442nm激光器进行单光子激发，(B)用860nm激光器进行双光子激发。Hela细胞用50nM DPA-IQ在PBS中染色10分钟。
图10A-B示出了(A)TPA-IQ在具有不同水含量的DMSO/水混合溶剂中的发射光谱和(B)TPA-IQ相对发射峰强度(I/I0)与水含量关系图。浓度：10μM，激发波长：440nm(右边插图)TPA-IQ在DMSO(10μM)中的吸收光谱和(左边插图)在365nm的照射下，TPA-IQ在DMSO(10μM)和固态下的照片。
图11示出了MTT方法评估Hela细胞存活率，Hela细胞在培养基中用不同浓度的TPA-IQ培养24小时。
图12示出了从470nm到750nm发射波长的扫描图，带宽为15nm。用442nm激光器激发。
图13示出了Naph-IQ在Hela细胞中的信噪比(S/N)。Hela细胞用400nM TPA-IQ在PBS中染色10分钟。用442nm激光器激发。
图14示出了TPA-IQ在Hela细胞中的保留信号与扫描时间的关系图：实验中连续拍摄50帧，每帧的扫描时间为5.24秒。(A)用442nm激光器进行单光子激发，(B)用860nm激光器进行双光子激发。Hela细胞用50nM TPA-IQ在PBS中染色10分钟。
图15示出了Naph-IQ在DMSO(10μM)中的吸收光谱。
图16示出了MTT方法评估细胞存活率，Hela细胞在培养基中用不同浓度的Naph-IQ培养24小时。
图17示出了从460nm到700nm发射波长的扫描图，带宽为15nm。442nm激光器进行激发。
图18示出了Naph-IQ在Hela细胞中的信噪比(S/N)。Hela细胞用200nM Naph-IQ在PBS中染色10分钟。442nm激光器进行激发。
图19A-B示出了Naph-IQ在Hela细胞中的保留信号与扫描时间的关系图：实验中连续拍摄50帧，每帧的扫描时间为5.24秒。(A)用442nm激光器进行单光子激发，(B)用820nm激光器进行双光子激发。Hela细胞用200nM Naph-IQ在PBS中染色10分钟。
图20示出了TPE-IQ-2O、H2DCF-DA及其混合物在不同照射时间下的荧光变化。混合物的荧光强度增加，表明ROS的持续产生。染料(TPE-IQ-2O)：10mM；H2DCF-DA：5mM。激发波长：488nm。
图21示出了TPE-IQ-2O的LDH评估。用白光照射90分钟，HeLa细胞存活率随TPE-IQ-2O浓度增加而降低，而未进行白光照射，TPE-IQ-2O对HeLa细胞无明显的细胞毒性，有无白光照射，TPE-IQ-2O对COS-7细胞都无明显细胞毒性。
图22示出了自噬过程和雷帕霉素治疗过程的示意图。
图23示出了AIE-LysoY在THF中的UV谱图。[AIE-LysoY]＝10μM。
图24A-B示出了(A)AIE-LysoY在具有不同水含量(fw)的THF/水混合溶剂中的PL光谱和(B)AIE-LysoY的相对强度(I/I0)与THF/水混合溶剂组成的关系图。浓度为10μM；I0为在纯THF溶液中的PL强度；λex/em＝390/565nm。
图25示出了AIE-LysoY在乙醇和己烷中的标准化PL谱图。浓度为10μM；λex＝390nm。
图26示出了AIE-LysoY在具有不同TFA含量的THF/水混合溶剂中的PL强度。浓度为10μM；λex/em＝390/565nm。
图27示出了通过MTT方法评估AIE-LysoY对HeLa细胞的毒性。
图28示出了随着扫描次数的增加，AIE-LysoY(圆形)和LTR(正方形)荧光发射的信号损失(％)。λex＝405nm(AIE-LysoY)和561nm(LTR)；λem＝468-696nm(AIE-LysoY)和573-696nm(LTR)；照射时间：7.75秒/扫描。
图29示出了TPE-TMX在CDCl3-d6中的1H-NMR谱。
图30示出了TPE-TMX在CDCl3-d6中的13C-NMR谱。
图31示出了Cy-Py-N3的质谱图。
图32A-B示出了(A)TPE-TMX在具有不同水含量(fw)的THF/水混合溶剂中的PL光谱和(B)TPE-TMX的相对强度(I/I0)与水性混合溶剂组成的关系图。I0为在纯THF溶液中的PL强度；[TPE-TMX]＝10μM；激发波长：320nm。
图33示出了不同细胞用不同浓度TPE-TMX培养后的存活率。
图34示出了随着扫描次数的增加，TPE-TMX和LTR在染色的MCF-7细胞中荧光发射信号损失。激发波长：405nm(TPE-TMX)和561nm(LTR)；滤光片：450-750nm(TPE-TMX)，580-750nm(LTR)。照射时间：3.58秒/扫描。激光强度：0.1mW。
图35A-B示出了(A)TTE在THF中以及在水含量(fw)增加到99％的THF/水混合溶剂中的PL光谱和(B)在410nm处，TTE的PL强度与THF/水混合溶剂水含量的关系图。激发波长：368nm。
图36示出了TTE在聚集体和结晶状态下的PL谱。激发波长：320nm。
图37A-B示出了(A)sl-TTE在THF中以及在水含量(fw)增加到90％的THF/水混合溶剂中的PL光谱和(B)在489nm、389nm、和380nm处，sl-TTE的PL强度与THF/水混合溶剂水含量的关系图。激发波长：323nm。
图38A-B示出了(A)fl-TTE在THF中以及在水含量(fw)增加到90％的THF/水混合溶剂中的PL光谱和(B)在381nm处，fl-TTE的PL强度与THF/水混合溶剂水含量的关系图。激发波长：299nm。
图39示出了MTT方法评估细胞存活率，Hela细胞在培养基中用不同浓度的TTE培养24小时。
图40示出了TTE在HeLa细胞中的光稳定性。
图41示出了TTE在肺癌细胞A549中的光稳定性。
图42A-B示出了(A)TFE在THF中以及在水含量(fw)增加到99％的THF/水混合溶剂中的PL光谱和(B)在489nm处，TFE的PL强度与THF/水混合溶剂水含量的关系图。激发波长：387nm。
图43示出了TFE在聚集体、无定形以及晶体状态下的PL光谱。激发波长：387nm。
图44A-B示出了(A)fl-TFE在THF中以及在水含量(fw)增加到99％的THF/水混合溶剂中的PL光谱和(B)在361nm处，fl-TFE的PL强度与THF/水混合溶剂水含量的关系图。激发波长：274nm。
图45A-B示出了经IDA-TPE染色的Hela细胞的图像。染色时间：30分钟。浓度：10μM。
具体实施方式
定义
提供以下定义用于理解本专利内容及权利要求。
注意，本专利说明书和所附权利要求中所使用的单数形式“一”，“一个”和“该”包括复数涵义，除非上下文另有明确规定。
“聚集诱导发光”是指物质的荧光/磷光在其形成聚集或固态时急剧增强的现象。当物质发生分子溶解时，其不发光。但当分子内旋转受限时，会发出强的荧光。
“发射强度”是指通常由荧光光谱仪或荧光显微镜测量获得的荧光/磷光的量值。
“荧光团(fluorophore或fluorogen)”是指表现出荧光的分子。
“发光体(luminogen或luminophore)”是指表现出发光的分子。
“AIEgen”是指表现出AIE特征的分子。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语与本发明所述主题相关的本领域普通技术人员通常理解的含义相同。
如果提供了一系列值，例如浓度范围、百分比范围或比例范围，则应理解在上限和下限之间范围内的每个中间值以及在所述范围内的任何其他值均包含在本专利的保护范围内。除非上下文另有明确规定，否则本专利中所述的每个数值及其上下浮动十分之一所形成的数值范围内的所有数值都在本专利的保护范围内。
在整个专利说明中，各种实施方案的描述使用“包括”语言；然而，本领域技术人员将会理解，在一些具体情况下，也可以使用“基本上由...组成”或“由...组成”来描述实施方案。
为了更好地理解本发明的教导并且绝不限制本发明的范围，除非另有说明，否则在说明书和权利要求书中使用的表示数量、百分比或比例的所有数字以及其它数值应被理解在所有情况下都被“约”修饰。因此，除非有相反的指示，否则在以下说明书和所附权利要求中阐述的数值参数是可能根据寻求获得的期望性质而变化的近似值。至少，每个数值参数应至少根据报告的有效数字的数量和通过应用普通舍入技术来解释。
缩写
用于癌细胞可视化和鉴别的AIE发光探针
在一个实施方案中，本方案涉及具有AIE性质并可选择性对癌细胞进行染色的有机探针及其制备方法。当将探针应用于健康的正常细胞和癌细胞的混合物时，从癌细胞观察到明亮的发光，而从正常细胞仅观察到微弱的发射，其中正常细胞选自COS-7或MDCK-II，癌细胞选自HeLa、MDA-MB-231和MCF-7。PC-9、HepG2和HCC827等其他癌细胞在被有机探针染色后发射出了更强的荧光。然而，正常细胞LX2并没有明显的发射光。为了使这些AIE探针更方便使用，可通过用于手术操作的喷雾技术使癌细胞可以在原位可视化。此外，这些有机探针可以在光照射下产生活性氧物质(ROS)，从而使其有希望成为癌症治疗的试剂。
在本案例中，设计并合成了具有AIE特性的荧光探针。通过三组分反应使多种醛官能化的芳香族共轭聚芳基衍生物(polyarylenederivatives)进一步与内炔和伯胺合成，从而得到具有AIE特征的能够使若干癌细胞可视化的探针。这些AIE活性分子应用于从经过共同染色的癌症细胞和正常细胞的混合物中可视化和区分出癌细胞。
本实施方案涉及用于癌细胞成像和染色的探针，该探针包括具有选自以下化学分子结构所构成的组中的化学结构式的AIE发光体：
其中所述抗衡阴离子X-选自单一或更多电荷的阴离子；并且其中每个R则独立地选自由烷基、不饱和烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基构成的组。
在一个实施方案中，本发明中的AIE发光体选自由以下化学分子结构所构成的组：
双光子吸收(TPA)是指分子同时吸收相同或不同频率的两个光子从而使分子从一个状态(通常为基态)激发到较高能量的电子状态。此外，所涉及的分子的低能量状态和高能量状态之间的能量差等于这两个光子的能量之和，这种能力使得分子可被较长波长的光激发。在一个实施方案中，本发明的探针具有双光子吸收能力，并且可以被较长波长激发。在一个实施方案中，本发明的探针可选择性地对线粒体进行染色。在一个实施方案中，本发明的探针可用于线粒体成像，因为这些AIE发光体与线粒体具有静电相互作用。在一个实施方案中，由于被细胞摄取并富集于线粒体的探针发射荧光，从而实现线粒体成像。在一个实施方案中，成像样本可以包括任何种类的细胞。在一个实施方案中，成像样本包括任何癌细胞。例如，癌细胞可以选自由HeLa细胞、MCF-7细胞、MDA-MB-231细胞、PC-9细胞、HepG2细胞和HCC827细胞构成的组。
在一个实施方案中，本发明的探针可以通过荧光强度的差异将正常细胞与癌细胞区分开，其中，癌细胞和正常细胞可分开单独染色也可以混合在一起染色。在一个实施方案中，癌细胞具有较高的荧光强度，而正常细胞具有较低的荧光强度，这是由于癌细胞吸收富集了更多的本发明的探针。
在一个实施方案中，本发明涉及细胞的成像方法，包括：将如本文所述的探针引入含有细胞的样本，其中所述AIE发光体与线粒体具有静电相互作用；并通过监测被细胞摄取并富集于线粒体中的探针发出的荧光来进行细胞成像。
在一个实施方案中，本发明的探针可用于包括任何种类的细胞的样本的成像，例如，上述细胞。
在一个实施方案中，本发明的探针经光照射可产生ROS。
用于自噬可视化的溶酶体靶向的AIEgen
此外，自噬过程可以降解并循环使用细胞质的成分，溶酶体在自噬过程中有很重要的作用。为了更好地了解细胞自噬过程，人们希望找到有着高对比度和光稳定性的溶酶体靶向探针。
AIEgen已经在众多生物荧光响应体系中得到应用，包括靶向细胞器、蛋白质探针、DNA分化等等。可将亲水基团、带电荷分子或者多肽链引入经典的AIE核心(TPE和噻咯分子)来增强其水溶性，并减弱在水性介质中的荧光发射，从而得到更好的信噪比。
如此，本发明的实施方案涉及荧光AIE探针(即AIE-LysoY)的设计与合成，AIE-LysoY是一种吗啉功能化的聚集诱导发射发光体。AIE-LysoY具有激发态分子间质子转移(ESIPT)的性质，有利于得到出色的成像对比度。AIE-LysoY凭借其ESIPT性质为溶酶体可视化提供了新的平台，其具有如下优点：良好的生物兼容性，很大的斯托克位移，优越的信噪比，以及高光稳定性，其可用于溶酶体可视化、以及涉及溶酶体的自噬过程的可视化。AIE-LysoY的化学结构式是：
基于吗啉的功能性，AIE-LysoY能选择性地在细胞的溶酶体中聚集并点亮。这种AIE效应和ESIPT特性的结合使得AIE-LysoY能将HeLa细胞中的溶酶体可视化，并实现优越的分辨率和对比度。同时，AIE-LysoY有着众多优势，例如很大的斯托克位移，操作简单，多样的培育浓度与时间，极佳的光稳定性和对溶酶体很高的亲和性，这样既能使探针准确定位溶酶体，并且对与溶酶体相关的细胞间活动(例如自噬)有更好的了解。
在本实施方案中，用于溶酶体成像的AIEgen包括：吗啉功能化的AIE衍生物，其骨架结构选自以下结构所构成的组中：
其中R、R’、R”和R”’中至少有一个为并且
其中R、R’、R”和R”’独立地选自由以下基团构成的组：
本发明的一个实施方案涉及溶酶体成像和细胞自噬过程可视化的方法，包括：将本实施方案的AIEgen引入到样品中；AIEgen通过质子化作用和渗透性变化进入溶酶体并在其中聚集，从而可观测到AIEgen“激活”后发出的荧光，由此实现溶酶体成像和细胞自噬过程可视化。
在一个实施方案中，溶酶体为活哺乳动物细胞的溶酶体。在一个实施方案中，AIEgen在活哺乳动物细胞中培育。在一个实施方案中，培育AIEgen的活哺乳动物细胞的荧光图像由荧光显微镜和共聚焦显微镜中的至少一个表征。
在一个实施方案中，本发明涉及用于溶酶体成像的AIEgen，其包含：具有如下化学结构的吗啉功能化的AIE衍生物：
具有抗肿瘤活性的高荧光亮度AIE活性诊断治疗试剂
满足期望目标产品要求的挑战使药物发现工作复杂化。然而，在本发明的一个实施方案中，在仔细观察了TMX的化学结构之后，TPE的一个结构类似物(TPE-TMX)由于其荧光特征引起了我们的兴趣。
在本发明的一个实施方案中，设计并合成了TPE-TMX，其用苯基取代乙基，以用于细胞成像和抗肿瘤治疗。由于其新颖的荧光特征，药物在生物体系中的分布可以精确可视化。而且，其优异的光稳定性和长期追踪能够使其工作机制得到成功监测。其与TMX相似的化学结构使其能够有效治疗特定乳腺癌细胞，如MCF-7细胞。不同于TMX普遍接受的机制，TPE-TMX表现出了治疗乳腺癌细胞的可能的新途径，为药物开发提供了新的见解。
不同于传统的荧光团，TPE分子在分子溶解时无发射，但是当其聚集时会高度发射，即呈现AIE行为。分子内旋转受限是这一行为的主要原因。在稀溶液中，TPE中的苯环进行活跃的分子内旋转，引起激发态的快速非辐射衰变从而使荧光淬灭。在聚集体中，这些运动被分子间的位阻作用阻断，打开导致强荧光发射的辐射途径。通过利用这些特征，一系列TPE衍生物被发展并应用于许多生物领域。
因此，在本发明的一个实施方案中，通过用苯基取代来替代TMX中的乙基，然后未再进行其他修饰，得到的TPE-TMX就是用于治疗ER+乳腺癌的治疗剂。在这方面，治疗诊断学(一个综合的治疗系统)将诊断和治疗结合到一个系统中。诊断成像能力与治疗性干预措施的结合使得药物能够进行靶向和监测，同时能够结合其他优点，比如以非侵入性和实时性方式评估药物分布、释放和评价药物反应和疗效。
因此，TPE-TMX染料具有对DNA合成的高特异性，优异的光稳定性和高抗光漂白性。由于上述优点，该染料可以用于监测DNA的合成过程。
TPE-TMX根据以下合成路线被合成：
最终产物通过HRMS、1H NMR、13C NMR光谱充分地进行表征，获得了对应于其结构的令人满意的结果(图29-31)。研究了TPE-TMX的光学性能，TPE-TMX在THF溶液中的光致发光(PL)光谱如图32A-B所示。TPE-TMX在THF溶液中的最大发射在478nm.
在一个实施方案中，其他具有AIE特征的生物荧光探针也可用于治疗以及成像特定乳腺癌的抗肿瘤活性。在生物探针的一些实施方案中，成像的荧光来自摄取了AIE荧光团的细胞中的溶酶体。在生物探针的其它实施方案中，AIE荧光团由氨基官能团组成。在另一个实施方案中，细胞选自任何种类的细胞。在另一个实施方案中，在用生物探针处理后，只有特定的乳腺癌细胞受到影响。此外，成像样品可以是癌细胞，如HeLa细胞、MCF-7、Cos 7和MDA-MB-231。在一些实施方案中，所述AIE荧光分子具有选自以下通式构成的组中的主链结构：
其中R1、R2和R3为独立选自由H、烷基、不饱和烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基所构成的组中的取代基。
本发明的一个实施方案涉及体外抗肿瘤活性的方法，其包括用AIE治疗诊断生物探针处理细胞并通过荧光显微镜或激光共聚焦扫描显微镜检测细胞成像的步骤。在体外细胞成像方法的一些实施方案中，荧光显微镜或激光共聚焦扫描显微镜技术可用于活细胞跟踪。
在一些实施方案中，具有AIE特征的氨基功能化荧光探针用于抗肿瘤活性。在诊断治疗生物探针的一些实施方案中，包含氨基官能团的AIE荧光团可用于治疗特定乳腺癌细胞。
在一个实施方案中，本发明涉及用于治疗和成像抗肿瘤活性的生物荧光探针，其包括：包含氨基官能团并且具有选自以下结构所构成的组中的化学结构的AIE荧光团：
其中R1、R2和R3独立选自由H、烷基、不饱和烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基构成的组。
在一个实施方案中，本发明的生物探针用于治疗以及成像特定乳腺癌的抗肿瘤活性。在一个实施方案中，成像的荧光来自摄取AIE荧光团的细胞中的溶酶体。在一个实施方案中，细胞选自任何种类的细胞。在一个实施方案中，乳腺癌细胞在用生物荧光探针处理后受到影响。
本发明的一个实施方案涉及治疗和成像抗肿瘤活性的方法，其包括：将本发明的生物探针引入细胞样品；并通过荧光显微镜或激光共聚焦扫描显微镜监测细胞成像，其中荧光发射自由细胞摄取并被积累在线粒体中的探针。
在一个实施方案中，样品包括选自由HeLa，MCF-7，Cos 7和MDA-MB-231构成的组中的癌细胞。在一个实施方案中，样品含有活细胞，荧光显微镜或激光共聚焦扫描显微镜用于追踪活细胞。
应用于生物传感器的AIE发光体
本发明的一个实施方案涉及具有AIE特征的两种荧光染料四噻吩乙烯(TTE)和四呋喃乙烯(TFE)的研究。发现了一种新的机制，即从聚集状态到晶体状态时发生光致发光的增加，这被称为聚集诱导发光效应。分析分子的晶体结构，发现杂原子与杂原子(硫与硫和氧与氧)的相互作用。这些相互作用导致簇的形成，创建了一个更为共轭的网络，其中观察到从聚集到晶体时发射波长红移。TTE和TFE的AIE现象背后的机制是由于分子内旋转(RIR)的限制，已经通过合成完全锁定的TTE(fl-TTE)和完全锁定的TFE(fl-TFE)来证明这一机制。
因此，本发明的一个实施方案涉及完全锁定的TTE(fl-TTE)和完全锁定的TFE(fl-TFE)的锁定结构的合成。这些分子显示出有趣的行为。尽管它们都是ACQ染料，但它们能够以粉末形式发光。因此，它们可以被定义为“非常规ACQ发光体”。为了充分了解这一效果，需要进行晶体结构分析。由于这些分子(如它们的未锁定的母体化合物TTE和TFE)拥有杂原子，所以它们的固态发光也可能牵涉到发光效应.
TTE、TFE和fl-TFE已被测试用于癌细胞的可视化的生物探针。具体而言，已经在HeLa和肺癌细胞A549中测试了TTE，仅在HeLa细胞中测试了TFE和fl-TFE。对于这个应用只有TTE被证明是有用的，这是因为仅有它才能够进入细胞内，即使它没有任何附着到主链上的官能团。TTE是在本发明的实施方案中描述的分子，半锁定TTE(sl-TTE)是TTE的光氧化反应的中间产物。该分子在固态中显示出可逆的光致变色性质，该现象已经通过在不同时间拍摄的照片得到表征。
在一个实施方案中，本主题涉及用于癌细胞成像和染色的探针，其包含具有选自以下结构所构成的组中的化学主链结构的AIE发光体:
其中所述AIE发光体是聚集体发光元件(clusteroluminogen)；并且
其中TTE用作癌细胞成像的染料。在一个实施方案中，TTE进入癌细胞，选择性地将脂滴染色，并且具有蓝绿色发射现象。
在一个实验方案中，本发明涉及具有以下化学结构的发光体:
在一个实施方案中，发光体是粉末状态发光的非常规ACQ发光体。在一个实施方案中，fl-TTE是非常规ACQ发光体。在一个实施方案中，从纯THF溶液到THF:H2O＝1:99(V/V)的溶液中的聚集状态，fl-TTE具有发光红移。在一个实施方案中，sl-TTE具有AIE和ACQ属性。在一个实施方案中，sl-TTE显示固态光致变色性能。
在一个实验方案中，本发明涉及用于癌细胞成像和染色的探针，其包含具有如下化学结构的AIE发光体：
其中所述AIE发光体被癌细胞摄取，并且图像显示在癌细胞内的细胞器被染色。在一个实施方案中，染色的细胞器是线粒体。
实施例
给出以下实施例以说明本发明的具体应用。这些实施例并不旨在限制本专利申请中描述的主题的范围。
实施例1
表征：在Perkin Elmer LS 55光谱仪上记录稳态荧光光谱。在Olympus BX 41荧光显微镜上收集荧光图像。
细胞培养：在37℃的5％CO2湿度培养箱中，在含有10％FBS和1％抗生素(100单位/mL青霉素和100g/mL链霉素)的MEM中培养HeLa细胞。在37℃的5％CO2湿度培养箱中，在含有10％FBS和抗生素(100单位/mL青霉素和100g/mL链霉素)的DMEM中培养COS-7、MDA-MB-231、MCF-7和MDCK-II细胞。
细胞成像：将两种不同种类的细胞在配有盖玻片的35mm培养皿上生长过夜。将活细胞用200nM的TPE-IQ-2O孵育1、5、10和20分钟。在典型的实验中，先将2μL的10mM TPE-IQ-2O的DMSO储备溶液用细胞培养基稀释至2mL，然后进一步稀释至所需浓度。然后在荧光显微镜(BX41显微镜)下，使用相同的激发和发射滤光片：激发滤光片＝400-440nm，二向色镜＝455nm，发射滤光片＝465nm长通，从而对细胞进行成像。
将PC-9、HepG2和HCC827细胞在配有盖玻片的35mm培养皿上生长过夜。将活细胞用200nM的TPE-IQ-2O孵育20分钟和10分钟。在这些实验中，仅癌细胞被染色并具有荧光。
将LX2细胞在配有盖玻片的35mm培养皿上生长过夜。将活细胞用200nM的TPE-IQ-2O孵育20分钟和10分钟。在所有实验中，正常细胞没有明显的荧光。
将HeLa细胞在配有盖玻片的35mm培养皿上生长过夜。然后将HeLa细胞用200nM的TPE-IQ-20和Mito-tracker red(50nM)/Lyso-tracker red(50nM)/DAPI(500nM)染色20分钟。该实验的结果表明TPE-IQ-2O可以选择性靶向细胞的线粒体。
结构I、II、III和IV的合成路线：将含有2.0mol％的[RhCp*Cl2]2、0.30mmol的AgBF4、0.30mmol的Cu(OAc)2、0.36mmol不同的苯甲醛和0.30mmol的内炔的密封管抽真空、并充氮气三次。然后在氮气气氛下，通过注射器将0.45mmol丙胺和2.5mL叔戊醇依次加入到体系中，并将该反应混合物在110℃下搅拌3小时。当反应完成时，将混合物冷却并用10mL二氯甲烷稀释。将混合物通过硅藻土垫过滤，并进一步用30mL二氯甲烷和20mL甲醇洗涤。将合并的滤液在旋转蒸发器中浓缩，残余物通过Al2O3色谱柱纯化，使用二氯甲烷/甲醇(100:1v/v)作为洗脱剂，得到具有结构I、II、III和IV的纯产物，其为橙色固体，产率为50％到80％。
制备6-(2,2-双(4-甲氧基苯基)-1-苯基乙烯基)-3,4-二苯基-2-丙基异喹啉-2-鎓(结构I，TPE-IQ-2O)：将含有2.0mol％的[RhCp*Cl2]2、0.30mmol的AgBF4、0.30mmol的Cu(OAc)2、0.36mmol的4-(2,2-双(4-甲氧基苯基)-1-苯基乙烯基)苯甲醛和0.30mmol的内炔的密封管抽真空、并充氮气三次。然后在氮气气氛下，通过注射器将0.45mmol丙胺和2.5mL叔戊醇依次加入到体系中，并将该反应混合物在110℃下搅拌3小时。当反应完成时，将混合物冷却并用10mL二氯甲烷稀释。将混合物通过硅藻土垫过滤，并进一步用30mL二氯甲烷和20mL甲醇洗涤。将合并的滤液在旋转蒸发器中浓缩，残余物通过Al2O3色谱柱色谱柱纯化，使用二氯甲烷/甲醇(100:1v/v)作为洗脱剂，得到纯的产物TPE-IQ-2O，其为橙色固体，收率为79.10％。
1H NMR(400MHz,CDCl3),δ(TMS,ppm):11.35(s,1H),8.66(d,1H),7.53(d,2H),6.58-7.31(m,21H),4.73(m,4H),3.72(s,3H),3.81(s,3H),1.90(d,2H),0.87(m,3H).13CNMR(100MHz,CDCl3),δ(TMS,ppm):159.12,159.06,154.64,151.12,145.46,143.42,142.73,138.23,137.40,137.04,135.07,134.98,134.60,133.09,133.03,132.89,131.61,131.54,131.10,130.46,130.21,130.16,128.88,128.46,128.44,128.36,127.26,125.96,114.03,113.25,60.27,55.55,55.31,25.59,10.97.MALDI-TOF:m/z(阳离子):实测值638.3088(M+,计算值638.3059),m/z(阴离子):实测值86.9980(M+,计算值87.0035)。表征数据：氢NMR谱和碳NMR谱(图1),阳离子MALDI-TOF质谱(精确分子量：638.3054)和阴离子MALDI-TOF质谱(图2).
TPE-IQ-2O表现出了典型的AIE特征，如图3所示。TPE-IQ-2O的THF溶液几乎不发光，而在含有90％己烷的THF-己烷混合溶液中，TPE-IQ-2O形成聚集体并在紫外激发时发出峰值在约620nm处的强烈荧光。
HeLa细胞和COS-7正常细胞：将两种不同的细胞在配有载玻片的35mm培养皿上生长过夜。活细胞用200nM的TPE-IQ-2O孵育20、10、5和1分钟。Hela细胞用TPE-IQ-2O染色；COS-7细胞用TPE-IQ-2O染色；HeLa细胞和COS-7细胞共同培养并被TPE-IQ-2O共同染色。条件：200nM；滤光片：均关闭；激发光：400-440nm；拍照曝光时间：亮场：1000ms荧光：1000ms。
在所有实验中，仅有HeLa癌细胞被染色并呈现荧光。而正常细胞COS-7并未被TPE-IQ-2O染色且并未发射荧光。然而，当两种细胞在相同环境中生长并随后进行染色后，仅HeLa癌细胞会发出荧光。
MCF-7细胞和COS-7正常细胞：将两种不同的细胞在配有载玻片的35mm培养皿上生长过夜。活细胞用200nM的TPE-IQ-2O孵育20、10和5分钟。MCF-7细胞用TPE-IQ-2O染色；COS-7细胞用TPE-IQ-2O染色；MCF-7细胞和COS-7细胞共同培养并被TPE-IQ-2O共同染色。条件：200nM；滤光片：均关闭；激发光：400-440nm；拍照曝光时间：亮场：1000ms荧光：1000ms。
在所有实验中，仅有MCF-7癌细胞被染色并呈现荧光。而正常细胞COS-7并未被TPE-IQ-2O染色且并未发射荧光。然而，当两种细胞在相同环境中生长并随后进行染色后，仅MCF-7癌细胞会发出荧光。
MDA-MB-231细胞和COS-7正常细胞：将两种不同的细胞在配有载玻片的35mm培养皿上生长过夜。活细胞用200nM的TPE-IQ-2O孵育20、10、5和1分钟。MDA-MB-231细胞用TPE-IQ-2O染色；COS-7细胞用TPE-IQ-2O染色；MDA-MB-231细胞和COS-7细胞共同培养并被TPE-IQ-2O共同染色。条件：200nM；滤光片：均关闭；激发光：400-440nm；拍照曝光时间：亮场：1000ms荧光：1000ms。
在所有实验中，仅有MDA-MB-231癌细胞被染色并呈现荧光。而正常细胞COS-7并未被TPE-IQ-2O染色且并未发射荧光。然而，当两种细胞在相同环境中生长并随后进行染色后，仅MDA-MB-231癌细胞会发出荧光。
HeLa细胞和MDCK-II正常细胞：将两种不同的细胞在配有载玻片的35mm培养皿上生长过夜。活细胞用200nM的TPE-IQ-2O孵育20分钟。Hela细胞用TPE-IQ-2O染色；MDCK-II细胞用TPE-IQ-2O染色；MDA-MB-231细胞和COS-7细胞共同培养并被TPE-IQ-2O共同染色。条件：200nM 10分钟；滤光片：均关闭；激发光：400-440nm；拍照曝光时间：亮场：1000ms荧光：1000ms。
在所有实验中，仅有Hela癌细胞被染色并呈现荧光。而正常细胞MDCK-II并未被TPE-IQ-2O染色且并未发射荧光。然而，当两种细胞在相同环境中生长并随后进行染色后，仅Hela癌细胞会发出荧光。
ROS的产生：TPE-IQ-2O、H2DCF-DA(ROS指示剂)和它们的混合物在不同的白光照射时间下的荧光强度变化。经PL仪器检测，TPE-IQ-2O和H2DCA的混合物显示出强度增强，这表明有连续的ROS产生(图20)。染料(TPE-IQ-2O)：10mM；H2DCF-DA：5mM。激发波长：488nm。
癌细胞和正常细胞的LDH细胞毒性测定：将HeLa细胞和COS-7细胞接种在96孔板中24小时。然后在每个孔中加入不同浓度的TPE-IQ-2O。在黑暗中处理TPE-IQ-2O 30分钟后，除去染料。一半的细胞用白光照射处理90分钟，其余的细胞保持在黑暗中。继续培养24小时后，将10μL的10X裂解缓冲液溴化物加入到未处理的细胞中作为最大LDH活性，同时向其他孔中加入10μL超纯水。在37℃、5％CO2的条件下孵育45分钟后，将50μL各孔样品培养液转移到新的96孔板中，然后加入50μL反应混合物。在避光培养30分钟后，将50μL终止溶液加入每个孔中。然后通过酶标仪测得吸光度。在白光照射90分钟后，HeLa细胞的活性随着TPE-IQ-2O浓度的增加而降低，而在没有经白光照射的HeLa细胞、经过或没有经过白光照射的COS-7细胞中并没有观察到明显的细胞毒性(图21)。
实施例2
结构II(DPA-IQ)的制备：简言之，在氮气保护下，将[RhCp*Cl2]2(2.0mol％)、AgBF4(0.30mmol)、Cu(OAc)2(0.30mmol)、4-(二苯基氨基)苯甲醛(0.36mmol)、二苯基乙炔(0.30mmol)、丙胺(0.45mmol)在2.5ml叔戊醇中的反应混合液在110℃下加热搅拌3小时。除去溶剂后，使用二氯甲烷/甲醇(100:1v/v)作为洗脱剂，通过氧化铝柱色谱法纯化残余物，从而得到为黄色固体的纯产物，收率为60％。
1H-NMR(400MHz；d6-DMSO)δH 9.77(s,1H),8.29(d,2H,J＝9.6Hz),7.44-7.36(m,10H),7.30-7.24(m,6H),7.11-7.10(m,3H),7.04-7.02(m,2H),6.43(s,1H),4.18(t,2H,J＝7.2Hz),1.75-1.69(m,2H),0.73(t,2H,J＝7.2Hz)ppm.13C-NMR(400MHz；CDCl3)δC 155.0,149.1,144.4,143.3,139.7,135.4,133.7,133.6,131.5,130.4,130.2,130.0,128.8,128.2,128.1,127.0,126.8,123.5,122.1,109.5,59.3,25.3,10.9ppm.11B-NMR-1.327ppm.19F-NMR-148.3ppm.MALDI-MS DPA-IQ阳离子(C36H31N2 +):计算值为491.2482,实测值为491.2494。
DPA-IQ表现出典型的AIE特征。DPA-IQ的DMSO溶液几乎不发光，而该材料的聚集状态粉末在紫外线激发时发出强烈的绿色发光。图4所示为紫外吸收光谱。MTT实验表明DPA-IQ对线粒体细胞器的染色效果与市售MitoTracker Red FM一样好，并且DPA-IQ具有低细胞毒性(图5)。由于DPA-IQ在所有测试浓度下均可高分辨率染色线粒体，因此DPA-IQ可在从50nM到500nM的不同工作浓度下有效。
DPA-IQ具有吸收双光子的能力，并且结果显示了癌细胞中的染色部分的高分辨率。图6示出了从460nm到700nm发射波长的扫描图，带宽为15nm。用442nm激光器激发。
如图7所示，信噪比(S/N)是可接受的，该信噪比为DPA-IQ在Hela细胞中的S/N。HeLa细胞用含有50nM的DPA-IQ的PBS溶液染色10分钟。用442nm激光激发，图8中测试了不同的双光子激发，其示出了ROIs随激发波长的变化图。HeLa细胞用含有50nM的DPA-IQ的PBS溶液染色10分钟。
当双光子激发波长选择为780nm、800nm、840nm、860nm、880nm、和900nm的情况下，都可以获得清晰的图像。与单光子激发相比，两种技术之间的S/N以及结果表明这两种激发方法几乎无差别，这些结果表明由于这些可以被双光子激发的染料的高质量，因此有望用于体内成像，如图9所示。
HeLa/HepG2/PC-9细胞和LX2正常细胞：HepG2细胞(人肝癌细胞系)、PC-9细胞(人肺腺癌细胞系)、HeLa细胞(人宫颈癌细胞系)和LX2细胞(正常细胞，人肝星状细胞系)用200nM的DPA-IQ染色10分钟。在相同的设备设置下拍摄图像。比例尺：30μm。激发波长：400-440nm。结果显示，癌细胞显示出强荧光发射而正常健康细胞LX2显示微弱的荧光发射。
实施例3
结构III(TPA-IQ)的制备：合成方法类似于DPA-IQ。
1H-NMR(400MHz；d6-DMSO)δH 10.29(s,1H),8.66(d,1H,J＝8.8Hz),8.43(d,1H,J＝8.4Hz),7.60-7.58(m,3H),7.49(s,2H),7.40-7.28(m,12H),7.15-7.08(m,6H),7.00(d,2H,J＝8.4Hz),4.36(t,2H,J＝7.2Hz),1.85-1.80(m,2H),0.79(t,3H,J＝7.2Hz)ppm.13C-NMR(400MHz；d6-DMSO)δC 149.3,149.1,147.7,146.3,144.3,137.9,137.7,133.5,131.4,131.1,130.4,130.3,130.1,130.0,129.8,128.7,128.5,128.3,125.5,125.2,124.3,121.6,120.8,60.0,23.7,10.5ppm.11B-NMR(128MHz；d6-DMSO)-1.32ppm.19F-NMR(376MHz；d6-DMSO)-148.3ppm.MALDI-MS TPA-IQ的阳离子(C42H35N2 +):计算值为567.2795,实测值为567.2771。
TPA-IQ表现出典型的AIE特征，如图10所示。TPA-IQ的DMSO溶液几乎不发光，而当UV激发时该物质的聚集状态粉末发出很强的黄橙色荧光。图10所示为紫外吸收光谱。
MTT实验表明，TPA-IQ对线粒体细胞器的染色效果与市售MitoTracker Red FM一样好，并且TPA-IQ具有更高的分辨率和低细胞毒性(图11)。
由于DPA-IQ在所有测试浓度下均可高分辨率染色线粒体，因此DPA-IQ可在从200nM到1000nM的不同工作浓度下有效。
TPA-IQ利用了其三苯胺基团的非线性光子吸收性能，因此TPA-IQ具有吸收双光子的能力，结果显示出癌细胞中染色部分的高分辨率。图12示出了从470nm到750nm发射波长的扫描图，带宽为15nm(用442nm激光器激发)。图13所示的是TPA-IQ在Hela细胞中的信噪比(S/N)，该信噪比是可接受的。HeLa细胞用400nM的TPA-IQ的PBS溶液染色10分钟。用442nm激光器激发。如图14所示，这两种技术之间的信噪比和结果表明：随着扫描时间的延长，双光子吸收率降低。
实施例4
结构IV(Naoh-IQ)的制备：合成方法类似于DPA-IQ。
1H-NMR(400MHz；d6-DMSO)δH 10.35(s,1H),8.75(d,1H,J＝8.8Hz),8.30-8.26(m,2H),7.73(d,1H,J＝8.0Hz),7.60-7.42(m,9H),7.30-7.24(m,5H),7.10(d,1H,J＝8.0Hz),4.43(t,2H,J＝7.2Hz),4.01(s,3H)1.89-1.84(m,2H),0.82(t,3H,J＝7.2Hz)ppm.13C-NMR(400MHz；d6-DMSO)δC 155.8,149.7,148.9,144.4,138.2,137.4,133.5,133.3,130.8,130.4,130.1,129.3,128.8,128.4,128.2,127.7,126.0,125.7,124.1,122.3,104.4,60.3,55.9,23.8,10.5ppm.11B-NMR(128MHz；d6-DMSO)-1.33ppm.19F-NMR(376MHz；d6-DMSO)-148.3ppm.MALDI-MS Naph-IQ的阳离子(C35H30NO+):计算值为480.2322,实测值为480.2334。
Naph-IQ表现出典型的AIE特征。Naph-IQ的DMSO溶液几乎不发光，而当UV激发时该物质的聚集状态粉末发出蓝色荧光。图15所示为Naph-IQ的吸收光谱。
市售的MitoTracker Red FM作为对照物与Naph-IQ共同染色。MTT实验结果表明，Naph-IQ对线粒体细胞器的染色效果与MitoTracker Red FM一样好，并且Naph-IQ的分辨率更高且细胞毒性低(图16)。由于Naph-IQ在所有测试浓度下均可高分辨率染色线粒体，因此Naph-IQ可在从50nM到500nM的不同工作浓度下有效。
Naph-IQ具有双光子吸收的能力，结果能够显示出癌细胞中染色部分的高分辨率。图17示出了从460nm到700nm发射波长的扫描图，带宽为15nm(用442nm激光器激发)。图18所示的是Naph-IQ在Hela细胞中的信噪比(S/N)，该信噪比是可接受的。HeLa细胞用200nM的Naph-IQ的PBS溶液染色10分钟。用442nm激光器激发。同样的，如图19所示，这两种技术之间的信噪比和结果表明：随着扫描时间的延长，双光子吸收率降低。
实施例5
AIE-LysoY的合成路线如下所示：
M1和M2由商业可购的前体经过一步修饰制得，然后使M1和M2在温和反应条件下缩合制得FAS-Br。将FAS-Br与吗啉基团连接得到AIE-LysoY。将吗啉基团的中度碱性特性用以溶酶体定位。一旦进入溶酶体，溶酶体的高度酸性条件使吗啉质子化，进而使得AIE-LysoY有更高的亲水性并停留在溶酶体中。在这种机制下，溶酶体被AIE-LysoY选择性点亮。
在THF中，AIE-LysoY表现出的吸收带峰值在390nm(图23)。当AIE-LysoY分子溶解于THF中时，其发光微弱，小的吸收带集中在565nm。随着THF/水混合溶液中水含量的增多，AIE-LysoY发光增强，表现出明显的AIE现象(图24A，AIE-LysoY在不同水含量(fw)的THF/水混合溶液中的荧光光谱图)。AIE-LysoY的AIE效应可由纳米聚集体的形成带来的RIM和ESIPT的激活效应解释。在纯THF溶液中，AIE-LysoY经历动态分子内运动，因而在这些溶液中激发态通过非辐射通道衰减。在低溶解度的混合溶剂中，AIE-LysoY形成纳米聚集体，因而分子内运动受限。故AIE-LysoY激发态通过荧光辐射通道衰减，发光强度增强。
AIE-LysoY也有ESIPT性质。其展示了如下两种发光形式：
在非质子溶剂中，有分子内氢键存在，故而表现出较长波长的酮式结构发光。在质子溶剂中，由于这种分子内氢键(图25)的断裂，表现出较短波长的烯醇结构发光。外部有机酸的加入也能够打破这种分子内氢键，造成酮式结构发光强度的减弱。为了验证这一结果，pKa约为-0.3的强有机酸三氟乙酸(TFA)被加入AIE-LysoY的聚集体悬浮液(THF/水＝1/99)中。随着三氟乙酸含量由1％增加到5％，AIE-LysoY在565nm的发射光强度显著减弱。当三氟乙酸含量为10％时，AIE-LysoY完全无发射光(图26)。这是由于三氟乙酸的加入使中心的氮原子质子化，ESIPT发射不复存在。
AIE-LysoY的合成路线如下：
(9H-芴-9-亚基)肼(M1)
9H-芴-9-酮(5g,27.75mmol)溶解在纯乙醇(70ml)中，然后加入肼(20ml)，该混合物回流反应12小时。将沉淀物真空抽滤，使用纯乙醇洗涤三次，真空干燥，得黄色针状晶体。(5.0g,产率93％)。
4-((6-溴己基)氧基)-2-羟基苯甲醛(M2)
首先将2,4-二羟基苯甲醛(5.0g,36.2mmol)和1,6-二溴己烷(8.8g,36.2g)溶解在乙腈(50ml)中，然后加入碳酸钾(6.0g,43.4mmol)，在60℃氮气保护下搅拌混合物36小时。待冷却至室温后，混合物使用二氯甲烷(40ml)萃取三次。得到的溶液使用稀盐酸溶液洗涤两次，纯水洗涤一次。合并的二氯甲烷有机相使用无水硫酸镁干燥，减压浓缩。残余物通过柱色谱(硅胶，石油醚/乙酸乙酯＝8/1)进一步分离，得到白色固体(2.25g,产率20.6％)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ＝11.48(s,1H),9.71(s,1H),7.41(d,J＝8.7Hz,1H),6.52(dd,J＝8.7,2.3Hz,1H),6.41(d,J＝2.3Hz,1H),4.01(t,J＝6.4Hz,2H),3.43(t,J＝6.7Hz,2H),1.89-1.79(m,4H),1.54-1.48(m,4H)。
(E)-2-(((9H-芴-9-亚基)肼基)甲基)-5-((6-溴己基)氧基)苯酚(FAS-Br)
将4-((6-溴甲基)氧基)-2-羟基苯甲醛(M2,2.0g,6.64mmol)溶解在纯乙醇(30ml)中，然后加入(9H-芴-9-亚基)肼(M1,1.37g,7.1mmol)，使混合物在60℃下反应12小时。将沉淀物真空抽滤，使用纯乙醇洗涤三次，然后真空干燥。残余物通过柱色谱(硅胶,石油醚/二氯甲烷＝3/1)进一步分离，得到黄色粉末固体(2.54g,产率80％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝12.08(s,1H),8.71(s,1H),8.27(d,J＝7.6Hz,1H),7.90(d,J＝7.5Hz,1H),7.61(dd,J＝17.2,7.4Hz,2H),7.50-7.38(m,2H),7.38-7.24(m,4H),6.57(m,3H),4.03(t,J＝6.4Hz,2H),3.73(t,J＝4.6Hz,2H),2.46(m,2H),2.35(m,2H),1.94-1.66(m,2H),1.53-1.39(m,4H).
(E)-2-(((9H-芴-9-亚基)肼基)甲基)-5-((6-吗啉代己基)氧基)苯酚(AIE-LysoY)
将(E)-2-(((9H-芴-9-亚基)肼基)甲基)-5-((6-溴己基)氧基)苯酚(FAS-Br,1.0g,2.1mmol)加入吗啉(8ml)中，氮气保护下将混合物回流4小时，然后将混合物真空干燥，并使用二氯甲烷(4ml)萃取三次。萃取液使用卤水洗涤，无水硫酸镁干燥，减压浓缩。残余物通过柱色谱(硅胶柱，甲醇/二氯甲烷＝1/20)进一步分离，得黄色固体(0.96g,产率95％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝12.06(s,1H),8.72(s,1H),8.25(d,J＝7.6Hz,1H),7.90(d,J＝7.5Hz,1H),7.64(dd,J＝17.2,7.4Hz,2H),7.50-7.38(m,2H),7.38-7.24(m,4H),6.53(ddd,J＝51.6,28.0,17.0Hz,3H),4.03(t,J＝6.4Hz,2H),3.73(t,J＝4.6Hz,4H),2.46(s,4H),2.35(m,2H),1.90-1.76(m,2H),1.52-1.39(m,4H).m/z(MALDI-TOF)484.2593[M+]；calc.483.2522。
应用
在使用AIE-LysoY作为溶酶体的荧光显示剂之前，首先进行3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基溴化四唑(MTT)细胞增殖实验来评价其生物毒性。经15μM的AIE-LysoY培育24小时之后，HeLa细胞的存活力仍高于80％(图27)，表明AIE-LysoY对于细胞生长近无影响。AIE-LysoY良好的生物兼容性使其能作为荧光示踪剂来跟踪溶酶体的自噬过程。
然后，通过荧光显微镜来评价AIE-LysoY应用于溶酶体成像和溶酶体定位的效果。将HeLa细胞使用10μM的AIE-LysoY染色10分钟，然后洗去多余的AIE-LysoY分子，再用50nM的LTR培育30分钟。AIE-LysoY选择性地聚集在点状溶酶体中，发出黄色荧光，清楚地从背景中区分出来。AIE-LysoY的荧光与LTR的荧光完美重合，表明AIE-LysoY有效地定位溶酶体。
通过皮尔森系数(Rr)来量化分析这两种荧光信号的重合程度，皮尔森系数描绘了二者之间的线性相关度，得到重合指数为0.90。如此高的Rr值表明了AIE-LysoY是一种溶酶体选择性探针。而且，相比LTR，在更短的培育时间下，AIE-LysoY的对比度更高，这得益于AIE-LysoY的高发光强度和高度选择性。有趣的是，如果HeLa细胞先使用LTR染色，再使用AIE-LysoY，后者的对比度依旧高于前者。这些结果表明即使溶酶体先被LTR染色，由于AIE-LysoY对溶酶体更高的亲和性，AIE-LysoY仍然能够进入溶酶体。此外，AIE-LysoY也表现了不同染色时间的优势。改变染色时间由10分钟至60分钟，AIE-LysoY对溶酶体的特异性仍然存在，高对比度也未消失.
相比LTR，AIE-LysoY的工作浓度高很多。LTR也不比AIE-LysoY灵敏度高。如之前所提到的，LTR只能在低浓度时使用以避免ACQ现象。在如此低的工作浓度时，荧光探针分子会在细胞质中分散，在持续的激发光下极易被光氧化，故而这些探针光稳定性很低。为了评价AIE-LysoY的光稳定性，使用共聚焦显微镜(Zeiss laser scanning confocal microscopeLSM7DUO)持续扫描由AIE-LysoY染色的细胞。同时测量LTR的光稳定性作为对比。激发光(AIE-LysoY为405nm，LTR为561nm)通过功率表统一。经过50分钟的持续扫描，总共照射时间为约6分钟，由AIE-LysoY染色的HeLa细胞的荧光信号几乎保持不变，表现出极佳的光稳定性(图28，实点线)。相比之下，仅仅25次扫描之后LTR的荧光强度降低至初始值的50％之下(图28，空点线)。荧光信号轻微的浮动可能是由于活细胞中溶酶体的动态运动。在溶酶体成像中AIE-LysoY极佳的光稳定性可能来源于其纳米粒的本质，能够保护粒子内部发色团不被光氧化。从而，在长时间照射之后，AIE-LysoY的荧光能够持续。AIE-LysoY良好的光稳定性使其在长时间跟踪溶酶体的生物过程中有很大的应用潜力。
使用分子工程方法来设计溶酶体特异性生物探针。制备AIE-LysoY的前体FAS-Br和两个由吗啉功能化的AIEgen(TPE-2Mor和Nred-mor)，并应用于分子成像。TPE-2mor和Nred-mord的分子结构如下所示：
FAS-Br点亮HeLa细胞的分子内脂肪粒和线粒体的内网结构，而不是溶酶体，这表明需要吗啉来定位酸性的溶酶体。但是仅仅含有吗啉基团并不能确保溶酶体选择性。TPE-2Mor和Nred-mor两者都含有吗啉基团，但是皆不能选择性地点亮溶酶体。TPE-2Mor染色了所有的疏水部分，而Nred-mor选择性地聚集在线粒体中。TPE-2Mor含有疏水性的TPE内核，而Nre-mor携带了有电荷的吡啶部分。TPE的疏水作用和正电荷吡啶与其他细胞器的静电作用可能会与吗啉带来的驱动力相竞争，从而减少甚至破坏溶酶体选择性。所以，准确定位溶酶体需要合理小心地控制分子的疏水性和极性.
哺乳动物的雷帕霉素靶蛋白(mTOR)被确认为细胞自噬的抑制剂。雷帕霉素，一种脂溶性大环内酯类抗生素，能绑定mTOR，增强细胞自噬，故广泛地被应用为自噬诱发剂。雷帕霉素的化学结构如下所示：
使用雷帕霉素治疗被朊病毒蛋白侵染的小鼠，通过激活细胞自噬和朊病毒蛋白降解，能够延长小鼠寿命。雷帕霉素治疗中，溶酶体的数目、尺寸和酸度均有所增加。使用具有良好溶酶体定位性和优异的光稳定性的AIE-LysoY能够长期追踪细胞自噬过程，为了解细胞活动提供更多可能。为验证可行性，使用10μM的AIE-LysoY染色HeLa细胞10分钟，然后在不同时间加入雷帕霉素治疗，再使用荧光显微镜观测。
在荧光显微镜下溶酶体清晰可见。自噬过程中，溶酶体的数目将增加并且溶酶体将与自噬体融合形成自溶酶体。黄色亮点的数目对应溶酶体的数目，黄色亮点的数目随着雷帕霉素治疗的增长而增加。如果放大图片，溶酶体仍能以极好的分辨率和对比度可视。特别是新形成的溶酶体也被点亮，虽然多余的AIE-LysoY在雷帕霉素治疗之前已被洗去。这一结果表明了自噬室与原始溶酶体在自噬过程中的融合。
此外，LTR也提供了相似的荧光图像，与用雷帕霉素处理的HeLa细胞中的AIE-LysoY表现出良好的重合性。但是LTR需要与雷帕霉素同时培育细胞，不然其发光将会大大减弱，因为多余的LTR会在之前被洗去。由于AIE-LysoY对溶酶体的高度选择性和极佳的光稳定性，可以作为溶酶体选择性生物探针以研究细胞自噬过程。
实施例6
溶酶体成像
研究TPE-TMX在细胞环境中的行为并与TMX进行比较。MCF-7细胞分别与2μM TPE-TMX和50nM TMX孵育24小时。然后将细胞洗涤，未进行固定直接在显微镜下进行观察。令人吃惊的是，TMX和TPE-TMX在MCF-7中表现类似的细胞内分布，两种药物好像都定位在细胞核周围。然而，由于TMX的发射波长不在可见光谱范围内，因而TMX在细胞内的确切位置不能通过荧光显微镜来证实。因此，使用一系列商业荧光标记物来成像TMX的药物递送。值得注意的是，LTR是一种溶酶体特异性染料，可以与TMX完美匹配，这表明TMX可能定位在溶酶体。另一方面，TPE-TMX发射强的蓝色荧光，因而TPE-TMX无需荧光染料的辅助，就可以在细胞中成功监测。对照组在紫外照射下无荧光。该结果表明，蓝色荧光是来自TPE-TMX，而不是细胞的自发荧光。
为了进一步证实TPE-TMX的亚细胞分布，LTR也被用于与TPE-TMX共染MCF-7细胞。MCF-7细胞首先用2μM TPE-TMX孵育30分钟，然后用LTR孵育15分钟。TPE-TMX的蓝色荧光与LTR的红色荧光共定位，表明TPE-TMX选择性地染色活细胞的溶酶体。这些图像的Pearson相关系数显示LTR和TPE-TMX在细胞中具有很好的共定位(r＝0.96)。如预期的那样，TPE-TMX是一种特异性荧光染料，用于可视化溶酶体细胞器结构以及监测药物释放。
抗肿瘤特异性
对于TPE-TMX合理的分子设计，对TMX修饰后可以保持其治疗效果是至关重要的。为了研究其治疗效果，利用MTT方法来评估TPE-TMX对各种细胞系的细胞毒性(图33)。结果表明，与TMX相似，TPE-TMX仅对ER+乳腺癌细胞(MCF-7细胞)具有治疗效果，对于其他细胞，甚至ER非依赖型乳腺癌细胞(MDA-MB-231细胞)，TPE-TMX浓度达到10μM时仍对其存活率无明显影响。因此，TPE-TMX可能与受体形成复合物，因而可以在MCF-7细胞中选择性积累从而导致细胞死亡。
为了验证这个假设，将不同细胞系用TPE-TMX处理然后用荧光显微镜进行观察。可以注意到，对于所有测试的细胞系，TPE-TMX都定位在其溶酶体上。溶酶体是负责消化细胞内生物分子的一个酸性酶富集的细胞器，因而具有碱性氨基基团的TPE-TMX更有利于靶向细胞的溶酶体。一旦分子在溶酶体的表面积累，它们的分子间运动就会受限，这将激活AIE过程，从而将细胞器点亮。然而，与其他细胞相比，MCF-7细胞中TPE-TMX的荧光更强。而且，数据表明，TPE-TMX会诱导MCF-7细胞形成液泡，溶酶体肿胀从而使细胞死亡，而在其他细胞系中没有观察到明显的形态变化。
光稳定性
为了确定TPE-TMX对MCF-7细胞的作用机制，高度需求能够实现长期追踪的探针。为了比较TPE-TMX和LTR对光漂白的抵抗能力，对染色的MCF-7细胞进行连续UV照射扫描，并记录每次扫描时的PL强度。首先将这两组MCF-7细胞在培养基中孵育24小时，然后分别用2μM TPE-TMX和LTR染色30分钟。显微镜405nm和561nm通道的激发功率统一为0.1mW。将染料的初始荧光强度归一化，计算强度损失的百分比。如图34所示，在3分钟的总照射时间内进行50次扫描后，在TPE-TMX中没有观察到明显的PL损失，而LTR表现出大于55％的信号损失。这个结果表明，TPE-TMX表现出比LTR高得多的光漂白抵抗能力。
长期追踪
在用LTR对溶酶体成像的情况下，染色细胞的荧光随着扫描时间的增加急剧减弱。然而，TPE-TMX不同于其对应物，用TPE-TMX染色的细胞的荧光强度随着扫描时间的增加而增强，这是由于形成了带有AIE活性聚集体的自噬体。连续监测用TPE-TMX(2μM)处理的MCF-7细胞，可以发现空泡被诱导形成，溶酶体肿胀以及细胞群丢失。在用TPE-TMX处理192小时后，除了细胞核，整个细胞都发射强的荧光，这被认为是自噬现象。这种机制被认为是由称为自噬体的独特细胞器介导的降解系统，然后与溶酶体融合形成自噬溶酶体。一旦形成自噬溶酶体，细胞就会功能失调，最终导致细胞死亡。值得注意的是，该发现所提出的机制与TMX普遍接受的机制相矛盾，对于TMX，其被认为TMX-受体复合物可以进入细胞核表现抗肿瘤活性。这是第一次使用乳腺癌细胞的治疗诊断药物实现对自噬过程的荧光监测。
实施例7
表征：在Perkin Elmer LS 55光谱仪上记录稳态荧光光谱。在Olympus BX 41荧光显微镜上收集荧光图像。
细胞培养。在37℃的5％CO2湿度培养箱中，将HeLa细胞培养在含有10％FBS和1％抗生素(100单位/mL青霉素和100μg/mL链霉素)的MEM中。细胞成像。在37℃的5％CO2湿度培养箱中，将肺癌细胞A549在含有10％FBS和抗生素(100单位/mL青霉素和100μg/mL链霉素)的DMEM中培养。将两种不同类型的细胞在具有盖玻片的35mm培养皿上培养生长过夜。将活细胞与10μM TTE孵育15/30分钟，TFE孵育30分钟，fl-TFE孵育30分钟和5小时(最后两次仅在HeLa细胞中测试)。在典型的实验中，将2μL的10mM TTE在DMSO中的储备溶液用细胞培养基稀释至1mL，随后进一步稀释至所需浓度。使用相同的激发和发射滤光片在荧光显微镜(BX41显微镜)下观测成像细胞：激发滤光片＝330-385nm，二向色镜＝420nm，发射滤光片＝400nm长通。
对四噻吩乙烯TTE和四氟乙烯TFE，fl-TTE和fl-TFE中的发光特征的AIE研究。
TTE
AIE和聚集诱导发光性质：TTE显示了如图35A-B所示的典型的AIE特征。TTE的THF溶液是不发光的，而在99％水分(1％THF)的聚集状态下通过UV(410nm)激发下发射荧光。如图36和表1所示：
表1：被研究分子的光致细胞数据：TTE，sl-TTE和fl-TTE；TPE的光致细胞数据表示为基准
发光在晶体状态下红移。这是由于在发生S-S相互作用的晶体状态下达到其最大值的聚集诱导发光效应。
TFE
AIE和聚集诱导发光性质：像TTE一样，TFE是一种AIEgen。它表示出了如图42A-B所示的典型的AIE特征。TFE的THF溶液是不会发光的，而在99％水分下形成的聚集状态在UV激发下在489nm发射荧光，如表2所示：
表2：TPE、TFE和fl-TFE的光学性能总结
发光在晶体状态下红移。这是由于在发生O-O相互作用的晶体状态下达到其最大值的聚集诱导发光效应.
fl-TTE
fl-TTE显示了如图38A-B所示的典型ACQ特征。fl-TTE的THF溶液在溶液中强烈发射，其中发射波长为381nm。随着水分的增加，发射状态被淬灭，但是在365nm波长照射下拍摄粉末中的fl-TTE，可以发现发光。为了解释这种现象，需要进行晶体分析。由于该分子即使是TTE的锁定形式，仍然拥有硫原子，所以可能涉及S到S的相互作用.
fl-TFE
fl-TFE表现出了典型的ACQ特征，如图44A-B所示。fl-TFE的THF溶液在溶液中强烈发光(图44A-B)，其中发射发生在361nm。ACQ行为可在该波长下记录，但是随着水分的增加，发射红移，在99％fw水溶液状态，在524nm处可以捕获绿色峰。fl-TFE即使在粉末状态下也显示绿色发射，PL值约为465nm，如表3所示：
表3：TPE，TFE和fl-TFE的光学性能总结
由于fl-TFE具有O作为杂原子，其聚集和固态的发射能力可归因于聚集诱导发光效应。此外，由于在聚集状态下，fl-TFE颜色为绿色，所以波长有红移。
slETE的AIE和光致变色性质：sl-TTE显示了ACQ和AIE的行为，如图37A-B和表4所示：
表4：TTE和TPE的晶体数据
它还显示固态光致变色行为，通过紫外灯照射粉末后颜色发生变化，在30秒它的颜色从白色变成粉红色。该过程是可逆的，因为在用可见光照射粉红色粉末后，颜色又变成了白色。
通过使用TTE对Hela细胞进行癌细胞成像：将HeLa细胞在具有盖玻片的35mm培养皿上培养生长过夜。活细胞与10μM TTE孵育30分钟，如图17A-B所示。将HeLa细胞与50μM油酸孵育6小时，然后通过10μM TTE和1μg/mL共染色15分钟。TTE和BODIPY的图像之间的良好重叠表明TTE可以选择性地靶向脂滴。
通过使用TTE对肺癌细胞A549进行癌细胞成像:
A549细胞在具有盖玻片的35mm培养皿上培养生长过夜。将活细胞与10μM TTE孵育30分钟。将A549细胞与10μM TTE和1μg/mL孵育15分钟。TTE和BODIPY的图像之间的良好重叠表明TTE可以选择性地靶向脂滴。
4,5-双(噻吩-2-基)噻吩并[3,2-e]苯并[b]噻吩(sl-TTE)和四噻吩并[2,3-a:3',2'-c:2”,3”–f:3”’,2”’-h]-萘(fl-TTE)的合成
在光化学反应的典型运行中，将80mg(0.217mmol，1当量)四(2-噻吩基)乙烷(TTE)溶于200mL甲苯(溶液颜色为黄色)中，在N2气氛下将溶液脱气30分钟。此后，向该溶液中加入116mg(0.457mmol，2当量)的I2(其颜色从黄色变为红色)，再次进行30分钟的脱气。然后在反应混合物中加入50mL(714mmol，d＝0.83g/mL-1)的2-甲基环氧乙烷(环氧丙烷)，并将溶液脱气30分钟以上。在N2流下将所得混合物用放置在浸入石英井中的500W高压Hg蒸气灯的紫外光照射。
通过TLC监测反应(洗脱液：己烷/DCM＝8/2)，并将其进行至起始物质被耗尽并出现最终产物。总反应时间为20分钟。由于反应产物在反应溶剂中不溶解，因此反应产物在光解期间沉淀。将粗品用DCM和乙醇洗涤以除去可溶于该介质中的副产物醇(1-羟基-2-碘-2-甲基乙烷)(其与反应产物不同，反应产物不溶于DCM和EtOH中)。通过用己烷洗涤残留的粗品，可以分离中间产物(4,5-双(噻吩-2-基)噻吩并[3,2-e]苯并[b]噻吩(sl-TTE)。再通过对存留的粗品进行一次重结晶，从正二甲苯中获得最终所需产物四噻吩[2,3-a:3',2'-c:2”,3”-f:3”,2”-h]-萘(fl-TTE)(50mg，64％收率)，其为粉红色微晶粉末。
(fl-TTE).1H-NMR(400MHz,CS2+丙酮d6):δ,ppm＝8.09(d,1H,J＝4.8Hz),7.94(d,1H,J＝5.2Hz),UV/Vis(THF),λ/nm:338；ε,M-1cm-1:18.6E4；光能隙:3.67eV；MS:352.96[M+]；HPLC(反相，分析柱SB-C18，洗脱液:ACN:H2O＝9:1)保留时间:7.12’。质谱(MALDI)读取fl-TTE的精确质量为352.9580。
(sl-TTE).1H-NMR(400MHz,CS2+丙酮d6):δ,ppm＝7.99(d,1H,J＝4.8Hz),7.86(d,1H,J＝4.8Hz),7.54(d,1H,J＝4.8Hz),7.25(bs,1H),7.11(bs,1H),UV/Vis(THF),λ/nm:320；ε,M-1cm-1:7.73E3；光能隙:3.88eV；MS:353.97[M+]；HPLC(反相，分析柱SB-C18，洗脱液:ACN:H2O 9:1)保留时间:3.94分钟。质谱(MALDI)读取sl-TTE的精确质量为353.9685。
四(2-呋喃基)乙烯，TFE的合成
在配有氮气入口、温度计和冷凝器的四颈烧瓶(100mL)中加入脱气的干燥THF(17mL)。然后将溶剂冷却至-10℃，在惰性气氛下加入TiCl4(0.31mL，2.8mmol)。升温至-7℃，反应混合物变黄。然后分两次加入锌(0.42g，6.0mmol)，升温至-5℃。将反应混合物在-7℃/-9℃之间搅拌30分钟。在Ti(0)的形成结束时，反应混合物看起来像绿色悬浮液。将二-2-呋喃酮(0.43g，2.7mmol)溶解在3mL无水THF中，将该溶液滴加到在0℃的反应混合物中。然后使反应在1.5小时内达到室温，搅拌过夜。
通过TLC(正己烷/AcOEt：8/2)监测反应，直到酮完全消耗。然后将反应混合物倒入20mL Et2O中，用饱和NaHCO3溶液处理直到微碱性。将该混合物搅拌10分钟，然后通过硅藻土垫过滤。从水相中分离有机层(橙色)。水相用DCM(二氯甲烷)反复萃取，DCM似乎是比Et2O更好的溶剂。将有机相收集在一起并用Na2SO4干燥。滤出硫酸钠，蒸除溶剂，得到300mg粗品。粗产物通过柱色谱(己烷/DCM：1/1)纯化，得到191mg所需产物(49％产率)
熔点＝163-164℃,1H-NMR(300MHz,CDCl3):δ,ppm＝7.35(d,1H,J＝1.6Hz),6.44(dd,1H,J＝3.36Hz,J＝1.6Hz),6.30(d,1H,J＝3.33Hz),13C-NMR(75MHz,CDCl3):δ,ppm＝152.96(Cq),142.65(Cp),112.24(Cp),111.39(Cp)。注意：在N2气氛中将产品储存在黑暗中是非常重要的，否则产品会变暗；在这种情况下，通过使用己烷：DCM＝8：2作为洗脱剂在硅胶垫上过滤就足够了。
四氟呋喃[2,3-a:3’,2’-c:2”,3”-f:3”’,2”’-h]-萘(fl-TFE)的合成
在光化学反应的典型反应中，将110mg(0.38mmol，1当量)四(2-呋喃基)乙烯(TFE)溶于200mL甲苯(溶液颜色：黄色)中，在N2气氛下脱气30分。此后，向溶液中加入193mg(0.76mmol，2当量)的I2(溶液颜色从黄色变为红色)，再次对其进行30分钟脱气。然后在反应混合物中加入40mL(572mmol，d＝0.83g mL-1)的2-甲基环氧乙烷(环氧丙烷)，并将溶液脱气30分钟以上。在N2流中将所得混合物用放置在浸入石英井中的500W高压Hg蒸气灯的紫外光照射。
通过TLC监测反应(洗脱液：己烷/DCM＝8/2)，并将其进行反应直至消耗完原料并出现最终产物。总反应时间为45分钟。将粗品用饱和的偏亚硫酸氢钠水溶液洗涤，并用DCM萃取。将粗品用乙醇洗涤以除去该反应的副产物醇(1-羟基-2-碘-2-甲基乙烷)。残余粗品用正二甲苯重结晶一次，得到最终所需产物四氟呋喃[2,3-a:3’,2’-c:2”,3”-f:3”’,2”’-h]-萘(fl-TFE)(产率)，其为黄色微晶粉末。
(fl-TFE).1H-NMR(400MHz,THF d8):δ,ppm＝8.09(d,1H,J＝2.0Hz),7.32(d,1H,J＝2.0Hz),13C-NMR(400MHz,THF d8):δ,ppm＝106,118,146；UV/Vis(THF),λ/nm:338；光能隙:3.67eV；MS:288.04[M+]；HPLC(反相，分析柱SB-C18，洗脱液：ACN:H2O 7:3)保留时间:5.40’.质谱(MALDI)读取fl-TFE的精确质量为288.0429(预测的288.04226)。
实施例8
IDA-TPE的合成表征：稳态荧光光谱由Perkin Elmer LS 55光谱仪测量。荧光图像由Olympus BX 41荧光显微镜收集。
细胞培育。在37℃的5％CO2湿度培养箱中，HeLa细胞在含10％FBS和1％抗生素(100单位/mL盘尼西林和100g/mL链霉素)的MEM溶液中培育。
使用IDA-TPE对HeLa细胞的癌细胞成像:
HeLa细胞在带盖的35mm培养皿中培养过夜。这些活细胞用10μM的IDA-TPE培育30分钟，如图45所示。明亮的荧光表明IDA-TPE能定位HeLa细胞。在荧光显微镜(BX41Microscope)下，使用相同的激发和发射滤光片：激发滤光片＝330-385nm，二向色镜＝420nm，发射滤光片＝400nm长通，从而对细胞进行成像。
IDA-TPE的合成如下所示:
在氮气保护下的双颈瓶中，化合物1(200mg,0.47mmol,1.0eq.)和化合物2(0.56mmol,1.2eq)在DMF/TEA混合溶剂中反应过夜。然后移除DMF/TEA，并使用DCM洗涤存留产物，从而除去起始材料(化合物1)。得到白色固体粉末化合物3，产率75％。通过在酸性条件下使用CrO3并使用丙酮作为反应溶剂来进行琼斯氧化，从而将化合物3进一步氧化，经过4小时，反应原料基本消耗完。停止反应，通过使用水(最终产物不溶解于水中)使终产物从残余起始原料中分离出来。收集到的终产物的产率为90％。由于较强的氧化条件，终产物的纯度不是很高。尽管如此，终产物仍可以用来验证其在癌细胞成像中的可行性。如图45所示，IDA-TPE能够进入癌细胞，成像显示了癌细胞中细胞器被染色。例如，IDA-TPE能选择性染色线粒体等细胞器。
如果需要的话，IDA-TPE能在以下条件下用HPLC进一步纯化：反相柱XDBC18,乙腈/水＝60/40。
表征：1H-NMR主峰在丙酮中d6δ(ppm):7.16,7.32,7.46(m,9H),4.8(s,1H)；MALDI-TOF，447.1362[M2-].
通过本文中包含的信息，所存在的对于当前主题现有的精确描述的多方面定义的偏离，对于本发明主题所属领域的技术人员而言是显而易见的，这些描述上的偏移并没有偏离后附权利要求中所限定的范围。尽管所选择的实例和其他描述都仅仅是为了阐述当前提供的这个主题的特定的方面，但不代表将此主题的范围局限于当前的程序、特性或者是已定义的成分。诚然，关于对用以实施本发明主题的所描述的实施方式的各种修改，对于化学、生物化学或者相关领域的技术人员显而易见的修改均在随附权利要求的范围内。

Claims (35)

1.一种用于癌细胞成像和染色的探针，其包含AIE发光体，该AIE发光体具有选自以下结构所构成的组中的化学结构：
其中所述抗衡阴离子X-选自单一电荷或多电荷的阴离子；并且
其中每个R独立地选自由烷基、不饱和烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基构成的组。
2.权利要求1所述的探针，其中所述AIE发光体可选自由以下结构构成的组：
3.权利要求1所述的探针，其中所述探针表现出了对线粒体的选择性染色。
4.权利要求1所述的探针，其中所述探针具有双光子吸收能力，并且可被较长波长激发。
5.权利要求1所述的探针，因为所述AIE发光体与线粒体间具有静电相互作用，因此所述探针被用于线粒体成像。
6.权利要求1所述的探针，其中成像是由于被细胞摄取并被积累在线粒体中的探针发射的荧光。
7.权利要求1所述的探针，其中所述探针被用于包含任何种类的细胞的成像样品。
8.权利要求7所述的探针，其中所述成像样品包含任何癌细胞。
9.权利要求1所述的探针，其中所述探针能够通过荧光强度的差异从而将正常细胞与癌细胞区分开，其中所述癌细胞和所述正常细胞分开染色或混合进行染色。
10.权利要求9所述的探针，由于所述癌细胞摄取并累积更多的探针，因此所述癌细胞具有较高的荧光强度，而所述正常细胞具有较低的荧光强度。
11.权利要求1所述的探针，其中所述探针在光的照射下可以产生ROS。
12.一种使细胞成像的方法，包括：
将权利要求1所述的探针引入到含有细胞的样品中，其中所述AIE发光体与线粒体间具有静电相互作用；以及
通过监测由所述细胞摄取的生物探针发出的荧光来进行成像。
13.一种用于溶酶体成像的AIEgen，包含：
吗啉官能化的AIE衍生物，其具有选自以下结构所构成的组中的骨架结构：
其中R、R’、R”和R”’中的至少一个为并且
其中R、R’、R”和R”’独立地选自以下结构所构成的组中：
14.一种溶酶体成像和自噬过程可视化的方法，包括：
将权利要求12所述的AIEgen引入样品中；以及
观察所述AIEgen的荧光从而对溶酶体进行成像并将自噬过程可视化，其中所述AIEgen的荧光是所述AIEgen通过质子化而改变透过性从而进入并积累在溶酶体中而被激发的。
15.权利要求13所述的方法，其中所述溶酶体是活哺乳动物细胞的溶酶体。
16.权利要求13的方法，其中所述AIEgen与活的哺乳动物细胞一起孵育。
17.权利要求15所述的方法，其中通过荧光显微镜或共聚焦显微镜中的至少一种将与活的哺乳动物细胞一起孵育的所述AIEgen的荧光图像可视化。
18.一种用于溶酶体成像的AIEgen，包含：
吗啉官能化的AIE衍生物，其化学结构为：
19.一种荧光生物探针，其用于抗肿瘤活性的治疗和成像，该荧光生物探针包含：
包含氨基官能团并具有选自以下化学结构所构成的组中的化学结构的AIE荧光团：
其中R1、R2和R3独立地选自由H、烷基、不饱和烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基构成的组。
20.权利要求18所述的荧光生物探针，其中所述生物探针用于治疗特定乳腺癌并对其抗肿瘤活性进行成像。
21.权利要求18所述的荧光生物探针，其中用于成像的荧光来自摄取了AIE荧光团的细胞中的溶酶体。
22.权利要求20所述的荧光生物探针，其中所述细胞选自任何种类的细胞。
23.权利要求20所述的荧光生物探针，其中所述荧光生物探针对乳腺癌细胞有治疗作用。
24.一种治疗肿瘤并对抗肿瘤活性进行成像的方法，包括：
将权利要求18所述的生物探针引入含有细胞的样品；以及
通过荧光显微镜或共聚焦激光扫描显微镜检测细胞成像，其中荧光发射自被细胞摄取的生物探针。
25.权利要求23所述的方法，其中所述样品包含选自由HeLa、MCF-7、Cos 7和MDA-MB-231构成的组中的癌细胞。
26.权利要求23所述的方法，其中所述样品包含活细胞，并且使用荧光显微镜或共聚焦激光扫描显微镜来跟踪所述活细胞。
27.一种用于癌细胞成像和染色的探针，其包含AIE发光体，该AIE发光体具有选自以下结构所构成的组中的化学骨架结构：
其中所述AIE发光体是团簇发光体；并且
其中所述AIE发光体可用作癌细胞成像的染料。
28.一种发光体，其化学结构选自由以下化学结构构成的组：
29.权利要求27所述的发光体，其中所述发光体是非常规的ACQ发光体，其在粉末状态下发射荧光。
30.权利要求28所述的发光体，其中fl-TTE是非常规ACQ发光体。
31.权利要求29所述的发光体，其中从纯THF溶液到含有1体积％THF和99体积％水的溶液中的聚集状态，fl-TTE的发射波长有红移。
32.权利要求27所述的发光体，其中sl-TTE具有AIE和ACQ性质。
33.权利要求31所述的发光体，其中sl-TTE显示出固态光致变色能力。
34.一种用于癌细胞成像和染色的探针，其包含具有以下化学结构的AIE发光体：
其中该AIE发光体被癌细胞摄取，并且图像显示所述癌细胞内的细胞器被染色。
35.权利要求33所述的探针，其中被染色的所述细胞器是线粒体。
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