CN114853665B

CN114853665B - 一种荧光化合物及其制备方法和应用

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Publication number: CN114853665B
Application number: CN202210360719.0A
Authority: CN
Inventors: 胡方; 杨慧; 陶盛昌
Original assignee: Southern Medical University
Current assignee: Southern Medical University
Priority date: 2022-04-07
Filing date: 2022-04-07
Publication date: 2023-08-08
Anticipated expiration: 2042-04-07
Also published as: CN114853665A

Abstract

本发明涉及荧光材料技术领域，公开了一种荧光化合物及其制备方法和应用。该荧光化合物的结构通式为其中，R₁、R₂、R₃、R₄、R₅分别独立地选自H、C_1～6烷基，R₆选自C_1～6烷基，X为卤素。该化合物具有聚集诱导发光现象，能够发出荧光，可对细胞进行染色、荧光标记，对细胞核进行精准定位，具有良好的抗荧光淬灭、抗光漂白性、大的斯托克斯位移等优点；而且该化合物在一定浓度范围内对多种细胞均无毒性，安全性高。

Description

一种荧光化合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及荧光材料技术领域，特别涉及一种荧光化合物及其制备方法和应用。

背景技术

荧光探针在生物、医疗等领域中发挥着巨大作用，逐渐成为研究热门。荧光探针能够进入细胞，对细胞内各种亚细胞结构进行标识定位，而细胞核是真核细胞内最大、最重要的细胞结构，是细胞遗传与代谢的调控中心，是真核细胞区别于原核细胞最显著的标志之一。细胞核在代谢、繁殖和遗传等多种细胞活动中起着关键作用，因此细胞核染色剂是研究细胞核形态和功能的重要手段。

现在已经开发出多种多样的细胞核染色剂，目前作为科研试剂使用较多的是Hoechst33342、DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)等，它们都具有蓝色的荧光，可以用来确定细胞的位置和数量。当需要使用蓝色荧光探针标记除了细胞核之外的细胞器或者细胞内生物分子时，可采用其它颜色的荧光探针对细胞核进行标记。其中，使用红色的细胞核荧光探针可以有效避免细胞本身的荧光背景，成像效果好。通过调研可知，市面存在有RedDot1、SYTO 64等红色荧光细胞核染色剂，然而RedDot1、SYTO 64等多存在有光漂白和自淬灭等现象，而且对于细胞核的特异性定位效果不佳，通常在细胞质中也存在大量背景信号，限制了在长期观测中的适应性，而且价格昂贵。

另外，较多细胞核红色荧光探针还存在如下缺点：

1、易发生荧光淬灭，表现为在共聚焦显微镜拍摄过程中容易产生快速的荧光淬灭现象；

2、共定位染色不精准，表现为在细胞染色过程中不仅将细胞核染色，也将细胞核之外的细胞质也染色；

3、斯托克斯位移太小，使吸收和发射光谱之间重叠太大，导致能量转移而导致的荧光效率降低。

4、容易发生光漂白现象，表现为当激发光的强度超过一定限度时，光吸收就趋于饱和，荧光淬灭严重。

因此，开发低毒性、高稳定性、特异性强，能够用于精准细胞核定位，具有良好的抗荧光淬灭、抗光漂白性、精准的细胞核定位、大的斯托克斯位移的新一代细胞核荧光探针具有重要的科学意义以及广泛的应用价值。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种荧光化合物，与甘油共同作用能够用于精准细胞核定位，具有良好的抗荧光淬灭、抗光漂白性、大的斯托克斯位移等优点。

同时，本发明还提出所述荧光化合物的制备方法和应用。

具体地，本发明涉及如下的技术方案：

本发明的第一方面是提出一种荧光化合物，所述荧光化合物具有如下通式I所述的结构式：

其中，R₁、R₂、R₃、R₄、R₅分别独立地选自H、C_1～6烷基，R₆选自C_1～6烷基，X为卤素。

本发明提供了一种新型的化合物，该化合物具有聚集诱导发光现象，能够发出荧光，可对细胞进行染色、荧光标记，与甘油共孵育后对细胞核进行精准定位，具有良好的抗荧光淬灭、抗光漂白性、大的斯托克斯位移等优点；而且该化合物在一定浓度范围内对多种细胞均无毒性，安全性高。

在本发明的一些实例中，所述R₁、R₂、R₃、R₄、R₅分别独立地选自H、C_1～3烷基，R₆选自C_1～3烷基。

在本发明的一些实例中，所述R₁、R₂、R₃、R₄、R₅分别独立地选自H，R₆选自乙基。

在本发明的一些实例中，所述X选自Cl或Br，优选Br。

本发明的第二方面是提供上述荧光化合物的制备方法，包括如下方法一和方法二中的至少一种：

所述方法一包括如下步骤：

使化合物1a与化合物2a反应，得到化合物3a；

化合物3a与化合物4a反应得到化合物5a；

化合物5a与化合物6a反应得到所述荧光化合物；

所述方法一的合成路线为：

所述方法二包括如下步骤：

使化合物1b与化合物2b反应，得到化合物3b；

化合物3b与化合物4b反应得到化合物5b；

化合物5b与化合物6b反应得到所述荧光化合物；

所述方法二的合成路线为：

对于所述方法一：

在本发明的一些实例中，所述化合物1a与化合物2a的反应温度为60～100℃，优选75～85℃；反应时间为5～20小时，优选10～15小时。

在本发明的一些实例中，所述化合物1a与化合物2a的摩尔比为1：0.5～1.5，优选约1：1。

在本发明的一些实例中，所述化合物1a与化合物2a的反应过程在催化剂存在下进行。所述催化剂包括四三苯基膦钯、氯化钯、醋酸钯、双三苯基磷二氯化钯中的至少一种，优选四三苯基膦钯。

在本发明的一些实例中，所述化合物1a与催化剂的比例为1mmol：1～3mg，优选1mmol：2～2.5mg。

在本发明的一些实例中，所述化合物1a与化合物2a的反应在碱存在下进行。所述碱包括碳酸钾、碳酸钠、碳酸氢钾、碳酸氢钠、氢氧化钠、氢氧化钾、氨水中的至少一种，优选包括碳酸钾。

在本发明的一些实例中，所述化合物1a与碱的比例为1mmol：0.1～1g，优选1mmol：0.2～0.5g。

在本发明的一些实例中，所述化合物1a与化合物2a的反应在保护氛围下进行，例如在氮气、氩气中进行。

在本发明的一些实例中，所述化合物1a与化合物2a的反应体系中，可根据本领域的通用操作加入适量的溶剂对各原料进行分散。所述溶剂可选自甲苯、苯、四氢呋喃、二氯甲烷、乙醇、甲醇、N,N二甲基甲酰胺中的至少一种，优选四氢呋喃，但并不限于此。所述溶剂的用量可根据实际情况和本领域的通用操作确定，作为示例，化合物1a与溶剂的比例可设为1mmol：1～10mL，优选1mmol：1～3mL。

在本发明的一些实例中，所述化合物1a与化合物2a反应结束后，还包括对反应产物进行萃取、纯化步骤，所述萃取可采用二氯甲烷和水，纯化方法可采用硅胶柱层析纯化(石油醚：乙酸乙酯＝3～6：1，v：v)。

在本发明的一些实例中，所述化合物3a和化合物4a的反应温度为10～40℃，优选20～30℃，在实际操作中，可直接在室温下进行；反应时间为2～10小时，优选4～6小时。

在本发明的一些实例中，所述化合物4a与化合物3a的摩尔比为1：2～5，优选约1：2～2.5。

在本发明的一些实例中，所述化合物3a与化合物4a的反应在碱存在下进行。所述碱包括碳酸钾、碳酸钠、碳酸氢钾、碳酸氢钠、氢氧化钠、氢氧化钾、氨水中的至少一种，优选氢氧化钾。

在本发明的一些实例中，所述化合物3a与碱的摩尔比为1：0.5～1.5，优选1：1。

在本发明的一些实例中，所述化合物3a与化合物4a的反应在保护氛围下进行，例如在氮气、氩气中进行。

在本发明的一些实例中，所述化合物3a与化合物4a的反应体系中，可根据本领域的通用操作加入适量的溶剂对各原料进行分散。所述溶剂可选自甲苯、苯、四氢呋喃、二氯甲烷、乙醇、甲醇、N,N二甲基甲酰胺中的至少一种，优选乙醇，但并不限于此。所述溶剂的用量可根据实际情况和本领域的通用操作确定，作为示例，化合物3a与溶剂的比例可设为1mmol：20～50mL，优选1mmol：30～40mL。

在本发明的一些实例中，所述化合物3a与化合物4a反应结束后，还包括对反应产物进行萃取、纯化步骤，所述萃取可采用二氯甲烷和水，所述纯化方法可采用重结晶，重结晶过程在石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯混合体系中进行，石油醚：二氯甲烷：乙酸乙酯＝45～55：2～7：1(v:v:v)，优选石油醚：二氯甲烷：乙酸乙酯＝50：5：1(v:v:v)。

在本发明的一些实例中，所述化合物5a与化合物6a的反应温度为50～80℃，优选60～70℃；反应时间为30～60小时，优选40～50小时。

在本发明的一些实例中，所述化合物5a与化合物6a的摩尔比为1：2～10，优选1：4～6。

在本发明的一些实例中，所述化合物5a与化合物6a的反应在保护氛围下进行，例如在氮气、氩气中进行。

在本发明的一些实例中，所述化合物5a与化合物6a的反应体系中，可根据本领域的通用操作加入适量的溶剂对各原料进行分散。所述溶剂可选自甲苯、苯、四氢呋喃、二氯甲烷、乙醇、甲醇、N,N二甲基甲酰胺中的至少一种，优选甲苯，但并不限于此。所述溶剂的用量可根据实际情况和本领域的通用操作确定，作为示例，化合物5a与溶剂的比例可设为1mmol：80～120mL，优选1mmol：90～110mL。

在本发明的一些实例中，所述化合物5a与化合物6a反应结束后，还包括对反应产物进行纯化的步骤，纯化方法可采用重结晶。

对于所述方法二：

在本发明的一些实例中，所述化合物1b与化合物2b的反应温度为60～100℃，优选75～85℃；反应时间为5～20小时，优选10～15小时。

在本发明的一些实例中，所述化合物1b与化合物2b的摩尔比为1：0.5～1.5，优选1：1。

在本发明的一些实例中，所述化合物1b与化合物2b的反应过程在催化剂存在下进行。所述催化剂包括四三苯基膦钯、氯化钯、醋酸钯、双三苯基磷二氯化钯中的至少一种，优选四三苯基膦钯。

在本发明的一些实例中，所述化合物1b与催化剂的摩尔比为1：0.001～0.005。

在本发明的一些实例中，所述化合物1b与化合物2b的反应在碱存在下进行。所述碱包括碳酸钾、碳酸钠、碳酸氢钾、碳酸氢钠、氢氧化钠、氢氧化钾、氨水中的至少一种，优选碳酸钾。

在本发明的一些实例中，所述化合物1b与碱的摩尔比为1：0.5～1.5，优选1：1。

在本发明的一些实例中，所述化合物1b与化合物2b的反应在保护氛围下进行，例如在氮气、氩气中进行。

在本发明的一些实例中，所述化合物1b与化合物2b的反应体系中，可根据本领域的通用操作加入适量的溶剂对各原料进行分散。所述溶剂可选自甲苯、苯、四氢呋喃、二氯甲烷、乙醇、甲醇、N,N二甲基甲酰胺中的至少一种，优选甲苯，但并不限于此。所述溶剂的用量可根据实际情况和本领域的通用操作确定，作为示例，化合物1b与溶剂的比例可设为1mmol：1～10mL，优选1mmol：1～3mL。

在本发明的一些实例中，所述化合物1b与化合物2b反应结束后，还包括对反应产物进行萃取、纯化步骤，所述萃取可采用二氯甲烷和水，纯化方法可采用硅胶柱层析纯化(石油醚：乙酸乙酯＝3～6：1，v：v)。

在本发明的一些实例中，所述化合物3b和化合物4b的反应温度为60～100℃，优选75～85℃；反应时间为2～10小时，优选4～6小时。

在本发明的一些实例中，所述化合物3b和化合物4b的摩尔比为1：2～10，优选约1：4～6。

在本发明的一些实例中，所述化合物3b和化合物4b的反应在保护氛围下进行，例如在氮气、氩气中进行。

在本发明的一些实例中，所述化合物3b和化合物4b的反应体系中，可根据本领域的通用操作加入适量的溶剂对各原料进行分散。所述溶剂可选自甲苯、苯、四氢呋喃、二氯甲烷、乙醇、甲醇、N,N二甲基甲酰胺中的至少一种，优选N,N-二甲基甲酰胺，但并不限于此。所述溶剂的用量可根据实际情况和本领域的通用操作确定，作为示例，化合物3b与溶剂的比例可设为1mmol：5～15mL，优选1mmol：5～10mL。

在本发明的一些实例中，所述化合物3b和化合物4b反应结束后，还包括对反应产物进行纯化的步骤，所述纯化方法可采用石油醚、乙酸乙酯体系硅胶柱层析分离纯化。

在本发明的一些实例中，所述化合物5b与化合物6b的反应温度为50～80℃，优选60～70℃；反应时间为30～60小时，优选40～50小时。

在本发明的一些实例中，所述化合物5b与化合物6b的摩尔比为1：1～3，优选1：1～2。

在本发明的一些实例中，所述化合物5b与化合物6b的反应在有机碱存在下下进行。所述有机碱包括哌啶、三乙胺中的至少一种，优选哌啶。

在本发明的一些实例中，所述化合物5b与有机碱的摩尔比为1：2～5，优选1：3～4。

在本发明的一些实例中，所述化合物5b与化合物6b的反应体系中，可根据本领域的通用操作加入适量的溶剂对各原料进行分散。所述溶剂可选自甲苯、苯、四氢呋喃、二氯甲烷、乙醇、甲醇、N,N二甲基甲酰胺中的至少一种，优选甲醇、乙醇，但并不限于此。所述溶剂的用量可根据实际情况和本领域的通用操作确定，作为示例，化合物5b与溶剂的比例可设为1mmol：80～150mL，优选1mmol：100～130mL。

在本发明的一些实例中，所述化合物5b与化合物6b反应结束后，还包括对反应产物进行纯化的步骤，纯化方法可采用重结晶。

本发明的第三方面是提供所述荧光化合物在作为荧光探针中的应用。

本发明的第四方面还提供所述荧光化合物在细胞荧光标记中的应用。

本发明的第五方面还提供所述荧光化合物在细胞核荧光标记中的应用。

相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：

本发明提供了一种新型的化合物，该化合物具有聚集诱导发光现象，能够发出荧光，可对细胞进行染色、荧光标记，对细胞核进行精准定位，具有良好的抗荧光淬灭、抗光漂白性、大的斯托克斯位移等优点；而且该化合物在一定浓度范围内对多种细胞均无毒性，安全性高。

附图说明

图1为TPA-2BCP的氢谱分析图；

图2为TPA-2BCP的碳谱分析图；

图3为TPA-2BCP的紫外可见光谱图；

图4为TPA-2BCP在甘油-水混合体系中的荧光强度图；

图5为TPA-2BCP在四氢呋喃/水(THF/H₂O)混合体系中的荧光图；

图6为TPA-2BCP对小鼠乳腺癌细胞4T1、人宫颈癌细胞Hela、人乳腺癌细胞231、人脐静脉内皮细胞HUVEC、人乳腺癌细胞MCF-7存活率的影响结果图；

图7为在4T1、Hela、231、HUVEC、MCF-7活细胞中加入TPA-2BCP以及商业细胞核荧光探针hoechst33342共染后的激光共聚焦图像；

图8为商品细胞核荧光探针Hoechst33342和TPA-2BCP对4T1、Hela、231、HUVEC、MCF-7死细胞的荧光共聚焦成像图；

图9为TPA-2BCP与商业探针RedDot1对Hela的荧光强度与时间关系图；

图10为不同时间下TPA-2BCP与商业探针RedDot1对Hela细胞的荧光共聚成像图；

图11为0s时TPA-2BCP与商业探针RedDot1对Hela细胞的荧光共聚焦成像图；

图12为TPA-2BCP与商业探针SYTO 64对4T1的荧光强度与时间关系图；

图13为不同时间下TPA-2BCP与商业探针SYTO 64对4T1细胞的荧光共聚成像图；

图14为0s时TPA-2BCP与商业探针SYTO64对4T1细胞的荧光共聚焦成像图。

具体实施方式

以下结合具体的实施例进一步说明本发明的技术方案。以下实施例中所用的原料，如无特殊说明，均可从常规商业途径得到；所采用的工艺，如无特殊说明，均采用本领域的常规工艺。

一种荧光化合物，其制备方法包括如下步骤：

1)2-(4-吡啶-4-苯基)乙腈的制备：

将10mmol吡啶-4-硼酸和10mmol 4-溴苯乙腈、22mg四三苯基膦钯、4.14g碳酸钾，20mL四氢呋喃依次加入放有搅拌子的200mL烧瓶中，橡胶塞密封，冷凝回流，氮气保护，在80℃条件下反应12小时；反应物用二氯甲烷和水萃取后，再经硅胶柱层析纯化分离(石油醚：乙酸乙酯＝5：1，v:v)，收集产物，浓缩烘干后，产率为46.4％。

2)(2Z,2'Z)-3,3'-((苯氮杂炔基)双(4,1-苯撑基)双(2-(4-(吡啶-4-J基)苯基)丙烯腈)的制备：

将0.52mmol 2-(4-吡啶-4-苯基)乙腈和0.22mmol 4,4-二甲酰三苯胺、0.52mmol氢氧化钾及20mL乙醇加入放有搅拌子的烧瓶中，橡胶塞密封，氮气保护，在室温条件下反应5小时；将反应物旋干，用二氯甲烷、水萃取，再用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯体系(石油醚：二氯甲烷：乙酸乙酯＝50：5：1，v:v:v)重结晶分离纯化，浓缩烘干后，产率为78.4％。

3)4,4'-((1Z,1'Z)-((苯氮杂炔基)双(4,1-苯撑基)双(1-氰基-2,1-二酰基))双(4,1-苯撑基)双(1-乙基吡啶-1-三苯基)(即荧光化合物，标记为TPA-2BCP)的制备：

将0.092mmol的(2Z,2'Z)-3,3'-((苯氮杂炔基)双(4,1-苯撑基)双(2-(4-(吡啶-4-J基)苯基)丙烯腈)、0.5mL的溴乙烷、10mL甲苯加入放有搅拌子的烧瓶中，橡胶塞密封，氮气保护，在65℃条件下加热反应48小时，再重结晶分离纯化，浓缩烘干后，产率为71.2％。

TPA-2BCP的合成路线如下：

该荧光化合物TPA-2BCP也可以采用如下方法制备得到：

1)2-(4-吡啶-4-苯基)乙腈的制备：

将10mmol 4-溴吡啶盐酸盐和10mmol 4-氰甲基苯硼酸、10mmol碳酸钾，0.02mmol四三苯基膦钯，20ml甲苯依次加入放有搅拌子的200mL烧瓶中，橡胶塞密封，冷凝回流，氮气保护，在80℃条件下反应12小时；反应物用二氯甲烷和水萃取后，再经硅胶柱层析纯化分离(石油醚：乙酸乙酯＝5：1，v:v)，收集产物，浓缩烘干。

2)4-(4-(氰甲基)苯基)-1-乙基吡啶-1-溴的制备：

将2.7mmol 2-(4-吡啶-4-苯基)乙腈和14.8mol溴乙烷、20ml N,N-二甲基甲酰胺加入放有搅拌子的烧瓶中，橡胶塞密封，氮气保护，80℃条件下反应5小时；将反应物旋干，再用石油醚、乙酸乙酯体系硅胶柱层析分离纯化，浓缩烘干。

3)TPA-2BCP，即4,4'-((1Z,1'Z)-((苯氮杂炔基)双(4,1-苯撑基)双(1-氰基-2,1-二酰基))双(4,1-苯撑基)双(1-乙基吡啶-1-三苯基)的制备：

将0.159mmol的4-(4-(氰甲基)苯基)-1-乙基吡啶-1-溴、0.198mmol 4,4-二甲酰三苯胺，0.59mmol的哌啶，20mL的乙醇加入放有搅拌子的烧瓶中，橡胶塞密封，在65℃条件下加热反应48小时，再重结晶分离纯化，浓缩烘干。

合成路线如下：

结构和性能测试

(1)结构表征

TPA-2BCP，即4,4'-((1Z,1'Z)-((苯氮杂炔基)双(4,1-苯撑基)双(1-氰基-2,1-二酰基))双(4,1-苯撑基)双(1-乙基吡啶-1-三苯基)的¹H NMR(400MHz,氘代氯仿)：δ9.26(d,J＝6.6Hz,4H),9.18(s,4H),8.40(d,J＝6.4Hz,3H),7.99(d,J＝8.2Hz,3H),7.90(dd,J＝12.7,8.3Hz,6H),7.64(s,2H),7.43(t,J＝7.6Hz,3H),7.23(d,J＝8.0Hz,3H),7.19(d,J＝8.6Hz,3H),7.02(s,2H),5.04–4.96(m,4H),1.78(t,J＝7.4Hz,6H)。

¹³C NMR(151MHz,DMSO-d6)δ153.82,149.18,145.13,144.20,137.99,133.89,131.81,130.72,129.42,126.99,124.86,123.15,118.49,106.70,55.95,34.71,16.82。如图1和2所示。

(2)吸收、发射性能

采用二甲基亚砜(DMSO)预先配制好TPA-2BCP母液，用移液枪吸取一定量的母液加入2mL的纯水中使终浓度为10μM，再使用紫外-可见分光光度计测试吸收光谱范围，结果如图3所示。结果显示，TPA-2BCP的吸收波长范围在300～520nm，最大吸收波长为466nm。

配制系列黏度的甘油-水混合溶液，甘油的体积比例分别为10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％，再在每个混合体系中添加TPA-2BCP[C＝10μM)，再使用荧光分光光度计测试不同黏度下的TPA-2BCP的荧光强度(激发波长为466nm)，结果如图4所示。从图中可以看出，TPA-2BCP的发射波长范围在520～800nm，最大发射波长为652nm，发出红色荧光。随着黏度的增高，相同浓度下的TPA-2BCP的荧光强度增强，表明TPA-2BCP具有AIE(聚集诱导发光)现象。

而且，通过比较图3和图4可见，TPA-2BCP斯托克斯位移较大，吸收和发射光谱之间基本没有重叠，不会导致能量转移而导致的荧光效率降低。

(3)配制不同体积比例的THF/H₂O溶液(THF体积百分比为0、20％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、99％)，再加入使用DMSO预先配制好的TPA-2BCP母液，使终浓度为10μM，然后使用荧光分光光度计测试荧光强度的变化，结果如图5所示。结果显示，随着THF浓度的提高，荧光强度增强。

(4)细胞毒性

按照如下方法测试TPA-2BCP对4T1、Hela、231、HUVEC、MCF-7的细胞毒性：

1)接种细胞：在96孔板中每孔加入体积为100μL的细胞(密度＝5*10⁴个/mL)，5％CO₂，37℃孵育；2)培养细胞：待细胞贴壁后，使用预先用细胞培养级DMSO配制好的TPA-2BCP荧光探针母液，用完全培养基配制浓度分别为0、5、10、20、40、80μM的TPA-2BCP，每孔100μL，在5％CO₂，37℃培养箱中避光孵育2小时，后用1*PBS洗涤3次；3)加入新配制的3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐溶液(5mg/mL MTT；即0.5％MTT)，每孔加入20μL，培养4小时；4)将孔内培养液小心吸出后，每孔加入150μL DMSO振荡10分钟，使结晶物充分溶解；5)选择490nm波长，在酶标仪上测定各孔光吸收值，记录结果。

细胞毒性测试结果如图6所示。结果显示，TPA-2BCP对4T1、Hela、231、HUVEC、MCF-7细胞暗毒性影响较低。TPA-2BCP作为荧光探针使用剂量一般为2μM，对细胞的基本无暗毒性。

(5)细胞染色

活细胞染色：使用共聚焦皿(20mm规格)接种细胞(4T1、Hela、231、HUVEC、MCF-7活细胞)，1*10⁵个细胞/皿，待细胞贴壁后，加入使用完全培养基DMEM配制好的TPA-2BCP(2μM)，放置在5％CO₂培养箱37℃孵育1小时，取出后使用1*PBS(pH7.4磷酸盐缓冲液)洗涤细胞3次，加入商业探针Hoechst33342，每皿为500μL，在室温条件下孵育5分钟，后用1*PBS洗涤3次，在拍摄前往共聚焦皿中滴加10～100μL甘油，再使用倒置激光共聚焦显微镜(CLSM)拍摄观察染色情况，结果如图7所示(图中DIA为明场图片)。结果显示，TPA-2BCP可进入4T1、Hela、231、HUVEC、MCF-7细胞细胞核。

死细胞染色：首先使用共聚焦皿(20mm规格)培养1*10⁵个细胞/皿，待细胞贴壁后，用4％多聚甲醛固定细胞20分钟，待细胞固定，加入使用完全培养基DMEM配制好的TPA-2BCP(2μM)，放置在二氧化碳培养箱37℃孵育1小时，取出后使用1*PBS(pH7.4磷酸盐缓冲液)洗涤细胞3次，加入商业探针Hoechst33342，500μL/皿,在室温条件下孵育5分钟，后用1*PBS洗涤3次，在拍摄前往共聚焦皿中滴加10～100μL甘油，再使用倒置激光共聚焦显微镜(CLSM)拍摄观察染色情况，结果如图8所示。结果显示，TPA-2BCP可进入4T1、Hela、231、HUVEC、MCF-7死细胞细胞核。

根据活细胞和死细胞染色结果可以看出，与甘油共孵育后TPA-2BCP具有精准的细胞核靶向作用，对4T1、Hela、MCF-7、231、HUVEC等细胞的细胞核都有精确的靶向作用。

(6)荧光稳定性

在共聚焦皿中(20mm规格)接种Hela(或4T1细胞)，1*10⁵个细胞/皿，对于每一种细胞，分别共接种三皿细胞，待细胞贴壁后，在第一皿细胞中加入TPA-2BCP荧光探针后放进5％CO₂培养箱37℃培养1小时，取出后在超净台中用PBS洗涤3次，另外两皿细胞中分别加入商业细胞核红色荧光探针RedDot1和SYTO 64后放进5％CO₂培养箱37℃培养10分钟，三皿细胞均在同一参数下的倒置激光共聚焦显微镜连续拍摄1小时，再使用共聚焦显微镜软件分析荧光强度的变化趋势，结果如图9～14所示。从图中可以看出TPA-2BCP与商业探针RedDot1、SYTO 64相比具有更强的抗荧光淬灭能力，在1小时内能保持稳定的荧光强度。

综上，TPA-2BCP作为荧光探针，具有如下的优点：

1)高稳定性，在激光共聚焦显微镜下连续拍摄一个小时，TPA-2BCP的荧光强度能稳定维持在一定范围内，说明TPA-2BCP荧光探针有着很强的抗荧光淬灭能力；

2)精准的细胞核靶向作用，TPA-2BCP与甘油共孵育后对4T1、Hela、MCF-7、231、HUVEC等细胞的细胞核都有精确的靶向作用；

3)低细胞毒性，TPA-2BCP对4T1、Hela、MCF-7、231、HUVEC细胞在染色过程中使用剂量为2μM,对细胞基本上没有毒性；

4)荧光效率高，TPA-2BCP的吸收波长范围在300～520nm，发射波长范围在520～800nm。斯托克斯位移较大，吸收和发射光谱之间基本没有重叠，不会导致能量转移而导致的荧光效率降低。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种荧光化合物，其特征在于：所述荧光化合物具有如下通式I所述的结构式：

I，

2.根据权利要求1所述荧光化合物，其特征在于：所述R₁、R₂、R₃、R₄、R₅分别独立地选自H、C_1～3烷基，R₆选自C_1～3烷基。

3.根据权利要求2所述荧光化合物，其特征在于：所述R₁、R₂、R₃、R₄、R₅分别独立地选自H，R₆选自乙基。

4.权利要求1～3任一项所述荧光化合物的制备方法，其特征在于：包括如下方法一和方法二中的至少一种：

所述方法一包括如下步骤：

使化合物1a与化合物2a反应，得到化合物3a；

化合物3a与化合物4a反应得到化合物5a；

化合物5a与化合物6a反应得到所述荧光化合物；

所述方法一的合成路线为：

;

所述方法二包括如下步骤：

使化合物1b与化合物2b反应，得到化合物3b；

化合物3b与化合物4b反应得到化合物5b；

化合物5b与化合物6b反应得到所述荧光化合物；

所述方法二的合成路线为：

。

5.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于：所述化合物1a与化合物2a的反应温度为60～100℃。

6.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于：所述化合物1a与化合物2a的摩尔比为1：0.5～1.5。

7.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于：所述化合物3a和化合物4a的反应温度为10～40℃。

8.权利要求1～3任一项所述荧光化合物在制备荧光探针中的应用。

9.权利要求1～3任一项所述荧光化合物在制备细胞荧光标记试剂中的应用。

10.权利要求1～3任一项所述荧光化合物在制备细胞核荧光标记试剂中的应用。