CN115850994B - 一种耐酸碱型近红外荧光染料及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于荧光分析和生物医学成像用荧光染料技术领域，具体涉及一种耐酸碱型近红外荧光染料及其制备方法和应用。本发明提供的耐酸碱型近红外荧光染料，结构式如式(I)所示：式(I)；式(I)中，R1为甲基、乙基、丙基中的一种；R2为氟或氯；R3为氢、氟、氯中的一种。本发明提供的上述结构的耐酸碱型近红外荧光染料，属于一种结构新颖的近红外Rhodol染料分子，其具有近红外区域发射波长(约700nm)、较低的pKa值、较大的斯托克斯位移(大于140nm)，在酸性和/或碱性微环境中的荧光检测、目视定性检测、细胞/活体成像检测中具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于荧光分析和生物医学成像用荧光染料技术领域，具体涉及一种耐酸碱型近红外荧光染料及其制备方法和应用。
背景技术
人体pH复杂多变，血液的理想pH值是7.4，唾液的pH值通常在6.5～7.5之间，胃的底部或上部pH值在4.0～6.5之间。作为酸性细胞器，溶酶体pH在5.0左右。溶酶体含有60余种水解酶，能水解蛋白质、糖类、脂类等物质，与细胞代谢、免疫调节、激素分泌等生命活动息息相关。此外，肿瘤组织因异常代谢造成其微环境pH值在6.5～7.1之间，这一酸性微环境是肿瘤组织内稳态破坏的典型特征，且与肿瘤细胞的凋亡、增殖、转移和免疫逃逸等息息相关。因此，微环境pH的变化往往与疾病的发生密不可分。
近年来，荧光探针因具有无创伤性、空间分辨率高、灵敏度高的特点，可在分子水平对细胞、组织和生物体实现实时、多维度的可视化检测，已成为生物医学领域重要的研究手段。有效开发成像工具以在病理环境中的动态pH变化条件下监测各项生物标志物的异常变化，在疾病的检测、诊断与治疗中越来越起到关键作用。
目前，常规染料分子根据其供电子基团的不同，多单一性地适用于酸性(以-NR2为供电子，如罗丹明类荧光分子)/碱性(以-OH为供电子，如荧光素类荧光分子)环境，在pH不适用的微环境中会发生不同程度的荧光淬灭。以适用单一pH环境的染料分子为基础构建的分子探针，需在分子识别后外排至适用pH环境中才能完全释放荧光，其荧光强度高度依赖于外排速率，不利于各项生物标志物的精准检测。因此，开发耐酸碱型成像材料和成像工具，在病理环境中动态pH变化条件下实现生物标志物的原位检测具有重要的研究意义。
与可见光(380～650nm)相比，发射在近红外区域(650～900nm)的荧光可获得更深的组织穿透深度、更低的光损伤和更好的成像质量，更适用于活体研究。因此，近十年来荧光成像技术主要集中在近红外窗口上。得益于其光学特性，近红外Rhodol染料分子借助四氢喹喔啉结构的强供电子能力不仅实现了近红外区域荧光发射，也兼具了罗丹明类荧光团的大摩尔消光系数、高荧光量子产率、保留荧光素类荧光团可修饰的羟基位点(在螺环内酯状态下)等优点，在荧光示踪及生物医学分析中得到广泛应用。然而，现有的近红外Rhodol染料分子，虽然能够在生理环境中产生稳定的光学信号，但其pH适用范围较窄，仍存在较大的使用局限性，无法满足病理环境中动态pH变化条件下生物标志物的检测需求。
因此，亟需开发一种新型的耐酸碱型近红外染料分子，从而为病理环境中动态pH变化条件下实现生物标志物的原位检测提供分子基础。
发明内容
基于上述目的，本发明的目的在于提供一种耐酸碱型近红外荧光染料，其结构新颖，具有近红外区域发射波长和较低的pKa值，适于动态pH变化微环境活体成像。
本发明的目的还在于提供一种耐酸碱型近红外荧光染料的制备方法，其合成步骤简便，易于大规模工业化生产。
本发明的另一目的在于提供一种耐酸碱型近红外荧光染料的应用。
为实现上述目的，本发明的耐酸碱型近红外荧光染料，采用的技术方案是：
一种耐酸碱型近红外荧光染料，结构式如式(I)所示：
式(I)中，R1为甲基、乙基、丙基中的一种；R2为氟或氯；R3为氢、氟、氯中的一种。
本发明提供的上述结构的耐酸碱型近红外荧光染料，属于一种结构新颖的近红外Rhodol染料分子。本发明通过试验探究发现，通过在染料分子的电子受体邻位引入弱吸电子基团(F或Cl)，能够有效改变分子内电荷转移，从而拓宽近红外Rhodol染料分子的pH适用范围。试验证实：本发明提供的上述近红外荧光染料，具有近红外区域发射波长(约700nm)、较低的pKa值、较大的斯托克斯位移(大于140nm)，非常适用于动态pH变化微环境下的活体成像。
本发明的耐酸碱型近红外荧光染料的制备方法，采用的制备路线如下所示：
具体制备方法包括以下步骤：
(1)将化合物a、化合物b、有机溶剂混合，加热搅拌反应，然后分离提纯，得到中间体c；将中间体c与有机溶剂混合，加入还原剂和酸后进行加热回流反应，反应结束后萃取，然后分离提纯，得到中间体d；
(2)将化合物e、化合物f、有机溶剂混合，加入盐后进行搅拌反应，然后分离提纯，得到中间体g；
(3)将中间体d、中间体g、有机溶剂混合，加热搅拌反应，然后分离提纯，即得式(I)所示的耐酸碱型近红外荧光染料；
其中，步骤(1)和步骤(2)不区分先后顺序。
由上述反应路线可知，化合物a为4-甲氧基邻苯二胺，化合物b为乙二醛，化合物e为间苯二酚，化合物f为邻苯二甲酸酐。
本发明提供的耐酸碱型近红外荧光染料的制备方法，将乙二醛、4-甲氧基邻苯二胺进行两步反应的产物，与间苯二酚和邻苯二甲酸酐反应的产物进行混合反应，得到式(I)所示的耐酸碱型近红外荧光染料。该制备方法的合成步骤简便，后处理简单，产物产率高，易于大规模工业化生产。
本发明对制备过程中采用的有机溶剂的种类不作特殊限定，技术人员可以根据溶解和反应效果进行确定。优选地，步骤(1)～(3)中，所述有机溶剂选自无水乙腈、无水甲苯、硝基苯、甲磺酸中的一种或多种。
基于提高反应效率和产物得率的考虑，优选地，步骤(1)中，所述化合物a、化合物b的摩尔比为1∶(35～40)；步骤(2)中，所述化合物e、化合物f、盐的摩尔比为1∶1∶(2～3)；步骤(3)中，所述中间体d、中间体g的摩尔比为1∶1。
优选地，步骤(1)中，所述还原剂为硼氢化钠；所述酸为甲酸、乙酸、丙酸中的一种；所述萃取采用的萃取溶剂为水和乙酸乙酯；步骤(1)所述加热搅拌反应的温度为55～65℃，时间为10～15h；所述加热回流反应的温度为55～65℃，时间为4～6h。
进一步地，步骤(2)中，所述盐为无水AlCl3；步骤(2)所述搅拌反应的温度为20～40℃，时间为10～15h。
进一步优选地，步骤(3)中，所述加热搅拌反应的温度为85～95℃，时间为4～8h。
步骤(1)～(3)中，涉及的分离提纯手段可以采用现有技术中的常规方法，例如，分离为过滤或浓缩，提纯为柱层析。进一步优选地，所述柱层析采用的溶剂为甲醇、乙酸乙酯、乙醚、二氯甲烷、石油醚、正己烷中一种或两种以上的组合。
本发明还提供了耐酸碱型近红外荧光染料的应用，具体是在酸性和/或碱性微环境中的荧光检测、目视定性检测、细胞/活体成像检测中的应用。
更进一步地，所述荧光检测为：所述耐酸碱型近红外荧光染料作为比色探针监测微环境中的pH变化；所述细胞/活体成像检测为：所述耐酸碱型近红外荧光染料作为荧光染料在病理微环境动态pH变化条件下进行细胞/活体荧光成像。
本发明提供的耐酸碱型近红外荧光染料，用于酸性和/或碱性微环境荧光成像可快速识别且裸眼可见其颜色变化，可以实现可视化检测。并且，本发明所制备的近红外荧光染料可在病理微环境中动态pH变化条件下保持良好发光效果，可用于动态pH变化微环境中活细胞检测和活体成像检测，在化工、环境、生物医药等领域具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例1的耐酸碱型近红外荧光染料I-1的光谱图(图1a)、荧光强度随pH的变化曲线(图1b)以及pKa曲线(图1c)；
图2为本发明实施例2的耐酸碱型近红外荧光染料I-2的光谱图(图2a)、荧光强度随pH的变化曲线(图2b)以及pKa曲线(图2c)；
图3为本发明实施例3的耐酸碱型近红外荧光染料I-3的光谱图(图3a)、荧光强度随pH的变化曲线(图3b)以及pKa曲线(图3c)；
图4为本发明实施例4的耐酸碱型近红外荧光染料I-4的光谱图(图4a)、荧光强度随pH的变化曲线(图4b)以及pKa曲线(图4c)；
图5为对比例1的近红外荧光染料的光谱图(图5a)、荧光强度随pH的变化曲线(图5b)以及pKa曲线(图5c)；
图6为本发明实施例1的耐酸碱型近红外荧光染料I-1的核磁谱图；
图7为本发明实施例2的耐酸碱型近红外荧光染料I-2的核磁谱图；
图8为本发明实施例3的耐酸碱型近红外荧光染料I-3的核磁谱图；
图9为本发明实施例4的耐酸碱型近红外荧光染料I-4的核磁谱图；
图10为对比例1的近红外荧光染料的核磁谱图。
具体实施方式
以下结合具体实施方式，对本发明的技术方案作进一步描述。但是本领域技术人员应当理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。以下实施例中涉及的原料和操作技术如无特别说明，均为现有技术中的常规原料和技术。其中，荧光光谱图采用英国爱丁堡FS5荧光分光光度计测试得到。
以下实施例涉及的耐酸碱型近红外荧光染料的制备方法，合成路线如下：
制备方法包括以下步骤：
(1)将化合物a、化合物b、有机溶剂混合，加热搅拌反应，然后分离提纯，得到中间体c；将中间体c与有机溶剂混合，加入还原剂和酸后进行加热回流反应，反应结束后萃取，然后分离提纯，得到中间体d；
(2)将化合物e、化合物f、有机溶剂混合，加入盐后进行搅拌反应，然后分离提纯，得到中间体g；
(3)将中间体d、中间体g、有机溶剂混合，加热搅拌反应，然后分离提纯，即得式(I)所示的耐酸碱型近红外荧光染料。
上述反应路线中，化合物a为4-甲氧基邻苯二胺，化合物b为乙二醛，化合物e为间苯二酚，化合物f为邻苯二甲酸酐。
实施例1
本实施例提供的耐酸碱型近红外荧光染料，结构式如式(I-1)所示：
本实施例的耐酸碱型近红外荧光染料的制备方法，包括如下步骤：
(1)将4.9mL的乙二醛(40％，4mol)加入到10mL含有1.52g的4-甲氧基邻苯二胺(0.11mol)的无水乙腈溶液中，在60℃条件下搅拌12h。反应结束后，旋蒸除去溶剂。过硅胶柱，用石油醚和乙酸乙酯的混合溶液进行梯度洗脱，洗脱剂石油醚和乙酸乙酯的体积比从20:1变至10:1，除去溶剂，得白色固体产品1.59g(化合物c)。将化合物c溶解在无水甲苯(20mL)中，0℃下在30min内将NaBH4(3.8g，1mol)加入甲苯中，得到淡黄色浆液搅拌10min。在5-10℃下用1h时间滴加冰乙酸(5.73mL，1mol)。棕色浆液再搅拌1h，加热回流5h。反应完毕，冷却，加入水(25mL)，分离出甲苯层，水层用乙酸乙酯萃取(30mL)，用稀NaCO3和水反复洗涤合并的萃取物和甲苯层。Na2SO4干燥，旋蒸除去溶剂(深棕色油状物)。过硅胶柱，用石油醚和乙酸乙酯的混合溶液进行梯度洗脱，洗脱剂石油醚和乙酸乙酯的体积比从20:1变至10:1，除去溶剂，得金黄色油状物(化合物d-1)；
(2)在氮气流下，将4-氟间苯二酚(0.64g，5mmol)和邻苯二甲酸酐(0.74g，5mmol)溶解在30mL硝基苯中，然后加入无水AlCl3(1.47g，11mmol)，将反应混合物在室温反应12h。将反应混合物倒入剧烈搅拌的30mL正己烷和40mL、0.5M的HCl的两相溶液中。反应搅拌2h后，得到橙黄色沉淀物，过滤得到粗产物。然后将产物通过柱层析纯化，使用二氯甲烷/甲醇(15:1，v/v)作为洗脱液，得到化合物g-1，为橙色固体(0.85g，得率62％)。
(3)将步骤(1)所得的中间体化合物d-1(0.2mmol)和步骤(2)所得化合物g-1(0.2mmol)依次加入甲烷磺酸(2mL)中，在90℃加热4-8h，冷却后倒入冰水中，再加入0.5mL的高氯酸。由此产生的沉淀物被过滤掉，并用大量的水冲洗。样品干燥后，以CH2C12/EtOH混合物为洗脱剂，硅胶层析纯化得到实施例1的耐酸碱型近红外荧光染料，即式(I-1)化合物。
实施例1的耐酸碱型近红外荧光染料的核磁谱图如图6所示。结构表征结果为：1HNMR(300MHz,Methanol-d4)δ8.16(s,1H),7.65(s,2H),7.35(s,1H),6.87(s,1H),6.72(s,2H),6.17(s,1H),3.67(s,4H),1.32(s,8H)。
实施例2
本实施例提供的耐酸碱型近红外荧光染料，结构式如式(I-2)所示：
本实施例的耐酸碱型近红外荧光染料的制备方法，包括如下步骤：
(1)该步骤同实施例1的步骤(1)，得到的产物记为化合物d-2；
(2)在氮气流下，将2,4-二氟间苯二酚(0.73g，5mmol)和邻苯二甲酸酐(0.74g，5mmol)溶解在30mL硝基苯中，然后加入无水AlCl3(1.47g，11mmol)，将反应混合物在室温反应12h。将反应混合物倒入剧烈搅拌的30mL正己烷和40mL、0.5M的HCl的两相溶液中。反应搅拌2h后，得到橙黄色沉淀物，过滤得到粗产物。然后将产物通过柱层析纯化，使用二氯甲烷/甲醇(15:1，v/v)作为洗脱液，得到化合物g-2，为橙色固体(0.43g，29％)。
(3)将步骤(1)所得的中间体化合物d-2(0.2mmol)和步骤(2)所得化合物g-2(0.2mmol)依次加入甲烷磺酸(2mL)中，在90℃加热4-8h，冷却后倒入冰水中，再加入0.5mL的高氯酸。由此产生的沉淀物被过滤掉，并用大量的水冲洗。样品干燥后，以CH2C12/EtOH混合物为洗脱剂，硅胶层析纯化得到实施例2的耐酸碱型近红外荧光染料，即式(I-2)化合物。
实施例2的耐酸碱型近红外荧光染料的核磁谱图如图7所示。结构表征结果为：1HNMR(300MHz,Methanol-d4)δ8.22(d,J＝7.4,1H),7.74–7.68(m,2H),7.32(s,1H),6.93(s,1H),6.61(d,J＝7.5,1H),6.07(s,1H),3.75(m,4H),3.36(s,3H),2.70(s,1H),1.29(d,J＝7.4,6H)。
实施例3
本实施例提供的耐酸碱型近红外荧光染料，结构式如式(I-3)所示：
本实施例的耐酸碱型近红外荧光染料的制备方法，包括如下步骤：
(1)该步骤同实施例1的步骤(1)，得到的产物记为化合物d-3；
(2)在氮气流下，将4-氯间苯二酚(0.72g，5mmol)和邻苯二甲酸酐(0.74g，5mmol)溶解在30mL硝基苯中，然后加入无水AlCl3(1.47g，11mmol)，将反应混合物在室温反应12h。将反应混合物倒入剧烈搅拌的30mL正己烷和40mL、0.5M的HCl的两相溶液中。反应搅拌2h后，得到橙黄色沉淀物，过滤得到粗产物。然后将产物通过柱层析纯化，使用二氯甲烷/甲醇(15:1，v/v)作为洗脱液，得到化合物g-3，为橙色固体(0.54g，75％)。
(3)将步骤(1)所得的中间体化合物d-3(0.2mmol)和步骤(2)所得化合物g-3(0.2mmol)依次加入甲烷磺酸(2mL)中，在90℃加热4-8h，冷却后倒入冰水中，再加入0.5mL的高氯酸。由此产生的沉淀物被过滤掉，并用大量的水冲洗。样品干燥后，以CH2C12/EtOH混合物为洗脱剂，硅胶层析纯化得到实施例3的耐酸碱型近红外荧光染料，即式(I-3)化合物。
实施例3的耐酸碱型近红外荧光染料的核磁谱图如图8所示。结构表征结果为：1HNMR(300MHz,Chloroform-d)δ8.28(s,1H),7.56(s,2H),7.08(s,1H),7.02(s,1H),6.74(s,1H),5.97(s,1H),3.57(s,3H),3.42(s,4H),3.18(s,1H),1.23(s,6H)。
实施例4
本实施例提供的耐酸碱型近红外荧光染料，结构式如式(I-4)所示：
本实施例的耐酸碱型近红外荧光染料的制备方法，包括如下步骤：
(1)同实施例1的步骤(1)，得到的产物记为化合物d-4；
(2)在氮气流下，将2,4-二氯间苯二酚(0.89g，5mmol)和邻苯二甲酸酐(0.74g，5mmol)溶解在30mL硝基苯中，然后加入无水AlCl3(1.47g，11mmol)，将反应混合物在室温反应12h。将反应混合物倒入剧烈搅拌的30mL正己烷和40mL、0.5M的HCl的两相溶液中。反应搅拌2h后，得到橙黄色沉淀物，过滤得到粗产物。然后将产物通过柱层析纯化，使用二氯甲烷/甲醇(15:1，v/v)作为洗脱液，得到化合物g-4，为橙色固体(0.63g，71％)。
(3)将步骤(1)所得的中间体化合物d-4(0.2mmol)和步骤(2)所得化合物g-4(0.2mmol)依次加入甲烷磺酸(2mL)中，在90℃加热4-8h，冷却后倒入冰水中，再加入0.5mL的高氯酸。由此产生的沉淀物被过滤掉，并用大量的水冲洗。样品干燥后，以CH2C12/EtOH混合物为洗脱剂，硅胶层析纯化得到实施例4的耐酸碱型近红外荧光染料，即式(I-4)化合物。
实施例4的耐酸碱型近红外荧光染料的核磁谱图如图9所示。结构表征结果为：1HNMR(300MHz,Chloroform-d)δ8.25(s,1H),7.62(m,2H),7.06(d,J＝7.1Hz,1H),7.02(s,1H),6.63(s,1H),5.97(s,1H),3.59(s,2H),3.42(s,4H),3.18(s,2H),1.23(s,6H)。
对比例1
本对比例提供的近红外荧光染料，结构式如下所示：
本对比例的近红外荧光染料的制备方法，包括如下步骤：
(1)将同实施例1的步骤(1)，得到的产物记为化合物d-5；。
(2)在氮气流下，将间苯二酚(0.55g，5mmol)和邻苯二甲酸酐(0.74g，5mmol)溶解在30mL硝基苯中，然后加入无水AlCl3(1.47g，11mmol)，将反应混合物在室温反应12h。将反应混合物倒入剧烈搅拌的30mL正己烷和40mL、0.5M的HCl的两相溶液中。反应搅拌2h后，得到橙黄色沉淀物，过滤得到粗产物。然后将产物通过柱层析纯化，使用二氯甲烷/甲醇(15:1，v/v)作为洗脱液，得到化合物g-5，为橙色固体(1.08g，84％)。
(3)将步骤(1)所得的中间体化合物d-5(0.2mmol)和步骤(2)所得化合物g-5(0.2mmol)依次加入甲烷磺酸(2mL)中，在90℃加热4～8h，冷却后倒入冰水中，再加入0.5mL的高氯酸。由此产生的沉淀物被过滤掉，并用大量的水冲洗。样品干燥后，以CH2C12/EtOH混合物为洗脱剂，硅胶层析纯化得到对比例1的近红外荧光染料。
对比例1的耐酸碱型近红外荧光染料的核磁谱图如图10所示。结构表征结果为：1HNMR(300MHz,Methanol-d4)δ8.31(s,1H),7.83(s,2H),7.62(d,J＝7.5Hz,1H),7.41(s,1H),7.14(d,J＝7.3Hz,2H),6.96(s,1H),5.91(s,1H),3.78(s,4H),3.36(s,2H),3.15(s,2H),1.32(d,J＝7.2,6H)。
试验例
分别对实施例1～4提供的耐酸碱型近红外荧光染料I-1、I-2、I-3、I-4以及对比例1提供的化合物进行荧光光谱分析、随pH变化的荧光强度分析以及pKa分析。
其中，荧光强度是将不同试验组的荧光染料保持在10μmol/L，然后置于pH为1～12的浓度为10mM的磷酸缓冲液中，测试其荧光强度。采用Henderson-Hasselbalch公式log[(Fmax-F)/(F-Fmin)]＝pKa-pH计算各荧光染料的pKa值。上述公式中，Fmax为染料分子不同pH条件下测得的最大荧光值，Fmin为染料分子不同pH条件下测得的最小荧光值，F为染料分子在确定pH值下测得的荧光值。
实施例1～4的耐酸碱型近红外荧光染料I-1、I-2、I-3、I-4和对比例1的荧光染料的测试结果分别如图1～5所示。
由图1可知，实施例1的近红外荧光染料I-1的最大激发波长为542nm，最大发射波长为696nm，斯托克斯位移154nm(图1a)。实施例1的近红外荧光染料在pH为1～3时，在激发光波长542nm、发射波长696nm处的荧光发射强度较低，并趋于稳定。在pH为4～7时随着pH值的升高而逐渐增强，并在pH＝7时达到荧光最大强度值，此后荧光强度保持稳定(图1b)。进一步利用pKa公式计算荧光染料的pKa值，可得实施例1染料的pKa＝4.83(图1c)。
由图2可知，实施例2的近红外荧光染料I-2的最大激发波长为548nm，最大发射波长为698nm，斯托克斯位移150nm(图2a)。实施例2的近红外荧光染料在pH为1～2时，在激发光波长542nm、发射波长696nm处的荧光发射强度较低，并趋于稳定。在pH为3～5时随着pH值的升高而逐渐增强，并在pH＝5时达到荧光最大强度值，此后荧光强度保持稳定(图2b)。进一步利用pKa公式计算荧光染料的pKa值，可得实施例2染料的pKa＝3.56(图2c)。
由图3可知，实施例3的近红外荧光染料I-3的最大激发波长为546nm，最大发射波长为695nm，斯托克斯位移149nm(图3a)。实施例3的近红外荧光染料在pH为1～3时，在激发光波长542nm、发射波长696nm处的荧光发射强度最低，并趋于稳定。在pH为4～8时随着pH值的升高而逐渐增强，并在pH＝8时达到荧光最大强度值，此后荧光强度保持稳定(图3b)。进一步利用pKa公式计算荧光染料的pKa值，可得实施例3染料的pKa＝5.21(图3c)。
由图4可知，实施例4的近红外荧光染料I-4的最大激发波长为554nm，最大发射波长为701nm，斯托克斯位移147nm(图4a)。实施例4的近红外荧光染料在pH为1～2时，在激发光波长542nm、发射波长696nm处的荧光发射强度最低，并趋于稳定。在pH为3～6时随着pH值的升高而逐渐增强，并在pH＝6时达到荧光最大强度值，此后荧光强度保持稳定(图4b)。进一步利用pKa公式计算荧光染料的pKa值，可得实施例4染料的pKa＝4.55(图4c)。
由图5可知，对比例1的近红外荧光染料的最大激发光波长为542nm，最大荧光发射波长为694nm，斯托克斯位移152nm(图5a)。对比例1的近红外荧光染料I-1在pH为1～4时，在激发光波长542nm、发射波长694nm处的荧光发射强度较低，并趋于稳定。在pH为5～8时，随着pH值的升高而逐渐增强，并在pH＝8时达到荧光最大强度值，此后荧光强度保持稳定(图5b)。进一步利用pKa公式计算荧光染料的pKa值，可得对比例1染料的pKa＝6.38(图5c)。
由以上结果综合分析可知，与对比例1的染料分子相比，在电子受体邻位进行弱吸电子卤素原子(Cl原子或F原子)修饰，可实现染料分子pKa的有效调控。通过化学修饰调控，最优可使得染料分子的pKa由6.38降至化合物I-2的pKa＝3.56，使染料分子的荧光强度由单一酸性敏感、碱性非敏感转变为酸碱均非敏感。而这一现象与卤素原子修饰的数目和种类有关。本发明中，通过卤素原子尤其是双F原子修饰可最大程度降低染料分子pKa，并使其荧光强度在pH为5～10时保持稳定，从而能够使得该类染料分子在病理环境中动态pH变化条件下，不受限于pH影响，实现原位精准成像。
综上可知，本发明提供的耐酸碱型近红外荧光染料，具有近红外区域发射波长、较低的pKa值和较大的斯托克斯位移，非常适用于病理环境中动态pH变化条件下生物标志物的活体原位荧光成像。此外，通过不同的化学修饰得到的染料分子可实现特定pH范围荧光响应变化，能够有效用于不同微环境pH变化荧光监测及目视比色检测。
Claims (10)
1.一种耐酸碱型近红外荧光染料，其特征在于，所述耐酸碱型近红外荧光染料的结构式如式(I)所示：
式(I)中，R1为乙基，R2、R3均为氟；或者R1为乙基，R2、R3均为氯。
2.一种如权利要求1所述的耐酸碱型近红外荧光染料的制备方法，其特征在于，制备路线如下所示：
具体制备方法包括以下步骤：
(1)将化合物a、化合物b、有机溶剂混合，加热搅拌反应，然后分离提纯，得到中间体c；将中间体c与有机溶剂混合，加入还原剂和酸后进行加热回流反应，反应结束后萃取，然后分离提纯，得到中间体d；
(2)将化合物e、化合物f、有机溶剂混合，加入盐后进行搅拌反应，然后分离提纯，得到中间体g；
(3)将中间体d、中间体g、有机溶剂混合，加热搅拌反应，然后分离提纯，即得式(I)所示的耐酸碱型近红外荧光染料；
其中，步骤(1)和步骤(2)不区分先后顺序。
3.根据权利要求2所述的耐酸碱型近红外荧光染料的制备方法，其特征在于，步骤(1)～(3)中，有机溶剂选自无水乙腈、无水甲苯、硝基苯、甲磺酸中的一种或多种。
4.根据权利要求2所述的耐酸碱型近红外荧光染料的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述化合物a、化合物b的摩尔比为1∶(35～40)；步骤(2)中，所述化合物e、化合物f、盐的摩尔比为1∶1∶(2～3)；步骤(3)中，所述中间体d、中间体g的摩尔比为1∶1。
5.根据权利要求2～4任一项所述的耐酸碱型近红外荧光染料的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述还原剂为硼氢化钠；所述酸为甲酸、乙酸、丙酸中的一种；所述萃取采用的萃取溶剂为水和乙酸乙酯；步骤(1)所述加热搅拌反应的温度为55～65℃，时间为10～15h；所述加热回流反应的温度为55～65℃，时间为4～6h。
6.根据权利要求2～4任一项所述的耐酸碱型近红外荧光染料的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述盐为无水AlCl3；步骤(2)所述搅拌反应的温度为20～40℃，时间为10～15h。
7.根据权利要求2～4任一项所述的耐酸碱型近红外荧光染料的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述加热搅拌反应的温度为85～95℃，时间为4～8h。
8.根据权利要求2～4任一项所述的耐酸碱型近红外荧光染料的制备方法，其特征在于，步骤(1)～(3)中，所述分离提纯中，分离为过滤或浓缩，提纯为柱层析；所述柱层析采用的溶剂为甲醇、乙酸乙酯、乙醚、二氯甲烷、石油醚、正己烷中的一种或两种以上的组合。
9.一种如权利要求1所述的耐酸碱型近红外荧光染料的应用，其特征在于，在酸性和/或碱性微环境中的荧光检测、目视定性检测、细胞/活体成像检测中的应用。
10.根据权利要求9所述的耐酸碱型近红外荧光染料的应用，其特征在于，所述荧光检测为：所述耐酸碱型近红外荧光染料作为比色探针监测微环境中的pH变化；所述细胞/活体成像检测为：所述耐酸碱型近红外荧光染料作为荧光染料在病理微环境动态pH变化条件下进行细胞/活体荧光成像。
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