CN108138043A - 红色荧光AIEgen - Google Patents
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Abstract
本主题涉及红色荧光AIEgen的合成和应用。本主题涉及线粒体靶向的AIEgen,其提高肺癌的放射敏感性。本发明中的AIEgen也可以靶向细胞膜、脂滴、或溶酶体、以及作为放疗中的放射增敏剂。本主题还涉及利用AIEgen的双光子成像。
Description
相关申请
本专利申请要求于2015年11月10号提交的美国临时专利申请号62/285,826和2016年7月13号提交的国际专利申请号PCT/CN2016/089911的优先权,其均其由其发明人提交并通过引用全文并入本文。
技术领域
本主题涉及红色荧光AIEgen的合成和应用。本主题涉及线粒体靶向的AIEgen,其提高肺癌的放射敏感性。本发明的AIEgen也可以靶向细胞膜、脂滴、或溶酶体、以及作为放疗的放射增敏剂。本主题还涉及利用AIEgen的双光子成像。
背景
荧光染料已广泛用于现代生物学研究,并促进了荧光显微镜的发展。荧光成像是一种能够穿透组织并观察单个细胞的有力工具,并且迄今为止,在基因表达、蛋白质功能、蛋白质-蛋白质相互作用、以及许多其他细胞过程的进展和无创性研究中发挥重要作用。
此外,荧光成像已被证实是研究聚合物共混物微观结构的有力工具。具体而言,远红外到近红外(FR/NIR)荧光染料对体内成像是有利的,因为可以最小化光吸收和本体自发荧光的影响。由于更长的荧光波长,可以实现更高程度的组织穿透。出于同样的原因,利用FR/NIR荧光染料对聚合物共混物的微观结构的成像,不仅可以了解其表面模式,还可以洞悉更深层的信息。
关于荧光发色团的分子设计,聚集导致猝灭(ACQ)效应总是引起光漂白和聚集时荧光强度的衰减,从而导致对细胞器的长时间监测的限制以及较低的性能。
2001年,发现了具有聚集诱导发光(AIE)性质的分子。由于分子内运动受限(RIM),AIE活性分子在聚集和/或晶体状态下是高度自发光的,从而允许在如OLED和生物探针等各领域中应用。AIE活性分子已成功用作生物探针,证实其具有高光稳定性和高生物相容性。
概述
在一实施方案中,本主题涉及制备用于生物学应用的具有聚集诱导发光性质的红色荧光AIEgen的方法,其包括将选自叔氨基、烷氧基和咪唑基的供体与选自氰基、吡啶盐和吲哚盐的受体组合。
在一实施方案中,本主题涉及制备AIEgen的方法,其包括构建供体-受体AIE衍生物化合物,其中供体-受体AIE衍生物包含选自以下的通式的骨架结构:
其中,R、R’、R”和R”’独立地选自:
H、
并且
其中,n为0至20的整数。
在一实施方案中,本主题涉及用作染料的包含供体-受体AIE衍生物化合物的AIEgen,其中供体-受体AIE衍生物包含选自以下的通式的骨架结构:
其中,R、R’、R”和R”’独立地选自:
H、 并且
其中,n为0至20的整数。
在一实施方案中,本主题涉及具有以下结构的AIEgen:
在一实施方案中,本主题涉及具有以下结构的AIEgen:
附图概述
图1显示了ASCP在不同溶剂中的(A)吸收光谱和(B)PL光谱。浓度:10μM;λex=460nm。
图2显示了(A)ASCP在具有不同甲苯分数(ft)的甲苯/DMSO混合物中的PL光谱。(B)ASCP在650nm处的相对发光强度(I/I0)相比其甲苯/DMSO混合物的组成的图谱。I0=ASCP在纯DMSO溶液中的发光强度。浓度:10mM;λex=460nm。
图3显示了在存在不同浓度的ASCP 8小时的情况下,HeLa细胞的活力。数据表示为五次单独的实验的平均值。
图4显示了用ASCP(5μM)染色30分钟的HeLa细胞的(A和B)荧光图像和(C)明场图像,其中分别聚焦在线粒体(A)和细胞核(B)。λex=460-490nm;比例尺=30μm。(D和E)用(D)ASCP(5μM)和(E)MitoTracker Green(MTG;200nM)染色的HeLa细胞的共聚焦图像。(F)表示(D)和(E)的合并图像。条件:对于ASCP,λex=405nm且λem=600-700nm;对于MTG,λex=488nm且λem=500-540nm;比例尺=20μm。
图5显示了在具有1%DMSO的HEPES(pH 7.4)缓冲溶液中,与不同磷脂囊泡(22μM)、DNA(100μg/mL)和RNA(100μg/mL)混合的ASCP的(A)吸收光谱和(B)PL光谱。浓度:10μM;λex=460nm。
图6显示了用ASCP(5μM)染色30分钟的HeLa细胞的6(A和B)共聚焦图像和(C)明场图像。条件:(A)λex=405nm;λem=500-650nm;(B)λex=560nm;λem=650-750nm。
图7显示了在用或未用核糖核酸酶或脱氧核糖核酸酶进行处理的情况下,用(A-C)ASCP(10μM)染色2小时和用(D-F)SYTO RNASelect(5μM)染色2小时的HeLa细胞的荧光图像。
图8显示了在连续激发下采集的用(A和C)ASCP和(B和D)SYTO RNASelect染色的HeLa细胞的共聚焦图像。(E)不同扫描次数的ASCP(黑色)和SYTO RNASelect(红色)的荧光发光的信号(%)。条件:对于ASCP,λex=560nm且λem=650-750nm;对于SYTO RNASelect,λex=488nm,λem=500-600nm。
图9显示了ASCP-2P在DMSO溶液中的吸收光谱。
图10显示了(A)ASCP-2P在具有不同甲苯分数(ft)的甲苯/DMSO混合物中的PL光谱和(B)ASCP-2P在640nm处的相对发光强度(I/I0)相比其甲苯/DMSO混合物的组成的图谱。I0=ASCP-2P在纯DMSO溶液中的发光强度。浓度:10μM;λex=460nm。
图11显示了在PBS溶液中在有和无脂质囊泡(22μM)的情况下,ASCP-2P(10μM)的PL光谱。λex=460nm。
图12显示了(A)在不同白光照射下ASCP-2P(10μM)与H2DCFDA(5μM)在PBS溶液中的PL图谱,和(B)含有不同AIEgen(10μM)和H2DCFDA(5μM)的PBS溶液在534nm处的荧光强度,随不同白光照射时间的变化。λex=495nm。
图13显示了在不同白光照射下在PBS溶液中,(A)H2DCFDA(5μM)与不同AIEgen(10μM)(B:ASCP;C:TPE-PY;和D:TPE-IQ)的PL光谱。λex=495nm。
图14显示了用ASCP-2P(5μM)和MitoTracker Deep Red(MTDR,50nM)共染的A549癌细胞的(A和B)共聚焦图像和(C)用明场的合并的图像。共聚焦图像显示了通过使用H2DCFDA作为ROS指示剂的接受不同处理的A549癌细胞的细胞内ROS水平。(D)探针+,光-;(E)探针+,光+;(F)探针+,光+,NAC+。条件:(A)ASCP-2P:λex=488nm,λem=620-640nm;(B)MTDR:λex=633nm,λem=655-675nm;(D-F)H2DCFDA:λex=488nm,λem=510-530nm。
图15显示了在黑暗中与ASCP-2P一起孵育的A549细胞的细胞活力(黑色),用白光照射预处理1分钟然后在黑暗中与ASCP-2P一起孵育的A549细胞的细胞活力(红色),以及用白光照射1分钟然后在黑暗中与ASCP-2P和NAC一起孵育的A549细胞的细胞活力(蓝色)。
图16显示了(A)不同处理时的克隆形成和(B)(A)的克隆形成测定的定量数据。**表示P<0.01。
图17显示了(A)用不同的常用的放射增敏剂处理后的克隆形成和(B)(A)的克隆形成测定的定量数据。**表示P<0.01。
图18显示了在所指示的不同处理下,来自A549细胞的(A)p-ERK、ERK、p-Akt和Akt;(B)Bcl-XL、Bcl-2、BAD和半胱天冬酶-3和(D)p-ERK、p-Akt、Bcl-2、Bax和BAD的Western印迹分析。(C)显示了这样的途径的示意图,其指示ASCP-2P如何作为有效的针对照射的放射增敏剂。
图19显示了3”在THF溶液中的吸收光谱。
图20显示了5”在THF溶液中的吸收光谱。
图21显示了(A)3”在具有不同水分数(fw)的THF/水混合物中的PL光谱和(B)相对PL光谱对比fw的图谱。I0是THF中的染料在580nm处的PL强度;染料浓度:10μM;激发波长:410nm。
图22显示了(A)5”在具有不同水分数(fw)的THF/水混合物中的PL光谱和(B)相对PL强度对比fw的图谱。I0是THF中的染料在680nm处的PL强度;染料浓度:10μM;激发波长:525nm。
图23显示了用3”(5μM)和Lyso-tracker red共染色15分钟的HeLa细胞的荧光图像。(A)Lyso-tracker red:Ex.:520-560nm;(B)16:Ex.:400-440nm;(C和D)无日光下的合并图像和日光图像。
图24显示了用3”(5μM)染色15分钟,并用442nm和840nm激发的HeLa细胞的共聚焦图像。Em:500-580nm。
图25显示了用5”(5μM)染色30分钟,并用512nm和1000nm激发的HeLa细胞的共聚焦图像。Em:520-630nm。
图26显示了共聚焦图像中的PL光谱。○:表示脂滴中的PL信号;△:脂滴外的PL信号。
详细描述
定义
提供以下定义是为了理解本发明和构建所附的专利权利要求书的目的。
需注意的是,如本说明书和所附的权利要求书中所使用的,除非上下文另外明确指出,否则单数形式“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”和“所述(the)”包括复数形式。
“聚集诱导发光”是指聚集形成时或在固态时开启荧光/磷光。当分子溶解时,材料是不发光的。然而,当分子内旋转受到限制时,开启发光。
“发光强度”是指通常从荧光光谱仪或荧光显微镜测量获得的荧光/磷光大小。
“荧光团”是指展示荧光的分子。
“发光团(luminogen)”是指展现出发光性质的分子。
“AIEgen”是指展现出AIE特征的分子。
除非另外定义,否则本文使用的所有技术和科学术语具有与目前描述的主题所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。
如果提供了数值范围(例如浓度范围,百分比范围或比例范围),除非上下文另外明确指出,否则应理解,在该范围的上限和下限之间的每个中间值至该下限单位的十分之一以及在该所述范围内的任何其他所述的值或中间值都涵盖在所描述的主题内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在较小范围内,并且这样的实施方案也涵盖在所描述的主题内,服从在所述范围内的任何明确排除的限制。如果所述范围包括一个或两个界限,所述主题中也包括排除那些所包括的界限中的任一个或两个的范围。
在整个申请中,各实施方案的描述使用语言“包括/包含(comprising)”;然而,本领域技术人员可以理解,在一些特定情况下,可以使用语言“基本由.....组成”或者“由.....组成”来可选地对实施方案进行描述。
为了更好地理解本教导,并且不限制本教导的范围的目的,除非另有指示,否则在说明书和权利要求书中使用的所有表示数量,百分比或比例的数字以及其他数值在所有情况下均被理解为由术语“约”修饰。因此,除非有相反指示,否则在下面的说明书和所附权利要求书中列出的数字参数是近似值,其可以根据试图获得的期望性质而变化。至少,每个数字参数至少应该根据所报告的有效数字的数量和通过应用普通舍入技术来解释。
缩写
ACQ 聚集导致淬灭
AEE 聚集增强发光
AIE 聚集诱导发光
ASCP (Z)-4-(4-(1-氰基-2-(4-(二甲基氨基)苯基)乙烯基)苯基)-1-甲基吡啶-1-鎓六氟磷酸盐(V)
ASCP-2P (Z)-4-(4-(1-氰基-2-(4-(二苯基氨基)苯基)乙烯基)苯基)-1-甲基吡啶-1-鎓六氟磷酸盐(V)
DCM 二氯甲烷
DMSO 二甲基亚砜
DNA 脱氧核糖核酸
DNase 脱氧核糖核酸酶
FR/NIR 远红外到近红外
GNP 金纳米颗粒
H2DCFDA 2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯
HEPES 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸
HRMS 高分辨率质谱
MALDI-TOF 基质辅助激光解吸电离飞行时间
MEM 最低基本介质
MTDR MitoTracker Deep Red
MTG MitoTracker Green
MTT 3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基四唑鎓溴化物
NAC N-乙酰半胱氨酸
NMR 核磁共振
OLED 有机发光二极管
PBS 磷酸盐缓冲盐水
PDT 光动力疗法
PL 光致发光
RNA 核糖核酸
RNase 核糖核酸酶
ROS 活性氧
RIM 分子内运动受限
THF 四氢呋喃
TICT 扭曲的分子内电荷转移
XTT 2,3-双-(2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基)-2H-四唑-5-甲酰苯胺
本主题涉及用于制备红色荧光AIEgen的不同方法。例如,一种可行的方法基于设计的供体-受体结构。
设计了几组发红光的AIEgen,并通过对共混物中聚合物的选择性染色来证明它们的生物学应用。对于氰基取代的二苯基乙烯衍生物,将不同的供体并入分子骨架中并形成供体-受体体系,导致从黄色到红色的可调的发光。此外,将靶向部分连接至这些分子用于细胞器特异性成像。还探索了它们的生物学应用,包括线粒体特异性成像和放疗。
在一实施方案中,本主题涉及制备用于生物学应用的具有聚集诱导发光性质的红色荧光AIEgen的方法,其包括将选自叔氨基、烷氧基和咪唑基的供体与选自氰基、吡啶盐和吲哚盐的受体组合。因此,本发明的化合物,有时称为供体-受体化合物,其在本文的一个实施方案中具有供体-受体结构。
在一实施方案中,本主题的AIEgen的荧光信号为约600nm。
在一实施方案中,本主题涉及制备AIEgen的方法,其包括构建供体-受体AIE衍生物化合物,其中供体-受体AIE衍生物包含选自以下的通式的骨架结构:
其中R、R’、R”和R”’独立地选自:
H、
其中n是0-20的整数。
在一实施方案中,本主题的AIEgen显示红色荧光。
在一实施方案中,本主题的AIEgen用于肺癌细胞的荧光细胞成像。
在一实施方案中,本主题的供体-受体AIE衍生物可靶向选自线粒体、核仁、溶酶体、细胞膜和脂滴的特定细胞器。
在一实施方案中,本主题涉及用作染料的包含供体-受体AIE衍生物的AIEgen,其中供体-受体衍生物包括选自以下的通式的骨架结构
其中R、R’、R’和R”’独立地选自:
H、
其中n是0-20的整数。
在一实施方案中,本主题的AIEgen具有以下结构:
在一实施方案中,本主题的AIEgen是用于靶向线粒体和核仁的染料。
在一实施方案中,本主题的AIEgen具有以下结构:
在一实施方案中,本主题的AIEgen是用于靶向线粒体的染料。在一实施方案中,本主题的AIEgen可以是放疗中的放射增敏剂。
在一实施方案中,本主题涉及具有以下结构的AIEgen:
本主题的AIEgen是用于靶向溶酶体的染料。本主题的AIEgen可以用于双光子成像。
在一实施方案中,本主题涉及具有以下结构的AIEgen:
本主题的AIEgen是用于靶向脂滴的染料。本主题的AIEgen可以用于双光子成像。
线粒体靶向的ASCP增强肺癌细胞的放射敏感性
特异性的AIEgen ASCP是用于靶向线粒体和核仁的具有AIE特征的双色细胞器特异性探针。由于与线粒体膜和核酸的不同的相互作用,在荧光显微镜下观察来自线粒体和核仁的不同发光颜色。由于高亮度、良好的生物相容性和优异的光稳定性,AIEgen荧光探针ASCP是有前景的同时用于线粒体和核仁成像的候选物。
ASCP的合成
ASCP(化合物6)根据以下方案所示的合成路线来制备:
3的合成:将4-溴苯基乙腈(1;0.69g,3.50mmol)和4-(二甲基氨基)苯甲醛(2;0.81g,3.00mmol)溶于100mL圆底烧瓶的40mL乙醇中。然后将5mL乙醇中的氢氧化钠(0.14g,3.50mmol)缓慢地加入到上述混合物中。搅拌2小时后,过滤出淡黄色沉淀,用乙醇洗涤,并在减压下干燥。产率:80%。1HNMR(400MHz,CDCl3),δ(ppm):7.86(d,2H,J=8.4Hz),7.54–7.48(m,4H),7.38(s,1H),6.73(d,2H,J=8Hz),3.07(s,6H).HRMS(MALDI-TOF):m/z326.0217(M+,计算的326.0419)。
化合物5的合成:将3(0.10g,0.306mmol),4-吡啶基硼酸(4;45mg,0.387mmol),碳酸钾(0.422g,3.06mmol)和Pd(PPh3)4(10mg,0.01mmol)在氮气下,加入到配有冷凝器的100mL双颈圆底烧瓶的20mL THF和3mL水中,搅拌混合物并将其过夜加热回流。冷却至室温后,将混合物用二氯甲烷(DCM)萃取三次。收集有机相,用水洗涤,并在无水硫酸钠上干燥。溶剂蒸发后,利用DCM/乙酸乙酯(v/v=99:1)作为洗脱液,通过硅胶柱层析纯化粗产物,得到橙色固体产物。产率:74%。1H NMR(400MHz,CDCl3),δ(ppm):8.68(d,2H,J=4.4Hz),7.76-7.68(m,4H),7.55(d,2H,J=4.4Hz),7.26(s,1H),6.74(d,2H,J=8.4Hz),3.08(s,6H).13CNMR(100MHz,CDCl3),δ(ppm):150.7,149.4,149.3,144.6,142.4,137.4,137.5,131.2,130.9,129.2,127.0,126.8,125.4,120.9,120.9,120.7,111.0,110.6,106.0,39.4,39.3.HRMS(MALDI-TOF):m/z 325.1575(M+,计算的325.1579)。
化合物6的合成(ASCP):将5(50mg,0.154mmol)溶于配有冷凝器的100mL双颈圆底烧瓶的5mL乙腈中。然后加入碘甲烷(0.1mL),并将混合物加热回流8小时。冷却至室温后,将混合物倒入二乙醚中。通过抽滤过滤出所形成的深红色沉淀。将沉淀重新溶于丙酮中,并与饱和KPF6溶液(5mL)混合。搅拌1小时后,通过压缩空气使丙酮蒸发。再次过滤出深红色沉淀,用水洗涤,并在减压下干燥。产率:95%。1H NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):8.98(d,2H,J=6.8Hz),8.53(d,2H,J=6.8Hz),8.18(d,2H,J=8.4Hz),8.03(s,1H),7.93–7.40(m,4H),6.83(d,2H,J=8.8Hz),4.29(s,3H),3.03(s,6H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6),δ(ppm):153.0,152.0,145.3,144.4,138.3,132.0,131.6,128.5,125.6,123.5,120.3,118.9,111.4,100.3,46.8.HRMS(MALDI-TOF):m/z 340.1826(M+,计算的340.1814)。
光学性质
研究了ASCP的光学性质。由于Py盐的亲水性,ASCP可溶于极性溶剂,微溶于水,但不溶于非极性溶剂,如二氧六环和甲苯。无论使用何种类型的溶剂,ASCP均在约450nm处显示吸收带(如图1A)。与之相反的是,当在不同的溶剂中进行测量时,其显示出明显不同的发光颜色和强度(如图1B)。
ASCP在稀释的二氧六环溶液中发出强烈的橙光。由于扭曲的分子内电荷转移(TICT)效应,随着溶剂极性的增加,染料分子发光减弱并且红移。在稀释的DMSO溶液中,ASCP显示出微弱的红色荧光。相比之下,向其DMSO溶液中逐渐加入甲苯,由于溶剂的极性逐渐减小而增强了发光并使发光颜色变成橙色(如图2)。在高甲苯分数时,观察到更加快速的荧光增强,这是由于ASCP聚集体的形成以及AIE过程的活化。
细胞成像
ASCP在聚集状态下的强发光促使其作为线粒体成像的荧光显像剂。为了检查染料是否适合于生物成像,首先使用MTT测定评估ASCP对HeLa细胞的细胞毒性。如图3所示,在ASCP浓度高达10μM时细胞活力仍然很高,这表明ASCP具有良好的生物相容性。
首先,评估ASCP对活HeLa细胞中的特定细胞器进行染色的能力。将HeLa细胞在含有5μM ASCP的MEM中培养和孵育30分钟。用新鲜的PBS洗涤细胞,然后在荧光显微镜下对其进行观察。由于ASCP中Py单元的高特异性,线粒体的网状结构被染色成发强烈的橙光(图4A)。
为了进一步证实ASCP的特异性,商业线粒体成像剂MitoTracker Green(MTG)被用于对HeLa细胞进行共染色。在共聚焦显微镜下采集的细胞图像示出,来自ASCP的橙色荧光与MTG发出的绿光具有极好的相关性(96.4%)(图4D-F)。
有趣的是,通过改变焦点,在核仁中观察到了红色荧光(图4B)。因此,从线粒体和核仁观察到的两种不同的荧光似乎与ASCP和不同生物分子之间的特异性相互作用有关。
线粒体和核仁中最丰富的组分分别是磷脂和核酸(DNA和RNA)。为了检测,选择线粒体膜中存在的磷脂和核酸来模拟实际的细胞内环境。首先通过混合所需比例的磷脂来制造不同的脂质囊泡作为线粒体模型。然后记录在存在于HEPES中的脂质囊泡和核酸的情况下,ASCP的吸收和发光光谱。HEPES中的ASCP在435nm处表现出最大吸收,这表明用脂质囊泡处理时没有或极少有波长移动。另一方面,在核酸存在时,ASCP的最大吸收红移了20nm(图5A)。类似地,尽管当ASCP与核酸混合时观察到了最大发光的50nm的红移,但通过脂质囊泡没有观察到ASCP发光的变化(图5B)。这些结果与从图4A-B所示的荧光图像的观察结果相一致。
ASCP可以用于从线粒体和核仁中收集各自的荧光,而不会交叉污染。通过改变激发波长和滤光片可以收集染料标记的HeLa细胞的共聚焦图像。优化好条件之后,线粒体可以在405nm光激发下用橙色荧光单独显现(如图6A)。另一方面,在560nm的激发波长下仅观察到了核仁中的红色荧光(图6B)。
核仁中荧光的来源
嵌入和静电吸引是ASCP和核酸之间可能存在的相互作用。当ASCP进入核酸的空腔时,它可以采取更共面和共轭的构象,因此会显示出更红的发光。另一方面,核酸中核苷酸之间的氢键可以为ASCP提供相对极性的环境,使其在较长的波长区域发光。
为了更好地理解红色荧光的来源,将ASCP标记的细胞固定并用脱氧核糖核酸酶(DNase)和核糖核酸酶(RNase)处理之后,进行荧光成像实验。从图7所示的荧光图像中,当施加RNase时,ASCP对核仁的特异性消失(图7B)。然而,用DNase处理后,染料标记的细胞仍然是发光的(图7C)
通过使用SYTO RNASelect(一种针对于核仁的商业荧光探针)来进一步验证ASCP的性能。如图7E-F所示,SYTO RNASelect的作用类似于ASCP。由于RNA构成核仁中的主要成份,ASCP和SYTO RNASelect因强烈的静电吸引而趋向于积聚在核仁中。当用RNase处理染料标记的细胞时,用于嵌入的结合位点瓦解,并且染料分子不再与RNA片段结合。因此,富含RNA的核仁中的ASCP和SYTO RNASelect的荧光发光显著降低。
光稳定性
对于发现有前景应用在细胞器成像和追踪中的荧光探针,光稳定性是关键的参数。为了定量研究ASCP和SYTO RNASelect的光漂白抗性,进行通过激光照射对染料标记的细胞的连续扫描,并记录每次扫描的荧光信号。染料标记的细胞分别在560和488nm下以相同功率照射。如图8所示,在50次扫描后,观察到ASCP染色的细胞中有5%的荧光损失。相反,在第15次扫描后,用SYTO RNASelect染色的细胞几乎没有检测到荧光信号。该结果表明,相比于SYTO RNASelect,ASCP具有更高的光漂白抗性和光稳定性。
线粒体靶向的ASCP-2P增强肺癌细胞的放射敏感性
ASCP-2P是一种用强供体-受体结构设计和合成的发红光的AIEgen。ASCP-2P是AIE活性和线粒体靶向的,并且通过商业ROS传感器对其ROS生成能力进行研究和验证。ASCP-2P被用作光敏剂来增加放疗中肺癌细胞的放射敏感性,与紫杉醇和金纳米颗粒相比,获得超高的SER10值。通过Western印迹分析鉴定细胞凋亡的死亡途径。首次证实了这种光敏剂在放疗中显示出了高度的癌症治疗潜能。
ASCP-2P的合成
ASCP-2P(化合物4’)根据以下方案所示的合成路线来制备:
3’的合成:将1’(0.14g,0.31mmol),(4-羟基苯基)硼酸(2’;45mg,0.39mmol),碳酸钾(0.42g,3.06mmol)和Pd(PPh3)4(10mg,0.01mmol)在氮气下,加入到配有冷凝器的100mL双颈圆底烧瓶的20mL THF和3mL水中。在搅拌下过夜加热混合物回流。冷却至室温后,混合物用DCM萃取三次。收集有机相,用水洗涤,然后在无水硫酸钠上干燥。溶剂蒸发之后,利用DCM/乙酸乙酯(v/v=99:1)作为洗脱液,通过硅胶柱层析纯化粗产物,得到橙色固体产物。产率:72%。1H NMR(400MHz,CDCl3),δ(ppm):8.68(d,2H,J=4.4Hz),7.81-7.70(m,3H),7.66(d,2H,J=7.6Hz),7.58(d,2H,J=8.0Hz),7.52(d,2H,J=4.8Hz),7.33(t,4H,J=7.2Hz),7.26-7.14(m,2H),7.11-7.04(m,4H),6.83(d,2H,J=8.4Hz).13C NMR(100MHz,CDCl3),δ(ppm):149.6,146.8,145.8,143.7,141.6,137.3,135.3,130.6,130.2,129.1,129.0,128.9,127.0,126.9,125.7,125.1,125.0,123.9,123.8,120.9,120.8,120.0,119.6,105.9.HRMS(MALDI-TOF):m/z 449.1916(M+,计算的449.1892)。
ASCP-2P(化合物4’)的合成:将3’(50mg,0.082mmol)溶于配有冷凝器的50mL双颈圆底烧瓶的5mL乙腈中。然后加入碘甲烷(0.1mL),并将混合物加热回流8小时。冷却至室温后,将混合物倒入二乙醚中。通过抽滤过滤出所形成的深红色沉淀。将沉淀重新溶于丙酮中,并与饱和KPF6溶液(5mL)混合。搅拌1小时后,通过压缩空气使丙酮蒸发。再次过滤出深红色沉淀,用水洗涤,并在减压下干燥。产率为96%。1H NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):8.95(d,2H,J=6.8Hz),8.50(d,2H,J=6.8Hz),8.17(d,2H,J=8.4Hz),8.07(s,1H),7.93(d,2H,J=8.4Hz),7.89(d,2H,J=8.8Hz),7.39(t,4H,J=8.0Hz),7.20–7.13(m,4H),6.93(d,2H,J=8.8Hz),4.30(s,3H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6),δ(ppm):145.6,145.3,143.7,137.5,131.1,129.8,128.6,126.2,125.7,124.9,124.7,119.2,104.5.HRMS(MALDI-TOF):m/z464.2133(M+,计算的464.2127)。
光学性质和细胞成像
研究了ASCP-2P的光物理性质。ASCP-2P的最大吸收在460nm处(图9)。在DMSO和甲苯的混合物中研究了其荧光性质。在纯的DMSO溶液中几乎不发光。向DMSO溶液中加入甲苯后,荧光强度逐渐增强并且发生了从660nm至620nm的蓝移,但是在80%的甲苯分数后有进一步的显著增强(图10)。
由于ASCP-2P结构是类似于ASCP的强供体-受体设计,因此显示出强的TICT性质。将ASCP-2P分子溶解在DMSO溶液中,发光由于TICT效应而减弱,并且经由自由的分子内运动通过非辐射衰减来淬灭发光。甲苯作为不良性溶剂以诱导ASCP-2P聚集体的形成。在开始时,由于甲苯的低极性,轻微增强和蓝移是由于TICT效应。在80%的甲苯分数之后,显著的增强归因于聚集体形成、激活RIM过程和辐射通道中的松弛。值得注意的是ASCP-2P具有AIE的特征,但也呈现了来自强供体-受体结构的TICT效应。Py基团已被报道为是线粒体靶向的基团。通过制备脂质囊泡来模拟线粒体膜环境,并将其与PBS溶液中的ASCP-2P混合(图11)。PBS溶液中的弱发光是由于高极性水溶液中的TICT效应。在与磷脂结合后,ASCP-2P的运动受到限制,从而激活RIM过程并且阻断了非辐射衰减。
最近,AIEgen已经被用作光敏剂来产生ROS,而且被开发用于图像引导的PDT。受此想法启发,研究了ASCP-2P的ROS生成的能力并与几种AIEgen进行了比较。使用商业ROS指示剂2’,7’-二氯二氢荧光素二乙酸酯(H2DCFDA),其是一种荧光素衍生物并且可以通过ROS氧化恢复其绿色荧光。
在白光照射下,将ASCP-2P与ASCP、TPE-PY和TPE-IQ进行比较(图13)。有趣的是,在与ASCP-2P混合中,照射30秒后,荧光信号饱和。其它候选物在30秒的照射内远远没有达到饱和强度(图12)。TPE-IQ和TPE-PY的较差的ROS生成能力的主要原因可能是由于吸收。它们的吸收小于400nm,这意味着大多数的分子在白光下未被激发,并且较少的氧获得了三重态的激发能量。有趣的是,ASCP几乎没有显示出ROS生成,而ASCP-2P却显示出了很高ROS生成能力(图12-13)。
为了研究ASCP-2P的氧化作用,将A549癌细胞与ASCP-2P一起孵育2小时。然后将H2DCFDA加入到此培养基中,随后暴露于白光下1分钟。随后,立即在共聚焦成像下观察细胞。如图14D-F所示,绿色荧光代表细胞内ROS的水平。绿色荧光越亮,细胞内ROS水平越高。值得注意的是,由较亮的荧光所表示的,ASCP-2P可以显著增加细胞内ROS的水平,这表明光是ASCP-2P诱导ROS的有效的触发器(图14E)。此外,一种抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)和ASCP-2P的共处理实质上逆转了ROS的诱导,这表明光对ASCP-2P的ROS诱导效应可以被抗氧化剂NAC消除(图14F)。
采用XTT测定来评估ASCP-2P的抗癌作用。如图15所示,在没有光暴露的情况下,ASCP-2P对A549细胞几乎没有毒性。即使在最高浓度(80μM)下也有近90%的细胞存活。然而,当暴露于白光下1分钟后,ASCP-2P导致剂量依赖性的细胞死亡。IC50值为约33μM。此外,在光下与NAC的共处理显著减弱ASCP-2P的细胞毒性作用。例如,80μM的ASCP-2P导致90%以上的细胞死亡,而在NAC共处理时,75%以上的细胞存活。
放射增敏
进行克隆形成测定以评估ASCP-2P的放射增敏作用。在照射之前,将A549癌细胞与ASCP-2P(10μM)一起孵育2小时以确保ASCP-2P至线粒体的靶向递送。之后,给予一系列剂量(2、4和6Gy)的照射。然后立即将细胞接种到6孔板中来研究集落形成能力。如图16A-B所示,没有光的情况下,ASCP-2P与单独照射相比没有显示出放射增敏作用。然而,ASCP-2P处理的细胞暴露于光下明显使癌细胞对辐射敏感,计算的SER10为1.62。
最近的研究表明,某些药物,如紫杉醇和顺铂,具有放射增敏作用。临床研究还表明,紫杉醇已被推荐为同步化疗和放疗的标准疗法。此外,数项研究致力于研究可能具有放射增敏作用的潜在的纳米材料,而金纳米颗粒(GNP)是纳米技术领域中最有前景的放射增敏剂之一。
在这方面,将ASCP-2P的放射增敏作用与紫杉醇和GNP进行比较。图16-17表明,在有光的情况下,ASCP-2P是能够使肺癌细胞对照射敏感的最有效的药剂。用ASCP-2P和紫杉醇或GNP处理的细胞中的集落形成能力有着显著的差异。如从曲线所计算的,紫杉醇的SER10为1.32,而GNP的SER10为1.19。两者的SER10均明显低于ASCP-2P的SER10(其达到1.62,三种药剂中最高的)。
为了研究放射增敏作用的潜在机制,选择较低剂量的ASCP-2P(10μM)与照射组合。10μM的ASCP-2P在光下诱导了非常少的细胞凋亡,其可以被认为是几乎无毒的。如图18A所示,单独的照射抑制了Akt和ERK的磷酸化,而ASCP-2P在光下几乎不影响p-Akt和p-ERK的表达。更重要的是,光下ASCP-2P与照射的组合显著阻断磷酸化过程,这表明了对p-Akt和p-ERK抑制的协同作用。
此外,还通过western印迹评估下游凋亡的途径(图18B)。ASCP-2P在光下诱导少量的细胞凋亡,而照射则抑制抗凋亡蛋白(Bcl-2,Bcl-XL)的表达,并促进凋亡蛋白(Bax,BAD)的表达。最重要的细胞凋亡标志物之一是半胱天冬酶-3,经历半胱天冬酶-3前酶的显著降低和切割的半胱天冬酶-3的增加。另外,相比于单独的照射或光下ASCP-2P,照射和光下ASCP-2P的组合在诱导细胞凋亡中更加有效。
另外,使用抗氧化剂NAC作为ROS清除剂来研究ASCP-2P的放射增敏作用是否主要依赖于细胞内ROS的诱导(图18)。显然,NAC大大地减弱了ASCP-2P对p-Akt和p-ERK表达的抑制作用,这逆转了下游凋亡途径的诱导。例如,在有光的情况下,在暴露于ASCP-2P之后,NAC的共处理实质上降低了抗凋亡的Bcl-2的表达,并增强了促凋亡Bax和BAD的表达,这清楚地表明ASCP-2P的放射增敏作用与光对细胞内ROS的诱导密切相关。
已知癌细胞中的辐射抗性与PI3k/Akt和MAPK途径的调节具有非常密切的关系。数项研究表明,PI3k/Akt的组成型表达(其保护细胞免于凋亡),在癌细胞的化学增敏中起着重要作用。在这里,已经证明ASCP-2P的有效的ROS诱导作用是由光暴露触发的,并且ASCP-2P可以通过抑制p-Akt和p-ERK并且随后诱导凋亡而作为对照射有效的放射增敏剂(如图18C-D)。
利用新的AIEgen对溶酶体和脂滴的双光子成像
合成
根据以下方案所示的合成路线制备化合物3”和5”:
将化合物1”(0.5mmol)和2”或4”(0.5mmol)在氮气下,加入到配有冷凝器的25mL双颈圆底烧瓶中。加入10mL无水乙醇,使混合物回流。再加入2mL吗啉,使反应进行2小时。冷却至室温后,混合物用DCM萃取三次。将有机相合并,用水洗涤并在无水硫酸钠上干燥。溶剂蒸发后,利用体积比为7:3的正己烷/乙酸乙酯作为洗脱液,通过硅胶柱层析来纯化粗产物。得到橙色固体,产率56%。
化合物3”的结构为:
化合物5”的结构为:
光物理性质
对于化合物3”和5”,吸收分别为410nm和525nm(图19-20)。化合物3”具有AEE活性,并且由于水分数增加,约600nm处的荧光增强并发生红移(图21)。化合物5”稍有不同。约650nm处的荧光增加,但在50%的水分数后降低(图22)。提议当分子距离足够近时,发生π-π相互作用。
3”和5”的应用
化合物3”用于靶向溶酶体(图23)。选择性通过商业染料Lyso-tracker red进行证实。其也可以用于双光子成像以提供更高的分辨率和高信噪比(图24)。
化合物5”用于脂滴成像。在共聚焦图像中,发现信号来自整个细胞。然而,当发光收集范围从520nm变为630nm时,发现信号仅来自脂滴(图25)。这是由于脂滴环境是非极性的,其将发光移动到更蓝的区域(图26)。
基于此处包含的信息,在不脱离以下权利要求书的精神和范围下,对本主题的精确描述进行各种改动对本主题所属领域的技术人员而言将是显而易见的。本主题在范围上并不受限于所限定的步骤、性质或成分,因为优选实施方案和其他描述仅旨在说明本文提供的主题的特定方面。事实上,对于化学、生物化学或相关领域的技术人员显而易见的用于实施本发明所述模式的各种修改旨落入以下权利要求书的范围内。
Claims (18)
1.制备用于生物学应用的具有聚集诱导发光性质的红色荧光AIEgen的方法,其包括将选自叔氨基、烷氧基和咪唑基的供体与选自氰基、吡啶盐和吲哚盐的受体组合。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述AIEgen的荧光信号为约600nm。
3.制备AIEgen的方法,其包括构建供体-受体AIE衍生物化合物中的化合物,其中所述供体-受体AIE衍生物包含选自以下的通式的骨架结构:
其中R、R’、R”和R”’独立地选自:
H、 并且
其中n为0至20的整数。
4.根据权利要求3所述的方法,其中所述AIEgen显示出红色荧光。
5.根据权利要求3所述的方法,其中所述AIEgen用于肺癌细胞的荧光细胞成像。
6.根据权利要求3所述的方法,其中所述供体-受体AIE衍生物能靶向选自线粒体、核仁、溶酶体、细胞膜和脂滴的特定细胞器。
7.用作染料的包含供体-受体AIE衍生物化合物的AIEgen,其中所述供体-受体AIE衍生物包含选自以下的通式的骨架结构:
其中R、R’、R”和R”’独立地选自:
H、 并且
其中n为0至20的整数。
8.根据权利要求7所述的AIEgen,其中所述AIEgen具有以下结构:
9.根据权利要求8所述的AIEgen,其中所述AIEgen是靶向线粒体和核仁的染料。
10.根据权利要求7所述的AIEgen,其中所述AIEgen具有以下结构:
11.根据权利要求10所述的AIEgen,其中所述AIEgen是靶向线粒体的染料。
12.根据权利要求10所述的AIEgen,其中所述AIEgen能够作为放疗的放射增敏剂。
13.AIEgen,其中所述AIEgen具有以下结构:
14.根据权利要求13所述的AIEgen,其中所述AIEgen是靶向溶酶体的染料。
15.根据权利要求13所述的AIEgen,其中所述AIEgen能够用于双光子成像。
16.AIEgen,其中所述AIEgen具有以下结构:
17.根据权利要求16所述的AIEgen,其中所述AIEgen是靶向脂滴的染料。
18.根据权利要求16所述的AIEgen,其中所述AIEgen能够用于双光子成像。
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