CN113717089B - 一种氟化Cy7化合物及其合成方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种氟化Cy7化合物，结构式如下：
其合成方法如下：1、在氮气保护下，2‑氟‑5‑硝基苯肼与3‑甲基‑2‑丁酮发生环化反应，生成式(Ⅰ)化合物；2、在氮气保护下，式(Ⅰ)化合物和1,3‑丙磺酸内酯发生亲和加成反应，生成式(Ⅱ)化合物；3、环己酮与三氯氧磷发生氧化反应，生成式(Ⅲ)化合物；4、在碱存在的条件下，式(Ⅱ)化合物和式(Ⅲ)化合物发生迈克尔加成反应，生成所述的氟化Cy7化合物。该化合物具有被动靶向能力，能够在肿瘤区域富集，且能在肿瘤过表达标志物的作用下被还原，生成新的化合物使得肿瘤区域通过19F MRI和荧光成像的方法进行显影成像，从而实现肿瘤的诊断。
Description
技术领域
本发明属于磁共振成像技术领域，具体涉及一种氟化Cy7化合物及其合成方法和应用。
背景技术
目前，利用影像学手段在疾病的早期检测与治疗等方面发挥着越来越重要的作用。磁共振成像(MRI)因无电离辐射、组织对比度高和时间、空间分辨率高等优点，具有其他成像技术不可比拟的优越性和广阔的发展前景。传统MRI信号的来源通常为质子(主要为身体中的水和脂肪等)，因此具有很强的背景信号的干扰，所以发展杂核MRI(如3He、19F、31P、129Xe)可以提高成像对比度。19F的旋磁比仅低于1H，且具有天然丰度为100％、响应范围较宽等优势可以进一步提高成像灵敏度。而荧光成像(FLI)的灵敏度通常都是在微摩尔量级，将磁共振成像和荧光成像相结合，可以综合两种成像方法的优点，获取更多的成像信息。
硝基还原酶(NTR)通常在缺氧环境的肿瘤组织中过表达，因此对NTR的选择性和高效检测具有重要的临床意义，通过磁共振和荧光的方法来快速、准确的识别NTR，对肿瘤的早发现早治疗具有重要的意义。
发明内容
基于上述现有技术，本发明提供了一种氟化Cy7化合物及其合成方法和应用，该化合物具有被动靶向能力，能够在肿瘤区域富集，且能在肿瘤过表达的标志物硝基还原酶和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的作用下被还原，生成新的化合物可造成F的化学位移变化和荧光激发波长的改变，使得肿瘤区域通过19F MRI和荧光成像的方法进行显影成像，从而实现肿瘤的诊断。
该化合物的合成方法简单，合成成本相对较低，适合大规模生产。
实现本发明上述目的所采用的技术方案为：
一种氟化Cy7化合物，其结构式如下：
一种氟化Cy7化合物的合成方法，包括如下步骤：
1、在氮气保护下，2-氟-5-硝基苯肼与3-甲基-2-丁酮发生环化反应，生成式(Ⅰ)化合物，反应式如下：
2、在氮气保护下，式(Ⅰ)化合物和1,3-丙磺酸内酯发生亲和加成反应，生成式(Ⅱ)化合物，反应式如下：
3、环己酮与三氯氧磷发生氧化反应，生成式(Ⅲ)化合物，反应式如下：
4、在碱存在的条件下，式(Ⅱ)化合物和式(Ⅲ)化合物发生迈克尔加成反应，生成所述的氟化Cy7化合物，反应式如下：
进一步，所述的环化反应的温度为95-110℃，时间为3-6h。
进一步，所述的亲和加成反应的温度为110-120℃，时间为24-36h。
进一步，所述的氧化反应的温度为50-60℃，时间为6-10h。
进一步，所述的迈克尔加成反应的温度为45-60℃，时间为3-6h。
进一步，所述的碱为无水乙酸钠或碳酸铯。
一种氟化Cy7化合物在制备对硝基还原酶进行识别的磁共振成像剂和荧光成像探剂方面的应用。
进一步，所述的氟化Cy7化合物可用于制备磁共振成像和荧光成像的双模态显影剂。
与现有技术相比，本发明的优点与有益效果在于：
1、该化合物可具有被动靶向能力，能够在肿瘤区域富集，且具有一个较长的血液循环时间，同时硝基还原酶(NTR)和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)在肿瘤环境中过表达，而该化合物在NTR和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)的作用下，其上的硝基(-NO2)被还原成氨基(-NH2)，这种强吸电子基团(-NO2)被还原成强供电子基团(-NH2)，再通过π-π共轭结构进行传递，可造成F的化学位移变化和荧光最大激发波长的改变，通过荧光成像和19F MRI两种成像模式进行可视化，可对肿瘤区域进行精准诊断。
2、该化合物荧光激发波长发生改变后，荧光激发波长在近红外区域，有效地减少了背景荧光信号的干扰，并且具备较深的组织穿透深度，可大大提高荧光成像的灵敏度和准确度。
3、该化合物具备较好的生物安全性，水分散性好，适合用于活体MRI，在肿瘤的早期诊断方面具有很好的应用前景。
4、该化合物制备方法简单，原料便宜易得，合成条件相对简单，合成成本相对较低，产率较高，适合大规模生产。
附图说明
图1为实施例1制备的氟化Cy7化合物的紫外-可见吸收光谱和荧光发射光谱图。
图2为实施例1制备的氟化Cy7化合物、商用Cy7和商用ICG的荧光稳定性比较图。
图3为实施例1制备的氟化Cy7化合物在NTR、NADH作用下的荧光信号变化图。
图4为实施例1制备的氟化Cy7化合物在NTR、NADH作用下的19F NMR变化图。
图5为实施例1制备的氟化Cy7化合物在NTR、NADH作用下的活体肿瘤的荧光成像图。
图6为实施例1制备的氟化Cy7化合物在NTR、NADH作用下的溶液19F MRI变化图。
图7为实施例1制备的氟化Cy7化合物在NTR、NADH作用下的活体肿瘤的19F MRI变化图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
1、2-氟-5-硝基苯肼的合成
1.1、称取2-氟-5-硝基苯胺20g(128.0mmol，1.0eq)于500mL圆底烧瓶中，接着向圆底烧瓶中加入160mL12 mol/L浓盐酸，在室温下搅拌30min，然后将圆底烧瓶转移到低温反应浴(-25℃)中继续搅拌10min；
1.2、称取NaNO210.6 g(153.6mmol，1.2eq)用30mL纯水溶解，得到NaNO2溶液，用恒压滴液漏斗将NaNO2溶液逐滴加入到圆底烧瓶中，滴加完成后继续反应1h；
1.3、称取二水合氯化亚锡57.7g(255.7mmol，2.0eq)用150mL浓盐酸溶解，得到氯化亚锡盐酸溶液，将氯化亚锡盐酸溶液缓慢滴加入到圆底烧瓶中，滴加完成后搅拌10min，转移到室温下继续反应1h；
1.4、反应结束后过滤，将滤饼依次用浓盐酸、乙醚和二氯甲烷洗涤，接着旋转蒸发仪除去溶剂，所得固体物用甲醇溶解、过滤，保留滤液，将滤液用旋转蒸发仪除去溶剂，最后在真空干燥箱中干燥，得到黄色固体产物(16.9g，产率为75.4％)；
1H NMR(500MHz,MeOD)δ8.04(dd,J＝37.5,6.9Hz,2H),7.45(t,J＝9.6Hz,1H)；
19F NMR(471MHz,MeOD)δ-121.81(d,J＝10.4Hz)；
13C NMR(126MHz,MeOD)δ153.91(s),144.70(s),133.92(d,J＝13.2Hz),118.36(d,J＝8.8Hz),116.28(s),116.11(s),110.21(d,J＝4.0Hz),48.14(s),47.96(s),47.80(s),47.62(s),47.45(s),47.28(s),47.11(s)。
2、式(Ⅰ)化合物的合成
称取步骤1制得的黄色固体产物14.15g(20mmol，1.0eq)和3-甲基-2-丁酮3.45g(40mmol，2.0eq)于100mL圆底烧瓶中，向圆底烧瓶中加入50mL冰醋酸，在氮气保护下加热到95℃并在95℃下反应3h，反应结束后冷却至室温，向圆底烧瓶中加入CH2Cl2萃取，分液并保留有机相，将有机相用1mol/L的NaHCO3水溶液洗涤多次直至无气泡产生，分液并保留有机相，将有机相进行减压蒸馏，残留物用柱层析提纯(洗脱剂：乙酸乙酯：正己烷＝1:20，v/v)，得到红色油状物(2.1g，产率为47.3％)；
1H NMR(500MHz,MeOD)δ8.13(dd,J＝9.2,4.2Hz,1H),7.39(t,J＝9.0Hz,1H),2.40(s,3H),1.56(d,J＝2.0Hz,6H)；
19F NMR(471MHz,MeOD)δ-119.65(dd,J＝8.8,4.2Hz)；
13C NMR(126MHz,MeOD)δ192.98(s),157.62(s),143.04(s),142.29(s),123.58(d,J＝8.3Hz),116.16(s),115.99(s),58.26(d,J＝1.7Hz),18.56(s),14.18(s)。
3、式(Ⅱ)化合物的合成
称取步骤2制得的红色油状物1.63g(7.2mmol，1.0eq)和1,3-丙磺酸内酯1.94g(15.8mmol，2.2eq)于50mL圆底烧瓶中，加入1,2-二氯苯30mL，在氮气保护下加热到110℃并在110℃下反应过夜，反应结束后冷却至室温，用CH2Cl2/H2O萃取，分液并保留水相，再用CH2Cl2洗涤3次，将所得的液体物减压除去溶剂，残留物用柱层析提纯(洗脱剂：CH3OH：CH2Cl2＝1:8，v/v)，得到淡粉色固体(1.2g，产率为48.4％)；
1H NMR(500MHz,MeOD)δ8.52(dd,J＝9.3,3.7Hz,1H),7.80(d,J＝1.1Hz,1H),3.57(t,J＝6.3Hz,1H),3.08–2.98(m,2H),2.93(dd,J＝17.3,10.3Hz,1H),2.53–2.38(m,2H),2.11–2.02(m,1H),1.84(s,5H)；
19F NMR(471MHz,MeOD)δ-117.79(s)；
13C NMR(126MHz,MeOD)δ173.91(s),152.16(s),150.44(s),145.92(s),137.85(s),130.19(s),122.63(d,J＝8.9Hz),101.27(s),52.05(s),26.16(s),24.66(s)。
4、式(Ⅲ)化合物的合成
取50mL无水DMF于150mL圆底烧瓶中，将圆底烧瓶置于冰水浴中，向圆底烧瓶中缓慢加入POCl3(35mL，380mmol，3.0eq)并搅拌30min，用注射器向圆底烧瓶中加入环己酮(9.98g，100mmol，1.0eq)，在50℃下加热反应10h，反应结束后冷却至室温，将圆底烧瓶中的混合液倒入400g冰中，静置过夜，过滤，将滤饼先用纯水洗涤再用二氯甲烷洗涤多次，再将所得固体物用真空干燥箱干燥，得到黄色固体(7.74g，产率为45.8％)。
1H NMR(500MHz,d6-DMSO)δ8.81(s,2H),2.36(t,J＝6.2Hz,4H),1.67–1.48(m,2H)；
13C NMR(126MHz,MeOD)δ150.65(s),148.69(s),141.75(d,J＝7.7Hz),139.03(d,J＝11.7Hz),120.80(d,J＝3.5Hz),112.88(s),111.37(s),111.19(s)。
5、氟化Cy7化合物的合成
称取步骤3制得的淡粉色固体(690mg，2mmol，2.0eq)、步骤4制得的黄色固体(191.4mg，1.1mmol，1.1eq)和无水乙酸钠(88mg，1.0eq)于100mL圆底烧瓶中，向圆底烧瓶中加入20mL乙酸酐，加热到60℃反应过夜，反应结束后过滤，将滤饼用CH2Cl2洗涤，将所得固体物用柱层析提纯(洗脱剂：CH3OH：CH2Cl2＝1:5，v/v)，得到墨绿色带金属光泽固体(416.5mg，产率为48.8％)；称取部分墨绿色带金属光泽固体用PBS进行溶解，制得浓度为5μM的待检测溶液备用；
m/z＝823.17143；
1H NMR(500MHz,MeOD)δ8.59(d,J＝14.1Hz,2H),8.01(dd,J＝9.2,3.8Hz,2H),7.52(dd,J＝11.3,9.2Hz,2H),6.60(d,J＝14.1Hz,2H),4.65–4.48(m,4H),3.73(s,1H),2.99(t,J＝6.9Hz,4H),2.86(t,J＝6.0Hz,4H),2.43–2.29(m,4H),1.99(s,13H)；
19F NMR(471MHz,MeOD)δ-124.59(d,J＝9.6Hz)；
13C NMR(126MHz,MeOD)δ173.91(s),152.16(s),150.44(s),145.92(s),142.36(d,J＝2.7Hz),137.84(d,J＝3.0Hz),131.69(d,J＝8.3Hz),130.19(s),122.63(d,J＝8.9Hz),118.08(s),117.90(s),101.27(s),52.05(s),26.16(s),24.66(s),23.70(s)。
将实施例1制备的氟化Cy7化合物进行紫外-可见吸收光谱分析和荧光发射光谱分析，移取0.6mL待检测溶液于微量比色皿中进行紫外-可见光光谱测试，另移取2.5mL待检测溶液于比色皿中进行荧光光谱测试，所得的紫外-可见吸收光谱和紫外-可见光光谱如图1所示，由图1可知，实施例1制备的氟化Cy7化合物紫外最大吸收波长为770nm，荧光最大发射波长为794nm。
试验一、本发明的氟化Cy7化合物的荧光稳定性试验
试验方法：
将实施例1制备的氟化Cy7化合物(标记为FCy7-NO2)、商用Cy7(CAS:943298-08-6)和商用ICG(CAS:3599-32-4)分别用PBS进行溶解，配制两组50mLFCy7-NO2溶液、50mLCy7溶液和50mLICG溶液，FCy7-NO2溶液、Cy7溶液和ICG溶液的浓度均为5μM，将其中一组FCy7-NO2溶液、Cy7溶液和ICG溶液置于常规条件(室温、日光照射)下，另一组FCy7-NO2溶液、Cy7溶液和ICG溶液置于紫外灯照射条件下，每种条件下，在不同时间点取相同体积(2.5mL)的FCy7-NO2溶液、Cy7溶液和ICG溶液在各自的最大激发波长处(FCy7-NO2为770nm，Cy7为748nm，ICG为768nm)测各自的荧光强度；
试验结果：
实施例1制备的氟化Cy7化合物、商用Cy7和商用ICG在不同照射条件的荧光强度随时间的变化图如图2所示，由图2可知，不管是日光照射条件下，还是在紫外灯照射条件下，与商用Cy7和商用ICG相比，实施例1制备的氟化Cy7化合物随着照射时间的增长，其荧光强度下降的比例最低，由此表明，本发明的氟化Cy7化合物引入了卤素基团(-F)和结构对称，比商用的Cy7和ICG具备更好的荧光稳定性。
试验二、本发明的氟化Cy7化合物在肿瘤过表达标志物NTR、NADH作用下的荧光试验
试验方法：
称取1.3mg实施例1制备的氟化Cy7化合物(标记为FCy7-NO2)溶解于15mLPBS中，配制15mL 0.1mM FCy7-NO2溶液，称取2.0mgNADH固体粉末溶解在15mL PBS中，配制15mL0.2mMNADH溶液，将NTR分散成5μg/mL的溶液待用。将15mLFCy7-NO2溶液、15mL NADH溶液和1mLNTR溶液混合，混合均匀后置于37℃水浴锅中加热，分别在不同时间点间隔取样，测其荧光强度的变化；
试验结果：
实施例1制备的氟化Cy7化合物在NTR、NADH作用下，其荧光强度随时间的变化图如图3所示，由图3可知，随着加热时间的延长，加热后的混合液的荧光强度逐渐增加，待完全反应完后(1h)，相对于最开始(0min)荧光信号增强了约8倍。
试验三、本发明的氟化Cy7化合物在肿瘤过表达标志物NTR、NADH作用下的19F NMR试验
试验方法：
称取13mg实施例1制备的氟化Cy7化合物(标记为FCy7-NO2)溶解于15mLPBS中，配制15mL 1mM FCy7-NO2溶液，称取20mg NADH固体粉末溶解在15mL PBS中，配制15mL 2mMNADH溶液，将NTR分散成5μg/mL的溶液待用。将15mLFCy7-NO2溶液、15mLNADH溶液和5mLNTR溶液混合，混合均匀后置于37℃水浴锅中加热，分别在不同时间点间隔取样，测其F谱的变化；
试验结果：
实施例1制备的氟化Cy7化合物在NTR、NADH作用下，其F谱随时间的变化图如图4所示，由图4所示，FCy7-NO2的化学位移在-118.7ppm处，在NTR/NADH作用下底物逐渐转变成FCy7-NH2，从而引起F的化学位移变化，FCy7-NH2信号在-123.9ppm处，和FCy7-NO2相差5.2ppm。
试验四、本发明的氟化Cy7化合物在肿瘤过表达标志物NTR、NADH作用下的活体荧光成像试验
试验方法：
称取1.3mg实施例1制备的氟化Cy7化合物(标记为FCy7-NO2)溶解于15mLPBS中，配制15mL 100μMFCy7-NO2溶液，通过尾静脉注射的方式在转移瘤模型老鼠(裸鼠的右后腿皮下注射A549细胞，2-3周后肿瘤成型)中注射100μL FCy7-NO2造溶液，利用视觉相机分别在不同时间点对转移瘤模型老鼠肿瘤部位拍照，测其肿瘤部位的荧光强度的变化；
试验结果：
实施例1制备的氟化Cy7化合物在肿瘤区域的NTR、NADH作用下，转移瘤模型老鼠肿瘤部位的荧光强度变化图如图5所示，由图5所示，FCy7-NO2在初始时刻0.1h时已通过血液循环传遍裸鼠全身，直到2h时肿瘤区域开始富集造影剂，荧光增加，但其他区域的背景信号也很强，直至24h后肿瘤区域的荧光对比效果最佳。
试验五、本发明的氟化Cy7化合物在肿瘤过表达标志物NTR、NADH作用下的溶液19FMRI试验
试验方法：
称取13mg实施例1制备的氟化Cy7化合物(标记为FCy7-NO2)溶解于5mLPBS中，配制15mL 3mMFCy7-NO2溶液，称取20mgNADH固体粉末溶解在5mL PBS中，配制15mL6mM NADH溶液，将FCy7-NO2溶液和NADH溶液混合，均分为5份2mL混合溶液，将5份混合溶液分别加入浓度为0、5、10、25、50μg/mL的NTR溶液，接着分别在37℃水浴中孵育1h，最后分别通过9.4T核磁成像仪检测目标产物FCy7-NH2的信号。
试验结果：
实施例1制备的氟化Cy7化合物在NTR、NADH作用下，随着NTR浓度的增加，反应物FCy7-NO2的19F MRI信号(δ＝-118.7ppm)逐渐降低，酶促反应的目标产物FCy7-NH2的19F MRI信号(δ＝-123.9ppm)逐渐增加，且两者信号的增减基本上是互补的，说明FCy7-NH2的信号来源正是由于FCy7-NO2。
试验六、本发明的氟化Cy7化合物在肿瘤过表达的标志物NTR、NADH作用下的活体19F MRI试验
试验方法：
称取13mg实施例1制备的氟化Cy7化合物(标记为FCy7-NO2)溶解于1.5mLPBS中，配制5mL 10mMFCy7-NO2溶液，将荷瘤老鼠(约5×106个A549细胞(约100μL)注射进小鼠的右后腿皮下，2-3周后形成转移瘤)用异氟烷麻醉，将100μL 10mM FCy7-NO2溶液原位注射进小鼠的肿瘤区域，然后通过9.4T核磁成像仪检测目标产物FCy7-NH2的信号，期间保持异氟烷麻醉。
试验结果：
实施例1制备的氟化Cy7化合物在肿瘤区域的NTR、NADH作用下，在30min左右的反应时间里，反应物FCy7-NO2的19F MRI信号(δ＝-118.7ppm)降低，酶促反应的目标产物FCy7-NH2的19F MRI信号(δ＝-123.9ppm)从无到有，且与肿瘤区域重合，说明FCy7-NO2能够在活体内实现对肿瘤区域中的NTR的识别。
Claims (9)
1.一种氟化Cy7化合物，其特征在于其结构式如下：
。
2.一种权利要求1所述的氟化Cy7化合物的合成方法，其特征在于包括如下步骤：
2.1、在氮气保护下，2-氟-5-硝基苯肼与3-甲基-2-丁酮发生环化反应，生成式（Ⅰ）化合物，反应式如下：
；
2.2、在氮气保护下，式（Ⅰ）化合物和1,3-丙磺酸内酯发生亲和加成反应，生成式（Ⅱ）化合物，反应式如下：
；
2.3、环己酮与三氯氧磷发生氧化反应，生成式（Ⅲ）化合物，反应式如下：
；
2.4、在碱存在的条件下，式（Ⅱ）化合物和式（Ⅲ）化合物发生迈克尔加成反应，生成所述的氟化Cy7化合物，反应式如下：
。
3.根据权利要求2所述的氟化Cy7化合物的合成方法，其特征在于：所述的环化反应的温度为95-110℃，时间为3-6h。
4.根据权利要求2所述的氟化Cy7化合物的合成方法，其特征在于：所述的亲和加成反应的温度为110-120℃，时间为24-36h。
5.根据权利要求2所述的氟化Cy7化合物的合成方法，其特征在于：所述的氧化反应的温度为50-60℃，时间为6-10h。
6.根据权利要求2所述的氟化Cy7化合物的合成方法，其特征在于：所述的迈克尔加成反应的温度为45-60℃，时间为3-6h。
7.根据权利要求2所述的氟化Cy7化合物的合成方法，其特征在于：所述的碱为无水乙酸钠。
8.一种权利要求2所述的氟化Cy7化合物在制备对硝基还原酶进行识别的磁共振成像剂和荧光成像探剂方面的应用。
9.根据权利要求1所述的氟化Cy7化合物的应用，其特征在于：所述的氟化Cy7化合物可用于制备磁共振成像和荧光成像的双模态显影剂。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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